Manual de Bioconversiones

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
INGENIERA BIOTECNOLGICA
PRCTICA 1
Determinacin de actividad enzimtica y efecto de la
concentracin de enzima, pH, temperatura y fuerza
Inica en la actividad enzimtica (alfa-amilasa).
La Prctica 1 incluye 6 mdulos de iniciacin de tcnicas analticas y manejo
de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres ltimas estn
enfocadas tema central relativa actividad enzimtica, parte fundamental del
desarrollo del curso.
Contenido
1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2
1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. ............ 7
1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de
bioconversiones. ................................................................................................. 13
1.4 Determinacin de crecimiento celular por turbidimetra (D.O.), peso
seco, protena y cuenta directa en cmara de Neubauer. ........................ 14
1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales. ................... 17
1.6 Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas
elegidas. ................................................................................................................. 20
1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos
enzimticos: Amilasas. ...................................................................................... 23
1.8 Efecto de la concentracin de enzima y fuerza inica en la actividad de
la enzima elegida. ................................................................................................ 25
1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica. ...................... 27
Cada mdulo se llevar a cabo en una o ms sesiones, las cuales sern

determinadas por el profesor, requirindose para toda la prctica un mximo de
9 sesiones (cinco semanas)

1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio.
USO DE MICROPIPETAS AUTOMTICAS
En las prcticas de Bioqumica los volmenes de las soluciones que se
necesitan medir son del orden de microlitros (L). Para tomar estas cantidades
con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen
fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen
principalmente del usuario y no de la micropipeta en s, a menos que esta no
est bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en
cuenta las siguientes consideraciones:
La pipeta debe de mantenerse siempre en posicin vertical durante todo el
proceso de pipeteo, nunca inclinada. Tambin, cuando la pipeta no se utilice se
debe dejar siempre en posicin vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje
horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga lquido
succionado.
Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo
miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se
puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado.
En stas, no se deben ajustar volmenes superiores o inferiores a los que se
recomiendan para cada pipeta.
Los modelos que toman volmenes inferiores a 200 L usan puntas amarillas
(o blancas), y las micropipetas que toman volmenes superiores a 200 L
hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas
que manejan volmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 L, pueden usar otro tipo
de puntas especficas.
La pipeta se agarra como si se tomara una empuadura. La parte superior
debe de reposar sobre su dedo ndice (Fig. 1).
Todas las pipetas tienen dos topes:
1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.
2) Segundo tope para expulsar de forma ms eficiente el volumen tomado y
se usa solo cuando se est expulsando el contenido. .
Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomar un

volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para
sacar de forma ms eficiente el volumen establecido

Posicin Inicial
1 2
Primer Tope
Segundo Tope
Fig. 1 Manera de asir una pipeta automtica y tomar una muestra (presin
del mbolo).
Tanto la presin como la liberacin del mbolo de la pipeta se debe de realizar
lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar
burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alteraran los volmenes; as
mismo se podra ensuciar la parte interna de la pipeta.
Tambin se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no
est bien ajustada a la pipeta.
Procedimientos
micropipeta
para
medir
correctamente
un
volumen
con
una
1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que

est dentro del intervalo establecido para la pipeta).
2. El volumen requerido se fija girando el mbolo (Fig. 2). Se debe girar
suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volmenes,
para evitar descalibrar las pipetas).
Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado.

3. Colocar una punta desechable en el vstago de la pipeta (Fig. 3);
asegurando que est bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de
torsin y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque
esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla.
3

Figura 3
Figura 4
4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar

hasta el primer tope.
5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la
superficie de lquido, manteniendo la pipeta en posicin vertical (Fig. 4).
6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin
con el dedo pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se
espera un par de segundos con la punta introducida en el lquido.
7. Retirar la punta de la muestra.
8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,
colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la
solucin.
9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope.,
continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la
totalidad del lquido que est en la punta.
10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la
pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.
11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin
permitir que el mbolo suba por s solo).
12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando
de ella, (Fig. 5).
En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla,
una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y
sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope.
El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.

Figura 5
Figura 6
http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropi
petas.htm
TRABAJO PRCTICO
Cada equipo realizar lo siguiente:
1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 L. Seleccionar el
volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada.
2. Tomarla muestra indicada como se indic anteriormente.
3.
Transferir el lquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la

micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir
la muestra, depositar la muestra segn el procedimiento ya indicado.
4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando

encima del recipiente la punta y presionando el pistn ubicado en la parte
inferior, atrs del pistn de succin. Cada vez que se agregue un volumen
seleccionado, se registrar su peso en la balanza (dependiendo de la
sensibilidad de la balanza), cada volumen se har por duplicado.
IMPORTANTE
Cuando se vaya a pipetear solvente voltiles, como diclorometano, acetona,
cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con
el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el
embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el
solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la
posicin inicial.
Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se
volatiliza dentro de la misma.
Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que
suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrar aire. Esto
indica que an no se haba tomado todo el volumen y se debe repetir todo el
procedimiento.

Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas as
como cambiar los volmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2:
Tabla 1. Volmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.
1000 L
600
200
100
200 L
150
100
50
20 L
16
12
8
4
1
Tabla 2. Volmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 L
600
200
200 L
150
100
20 L
20
10
Practicar con el profesor la toma de muestras voltiles

1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas.
Fotometra
La fotometra o "medida de la luz" es un mtodo ptico de anlisis dentro del cual
se encuentran la colorimetra y la espectrofotometra, que miden la cantidad
de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente.
La luz es una forma de energa electromagntica, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc.
Que es irradiada a partir de una fuente energtica en lneas o rayos virtualmente rectos. Se
propaga en el vaco sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria
rectilnea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su
direccin de desplazamiento y cuya longitud de onda se sita entre 380 y 780 nanmetros.
Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz
que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm.
Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama
infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiacin ultravioleta (UV).
Las medidas de absorcin de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la
ley de Beer.
Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la
longitud del medio absorbente aumenta.
I0
I = I0 10 -K.L
log
= KL
I
donde:
I = intensidad de luz transmitida
I0 = intensidad de luz incidente
K = coeficiente de extincin
L = espesor de capa
K es el coeficiente de extincin definen cuan fuertemente una substancia absorbe
la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentracin
molar.
Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio
absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que
aumenta la concentracin de la sustancia absorbente en el medio.
I0
I = I0 10 K.C
log
= K C
I
donde
C = concentracin de la sustancia absorbente

Sol.Absorbente
concentracin C
Luz
Rayo incidente
monocromtica
Intensidad I0
Rayo emergente
Intensidad I
L
Espesor de la solucin
Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromtica a travs de una solucin
Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:

I0
-CL
I = I0 10
log
= cL
donde = coeficiente de extincin molar

es el coeficiente de extincin cuando la solucin contiene un mol por litro.
El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele
expresar como un porcentaje
I
T=
- cL
=10
I0
La expresin log
I
%T =
x 100
I0
I0
I0
A = D.O. = log
se conoce como absorbancia (A) o densidad ptica (DO)

= c L ; para L=1, A = c
I
T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T
ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFTOMETRO
Espectrofotmetros: Los mtodos fotomtricos de anlisis utilizan los efectos de
la interaccin de las radiaciones electromagnticas con las molculas. Los
aparatos de medicin de la absorcin de la radiacin electromagntica se
denominan "espectrofotmetros" y estn constituidos de forma general de (Fig 2):
Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces
monocromticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable,
pasando a travs del mismo slo luz de una determinada longitud de onda. La
utilizacin de la luz monocromtica o de un intervalo pequeo de longitudes de
onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas
condiciones.
8

La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide sobre
el fototubo donde es detectada. La seal se enva a un registrador que
convierte la seal a un registro anlogo, digital o grfico.
En algunos colormetros este registro consta de dos escalas, una mide
absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a ,
la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.
Colimador
Monocromador
Fototubo
Celda con
muestra
Registro
Fuente de luz
%T 0
A
100
0
Figura 2. Esquema de las partes bsicas de un espectrofotmetro

Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se
introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de
transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda
con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de
onda determinada.
Colormetros: Los mtodos colorimtricos son una aplicacin de la
espectroscopa y se basan en la medida de la absorbancia de una solucin
coloreada en la regin visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele
ser una lmpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman
en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimtricamente, mediante
reaccin con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la
regin visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus
posibilidades de utilizacin.

CAPACITACIN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTMETROS
Actividad en laboratorio:
Los maestros de laboratorio indicarn cmo operar y programar los equipos. El
alumno deber anotar en su bitcora cada paso y realizar un diagrama de flujo
de los pasos, as como las consideraciones que hay que tener en el manejo,
mantenimiento y limpieza del equipo.
Existen diferentes modelos de espectrofotmetros en los laboratorios de
docencia, de investigacin y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio
se utilizarn dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno.
Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o
desechables de plstico, existen de diferentes volmenes de operacin 4, 2 y 1
mL.
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.
10

CENTRFUGA BECKMAN J2-MC
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.
Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL
JA-14 para 6 tubos de 250 mL.
Asegrese de equilibrar los tubos de centrfuga con la muestra en una
balanza.
Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua.
Para abrir:
Mueva el interruptor a la posicin ON.
Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)

Para programar:
Oprima ROTOR e introduzca el nmero 14 20, dependiendo del tipo de

rotor a usar.
Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades

mximas para cada rotor, para esto existe una tabla)
Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min).
Oprima TEMP y teclee la temperatura ( C)
Al terminar la seleccin, oprima ENTER.

Para operar:
Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias

(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso
Coloque la tapa del rotor.
Cierre la centrfuga.
Permita que el equipo enfre a la temperatura indicada antes de comenzar

el programa.
Oprima el botn START para iniciar el programa.
Se puede abortar oprimiendo el botn STOP.

NOTAS:
La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido.
Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cmara

de la centrfuga se deshiele. Asegrese de secar la cmara. Proceda a
cerrar el equipo.
11

CENTRFUGA HERMLE Z300
Antes de usar, siempre regstrese en la libreta u hoja de control del equipo.
Cuenta con tres Rotores para:
24 tubos Eppendorf de
12 tubos Falcon de
6 Tubos Falcon de
1.5 mL
15 mL
50 mL
Para cambiar rotor:
Utilice la llave del equipo.

La rosca es izquierda.
Girar a la derecha
Girar a la izquierda
Para abrir: Oprima
el
botn
de
para aflojar,
para apretar.
apertura.
El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) est encendido, seal
que el rotor se ha detenido y que es posible abrir.
Precaucin al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla
lentamente.
Para programar:
Mantener oprimido el botn preset
Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla
Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla
Para operar:
Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en

posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por
par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos
encontrados tengas el mismo peso.
Coloque la tapa del rotor (si ste posee una).
Cierre la centrfuga.
Oprima el botn start para iniciar el programa.
Se puede parar oprimiendo el botn stop.

En caso de que, por alguna falla en el suministro elctrico, la pantalla se
muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conctelo
nuevamente. Proceda con la programacin.
12

1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el
bioconversiones.
laboratorio de
Reactivo de Bradford
Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al
95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La
solucin resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones
finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250,
4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico.
Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si tiene
un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar
nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario.
Reactivo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS)
1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta
obtener un volumen final de mximo 50 mL.
2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada.
3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada.
4. Aforar a 100 mL con agua destilada.
5. Guardar en obscuridad y en frasco mbar.
Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener
cuidado con los volmenes que se manejan, por que el volumen final no debe
ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio
agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de
agua a la sal por que dar un volumen mayor) .
Solucin de Almidn 1% (p/v)
Suspender 1g de almidn en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el
cual deber estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en
bao de agua a 60 C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidn.
Solucin de alfa-amilasa
La concentracin de enzima ser indicada por el profesor y ser en mg de protena o
enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0.
Solucin de antrona
Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al
75%.
Para preparar el cido al 75%, se debe realizar en la campana de extraccin,
en un bao de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el
bao e ir agregando lentamente por las paredes el cido. Usar material de
seguridad, lentes y guantes.
13

1.4 Determinacin de biomasa microbiana por turbidimetra o Densidad
ptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cmara de Neubauer.
La determinacin biomasa microbiana puede realizarse por varios mtodos
tanto directos como indirectos, tres de estos son:
1. Densidad ptica (D.O.) o turbidimetra
2. Peso seco
4. Cuenta en cmara de Neubauer
PARTE EXPERIMENTAL
1) Densidad ptica
A partir de muestras obtenidas de una cintica de crecimiento, es decir del
medio de cultivo a travs del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo
concentrado), obtener la densidad ptica de las muestras leyendo a 600 nm.
Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es
necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El
blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; as mismo, ste se debe usar
para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1.
Se entregar un cultivo microbiano, el cual se leer la DO a 600 nm y a partir
de la lectura se establecern 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la
densidad ptica vs. dilucin.
La DO se puede graficar vs concentracin de protena extracelular, peso seco,
numero de clulas, protena celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas
2) Peso seco
a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60C por 24
horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar.
b) Tomar una alcuota de 10 a 15 mL de la suspensin celular (de cada dilucin
hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrfuga.
c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min.
Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar.
d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua
destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada.
e) Dejar las charolas en una estufa a 60C por 24 h o hasta que la pastilla este
completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola.
f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada
charola.
g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de clulas/mL.
14

