Tese Doutorado Jacqueline Ferreira

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING
CENTRO DE CINCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
Sensor de pH baseado em filmes de polmero conjugado e Sensor

biolgico baseado em filmes de ouro nanoestruturado
Tese
apresentada
por
Jacqueline Ferreira ao Programa de
Ps-Graduao em Qumica do
Departamento de Qumica do Centro
de Cincias Exatas da Universidade
Estadual de Maring como parte dos
requisitos para a obteno do ttulo de
Doutor em Cincias.
MARING, JUNHO/2009
Universidade Estadual de Maring

Centro de Cincias Exatas
Departamento de Qumica
Sensor de pH baseado em filmes de

polmero conjugado e Sensor
biolgico baseado em filmes de
ouro nanoestruturado
Tese de Doutorado
Jacqueline Ferreira
Orientador: Emerson Marcelo Girotto
Grupo de Materiais Polimricos e Compsitos
Maring - 2009
Dados Internacionais de Catalogao-na-Publicao (CIP)

(Biblioteca Central - UEM, Maring PR., Brasil)
F383s
Ferreira, Jacqueline
Sensor de pH baseado em filmes de polmero
conjugado e sensor biolgico baseado em filmes de
ouro nanoestruturado / Jacqueline Ferreira. -Maring : [s.n.], 2009.
xxiii, 169 f. : figs. color
Bibliografia : f. 152-169.
Orientador : Prof. Dr. Emerson Marcelo Girotto.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de
Maring, Programa de Ps-Graduao em Qumica, 2009.
1. Sensor ptico - Deteco de pH. 2. Sensor de
pH. 3. Polmeros condutores - Caracterizao por
Raman e espectroeletroqumica in situ. 4.
Polipirrol. 5. Biosensor - Deteco de marcadores
tumorais. 6. Plasmon de superfcie (SPR) Nanoestrutura. I. Girotto, Emerson Marcelo, orient.
II. Universidade Estadual de Maring. Programa de
Ps-Graduao em Qumica. III. Ttulo.
CDD 21.ed. 681.25
Aos meus pais, Ccero e Nair,

irms Janicler e Karina e ao Marcos
pelo incentivo, carinho, compreenso e
amor incondicional.
You can be the most brilliant scientist in all the

world; put you on a desert island with the very best
scientific equipment and the very best library and
you'll do uninteresting research. You must have
interaction. You must have discussion.
A. J. MacDiarmid
Agradecimentos
Deus pela vida, carinho e proteo
Ao Prof. Emerson, pela orientao.
Aos Professores do GMPC: Adley Forti Rubira, Eduardo Radovanovic, Gizilene M.
de Carvalho e Edvani C. Muniz e tambm ao Prof. Gentil J. Vidotti pela amizade e
ensinamentos.
Ao Prof. Alexandre G. Brolo, pela acolhida em Victoria, BC, Canad, durante o
estgio em seu laboratrio.
equipe de trabalho do Prof. Brolo: David Sinton, Reuven Gordon e Duan Xiabo e
aos alunos do grupo: Fatemeh, Carlos, Christy, John, Paul, Asif, Andrew e Michael
pela colaborao e amizade.
Aos amigos do laboratrio: Marcos Kunita, Thelma, Guilherme, Rafael, Marcos R.
Maurcio, Chico, Tiago, Gedalias, Aline, Rafo, Shirani, Adriano e, tambm aos
amigos que passaram pelo laboratrio: Aline, Ana Paula, Juliana, Rafaelle, Janana,
Luiz Henrique, Andrlson, Roberto, Rafael, Rassa, pelo agradvel convvio e
amizade.
Ao Marcos Kunita, novamente por manter o laboratrio sempre funcionando, pela
sua amizade e pela constante disposio em ajudar.
Ao Roberto e Andrlson por me guiarem durantes os primeiros passos no
laboratrio.
Aos amigos do Canad, os quais tm feito muita falta: Meikun, Yuchun, Celly,
Gustavo, Simon, Jason, Laura, Milton e Mohammad pela amizade, companheirismo
e por terem feito do meu estgio uma fase especial da minha vida.
todos os professores que participaram da minha formao.
Rafaelle, pelas medidas de EDS.
Ao Prof. Eduardo, pelas medidas de AFM.
Prof. Liliana, pelas medidas de espessura.
Ao Prof. Fernando Josepetti Fonseca, pelos microeletrodos de ouro digitalizado.
Ao Prof. Reuven pelos clculos tericos por FDTD.
Ao Mohammad e Fatemeh, pelas amostras fabricadas utilizando o FIB.
Ao Carlos, Paul e Michael pela contribuio na rea de microfludos.
s pessoas que mesmo distantes sempre estiveram muito perto: meus pais, irms,
sobrinhos, Ewandro, Adhiely, Paulinha, Cris e Duda.
Ao Seu Z, D. Maria e Eliane, pela pacincia e compreenso.
Aos rgos de financiamento: CAPES, CNPq, GSEP e NSERC.
Ao Claudemir e Cristina da secretaria de Ps-Graduao.
Ao meu Marcos, principalmente pela pacincia durante os momentos de estresse.
E a todos aqueles que contriburam de alguma forma para este trabalho.
ii
Resumo
Ttulo: Sensor de pH baseado em filmes de polmero conjugado e Sensor biolgico
baseado em filmes de ouro nanoestruturado
Autora: Jacqueline Ferreira
Orientador: Emerson M. Girotto
Palavras-chave: Sensor ptico, polipirrol, pH, biosensor, EOT, SPR
Este trabalho est dividido em duas partes: i) o estudo de filmes de polipirrol
dopado com azul de bromofenol (Ppi-AB) para aplicao em sensor de pH e ii) o
estudo de filmes de ouro nanoestruturado para aplicao em biosensor baseado em
emisso extraordinria de luz (EOT) induzido por ressonncia de plasmn de
superfcie (SPR). Na primeira parte, filmes de Ppi-AB foram sintetizados
eletroquimicamente e ento foram opticamente, eletroquimicamente e
estruturalmente caracterizados por espectroeletroqumica UV-Vis e Raman in situ,
IV, EDS-MEV e AFM. A interao entre dopante e polmero mostrou-se dependente
tanto do pH quanto do nvel de oxidao do polmero. Durante a oxidao da cadeia
do Ppi, o equilbrio de dissociao do AB se desloca para neutralizar as cargas
positivas geradas na matriz polimrica. Como as propriedades pticas e hmicas do
filme de Ppi so afetadas pela presena do indicador AB, fez-se em seguida o
estudo destas propriedades frente a variaes de pH. O Ppi-AB apresentou pKa em
7,4; o que o viabiliza para anlise de amostras fisiolgicas. Alm disso, o Ppi-AB
apresentou caractersticas importantes de um sensor eficiente como estabilidade,
reversibilidade, reprodutibilidade e curto tempo de resposta. Durante a segunda
parte deste trabalho, desenvolvemos um novo esquema para a deteco de
molculas biolgicas utilizando um substrato contendo nanoburacos perfurados