3) Cuenta directa en Cmara de Neubauer
La cmara de Neubauer es una cmara adaptada para ser utilizada en un
microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, con el fondo marcado con una
una cuadrcula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 reas de
1mm2 cada una. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm
respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos
ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido
entre la superficie de cada rea y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1
microlitros).
Las diferencia entre las reas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo
que permite en ese orden contar clulas de mayor a menor tamao, contando
bacterias y levaduras en el rea 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se
observa en 40 o 100X
Se deben contar el nmero de clulas de cuatro o cinco cuadros de un rea, la
concentracin en la suspensin celular ser:
Cl/mL = N X 104 X F
(ecuacin 1)
Donde:
N: La media de las clulas contadas (suma de clulas contadas por
subdivisin/Nmero de subdivisiones contadas)
25: es el nmero de cuadrados en cada grilla.
104: factor para pasar el nmero de clulas en el cuadrado central (volumen =
0.1mm3 = 0,1L) a nmero de clulas por mL (1000mm3 = 1000L=1 mL)
F: factor de dilucin
Figura 1. Grilla de conteo de la cmara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,

2007).
15

El conteo con la cmara se lleva a cabo de la siguiente forma:
a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cmara de Neubauer.
b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura
1.
c) Agitar la suspensin celular para tener una muestra homognea.
d) Con ayuda de una pipeta serolgica de 1 mL o con una pipeta
automtica de 100 L, tomar 0.1 mL de la suspensin y colocar la punta
de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solucin ingrese a
la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se
forman burbujas se debe repetir la operacin, lavando y secando la
cmara previamente.
e) Colocar la cmara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con
el objetivo 10x.
f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrcula de 25
cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y
contar el nmero de clulas de 4 o ms subdivisiones. Evitar contar dos
veces la misma clula u omitir alguna.
g) En caso de que el nmero de clulas sea muy elevado y se dificulte su
conteo, ser necesario diluir la suspensin en una proporcin conocida,
la que deber ser tenida en cuenta en la estimacin final.
h) Calcular el nmero de clulas con la ecuacin 1
Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications
and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).
16

1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales.
1) Azcares reductores
Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf,

posteriormente adicionar 0.1, de la solucin problema. Se puede
homogeneizar con la punta.
Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran
durante la ebullicin.
Poner a bao mara (ebullicin) por 5 min.
Llevarlo despus a hielo por 10 min.
Aadir a 1mL de agua destilada.
Agitar en el vortex y dejar hasta que est a temperatura ambiente,
posteriormente:
Leer la absorbencia a 540nm.
1.1 Curva tipo de maltosa.
La curva patrn se realiza con maltosa en un rango de concentracin de 0 a 2.0
g/L
Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de
acuerdo a la tcnica de azcares reductores.
Tabla 1. Diluciones para la curva patrn de maltosa.
Tubo
1. (Blanco)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Concentracin de
maltosa en la
muestra
(g/L)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Volumen de la
solucin de
maltosa de 2 g/L
(mL)
0.00
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Volumen de
agua destilada
(mL)
1.00
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.
17

Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas (ejey)
promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las
abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de maltosa determinada en
g/L.
Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:
y = mx + b
En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm.
x representa la concentracin de maltosa determinada en g/L.
La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98,
con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.
18

2) Azcares Totales por el mtodo de Antrona
Solucin de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100
Ml con H2SO4 al 75%. (ver prctica 1.3)
Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente

adicionar lentamente 1 mL de solucin de antrona, agregar la antrona
lentamente, es una reaccin exotrmica. Cuando este mtodo se realiza
con volmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en
frio (en bao de hielo porque es muy exotrmica)
Agitar en Vortex y luego llevar a ebullicin en bao Maria durante 10 min

(cuidado de que no se abras los tubos, es muy cido, se recomienda
sellar las tapas con una tira de Egapack).
Enfriar en hielo (para detener la reaccin). Posteriormente sacar del
hielo y dejar a temperatura ambiente
Leer a 650 nm (cuando la muestra ya est a temperatura ambiente).
2.2 Curva tipo de sacarosa.
La curva patrn se realiza con sacarosa en un rango de concentracin de 0 a
100 mg/L
Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de
acuerdo a la tcnica de antrona.
Tabla 2. Diluciones para la curva patrn de sacarosa.
Tubo
1. (Blanco)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Concentracin de
sacarosa en la
muestra
(mg/L)
0.0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Volumen de la
solucin de sacarosa
100 m g/L
(mL)
Volumen de
agua destilada
(mL)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.

Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:
y = mx + b
19

1.6 Determinacin de protena.
Objetivo
Determinar la concentracin de protena de una solucin enzimtica con el
mtodo de Bradford.
Introduccin
La determinacin de la concentracin de protenas puede realizarse por varios
mtodos, entre ellos:
1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su 280 [g-1L
cm-1], por ejemplo para la albmina de suero bovino (BSA) su 280 [g-1L cm-1]
es de 0.667.
*280: coeficiente de extincin a 280 nm (en la regin Ultravioleta del
espectro de luz)
Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albmina de
suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3:
Tabla 3. Curva patrn de BSA para lectura en 280 nm.
Sol. de BSA
1000 g/mL
(mL)
Agua destilada
(mL)
Concentracin
de BSA
( g/mL)
0.0 0.10
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90
1.0
1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10
0.0
100
0.2
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a

280 nm ajustando el equipo con un blanco de reactivos (el que no contiene
protena). Con los datos graficar, realizar una regresin lineal y obtener la
ecuacin de la recta, con la que se calcular la concentracin de la protena
problema.
20

2. Mtodo de Bradford: El mtodo de Bradford involucra la unin del azul
brillante de Coomassie G-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en
el mximo de absorcin de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que
permite la cuantificacin. Dicha unin es independiente de la composicin de
aminocidos de las protenas. La concentracin de protena se determina por
medio de una curva tipo con Seroalbmina Bovina (BSA) y el reactivo de
Bradford.
Desarrollo experimental
Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 g/mL, a
partir de una solucin de 200 g/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf
limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4
para obtener un volumen final de .02 mL de muetra
Tabla 4. Curva Tipo de albmina de suero bovino (BSA), para determinacin de
protena por Bradford
(BSA) 200
0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
g/mL (mL)
Agua destilada
0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
(mL)
Concentracin
de BSA
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180 200
(g/mL)
Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar

EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con
el blanco de reactivos o agua (el que no contiene protena)
La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando en
la ecuacin obtenida con la curva tipo de seroalbmina bovina a diferentes
concentraciones.
PROBLEMA: Determinar la concentracin de una solucin de tripsina por
espectrofotometra a 280 nm. .
A partir de una solucin que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada)
hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5
mL de la solucin de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a
un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua
respectivamente) y leerlas a 280 nm.
Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva,
tomar tres de ellas para hacer la determinacin de la concentracin por el
mtodo de Bradford, considerando la sensibilidad de este mtodo.
21

Informe
1. Establecer la curva patrn de protena con Bradford y otra por
espectrofotometra a 280 nm.
2. Calcular la concentracin de protena de la solucin de tripsina usando los
dos mtodos de determinacin de protena.
2. Discutir los resultados obtenidos.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.
En qu se basa el mtodo de Bradford?

En qu tiempo hay que leer la muestra en el mtodo Bradford y por qu?
Cul es la ventaja del mtodo de Bradford?
Qu otros mtodos de determinacin de protena existen, en que se basan
y su intervalo de sensibilidad?
Referencia.
Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72, 248-254.
22

1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de

extractos crudos enzimticos: Amilasas.
OBJETIVO
Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa y calcular las unidades de
actividad enzimtica.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.Preparar una solucin de almidn: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidn
en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se
desnaturaliza por calor en un bao de agua a 60 C durante 15 min, para pregelatinizar el almidn.
Reactivos:
Almidn 1.0 % (p/v)
Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M
Reactivo de DNS
-amilasa
2. Realizar curva tipo de maltosa por el mtodo de azcares reductores DNS.
Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por mtodo de DNS
(prctica 1.5)
3. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6)
a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar
5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida
en la prctica 1.6.
4. Cintica de hidrlisis del almidn:
Tener antes de iniciar un el bao de agua en ebullicin y otro de hielo.
1) Para cada muestra a la que se determinar actividad, tener listo un tubo
eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos).
2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solucin
de almidn 1% a 20C..
3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al
testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener
la reaccin en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente
23

0.1 mL de la mezcla de reaccin (otra persona), transferirlo rpidamente a
un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (ste ser el testigo). Realizar:
un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones
0.1 mL de solucin de almidn.
4) Dejar que la reaccin se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos)
0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo
EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reaccin a uno de los tubo que ya
contiene 0.1 mL del reactivo DNS.
5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo segn la tcnica de DNS: Poner en
bao de agua a ebullicin durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no
entre agua a los tubos.
6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un bao de agua fra durante
10 min.
7) Posteriormente aadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solucin.
8) Se homogeniza la solucin invirtiendo con la mano los tubos.
9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,
determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y
6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la
finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reaccin
enzimtica. .
10) Se utiliza la curva patrn de DNS realizada con maltosa para determinar la
concentracin de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL
de la muestra.
11) Expresar la actividad enzimtica en unidades de actividad de alfa
amilasa/mL. Considerar la siguiente definicin de una unidad de actividad
alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de
almidn despus de 1 min de reaccin con la enzima a 20C y pH 6.9
III. INFORME:
1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentracin de maltosa y determinar
la ecuacin de la regresin lineal.
2. Calcular la actividad enzimtica en unidades de actividad enzimtica (U)
y actividad especfica (Uesp).
U =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0

t
U esp =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0

(t )[ protena ]
3. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de

reaccin.
4. Cules son los productos de esta reaccin?
5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay
diferencias.
24

1.8 Efecto de la concentracin de enzima en la actividad

enzimtica de una amilasa.
OBJETIVO
Determinar el efecto de la concentracin de enzima en la actividad denzimtica.
Preparacin del sustrato: Almidn al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0,
0.1M preparado como se indic anteriormente.
Reactivos:
Almidn 1.0 % (p/v)
Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M
Reactivo de DNS
-amilasa
1. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin
enzimtica.
Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la
solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5
min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la
prctica 1.6.
2. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de la reaccin
enzimtica.
a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6,
adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes
concentraciones.
b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa
(excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos
para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin
c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reaccin) en un bao o
termomixer a 25C.
d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y
adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
25

e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la
prctica 1.5 y 1.7.
La reaccin se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reaccin y tempertaura
constante, siendo la nica variable la concentracin de enzima .
Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentracin de la
enzima en la actividad enzimtica .
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
0.25
0.5
1.0
2.0
3.0
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
Tubo
Testigo*
Soluciones de
Amilasa
(mg/mL)
Volumen de Sol.
Sustrato
(mL)
Vol. de sol. de enzima
en PO4 pH 7.0, 0.1M
(mL)
* 3P, significa 3 tubos Problema

*Para cada concentracin de enzima se hace un testigo, para lo cual
inmediatamente despus de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo
con DNS.
Realizar el blanco con sol de almidn
Procedimiento:
A
INFORME:
1. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs concentracin de
enzima.
2. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por todos
los equipos del grupo.
26

1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica.

OBJETIVO
Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica de una
enzima: -amilasa.
enzimtica.
Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la
solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario.
prctica 1.6.
2. Efecto de la temperatura en la actividad cataltica de las enzimas.
adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de
sustrato (almidn al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada
ponindolos en un bao mara.
Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la
temperatura en la actividad enzimtica .
Tubo
Temperatura
de reaccin
(C)
Sol. de
Almidn 1.0 %
(mL)
*Sol.
de
Enzima
en
regulador PO4
pH 7.0
(mL)
Testigo*
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
Uno
por
cada
temperatura
25
35
45
55
65
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
*-Amilasa: 1.0 mg/mL

3P, significa 3 tubos Problema
27

b)
c)
d)
e)
Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa
Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5
min (tiempo de reaccin) en un bao a cada temperatura.
Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y
Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la
prctica 1.5 y 1.7.
La reaccin se llevara cabo a tiempo constante de reaccin y concentracin de

enzima constante, siendo la nica variable la temperatura de reaccin.
enzimtica.
Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a
cada solucin de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es
necesario.
prctica 1.6.
4
Efecto del pH en la actividad cataltica de las Enzimas
Reactivos:
Almidn 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH
Regulador de Acetatos pH 5.0
Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M
Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0
Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el
profesor.
adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato
(almidn al 1%).
b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa
c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5
min (tiempo de reaccin).
d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y
e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la
prctica 1.5 y 1.7.
28

Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto
del pH en la actividad enzimtica.
Tubo
Testigo*
pH
3P1
3P2
3P3
3P4
3P5
3P6
3P7
5.0
6.0
7.0
7.5
8.0
9.0
10.0
Sol. de
almidn al 1.0
% (mL)
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
Enzima +
regulador al
pH indicado
(mL)
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
3P, significa 3 tubos Problema.

* Para cada pH se hace un testigo.
Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la
concentracin de enzima.
INFORME:
1. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de
reaccin.
2. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la
reaccin.
3. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por
todos los equipos del grupo.
29

Academia de Biotecnologa.
Asignaturas:
Profesores: Luis C. Fernndez Linares, Mara del Carmen Oliver Salvador,

Determinacin de constantes cinticas, Km y V max y medicin de la actividad
enzimtica de la invertasa
El objetivo de la prctica es determinar el efecto de la concentracin del sustrato en la
velocidad las reacciones enzimticas, determinando las constantes cinticas, Km y Vmax, de
la invertasa.
Las invertasa hidroliza la unin glicosdica de la sacarosa. La sacarosa es un disacrido
compuesto de una molcula de -D-glucosa y una molcula de -D-fructosa, ligadas por un
enlace -1,4-glicosdico. Cuando este enlace es roto en una reaccin de hidrlisis, se
genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa.
Sacarosa + H2O ---> glucosa + fructosa
El nombre oficial de la invertasa es beta-fructofuranosidasa (EC3.2.1.26), lo que implica que
la reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis del grupo terminal no reductor de la
sacarosa. La invertasa es utilizada principalmente en confitera, donde la industria de
alimentos prefiere ms a la fructosa que a la sacarosa, debido a que es mucho ms dulce y
no cristaliza tan fcilmente.
La invertasa es producida por una amplia gama de microorganismos que pueden utilizar la
sacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada principalmente por
cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Incluso
dentro del mismo cultivo de levadura, la invertasa existe en ms de una forma. Por ejemplo,
la invertasa intracelular tiene un peso molecular de 135,000 Da, mientras que la variedad
extracelular tiene un peso molecular de 270,000 Da.
A diferencia de la mayora de otras enzimas, la invertasa exhibe una actividad relativamente
alta en un amplio intervalo de pH (3.5-5.5), con el ptimo cercano a pH 5.0; por otro lado la
temperatura ptima es de aproximadamente 55 C.
Parte experimental:
Preparacin de reactivos:
Sustrato: preparar sacarosa (30.0 g/L), disolver el sustrato en agua, la mitad del volumen
que se vaya a preparar y se afora con regulador de acetatos 0.05M pH 5.0. Preparar 50 mL
de sustrato.
Enzima: invertasa 0.4 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0.
Diluciones de sutrato:
Obtencin de concentraciones de sacarosa: Realizar diluciones con regulador de acetatos
0.025 M de 0 a 30 g/L
Tabla 1. Preparacin de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones

Sacarosa (30 g/L)
(mL)
0
1
3
4
5
8
10
Acetatos 0.025M
(pH 5.0)(mL)
10
9
7
6
5
2
0
Concentracin final
de sacarosa (g/L)
0.0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
Preparar 10 ml de cada concentracin por grupo, dividir las soluciones por equipos.
Procedimiento:
La prueba se realizar por triplicado con un blanco para toda la prueba y un testigo para
cada concentracin.
1. Colocar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin y de acuerdo a la tabla 2, en un
tubo eppendorfd, se deja equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
2. Agregar 0.05 mL de la enzima y agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la
reaccin durante 5 min.
Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en C
(temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el
experimento).
3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (5 min), tomar un alcuota de 0.1 mL y
transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrlisis enzimtica).
*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reaccin e inmediatamente el reactivo
de DNS
4. Los tubos se calientan a ebullicin en bao Mara durante 5 min. Se enfran en bao de
hielo, adiciona 1.0 mL de agua y se leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra un
blanco de reactivos (0.1 mL de regulador de acetatos 0.25 M pH 5.0 + 0.1 de DNS + 1 mL
de agua).
5. Tomar la lecturas de Abs (tabla 2) del mtodo de azucares reductores y determinar la
concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en laboratorio o se
proporcionar en funcin del tiempo).
6. Determinar la concentracin de protena de la solucin de invertasa por el Mtodo de
Bradford
Tabla 2. Efecto de la concentracin de la sacarosa en la velocidad de reaccin de la
invertasa.
Sacarosa
Sacarosa
Invertasa
Acetatos
Absorbancia
(g/L)
(g/L)
(0.6 mg/mL)
0.025M, pH
(540 nm)
(mL)
(mL)
5.0
(mL)
0.0
(blanco) 0.0
0
1.0
3.0
0.95
0.05
-9.0
0.95
0.05
-12.0
0.95
0.05
-15.0
0.95
0.05
-24.0
0.95
0.05
-30.0
0.95
0.05
--
Los valores de A540nm netos son: (A540nm Problema)- (A540nm Testigo) = A540nm Neto
La velocidad se determinar para cada concentracin de sustrato, sern reportadas
en mmoles o moles de producto formado / min; as mismo determinar la actividad
especfica de la enzima para concentracin de sustrato.
Determinacin de las constantes cinticas de una enzima.

La magnitud de Km y Vmax vara segn el tipo de enzima y la naturaleza del sustrato. Es
tambin una funcin de la temperatura y del pH. Se determinarn las constantes cinticas
Km y kcat de la invertasa utilizando como sustrato sacarosa con las velocidades iniciales de
las reacciones a cada concentracin de sustrato, determinadas con los datos de sus
experimentos antes descritos. El clculo de las constantes se har en forma comparativa
usando tres mtodos grficos que estn basados en las formas lineales de la ecuacin
Michaelis-Menten. Estos son:
Lineaweaver-Burk: 1/vo versus 1/[S] o
1
Km
1
1
V V max [ S ] V max
Agustinsson: [S]/vo versus [S] o
S
1
Km
S
V Vmax
Vmax
Eadie Hofstee: vo versus v/ [S] o
V Km
V
Vmax
S
Nota: Considerar la concentracin real o final de la sacarosa que se utiliza en la reaccin.
INFORME:
1. Hacer la grfica de velocidad vs concentracin de sustrato.
2. Hacer las grficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y Calcule Km y
Vmax,
3. Determinar la constantes catalticas de la invertasa para estas condiciones de
reaccin
4. Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.
Referencia.

PRCTICA 3
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS.
OBJETIVOS
1. Inmovilizar una enzima por atrapamiento en alginato.

2. Determinar la actividad enzimtica y cinticas enzimticas de la invertasa
libre e inmovilizada.
3. Determinar el rendimiento o porciento de inmovilizacin
INTRODUCCIN.
Tcnicas de inmovilizacin.
La inmovilizacin se define como el proceso por el cual el movimiento en el
espacio de las clulas, enzimas, orgnulos, etc. se ve restringido total o
parcialmente por medio de un soporte o una matriz. En la industria se usan
frecuentemente enzimas o clulas inmovilizadas debido a que stas se pueden
rehusar o usar en procesos continuos.
Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima;
2. La reutilizacin de la enzima, por lo que disminuyen los costos del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control,
adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:
1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo.
2. No hay heterogeneidad en la distribucin de la enzima en el soporte.
3. Prdida de actividad de la enzima inmovilizada.
4. Mayor costo en relacin a la enzima libre.
En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes
categoras: Retencin fsica y Unin qumica.
Mtodos de inmovilizacin de enzimas por retencin fsica

Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros entrucruzables
o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la
suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se
inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de
un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen
1

ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada
en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se
encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El
atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin,
as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera
los grupos reactivos de la protena.
Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos:
Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y
producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser
permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes
(generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las
microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos
entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular
simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas,
permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en
mltiples pasos
Reactores de membrana: Estos reactores emplean membranas permeables al
producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a
la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que
atraviesa el reactor.
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA
Unin a soportes
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de
una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan
determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe
procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya
la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia
mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente
separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado
una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de
numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad
y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden
clasificarse en dos grandes grupos:
1. Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de
soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez,
slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao
de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.)

2. Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:

Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa, almidn,
dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc) protenas
fibrosas (colgeno, queratina, etc).
Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno) Polmeros
acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc).
Adsorcin
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno.
Unin covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de
inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos
del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los
20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas,
los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son
principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida
la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico.
Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha
sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas (7). El
mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan
uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos
bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos,
sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida.
El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas
Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden
clasificar en:
1. Aplicaciones analticas: biosensores
2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y
de tratamiento de residuos.

MATERIAL Y EQUIPO.
Materiales:
Agitadores magnticos
Coladores de acero inoxidable
Cristalizador
Esptula
Matraces Erlenmeyer
Vasos de precipitados
Agitador magntico
Jeringa desechable de 20 mL
Equipos:
Balanza
Espectrofotmetro
Potencimetro
Vrtex
Soporte universal
Parrilla
Seccin experimental.
Inmovilizacin de enzimas por atrapamiento con alginato de sodio.
Soluciones (Preparar soluciones por grupo):
1) 5 mL de solucin de invertasa de levadura (X mg/mL) en amortiguador de
acetatos 0.025M pH 5.0
2) 15 mL de alginato de sodio al 2% (p/v) en amortiguador de acetatos 0.025M
pH 5.0
3) 100 mL Cloruro de calcio 1.0%
4) 20 mL Citrato de sodio 0.5 M o fosfato de sodio sodio monobsico 0.5 M
5) Sacarosa al 3% en amortiguador de acetatos 0.025M pH 5.0
Parte experimental
Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en
condiciones de esterilidad).
1. En un vaso de precipitado de 50 ml mezclar 5 mL de enzima concentrada
con 15 mL de sol. de alginato 2% que se encuentre a 40 C. Agita la mezcla
alginato-enzima para homogenizar y lograr una temperatura homognea, de
unos 40C.
2. Montar un sistema de inmovilizacin (Fig.1), que tenga con una jeringa con
aguja con punta roma (sujeta al soporte universal para mantener la altura, entre
la aguja y la sol de CaCl2, constante) y un vaso con solucin de CaCl2, 1%; a
temperatura ambiente; con agitacin constante y suave, por medio de una
barra magntica.
3. Llenar la jeringa (quitar la aguja y succionar la solucin alginato-enzima
tirando del mbolo y poner de nuevo la aguja), fijarla al sistema, a un
centmetro de distancia del CaCl2, e ir descendiendo, de forma constante, el
embolo para obtener gotas homogneas, las cuales se irn depositando en la
solucin e CaCl2. Contar el nmero de perlas de alginato formadas por cada
mL y sacar un promedio final.
4

El goteo debe realizarse a la altura precisa (alrededor de 1cm), de lo contrario se

formar lentejas al golpear con la superficie lquida (con un goteo desde una
distancia mayor) o se formarn esferas con una protuberancia (con un goteo desde una
distancia muy corta que no permita que se logre la esfericidad)
5. Dejar estabilizar el gel durante 20 min, sin agitacin y a temperatura
ambiente.
6. Pasar las perlas y un poco de CaCl2 a un tubo falcon, etiquetar y conservar
en refrigeracin.
Figura 1. Sistema para inmovilizacin de enzimas por atrapamiento.
NOTA IMPORTANTE. Se debe contar con la suficiente enzima libre e
inmovilizada para realizar esta prctica y la prctica 4: Determinacin de Vmax

y Km de una enzima libre e inmovilizada.
Liberacin de la enzima del soporte de inmovilizacin, para determinar
concentracin de la misma.
Tomando en consideracin la cantidad de esferas que se obtuvieron por mL, se
toma ese nmero de esferas, entre 50 y 60 esferas que correspondan al
mililitro. Se homogenizan las esferas en 4 mL de una solucin de citrato de
sodio 0.5 M, durante 1 min con ayuda de un agitador vrtex (Durn, 1997). A la
solucin resultante se le determinar protena por Bradfor, realizar el blanco
con la solucin que se utiliz para disolver las esferas de alginato. (Si en la
5

determinacin de Bradford se solidifica el alginato se puede retirar cuidadosamente

con una aguja).
NOTA: Se requiere conocer la actividad (y la concentracin de protena) de la
solucin enzimtica, por lo que se necesita preparar una cantidad extra.
Se debe de la concentracin de protena de la solucin de cloruro de calcio, para
poder saber la cantidad de enzima que no qued inmovilizada por diferencia.
Posteriormente, se debe determinar la Actividad enzimtica y Actividad

enzimtica especfica y constantes cinticas, de la enzima libre e inmovilizada
(prctica 2) y comparar los resultados de enzima libre y enzima inmovilizada.
Consideracin: Esta segunda parte, que es inicio de la Prctica 4, puede dejarse
pendiente, si no es posible realizarlo en las 3 horas que dura la sesin.
Determinacin de Actividad enzimtica y constantes cinticas (tiempo cero

de estabilidad, parte inicial de la prctica 4):
Actividad enzimtica de la invertasa libre con sacarosa al 3.0 %, a temperatura
Ambiente, tiempo 5 min, por triplicado y testigos. (0.05 mL de enzima + 0.95 mL de
solucin de sacarosa)
Actividad enzimtica de la invertasa inmovilizada sacarosa al 3.0 %, a
temperatura ambiente, tiempo 5 min, Para la enzima inmovilizada seguir el mismo
protocolo de la libre y sustituir los 0.05 mL de enzima por lo equivalente en nmero
de perlas (de acuerdo a los resultados de nmero de perlas formadas por mL).
Determinar la concentracin de protena, por el mtodo de Bradford y por
triplicado. de:
a) invertasa libre,
b) enzima inmovilizada (la enzima liberada) y
c) de la solucin de cloruro de calcio residual,
Usar como blanco buffer, sol de citratos y sol. de cloruro de calcio,
respectivamente
Guardar la enzima libre e inmovilizada en refrigeracin, con stas se determinar
nuevamente la actividad a diferentes tiempos, y se compararn los tiempos el
inicial (primera sesin) y los otros tiempos, para determinar el efecto de la
inmovilizacin en la estabilidad de la enzima (Prctica 4).
Procedimiento para determinar la actividad enzimtica y constantes
cinticas:
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.

Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e

inmovilizada (nmero de perlas necesarias para igualar la concentracin de
invertasa libre)
Diluciones de sustrato:
Sacarosa (30 g/L) Acetatos 0.025 M, Concentracin de sacarosa

(mL)
pH 5.0 (mL)
(g/L)
0
1
3
4
5
8
10
10
9
7
6
5
2
0
0.0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
La prueba se realizar por triplicado con un blanco y un testigo para cada

concentracin de sustrato.
1. Colocar en 4 tubos eppendorf el nmero de perlas correspondiente a 0.05mL

de enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un
blanco por concentracin de sustrato (Tabla 1).
2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin (tabla 1), agitar el
tubo para homogenizar y dejar proceder la reaccin durante 5 min. Excepto el
testigo que es tiempo cero.
Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura
de en C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al
momento de realizar el experimento).
3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (0 o 5 min), tomar un
alcuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para
detener la hidrlisis enzimtica).
*testigo se adiciona la enzima e inmediatamente se transfiere 0.1 mL al reactivo de
DNS
4. Los tubos sellados con pelcula plstica, se calientan a ebullicin en bao

Mara durante 5 min. Se enfran en bao de hielo, y posteriormente de adiciona
1.0 mL de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se
leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra cada blanco (solucin de
sacarosa en buffer de acetatos)

5. Tomar las lecturas de Abs del mtodo de azcares reductores y determinar

la concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en
laboratorio o se proporcionar en funcin del tiempo).
Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes
tiempos con grficos y cuadros adecuados.
Informe:
1) Calcular la actividad enzimtica de la enzima libre y de la enzima inmovilizada

en el da 1.
2) Determinar el % de inmovilizacin de la enzima (la enzima que no se inmoviliza
se queda en la solucin de cloruro de potasio).
3) Determinar la estabilidad de la enzima libre e inmovilizada a los dos tiempos en
das.
4) Calcular las constantes cinticas de la enzima libre e inmovilizada.
5) Incluir en el informe una Introduccin, el fundamento y el objetivo de esta
prctica.
6) Comparar los parmetros cinticos de la enzima inmovilizada contra la

libre.

PRCTICA 4
Estabilidad de una enzima inmovilizada y libre, determinacin de
Vmax y Km.
OBJETIVOS
1. Establecer el efecto de la inmovilizacin en la estabilidad de una enzima.
2. Determinar el efecto de la inmovilizacin en la constante de MichaelisMenten (Km) y la velocidad mxima (Vmax.) y su relacin con la
estabilidad.
INTRODUCCIN
La inmovilizacin puede altera significativamente el comportamiento de las
enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo
lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los
componentes que intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos,
inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio
de reaccin y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Como
consecuencia, la actividad enzimtica se ve afectada por efectos de tipo difusional,
estrico y del microentorno.
Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus
de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones:
1. Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de
uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima
adquiere mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o
qumica. Este tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos
en los que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a
soportes activados. La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar
con la adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de
la enzima.
2. Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de
proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autolisis.
3. Se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima
retenidas en una determinada regin del espacio.
4. Existe una alteracin del microentorno del enzima debida a la interaccin de la
enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxgeno (como las
nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado,
la fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como
consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa
1

zona que en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto
tampn o buffer de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH.
Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en
presencia de disolventes orgnicos, la hidrofilia del soporte o su capacidad para
retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del
soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en
su microentorno para mantener su conformacin activa.
Efectos en la actividad enzimtica
Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede
ser debido a que:
1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al sitio
activo est impedido,
2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que
forme parte del sitio activo o que sea esencial para la actividad cataltica de
la enzima,
3. La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a
una forma inactiva, las condiciones experimentales del proceso causan la
desnaturalizacin de la enzima.
Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios
(disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a
efectos difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno.
1) Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los
sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por
resistencias de tipo externo e interno.
a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio
de reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria
(capa de Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las proximidades
de un soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el
resto de la disolucin, puesto que existe un gradiente de concentracin a
travs de la zona de difusin. Por tanto, los valores de km para las enzimas
inmovilizadas son siempre aparentes (km);
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que
atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se
encuentra la enzima inmovilizada.
2) Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si
tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son
opuestas hay atraccin. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el
valor de km aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del
obtenido en disolucin.

3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier
enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su
actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo
peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la
actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo,
muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son
muy activas frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia
protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto estrico se puede evitar
mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzimasoporte ms largo
4) Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno
diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados
elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del
pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el
intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida
a un soporte cargado negativamente tendr en su microentorno una concentracin
mayor de iones hidrgeno que en el medio de reaccin. Como resultado, la
enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms
activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente.
MATERIALES
Materiales:
o Esptulas de acero inoxidable.
o Matraces Erlenmeyer.
o Flotadores
o Gradillas para microtubos
o Termmetro
o Tubos eppendorf 1.5 mL
Equipos:
o Espectrofotmetro.
o Refrigerador comercial.
o Vrtex.
o Parrillas con agitacin
o Pipetas de 100, 200 y 1000 L
PARTE EXPERIMENTAL:
Se realizar en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la prctica 3, en al cual
se inmoviliz y se conserv la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima
inmovilizada.
Determinacin de Actividad enzimtica y constantes cinticas:
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.
Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada
(nmero de perlas necesarias para igualar la concentracin de invertasa libre)

Diluciones de sustrato:
Sacarosa (30 g/L)

Acetatos 0.025 M, Concentracin de sacarosa
(mL)
pH 5.0 (mL)
(g/L)
1
3
4
5
8
10
9
7
6
5
2
0
3.0
9.0
12.0
15.0
24.0
30.0
La prueba se realizar por triplicado con un blanco y un testigo para cada

concentracin de sustrato.
1. Colocar en 4 tubos eppendorf el nmero de perlas correspondiente a 0.05mL de

enzima libre y en otros 4 tubos eppendorf, 0.05 mL de enzima libre, y un blanco
por concentracin de sustrato (Tabla 1).
2. Agregar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin (tabla 1), agitar el tubo
para homogenizar y dejar proceder la reaccin durante 5 min. Excepto el testigo
que es tiempo cero.
Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de
en C (temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al
momento de realizar el experimento).
3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (0 o 5 min), tomar un
alcuota de 0.1 mL y transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para
detener la hidrlisis enzimtica).
*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reaccin e inmediatamente
el reactivo de DNS
4. Los tubos sellados con pelcula plstica, se calientan a ebullicin en bao Mara
durante 5 min. Se enfran en bao de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL
de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a
540 nm en un espectrofotmetro, contra cada blanco (solucin de sacarosa en
buffer de acetatos)
5. Tomar las lecturas de Abs del mtodo de azcares reductores y determinar la
concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en
laboratorio o se proporcionar en funcin del tiempo).
Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes
tiempos con grficos y cuadros adecuados.

ANLISIS DE RESULTADOS
a) Calcular la actividad enzimtica de la enzima libre y de la enzima
inmovilizada en el da 2 y 10.
b) Determinar los parmetros cinticos de la enzima inmovilizada y la enzima
libre dos y diez das despus de la inmovilizacin.
c) Determinar la actividad enzimtica de la enzima inmovilizada contra la libre
dos y diez das despus de la inmovilizacin
d) Comparar los parmetros cinticos y actividad enzimtica de la enzima
inmovilizada contra la libre el primer da (practica 3), a las 48 horas y a los
10 das.
5. Adiestramiento en la operacin de un biorreactor de laboratorio.

5.1 Manejo de un biorreactor
5.2 Preparacin y esterilizacin de medio de cultivo en el biorreactor.
5.3 Preparacin de de Inculo e inoculacin del medio en biorreactor.
5.1. Manejo de un Biorreactor

OBJETIVO.
Adquirir los conocimientos prcticos para reconocer las partes de un biorreactor de
laboratorio, las funciones de cada parte constituyente del biorreactor, as como el
montaje de stas y el funcionamiento del biorreactor y su mdulo de control.
MARCO TERICO.
1) CLASIFICACIN DE LOS BIORREACTORES.
La mayora de las compaas industriales de fermentacin tienen al menos una
seccin dedicada a los laboratorios de fermentacin, los cuales usan para
investigacin pura de nuevos productos, seleccin de nuevos cultivos de
fermentacin, desarrollo de nuevas materias primas, condiciones de proceso y
escalamiento, por ejemplo: en la industria farmacutica se aplica para el desarrollo
de nuevos antibiticos. En la industria de la cervecera y de los alimentos donde
continuamente se desarrollan sustitutos de protena.
En estas reas de investigacin y desarrollo el tipo de biorreactor puede variar
desde un matraz de 10 0mL, hasta un fermentador de acero inoxidable de 100
litros (L). En un rea grande de desarrollo se pueden encontrar varios tamaos de
biorreactores, desde uno de 5 L. pasando por uno de escala de entre 20 y 50 L, y
finalmente uno de escala piloto que podra ser de 100 a 1000 L. El nmero de
biorreactores generalmente lo rigen los costos y la disponibilidad de mano de obra.
Un biorreactor es un contenedor fsico en donde se efectan reacciones biolgicas
catalizadas por microorganismos o partes de ellos. Las fronteras del biorreactor
estn bien delimitadas. El biorreactor cuenta con espacios fsicos que permiten por
una parte controlar las condiciones de reaccin y por otra parte el monitoreo de la
reaccin biolgica por medio de electrodos especiales.
Los nombres que se le han adjudicado a los biorreactores de laboratorio son
variables a saber: biorreactores de mesa, propiamente de laboratorio, los
biorreactores de planta piloto y los biorreactores industriales.
Una definicin aceptable de los tipos anteriores de biorreactores podra quedar
como sigue:
Biorreactores de Mesa o Bench-Top (Biorreactores de laboratorio): Poseen

volmenes de trabajo de 0.5 a 10 L, el vaso puede ser de acero inoxidable, vidrio
o una combinacin de ambos y no son esterilizables in situ, su esterilizacin
requiere la introduccin del biorreactor dentro de una autoclave.
Biorreactores de planta piloto: Su desarrollo ha permitido encontrar formas
sofisticadas capaces de esterilizarse en diferentes tipos de fermentacin; los
cuales incluyen biorreactores de tanque agitado, air-lift, tipo torre, de cama
fluidificada y de disco rotario. Por lo general el material utilizado en su
construccin es el acero inoxidable. Los volmenes utilizados varan de 15 hasta
100 L
Biorreactores industriales: Se construyen invariablemente con acero inoxidable. El
volumen del biorreactor puede variar de 150 hasta 10000 L. Los biorreactores
industriales se esterilizan forzosamente in situ.
2) VARIABLES DE CONTROL EN BIORREACTORES.
Por lo general, cualquier tipo de biorreactor posee caractersticas de diseo que
permiten, por medio de un mdulo de control y electrodos, controlar al menos seis
variables bsicas que definen el medio ambiente en donde los microorganismos
se desarrollan, stas son: la agitacin, la temperatura, el pH del cultivo, la
aireacin del medio, la concentracin de oxgeno disuelto, y el nivel de espuma
existente en el biorreactor.
2.1) Agitacin.
La agitacin del medio de cultivo permite mantener condiciones homogneas
dentro del biorreactor. La agitacin se realiza, por lo general, por medio de un
motor acoplado a un eje que contiene impulsores de diversos tipos (de paleta tipo
Rushton, turbina hlice marina, etc.) Los impulsores definirn el patrn de flujo y la
hidrodinmica que existir en el reactor. La eleccin del tipo de impulsor depende
de la reologa del cultivo y del tipo de microorganismo que se utiliza en la
fermentacin teniendo especial cuidado en no daar a las clulas que se estn
cultivando. La agitacin vigorosa en un biorreactor provoca la creacin de un
vrtice que no permite una completa homogenizacin del medio de cultivo; as los
biorreactores cuentan con bafles que impiden la formacin del vrtice.
Los reactores tipo air-liftson agitados mediante la inyeccin de aire; el flujo de
aire permite una adecuada agitacin y aumenta la transferencia de oxgeno al
medio de cultivo.
2.2) Temperatura
La temperatura representa una variable importante de control de una
fermentacin. La temperatura afecta el crecimiento microbiano de manera notable,
debido a que los microorganismos de una especie determinada slo pueden
2
crecer en un rango restringido de temperaturas. As los microorganismos se

pueden clasificar en funcin de la temperatura de crecimiento: los
microorganismos psicrfilos presentan un rango de temperatura de crecimiento de
5 a 15C; los mesfilos de 25 a 40C y los termfilos de 45 a 60 C, sin mebargo
se han reportado casos de crecimiento de hasta 94C.
Para el control de la temperatura en los biorreactores, stos a menudo cuentan
con chaquetas por donde fluye agua fra o caliente y que funcionan como
intercambiadores de calor. Tambin los biorreactores cuentan con termopares
adaptados al cuerpo del biorreactor que de forma continua determina la
temperatura del cultivo, con la ayuda del mdulo de control. As, continuamente el
mdulo de control determina si hay que aumentar o disminuir la temperatura del
cultivo de acuerdo a un valor de temperatura de fermentacin preestablecido.
2.3) pH
El pH de una fermentacin expresa la concentracin de iones hidrgeno presentes
en el medio de cultivo. Al igual que la temperatura de fermentacin, el pH
determina de forma importante la velocidad de crecimiento de los
microorganismos y el rendimiento de bioconversin. El pH de crecimiento para una
especie de microorganismo representa generalmente un mximo denominado pH
ptimo. Debido a que durante las bioconversiones que se presentan, causadas por
el desarrollo microbiano, el pH del medio de cultivo vara continuamente durante el
transcurso de una fermentacin. As, es necesario compensar dichas variaciones
del pH mediante la adicin de soluciones cidas o bsicas que permiten mantener
un pH ptimo de crecimiento. Para ello, es necesario contar con un electrodo de
pH adaptado al biorreactor que provea continamente de lecturas instantneas de
la concentracin de iones hidrgeno en el medio de cultivo. Los electrodos de pH
utilizados en los biorreactores deben soportar temperaturas de esterilizacin ya
que stos deben estar sumergidos dentro del caldo de fermentacin.
2.4) Oxigenacin o aireacin.
El oxgeno merece especial mencin pues su ausencia o abundancia permite una
seleccin tanto de microorganismos como de productos del metabolismo. Cuando
el cultivo se produce en presencia de oxgeno molecular la fermentacin se
denomina aerbica, y cuando ste carece de oxgeno la fermentacin se
denomina anaerbica. La mayora de los cultivos microbianos son de tipo aerbico
por lo que es necesario proveer oxgeno al cultivo. Para ello, se inyecta aire u
oxgeno de forma estril al medio o caldo de cultivo por medio de un compresor. El
aire es inyectado desde la parte inferior del biorreactor, justo debajo de los
impulsores y distribuido en forma de burbujas con la ayuda de un difusor.
Las burbujas son fracturadas por los impulsores en burbujas ms pequeas, lo
que provoca el aumento del rea superficial de las burbujas; as la transferencia
de oxgeno resulta efectiva.
Para la determinacin de la concentracin de oxgeno disuelto en el caldo de

cultivo se utilizan electrodos galvanomtricos y polarogrficos que permiten
realizar lecturas de forma continua. Los impulsos elctricos generados por el
electrodo son convertidos en el mdulo de control del biorreactor en lecturas de
porcentaje de oxgeno disuelto. El mismo mdulo de control del biorreactor puede
justamente controlar la cantidad de oxgeno disuelto en el medio de cultivo por
medio de la inyeccin de aire u oxgeno o en su caso de nitrgeno gaseoso, todo
ello con la ayuda de un conjunto de electro-vlvulas. La adicin de nitrgeno
gaseoso al medio de cultivo permite disminuir la concentracin de oxgeno disuelto
ya que el nitrgeno desplaza al oxgeno disuelto. As con base a una
concentracin de oxgeno disuelto predeterminada, el mdulo de control puede
ajustar la inyeccin de aire o de nitrgeno.
2.5) Nivel de espuma
La mayora de los medio de cultivo utilizados para el crecimiento de
microorganismos contienen protenas y pptidos que promueven la formacin de
espuma. La agitacin vigorosa del medio de cultivo y la inyeccin de aire al
biorreactor provocan an ms la formacin de grandes cantidades de espuma;
sta puede incluso ser tan importante que puede ocupar todo el espacio vaco del
biorreactor (espacio de cabeza) y hasta salir por cualquier orificio de entrada de
flujo al biorreactor que no sta siendo empleado. La formacin de espuma en el
biorreactor conlleva el incremento del riesgo de contaminacin de la fermentacin.
Por ello es necesario controlar el nivel de espuma formada dentro del biorreactor.
Para ello se emplea un electrodo instalado dentro del biorreactor cuya altura, con
respecto al nivel del lquido, puede ser modulada para permitir solo una pequea
capa superficial de espuma. El electrodo est conectado al mdulo de control del
biorreactor por donde transita una corriente elctrica. La espuma al aumentar su
nivel y ponerse en contacto con el electrodo cierra un circuito elctrico, lo que
provoca la accin de una bomba peristltica que inyecta antiespumante al
biorreactor. Los antiespumantes algunos de origen mineral, tienen una rpida
accin contra la espuma presente, cortndola de forma inmediata.
Por otra parte, la formacin de espuma dentro del biorreactor promueve la
adhesin de microorganismos sobre las paredes del biorreactor, lo que provoca
que el cultivo microbiano pierda su homogeneidad. Por ello es imperioso evitar la
formacin de espuma dentro del biorreactor y en su caso controlar el nivel de sta.
EQUIPO.
-Biorreactor de laboratorio con su mdulo de control, partes y electrodos
(ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra
de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3 litros).
DESARROLLO EXPERIMENTAL.
a) El profesor describir y mencionar los nombres de las partes que
constituyen el biorreactor y explicar las funciones de cada una de ellas.
b) El profesor explicar el funcionamiento del mdulo de control del

biorreactor.
c) El profesor desmontar todas las partes del Biorreactor indicando las
medidas de cuidado que deber tenerse al manipular el biorreactor y sus
partes.
d) Los estudiantes tendrn que armar de nuevo el biorreactor y sus partes.
REPORTE DE RESULTADOS.
1. Elaborar un diagrama del biorreactor utilizado en la prctica sealando y
nombrando cada una de las partes que constituyen el equipo.
2. Describir las funciones de cada una de las partes que constituyen el
biorreactor.
3. Describir las variables fsicas y qumicas que se controlan en el biorreactor
y que definen el medio ambiente en donde se desarrollan los
microorganismos.
4. Describir as funciones del mdulo de control del biorreactor.
BIBLIOGRAFA.
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
Lydersen, B.K. , Delia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering Systems,
equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York, 805p.
Schgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features of
bioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.
5.2 Preparacin y esterilizacin de medio de cultivo y biorreactor

OBJETIVO.
Adquirir conocimientos prcticos relacionados con el proceso de esterilizacin de
medio de cultivo contenido en un biorreactor.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1. Formulacin de un medio de cultivo para el crecimiento de
microorganismos.
2. Conocimiento de una autoclave de laboratorio y su funcionamiento.
3. Monitoreo del proceso de esterilizacin por calor hmedo
4. Determinacin cualitativa de la eficacia del proceso de esterilizacin por
calor hmedo.
MARCO TERICO
La fermentacin en general se debe llevar a cabo en un medio ambiente
controlado, independientemente de que el propsito sea de investigacin
acadmica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe garantizarse
el crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtencin del producto
deseado libre de contaminantes. De ah que la esterilizacin sea una parte del
proceso de fermentacin que permite alcanzar este objetivo.
Si se tiene que llevar a cabo una fermentacin usando un microorganismo definido
para un producto o conjunto de productos, la invasin por microorganismos
contaminantes afectar adversamente de una u otra manera la produccin. As el
contaminante competir con el microorganismo deseado por los nutrientes
afectando finalmente el rendimiento. Los microorganismos contaminantes pueden
incluso degradarlo en pasos subsecuentes. Por otro lado la contaminacin
microbiana, sobre todo por bacilos y cocos afectar negativamente la recuperacin
y purificacin del producto final, sobre todo en las operaciones de filtrado y
ultrafiltrado. Por lo tanto, la contaminacin debe evitarse, lo cual se logra:
Usando un cultivo puro, esterilizando el biorreactor y el medio de cultivo, as como
los recipientes adicionales y todo material y superficie que est en contacto con el
cultivo o el medio de cultivo. Se deben as mantener condiciones aspticas
durante toda la fermentacin.
La esterilizacin y el mantenimiento de las condiciones aspticas a veces

conducen a la prdida o degradacin de los cultivos. El diseo del procedimiento
de esterilizacin depende de:
1. La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes
adicionales utilizados en la fermentacin.
2. El tamao y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el material
de construccin de stos.
3. Los servicios generales disponibles en el laboratorio.
4. Si los recipientes a ser esterilizados estn vacos o contienen medio de
cultivo u otras soluciones.
a) CRITERIOS PARA LA ESTERILIZACIN.
Es importante y an vital evitar la contaminacin de un sistema de fermentacin.
Sin embargo, en general, las medidas utilizadas son mas bien necesarias que
severas, con el fin de evitar dao al medio de cultivo y reducir los costos, por lo
tanto, el procedimiento de esterilizacin adoptado y el grado de remocin del
contaminante necesita ser relacionado a la naturaleza de la fermentacin y su
propsito.
As en trabajos de escala menor como el tratamiento de desechos, durante la
oxidacin de lodos activados, se utilizan microorganismos presentes en forma
natural. El equipo para dicho proceso probablemente no necesita ser esterilizado,
excepto, tal vez, los recipientes y lneas que albergan los nutrientes.
Algunas fermentaciones en donde interviene un nico microorganismo se
describen como protegidas ya sea porque el medio de cultivo permitir solamente
el crecimiento de un rango limitado de microorganismos (ejemplo: medio de cultivo
basado en un solo hidrocarburo), o microorganismos que producen un medio
ambiente hostil que inhibe el desarrollo de otros organismos (ejemplo: etanol
producido por levaduras). En tales casos, el rgimen empleado deber ser no tan
estricto, lo cual implica solo la limpieza de recipientes y lneas y el uso de
desinfectantes y/o hirviendo o pasteurizando el medio de cultivo, lo cual destruye
la mayoria de microorganismos no esporulados aunque no a todas las esporas
eventualmente presentes.
Sin embargo la mayora de las fermentaciones en el laboratorio consideran
fermentaciones de cultivo no protegidos, en cuyo caso, esencialmente todos los
contaminantes microbianos deben excluirse.
El caso ideal de la remocin total de microorganismos contaminantes est sin
embargo lejos de alcanzarse. Por lo tanto, el criterio de probabilidad de
contaminacin es frecuentemente utilizado como objetivo ms prctico.
Una probabilidad comnmente aceptada en fermentaciones industriales es de
1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen despus de
la esterilizacin. Se pueden imponer mayor o menores criterios estrictos
7
dependiendo de la consecuencia de una falla. Un ejemplo es la de enlatado de

alimentos, donde el criterio de esterilizacin se apoya en la tpica probabilidad de
sobrevivencia de 1x10-12 de esporas de Clostridium botulinum. Un criterio
semejante aplicado a la fermentacin se aplica para el caso de patgenos
peligrosos o ciertos productos peligrosos involucrados en tecnologa del DNA
recombinante.
La seleccin del mtodo de esterilizacin y el rgimen a usarse debe por lo tanto
ser hecho a la luz de un criterio apropiado de esterilizacin.
b) MTODOS DE ESTERILIZACIN
1.
2.
3.
4.
5.
Calor hmedo
Calor seco
Filtracin
Compuestos qumicos
Radiacin
El mtodo de esterilizacin ms comn para recipientes es el de calor hmedo.

Los factores importantes a considerar en determinar el mtodo mas adecuado de
esterilizacin son: La naturaleza del organismo empleado, la fermentacin y el
nivel de seguridad requerido.
MATERIALES, EQUIPO Y MTODO
a) Materiales
-Cajas de Petri
-Tubos de ensayo
-Vasos de precipitado de diferentes volmenes
-Barras magnticas para agitacin (mosca)
-Guantes de asbesto
-Solucin de Cloruro de Sodio al 0.09%
-Pipetas de 1 y 10 mL
-Pipetas automticas de 1 y 10 mL
-Portaobjetos y cubreobjetos.
-Medio de cultivo (ver anerxo)
b) Equipo
-Biorreactor de laboratorio (ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific
modelo Bioflo II de jarra de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3
litros).
- Balanza analtica
-Incubadora con control de temperatura
-Autoclave elctrica de 50 L de volumen
-Campana de flujo laminar vertical
-Microscopio ptico
8
-Agitador y Vortex
-Placa de agitacin magntica
-Contador de Colonias
C) Mtodo
a) Verificar que la autoclave elctrica contenga agua hasta el nivel marcado por
el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).
b) El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave. Verificar que
la salida de aire del biorreactor est abierta, de lo contrario se corre el riesgo
de que el biorreactor o alguna de sus partes se rompan durante el proceso
de esterilizacin.
c) Cerrar la puerta de la autoclave
d) Encender la autoclave para provocar la generacin de vapor.
e) verificar que la salida de aire de la autoclave se encuentre totalmente abierta,
de esta forma, el aire contenido en la autoclave ser excluido por el vapor
que se genera.
f) Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por la vlvula
de salida de la autoclave, es posible cerrar sta.
g) Esperar que la presin dentro de la autoclave sea de 1.5Kg/cm 2 (indicado por
el medidor de presin)y que a la vez la temperatura sea de 121C (indicado
por el medidor de temperatura).
h) Una vez alcanzadas las condiciones de esterilizacin (1.5 kg/cm 2 y 121 C)
mantenerlas durante 15 minutos, por medio del apagado y encendido de la
autoclave.
i) Posterior al proceso de esterilizacin, esperar a que la presin y la temperatura
de la autoclave disminuyan.
j) Una vez que el medidor de presin indique una presin de 0.1Kg/cm 2 abrir
lentamente la vlvula de salida y dejar escapar el vapor que an no se ha
condensado. Evitar que la presin caiga por debajo de cero (Bajo vaco), ya
que ello provoca riesgos de contaminacin del material ya esterilizado.
k) Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar el
biorreactor esterilizado. Dejar enfriar el biorreactor hasta temperatura
ambiente antes de utilizarlo.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Preparacin del medio de cultivo (clado nutritivo 2L) para el biorreactor.
b) Preparar 14 cajas de Petri conteniendo Agar nutritivo slido
c) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo.
d) Esterilizar el biorreactor en la autoclave durante 15 min. A 120C, de acuerdo
al mtodo de esterilizacin por calor hmedo descrito en el apartado de
Materiales equipo y mtodos.
e) Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar.
f) Aspticamente tomar una muestra de 1 mL del medio de cultivo esterilizado
y realizar diluciones hasta un factor de 10-3, Sembrar por extensin en placa
y duplicado en cajas de petri conteniendo agar nutritivo slido con las

diluciones 10-1 a 10-3
g) Realizar una preparacin en fresco del medio de cultivo esterilizado y
observarlo al microscopio visible.
h) Incubar las placas durante 24 -48 h a 37C
BIBLIOGRAFA
-Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
-Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
-Quintero Ramrez, R. Ingeniera Bioqumica, teora y aplicaciones, Alambra
mexicana, 1981, Mxico, 332p.
5.3.
Preparacin de de Inculo e inoculacin del medio en biorreactor.
Preparacin del inculo

Para la preparacin del inculo, se puede partir de un cultivo en tubo o en placa, o
tambin podra ser de un preinoculo o precultivo lquido de la cepa deseada. En el
caso de levaduras puede ser de alguna presentacin comercial como pasta o
polvo. Se toma una asada del cultivo y se transfiere a 100 mL de medio de cultivo
nuevo y estril, que se encuentra e un matraz de 250 mL. Se incuba a 30C
durante 18 h a 120 rpm.
Inoculacin del Biorreactor.

Antes de inocular el medio cultivo (ya estril), se toman 5 mL del medio del
biorreactor; para control de esterilidad; observando al microscopio y por cuenta en
placa.
Posteriormente se adiciona el inculo (100 mL) en el biorrecator, cuidando las
condiciones de esterilidad.
10
ANEXO
Medio de Cultivo para Levaduras
Glucosa
Extracto de levadura
KH2PO4
(NH4)2SO4
.
MgSO4 7H2O
pH
g/L
50
1
5
2
0.4
Ajustar a 5
Medio slido para preservacin de levaduras.
Glucosa
Agar agar
g/L
20
10
20
11

PRCTICA 6
PRODUCCIN DE UNA ENZIMA EN UN BIORREACTOR DE
LABORATORIO CON CLULAS LIBRES
La prctica se divide en dos secciones, la preparacin del medio y la

esterilizacin del biorrecator con el medio, 6.1; y el segundo, el seguimiento
del cultivo y de la produccin de enzima por Saccharomyces cerevisiae, 6.2.
6.1 Preparacin y esterilizacin de Medio de Cultivo en el

Biorreactor.
OBJETIVO GENERAL
Adquirir conocimientos prcticos para establecer un birreactor con medio de
cultivo para un bioporoceso.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1.
2.
3.
4.
Formular un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos.

Conocer el funcionamiento de una autoclave.
Esterilizar el biorrector y medio por calor hmedo.
Determinar cualitativamente la eficacia del proceso de esterilizacin por
calor hmedo.
5. Conocer la manera de preparar el inculo para una fermentacin.
6. Conocer la manera de inocular un biorreactor de laboratorio.
MARCO TERICO
Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones
adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en las fermentaciones por lo
que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

Esterilizacin de Medios de Cultivo

Una fermentacin se debe llevar a cabo, en general, en un medio ambiente
controlado, independientemente de que el propsito sea de investigacin
acadmica, desarrollo de producto o proceso. Esto implica que debe
garantizarse el crecimiento del microorganismo, microorganismos u obtencin
del producto deseado libre de contaminacin biolgica. De ah que la
esterilizacin sea una parte del proceso de fermentacin que permite alcanzar
este objetivo.
La esterilizacin y el mantenimiento de las condiciones aspticas a veces
conducen a la prdida o degradacin de los nutrientes de los cultivos. El
diseo del procedimiento de esterilizacin depende de:
a) La naturaleza del medio de cultivo y el contenido de los recipientes
adicionales utilizados en la fermentacin.
b) El tamao y tipo de biorreactor, de los recipientes adicionales y el
material de construccin de stos.
c) Los servicios generales disponibles en el laboratorio.
d) Si los recipientes a ser esterilizados estn vacos o contienen medio
de cultivo u otras soluciones.
e) De la carga microbiana del medio.
Criterios para la Esterilizacin
Una probabilidad comnmente aceptada en fermentaciones industriales es de
1x10-3; esto es la probabilidad de que 1 en 1000 lotes se contaminen despus
de la esterilizacin. Se pueden imponer criterios ms estrictos, dependiendo
de la consecuencia de una falla o el riesgo que se quiera asumir. Un ejemplo
es la de enlatado de alimentos, donde el criterio de esterilizacin se apoya en
la tpica probabilidad de sobrevivencia de 1x10 -12 de esporas de Clostridium
botulinum. Un criterio semejante aplicado a la fermentacin se aplica para el
caso de patgenos o microorganismos genticamente modificados. La
determinacin de bacterias viables es un mtodo sensible para determinar el
nmero de bacterias que sobrevivieron en el sistema.
Mtodos de Esterilizacin
La seleccin del mtodo de esterilizacin y el rgimen a usarse deben ser
hechos de acuerdo a criterios apropiados de esterilizacin; los mtodos
pueden ser:Calor hmedo
1.
2.
3.
4.
Calor seco
Filtracin
Compuestos qumicos
Radiacin
2

El mtodo de esterilizacin ms comn para recipientes es el de calor

hmedo. Al monitorear el proceso de esterilizacin por calor hmedo se
puede observar que el ciclo de esterilizacin est formado por tres perodos:
a) Elevacin de temperatura o calentamiento.
b) Mantenimiento de temperatura.
c) Descenso de temperatura o enfriamiento.
Materiales
- Cajas de Petri
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitado de diferentes volmenes
- Barras magnticas para agitacin (mosca)
- Guantes de asbesto
- Solucin de Cloruro de Sodio al 0.85%
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Pipetas automticas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Medio de cultivo para levaduras
- Matraces de 250 mL
Equipo
- Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L
- Balanza analtica
- Incubadora con control de temperatura
- Autoclave elctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar vertical
- Microscopio ptico
- Agitador Vortex
- Placa de agitacin magntica
Procedimiento
a) Preparar de 2.5 L de medio de cultivo para levadura, composicin por
litro de medio: Sacarosa, 30 g; Extracto de Levadura, 5 g; KH2PO4, 5 g;
(NH4)2SO4, 2 g; MgSO4 . 7H2O, 0.4 g. Ajustar a pH 5
b) Preparar 14 cajas Petri con medio de cultivo slido para levaduras
adicionado al medio 15 g/L de agar.
c) Antes de esterilizar el medio tomar muestra de 1 mL del medio de
cultivo, para realizar cuenta en placa. Sembrar por duplicado en las
cajas con medio slido con las diluciones 100 (directo) a 10-2.
3

d) Realizar una preparacin en fresco del medio de cultivo sin esterilizar y

una tincin de Gram y observarlo al microscopio.
e) Preparar el Biorreactor como se estableci en la prctica 5.
f) Verter en la jarra del biorreactor el medio de cultivo sin esterilizar.
g) Esterilizar el biorreactor en la autoclave:
1. Verificar que la autoclave contenga agua hasta el nivel marcado
por el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).
2. El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave.
Verificar que la salida de aire del biorreactor est abierta, de lo
contrario se corre el riesgo de que el biorreactor o alguna de sus
partes se rompan durante el proceso de esterilizacin.
3. Cerrar la puerta de la autoclave
4. Encender la autoclave para provocar la generacin de vapor.
5. Verificar que la salida de la vlvula de purga se encuentre
totalmente abierta, de esta forma, el aire contenido en la autoclave
ser excluido por el vapor que se genera.
6. Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por
la vlvula de salida de la autoclave, se cierra.
7. Esperar que la presin dentro de la autoclave sea de 1.05 Kg/cm2 o
15 lbs (indicado por el medidor de presin) que equivale a 121C
(indicado por el medidor de temperatura) y mantener (por medio del
apagado y encendido de la autoclave o controlando la flama)
durante 15 minutos.
8. Posterior al proceso de esterilizacin apagar o cerrar el gas y
esperar a que la presin llegue a 0.1Kg/cm2 abrir lentamente la
vlvula de salida y dejar escapar el vapor que an no se ha
condensado. Evitar que la presin caiga por debajo de cero (bajo
vaco), ya que ello provoca riesgos de contaminacin del material
ya esterilizado.
9. Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de
asbesto sacar el biorreactor esterilizado.
h) Una vez esterilizado el biorreactor, dejar enfriar hasta temperatura
ambiente antes de utilizarlo.

i) Aspticamente tomar una muestra de 1.5 mL del medio de cultivo

esterilizado y determinar no de clulas por cuenta en placa con la
muestra directa y dos diluciones, hasta 10-2; cada dilucin por
triplicado.
j) Realizar una preparacin en fresco del medio de cultivo esterilizado y
observarlo al microscopio visible y otra en tincin de Gram.
Preparacin del inculo
Para la preparacin del inculo, se puede partir de un cultivo en tubo inclinado
o en placa, o tambin podra ser de un preinculo o precultivo lquido de la
cepa deseada. En el caso de levaduras puede ser de alguna presentacin
comercial como pasta o polvo.
Inculo A: tomar una asada del cultivo de Saccharomyces cerevisiae y se
transfiere a un matraz de 500 mL con 300 mL de medio de cultivo nuevo y
estril. Se incuba a 30C durante 12 h a 18 h con una agitacin de 120 rpm.
Antes de inocular el biorreactor con el medio de cultivo ya estril, se prepara
un frotis de cada inculo y tie con la tcnica de Gram para corroborar la
pureza del inculo.
REPORTE DE RESULTADOS
a) Elaborar una tabla de resultados en donde se reporten los resultados
del conteo de microorganismos en cada una de las cajas Petri
sembradas con las diluciones del medio de cultivo, antes y despus del
proceso de esterilizacin. Comparar los resultados.
b) Calcular la concentracin de contaminantes (UFC/mL) en el medio de
cultivo sin esterilizar.
c) En caso de que exista contaminacin en el medio de cultivo ya
esterilizado, calcular la concentracin de contaminantes (UFC/mL).
d) Elaborar sus conclusiones sobre el papel que juega la esterilizacin en
las bioconversiones, as como de la eficacia del mtodo de
esterilizacin por calor hmedo en autoclave elctrica.

BIBLIOGRAFA
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd
Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Deindoerfer, F. H. y Humphrey, A. E., 1959. Appl. Microbiol. 7 : 256-264
Diego, 439p.
Lydersen, B.K. , Delia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering
Systems, equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York,
805p.
Quintero Ramrez, R. Ingeniera Bioqumica, teora y aplicaciones, Alambra
mexicana, 1981, Mxico, 332p.
Schgerl, K, Bioreactor engineering, volume 2; characteristics features of
bioreactors, John Wiley & Sons, 1981, Chichester, 393p.
6.2. Produccin de enzima en un biorreactor con clulas

libres.
OBJETIVO GENERAL
Adquirir los conocimientos prcticos para producir una enzima extracelular por
medio de una fermentacin con clulas libres.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1.
2.
3.
4.
5.
Producir invertasa con clulas libres de levaduras en cultivo sumergido.

Monitorear y obtener la cintica de crecimiento de biomasa.
Monitorear y obtener la cintica de produccin de enzima.
Determinar la actividad cataltica de la invertasa.
Establecer las constantes cinticas (Km, Vmax) de la invertasa
MARCO TERICO
Las Enzimas como Metabolitos
Los metabolitos primarios producidos durante un proceso de fermentacin
representan productos finales de bajo peso molecular usados para la
produccin de macromolculas o son convertidos en coenzimas. As tambin,
los metabolitos primarios pueden ser productos intermediarios en vas
metablicas relacionadas con los productos finales. Los aminocidos,
vitaminas, los nucletidos y ciertas enzimas son considerados productos
primarios.

En el caso de las enzimas, stas son consideradas metabolitos primarios

cuando la evolucin de su produccin guarda una relacin estrecha con el
crecimiento microbiano. Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser
obtenidas de diferentes fuentes.
Tipos de Enzimas y sus Fuentes
Al menos 75% de todas las enzimas industriales son de accin hidroltica y
son usadas para la despolimerizacin de sustancias naturales. Las proteasas
representan el tipo de enzimas industriales predominantes (40%) utilizadas en
la industria lechera y detergentes. Las carbohidratasas utilizadas en las
industrias de panificacin, cervecera, destilacin, almidn y textiles
representan el segundo grupo ms grande de enzimas industriales.
Las enzimas pueden ser obtenidas de diversas fuentes como tejidos
animales, plantas, hongos y bacterias. Las enzimas microbianas representan
90% de las enzimas industriales. Las enzimas de de origen vegetal ms
importantes son la papana, la bromelina, algunas enzimas amilolticas de
cereales, lipoxigenasas de soya y enzimas de frutas ctricas. En cuanto a las
enzimas de origen animal, estas incluyen a las lipasas y proteinasas
pancreticas, pepsinas y esterasas.
Levadura
Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, es decir, un tipo de
levadura que ha servido como uno de los modelos ms adecuados para el
estudio de problemas biolgicos, por ser un sistema eucariota, con una
complejidad slo ligeramente superior a la de las bacterias pero compartiendo
con ella muchas de sus ventajas tcnicas.
Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la
produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido
de carbono y etanol durante el proceso de fermentacin. En condiciones de
escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metablicas que le
permiten obtener un mayor rendimiento energtico, y por tanto no realiza la
fermentacin. Bsicamente el proceso de fermentacin se lleva a cabo
cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares, como
la sacarosa, y es por ello que en su metabolismo necesita sintetizar una
enzima que catalice la hidrlisis de sacarosa en glucosa y fructosa, siendo
una fuente productora de invertasa.
Invertasa
La invertasa, tambin conocida como sacarasa, es una enzima de inters
industrial utilizada en la hidrlisis de sacarosa para la obtencin de jarabes
fructosados, los cuales son empleados ampliamente en la industria de los
7

alimentos como en la industria refresquera, la de conservas, lcteos,

pastelera y confitera.
La invertasa desdobla la sacarosa en fructosa y glucosa, donde a la mezcla
resultante de estos se le denomina azcar invertido debido a la inversin de
sus propiedades pticas de una rotacin positiva a una negativa. Tambin se
cambian las propiedades qumicas, por ejemplo, en el caso de la sacarosa, el
tipo de enlace que subsiste entre sus molculas entrelazadas ( para la
glucosa y para la fructosa) impide que dicha molcula contenga terminales
reductores, por lo que al hidrolizarse, estas molculas que quedan libres
recuperan su poder reductor.
MATERIALES
- Vasos de precipitado de diferentes volmenes
- Barras magnticas para agitacin (mosca)
- Guantes de asbesto
- Agar nutritivo
- Solucin del reactivo DNS
- Solucin de glucosa, 2 g/L
- Solucin del reactivo de Bradford
- Solucin de anthrona
- Solucin de sacarosa, 30 g/L
- Solucin buffer fosfatos 0.1 M a pH 6.9
- Solucin estril de cloruro de sodio, 0.09%
- Colorantes y soluciones para tincin de Gram
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos
- Charolas de aluminio de 5 cm de dimetro
- Tiras de pH
EQUIPO
- Biorreactor de laboratorio New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra
de 5 L con su mdulo de control, partes y electrodos.
- Centrfuga para tubos falcn de 30 mL
- Balanza analtica
- Espectrofotmetro visible
- Incubadora orbital con control de agitacin y temperatura
- Autoclave elctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar
- Microscopio ptico
- Agitador Vortex
- Bao de agua con control de temperatura

MTODOLOGA
Inoculacin del Biorreactor.
Posteriormente de confirmar la pureza del inculo y la esterilidad del medio,
con ayuda del profesor se proceder a inocular, con 250 mL del inculo, el
biorreactor. Antes de inocular se verifica que el medio de cultivo del
biorreactor est libre de contaminantes. Despus de inocular el biorreactor se
toman muestras de 20 mL para cada tiempo en base al siguiente programa de
muestreo:
Tabla 1. Programa de Muestreo
Tiempo
Hora*
Horas
T0
8:00
0
T1
10:00
2
T2
12:00
4
T3
14:00
6
T4
16:00
8
T5
18:00
10
T6
20:00
12
T7
8:00
24
T8
10:00
26
T9
12:00
28
*Las horas no deben ser forzosamente exactas pero si apuntar la hora
exacta y el tiempo exacto de la muestra (Horas)
La muestra del tiempo cero (T0) se toma justo despus de inocular el
biorreactor. Si en los tiempos T7, T8 y T9, no hay cambios significativos en la
evolucin del crecimiento celular y en la produccin de invertasa, se procede
a detener la fermentacin.
* NOTA: El programa de muestreo anterior es una propuesta susceptible a
modificacin.
Condiciones de fermentacin: aireacin de 1 VVM, temperatura de 35C,

pH inicial de 7.0 y agitacin de 180 rpm.

De acuerdo al programa de muestreo, se ir llenando la Hoja de control de

la cintica de produccin de enzima con clulas libres (se anexa al final
de la prctica), con los datos de los parmetros establecidos.
Se evaluarn los siguientes parmetros para cada una de las muestras:

1. Realizar un frotis de cultivo del biorrecator para realizar tincin de Gram y
observar al microscopio, para comprobar pureza.
2. Leer la temperatura que marca el mdulo de control del biorreactor.
3. Determinar el pH del caldo de cultivo.
4. Establecer la biomasa por densidad ptica.
5. Establecer la concentracin de biomasa por peso seco.
6. Establecer no de clulas por cuenta en cmara de Neubauer
7. Determinacin de la produccin de protena extracelular (invertasa) por
medio del mtodo de Bradford, utilizando al sobrenadante como muestra
problema y agua como blanco
8. Azcares reductores del sobrenadante libre de clulas.
9. Determinacin de la actividad enzimtica (a los 5 minutos) de la invertasa
presente en el caldo de cultivo. De cada muestra centrifugada, tomar
0.05 mL del sobrenadante y se transferir a un microtubo. Adicionar 0.95
mL de solucin de sacarosa 30 g/L y mezclar. Inmediatamente (testigo) y
a los 5 min. (triplicado), tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo
con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente
durante 5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada al
tubo eppendorf, posteriormente pasar a una celda y medir absorbancia a
540 nm.
Metodologas
Azcares reductores por la tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS9, seguir
el protocolo descrito en la prctica No. 1. Realizar previamente una curva tipo
con soluciones de glucosa.
a) pH: Medir el pH del caldo de cultivo a partir de una muestra (3 a 5 mL)
extrada del biorreactor. Utilizar tiras o papel indicador de pH, o con un
potencimetro. La lectura de pH es continua por lo que se necesita
nicamente anotar el valor de la lectura.
10

b) Biomasa por peso seco:

1. Poner 10 mL de muestra en un tubo falcon de 30 mL de volumen y
centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos. (recuperar
sobrenadante para anlisis: azcares reductores, pH, AE, etc.))
2. Decantar el sobrenadante y mezclar la biomasa precipitada en el
tubo falcon con 1 mL de solucin salina isotnica.
3. Homogeneizar utilizando el Vortex.
4. Verter la suspensin celular en una charola de aluminio de peso
conocido. Enjuagar el tubo, para recuperar toda la biomasa, con 1
mL de solucin salina isotnica.
5. Meter la charola conteniendo la suspensin celular dentro del horno
a 80C y durante 24 horas o hasta peso constante.
6. Determinar el peso de la biomasa seca por diferencia de pesos. El
peso de la muestra seca y el de la charola menos el peso de la
charola, resulta en el peso seco de la biomasa contenida en los 10
mL de muestra.
7. Reportar la concentracin de biomasa en mg de biomasa seca/mL
de caldo de cultivo.
c) Biomasa por densidad ptica
1. Poner aproximadamente 1 mL de muestra homognea en una celda
2. Ajustar el espectrofotmetro a absorbancia de cero utilizando el
sobrenadante de centrifugacin como blanco (caldo de cultivo sin
biomasa) obtenido en la tcnica anterior de estimacin de biomasa
por peso seco.
3. Introducir la celda con la muestra problema en el espectrofotmetro
y determinar la densidad ptica a 600 nm.
d) Protena extracelular: Para determinar la concentracin de la invertasa
producida, tomada en cuenta como protena extracelular, se emplear
el mtodo de Bradford descrito en la prctica No. 1. Determinando
protena en el cultivo celular libre de clulas.
Al final de la fermentacin:
a) Detener la fermentacin apagando la agitacin y el mdulo de control.
Cerrar el flujo de agua de enfriamiento.
b) Desmontar el biorreactor de su mdulo y esterilizarlo junto con su
contenido utilizando la autoclave elctrica, no olvidando dejar la salida
de aire del biorreactor abierta.
c) Despus de la esterilizacin, desmontar el biorreactor y sus partes y
efectuar su limpieza.
11

REPORTE DE RESULTADOS
a) Elaborar una tabla de los datos obtenidos.
b) Elaborar una grfica de los resultados del crecimiento de la biomasa
(mg de biomasa seca/mL de caldo de cultivo), y de la densidad ptica a
600 nm contra tiempo (h).
c) Elaborar una grfica de los resultados de la produccin de invertasa
(mg de protena) contra tiempo (h).
d) Elaborar una grfica de los resultados del consumo de sustrato (mg de
sacarosa) contra tiempo (h).
e) Elaborar una grfica de los resultados de la actividad enzimtica
(U/mL) contra tiempo (h).
f) Elaborar una grfica del monitoreo de pH.
g) Elaborar una grfica del monitoreo de la temperatura.
h) Discutir sobre el comportamiento de las cinticas, explicando lo que
ocurri en cada fase de la fermentacin.
i) Calcular las constantes cinticas Vmax y Km mediante algn mtodo
sealado en la prctica No. 2, Determinacin de Vmax y Km de
enzimas.
j) Anexar la Hoja de control de la cintica de produccin de enzima con
clulas libres utilizada durante el desarrollo de la prctica.
k) Si se realizaron las cuatro fermentaciones diferentes marcadas en la
prctica No. 5, Adiestramiento en la operacin de un biorreactor de
laboratorio, comparar los resultados obtenidos entre ellas.
BIBLIOGRAFA
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2 nd
Edition, McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
12


Diego, 439p.
Lpez, Agustn; QUINTERO, Rodolfo. Tecnologa Enzimtica. UNAM. Mxico,
1987.
Scragg, Alan. Biotecnologa para Ingenieros. Sistemas biolgicos en procesos
tecnolgicos. Editorial Limusa. Mxico, 1999.
Segel H. Irwin, Biochemical Calculations (How to solve mathematical
problems in general biochemestry). Editorial John Wiley & Sons, Segunda
edicin, Estados Unidos de Amrica 1976
Stanbury, P.F. and Whitaker, A. Principles of fermentation technology.
Pergamon Press, 1984. Oxford, 255p.
Vogel, H.C. and Todaro, C.L. Fermentation and biochemical engineering
handbook. 2nd edition, Noyes Publications, 1997. New Jersey, 801p.
13

HOJA DE CONTROL DE CINTICA DE PRODUCCIN DE ENZIMA POR CLULAS LIBRES

CONDICIONES
Aireacin (vvm)
Agitacin (rpm)
Fecha y hora de inicio:
Fecha y hora de trmino:
Muestra
Tiempo
T ( C)
(h)
pH
Pureza de
Cultivo (+,-)
Charola
(g)
Charola
con
Muestra PS
(g)
DO
(600 nm)
No de
Cel/mL
DNS (DO) se
sobrenadante
Bradford
(DO) de
Observaciones
sobrenadante
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
14

PRCTICA 7
PRODUCCIN DE ENZIMA (INVERTASA) A PARTIR DE
Saccharomyces cerevisiae LIBRE E INMOVILIZADA EN UN
BIORREACTOR A NIVEL LABORATORIO.
OBJETIVOS:
El alumno determinar la actividad enzimtica de la invertasa producida por
Saccharomyces cerevisiae en estado libre e inmovilizado en esferas de
alginato de sodio, durante una fermentacin en un biorreactor a nivel
laboratorio.
Especficos:
- El alumno disear y construir un biorreactor nivel laboratorio para la
produccin de enzimas a partir de levadura en estado libre e
inmovilizado.
- El alumno inmovilizar clulas de S. cerevisiae en alginato de sodio.
- El alumno preparar el medio de cultivo para el crecimiento de la
levadura y la produccin de la enzima.
- El alumno llevar a cabo el seguimiento de la cintica de crecimiento de
la levadura en estado libre e inmovilizado.
- El alumno monitorear la produccin de protena en las clulas (en
estado libre e inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
- El alumno determinar la actividad enzimtica y la actividad enzimtica
especifica de la invertasa producida por las clulas en estado libre e
inmovilizado.
MARCO TERICO
Inmovilizacin de clulas: La inmovilizacin celular se define como la
localizacin de clulas en una regin definida en el espacio con la preservacin
de las funciones celulares. Esta regin de inmovilizacin debe ser una fase
slida que permita el intercambio de sustratos y productos con el medio
exterior, no debe ser txica para las clulas y debo ser fcilmente manipulable.
La inmovilizacin en soportes naturales y sintticos ha mostrado por un
lado, estabilidad en las funciones celulares, por otro lado, permite alcanzar altas
concentraciones de microorganismos en volmenes reducidos y permite la
reutilizacin del biocatalizador y la implantacin de sistemas continuos da
produccin, facilitando las etapas de separacin.

Los procesos biotecnolgicos pueden ser sustancialmente optimizados

utilizando microorganismos inmovilizados en comparacin con los procesos
que utilizan clulas libres.
La utilizacin de la inmovilizacin celular permite:
Facilitar las etapas de separacin de biomasa y producto.

La reutilizacin del biocatalizador microorganismos o
clulas vegetales o animales.
Facilitar la implantacin de sistemas continuos de
produccin.
Prolongar la actividad metablica de los
microorganismos o clulas vegetales o animales.
Prolonga el ciclo de vida de los microorganismos o clulas vegetales
o animales.
Aumentar la tolerancia de las clulas a sustancias txicas.
Mtodos de inmovilizacin: Las diferentes tcnicas que se utilizan para la

inmovilizacin celular pueden ser clasificadas de la siguiente manera: adsorcin
fsica y enlaces covalentes, micro encapsulacin, agregacin, y atrapamiento o
inclusin celular.
- Adsorcin y enlaces covalentes.
Las tcnicas de adsorcin y por enlaces covalentes se llevan acabo en los
espacios libres de los poros del soporte, en donde existen grandes
superficies. En este tipo de inmovilizacin, una gran parte de la superficie de la
clula est en contacto directo con el medio, en contraste con la encapsulacin
o tcnicas de atrapamiento, en donde un fragmento grande de las clulas es
capturado y las limitaciones de transferencia de masa pueden estar presentes.
- Adsorcin.
Las clulas pueden anclarse naturalmente a una superficie, las clulas se
anclan al soporte por atracciones electrostticas (fuerzas de Van der Walls,
inicas y de puentes de hidrgeno). El crecimiento produce una biopelcula en
la superficie del soporte y las limitaciones de transferencia de masa tienen
lugar dentro de esta biopelcula.
Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio
inico y materiales orgnicos corno la celulosa y carbn activado.
- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilizacin el fuerte enlace de la clula-soporte reduce la
prdida celular. La unin directa de las clulas a un soporte activado es posible
por la modificacin qumica de la matriz por medio de la utilizacin de sustancias
que sirvan de puente de unin qumica. El glutaraldehdo es usado para tal fin, sin
embargo, el riesgo del dao celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de
la membrana celular, puede ser una limitante.
2

- Micro-encapsulacin.
La micro-encapsulacin se usa en el rea farmacutica o en el campo de
medicina para produccin de frmacos e inmovilizacin de enzimas. Una
microcpsula consiste en una semi-membrana permeable, esfrica, delgada y
fuerte que rodea un centro liquido, con un dimetro que varia de unas mieras a
1mm. La membrana sin/e como una barrera semipermeable permitiendo la
entrada ce sustrato y la salida de metabolitos, pero no permite el paso de clulas.
- Atrapamiento o inclusin.
De entre los mtodos de inmovilizacin de clulas, el mtodo de inclusin celular
ha mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilizacin y es el que
preserva mejor las funciones celulares. Este mtodo consiste en atrapar las
clulas en una red tridimensional rgida de hidrogel; los soportes de
inmovilizacin pueden ser sintticos (por ejemplo la poliacrilamida, el
poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la gelatina, el alginato y la
carragenina). Una de las caractersticas particulares del mtodo de inclusin
o atrapamiento celular est
relacionada
con
las
condiciones
de
gelificacin del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificacin. La
gelificacin se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de
iones. Adems, la gelificacin es reversible, as, bajo ciertas condiciones
fsicas se cuenta con una suspensin celular que puede ser gelificada,
quedando las clulas atrapadas; posteriormente se puede volver a liberar las
clulas aumentando la temperatura o retirando los iones. Uno de ios materiales
ms empleados para realizar la inmovilizacin por inclusin celular es la Kcarragenina.
a) Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacrido no txico, de fcil adquisicin, aislado a partir
de algas marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmtica y alimentaria
como agente gelificante, espesante y estabilizante. Es un polmero, el cual esta
constituido por una estructura unitaria de sulfato de -D galactosa y 3,6-anhidro--Dgalactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solucin de algn
agente inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilizacin puede efectuarse
bajo condiciones muy suaves, sin el uso de qumicos que puedan inhibir la
actividad enzimtica de las clulas.
Invertasa: la invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa,
EC 3.2.1.26), cataliza la hidrlisis de restos terminales no reductores -Dfructofuranosdicos de fructofuransidos. Entre los sustratos sobre los que acta el ms
significado es, sin duda, la sacarosa, de ah que el enzima se designe con el nombre
de sacarasa. La denominacin trivial de invertasa, con la que tambin se conoce, hace
referencia al hecho de que los productos de la reaccin son conocidos desde antiguo
3

como azcar invertido ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla

equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrlisis es levorrotatoria, por lo
que en el proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de
rotacin ptica.
Sacarosa ([] = +66,5) + H O D-glucosa ([] = +52,5) + D-fructosa ([] = -92)
D
La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en

microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel importante en el
catabolismo de fructanos y ms especficamente en el de la sacarosa, en especial en
aquellos organismos en los que dichos azcares son utilizados como fuente de
carbono y energa. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran inters tanto
desde un punto de vista acadmico como de investigacin aplicada, siendo uno de los
enzimas ms conocidos.
La invertasa es una enzima de inters industrial utilizada en la hidrlisis de sacarosa
para la obtencin de jarabes fructosados (JF), los cuales son empleados ampliamente
en la industria de alimentos como la industria refresquera, la de conservas, lcteos,
pastelera y confitera.
Aplicacin biotecnolgica y biorreactores con clulas inmovilizadas.
Los biorreactores ms comunes usados con clulas inmovilizadas son: tanque
agitado, lecho fluidizado, columna empacada, y reactor air-lift (Fig. 1). El tipo de
biorreactor a utilizar depende del mtodo de inmovilizacin empleado, del
metabolismo las clulas y del requerimiento de transferencia de masa

Salida de aire
Alimentacin
Clulas
inmovilizadas
Aspersor de aire
Productos
B
Productos
Productos
Clulas
inmovilizadas
Alimentacin
Alimentacin
Figura 1. Biorreactores con clulas inmovilizadas A, Tanque agitado; B, air lift; C,

Columna empacada; y D, Lecho fluidizado.
Material, Equipo y Reactivos
Probetas.
Termmetro
Autoclave
Bao Mara
Potencimetro.
Microscopio ptico
Centrfuga
Balanza analtica
Espectrofotmetro UV-VIS
Campana de flujo laminar
Tubos Falcn
Tubos Eppendorf estriles (150
aprox.)
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Lmpara de alcohol
Mechero de Bunsen
Micropipetas
Encendedor
Portaobjetos
Puntas para micropipetas
Tiras de medicin de pH
Charolas de aluminio secas
Soluciones para realizar tincin de
Gram
o Cristal Violeta
o Lugol
o Alcohol-cetona
o Safranina
Reactivo DNS
Solucin de sacarosa al 30%
Agua destilada
Buffer pH 4
Buffer pH 7
5

Aceite de inmersin
Solucin de anthrona
Alcohol al 70 %
Solucin de sacarosa
Pinzas
Charolas de aluminio
Bao de hielo
Sacarosa
Vasos de precipitado de diferentes
volmenes
Barras magnticas para agitacin
(mosca)
Jeringa de 10 ml con punta roma

Manguera de silicn de 2 mm de
dimetro para bomba peristltica
Agar nutritivo.
Parrilla de agitacin y
calentamiento
Soporte Universal
Solucin estril de cloruro de calcio
al 1%.
Solucin de alginato al 2%
Pipetas de 1 y 10 mL
1 colador de cocina metlico
Primera parte:
Cada equipo debe disear un reactor, considerando material que sea factible de
conseguir, que est en el laboratorio o bien matraces, frascos de vidrio, probetas,
tubera etc. El reactor diseado deber garantizar la esterilidad del cultivo, adems de
proveer un sistema de agitacin homogneo, ya sea por medio de inyeccin de aire o
con barras magnticas. El volumen total de operacin del reactor no deber ser mayor
a 1 L.
Prueba de del biorrecator diseado, funcionamiento y esterilidad:
Preparar medio de cultivo agar nutritivo (el volumen depender del tamao del reactor
diseado) y colocarlo en el reactor. Cerrar el reactor y someterlo a esterilizacin en
autoclave, a 125 C por 15 minutos. Posteriormente verificar que no se halla daado el
rector o sus partes durante el proceso y dejar funcionando durante 24 h. Al da
siguiente, comprobar por medio de turbidez y cuenta en placa que no haya crecimiento
en el reactor.
Segunda parte
Medio a utilizar en toda la prctica, composicin por L de medio: sacarosa, 20 g;

KH2PO4, 5 g; (NH4)2SO4, 7 g; NaCl, 0.5 g; MgSO4 7H2O, 0.5 g, CaCl2 2H2O, 0.25 g;
extracto de levadura, 5.0 g
Ajustar el pH a 5 con H2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante
15 minutos.
Preparar, un da antes de iniciar el experimento en el birreactor, un inculo de S.
cerevisiae en cuatro matraces de 500 mL con 250mL de medio estril, pH 5. El
profesor proporcionar un cultivo en caja de petri de la cepa Saccharomyces
6

cerevisiae. De forma asptica, tomar con el asa una porcin de una colonia del cultivo
slido proporcionado e introducirla en el medio de cultivo estril del matraz. Incubar a
35C, con agitacin de 120 rpm y durante 14 a 16 horas (toda la noche). Verificar la
pureza del cultivo por tincin de gram
Inmovilizacin de clulas.
TODO el material donde se trabajar debe estar estril, y manipular en la
campana hasta que est montado en reactor. Prever tener todo el material estril,
pipetas, coladores, matraces, mangueras, etc.
Centrifigar 500 mL de medio a 5000 rpm, 15 min en tubos estriles y recuperar la
pastilla celular, (eliminar sobrenadante), posteriormente resuspender la biomasa
en 100 mL de solucin isotnica estril.
1. Contar el No de clulas por mL del inculo, por cuenta en cmara de
Neubauer.
2. Adicionar a un matraz de 500 0 1000 mL que contiene 400 mL de alginato
de calcio al 2.5% a 40-45 C, la biomasa contenida en los 100 ml del
inculo (biomasa resuspendida).
3. Agita con una barra magntica para homogenizar la suspensin.
4. La suspensin se bombea por medio de una bomba peristltica que
opera a 12 rpm y a travs de una aguja hacia una solucin de cloruro de
calcio al 1% (estril) en forma de gotas.
5. Las gotas al ponerse en contacto con la solucin de cloruro de calcio
solidifican instantneamente formndose as esferas de aproximadamente
3 mm de dimetro.
6. La solucin debe estar con agitacin mnima (60 rpm), para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer. Las esferas formadas
permanecen en la solucin de cloruro de calcio con agitacin durante
30 min.
7. Posteriormente son retiradas de forma estril (con un colador de
cocina metlico estril) e introducidas al biorreactor diseado. Todo ello
se realiza dentro de la campana de flujo laminar en condiciones de
esterilidad.
8. Tomar una muestra de esferas para determinar el volumen y peso de
la misma y establecer el nmero de clulas por esfera.
9. Tomar una muestra del cloruro de calcio para determinar las clulas
no inmovilizadas, por cuenta en cmara de Neubauer.
Una vez obtenidas la clulas inmovilizadas montar los dos reactores diseados, uno
para clulas libres (inocularlo al 10 %) y otro para inmovilizadas. Tener listo la cantidad
de medio de cultivo estril necesario para los reactores, tener preparado ms de lo
necesario para el caso de cualquier contingencia y los blancos.

La cintica se seguir por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para

anlisis; Monitoreando los siguientes parmetros en el sobrenadante:
1.
2.
3.
4.
Densidad ptica (biomasa)

(Volumen de muestra 1 mL mximo)
Cuenta en placa*
(Volumen de muestra 0.1 mL)
Cuneta directa en cmara de Neubauer
Tincin de Gram
*Cuenta en placa se realizar al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final,
por triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando
con 0.1 mL de la dilucin correspondiente (10 0 a 10-9 y extendiendo con varilla en L.
(Se requieren de 54 cajas por equipo, puntas estriles de 1000 y 100 L, para las
diluciones: 30 tubos eppendorf estriles, solucin isotnica estril)
En sobrenadante centrifugado a 5000 rpm 15 min determinar:
5.
6.
7.
8.
Protena por Bradford

Azcares reductores
Azcares totales
pH
9. Actividad enzimtica:

((Volumen de muestra 1 mL)
(Volumen de muestra 250 L)
De cada muestra centrifugada, tomar 0.05 mL del sobrenadante y se transferir a

un microtubo. Adicionar 0.95 mL de solucin de sacarosa 30 g/L y mezclar.
Inmediatamente y a los 5 min., tomar 0.1 mL del tubo y transferir a otro tubo
con 0.1 mL de reactivo de DNS. Los tubos se colocan en agua hirviente durante
5 minutos y luego en hielo. Adicionar 1 mL de agua destilada y medir
absorbancia a 540 nm.
Notas:
IMPORTANTE, la nica muestra que debe permanecer sin contaminar (tomada y
manipulada en condiciones de esterilidad) es la usada para cuenta en placa.
Tiempos recomendados: en funcin de los horarios de la clase, establecer el programa de
muestreo, la principal actividad se lleva a cabo en las primeras 12-18 horas, por lo que dejar
al inicio toda la noche el sistema puede hacer que se pierdan los puntos ms interesantes.
Se recomienda dejar todo listo, enfriar e iniciar en la maana.
Las muestras pueden ser tomadas y guardadas en refrigeracin para el posterior anlisis.
Se recomienda hacer de forma inmediata la cuanta en placa y Tincin de Gram (esta ltima
para asegurar que no hay contaminacin).
Resultados y anlisis de resultados

1.- Establecer el porcentaje de inmovilizacin de clulas
2.- Comparar la actividad y eficiencia de los dos reactores
3.- Establecer relaciones y correlaciones de los parmetros determinados. Curvas de
crecimiento, degradacin, actividad enzimtica, consumos de sustrato, etc.
4.- Discutir los resultados obtenidos

BIBLIOGRAFA
-
Aehle, W. (2007). Enzymes in Industry - Production and Applications (Tercera edicin ed.).
Leiden: Wiley-VCH.
Adrio, J. L., & Demian, A. L. (2005). Microbial Cells and Enzymes: A Century of Progress. En J.
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Aranda Barradas J. S.; Salgado Manjarrz E. 2002. Saccharomyces cerevisiae biomass

production and its uses in the food industry. Tecnologa de Alimentos, (37): 7-15
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System Design; 1995; pp 47-87.

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

Cada mdulo se llevar a cabo en una o ms sesiones, las cuales sern

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Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomar un

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1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que

Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado.

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4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar

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Transferir el lquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la

4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando

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Tabla 2. Volmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

Practicar con el profesor la toma de muestras voltiles

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Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer:

donde = coeficiente de extincin molar

se conoce como absorbancia (A) o densidad ptica (DO)

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Figura 2. Esquema de las partes bsicas de un espectrofotmetro

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Mueva el interruptor a la posicin ON.

Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)

Oprima ROTOR e introduzca el nmero 14 20, dependiendo del tipo de

Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades

Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min).

Oprima TEMP y teclee la temperatura ( C)

Al terminar la seleccin, oprima ENTER.

Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias

Coloque la tapa del rotor.

Permita que el equipo enfre a la temperatura indicada antes de comenzar

Oprima el botn START para iniciar el programa.

Se puede abortar oprimiendo el botn STOP.

La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido.

Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cmara

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Para cambiar rotor:

Utilice la llave del equipo.

Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla

Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla

Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en

Coloque la tapa del rotor (si ste posee una).

Oprima el botn start para iniciar el programa.

Se puede parar oprimiendo el botn stop.

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Figura 1. Grilla de conteo de la cmara de Neubauer (Fugelsang and Edwards,

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Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf,

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.

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Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente

Agitar en Vortex y luego llevar a ebullicin en bao Maria durante 10 min

Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.

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0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90

Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a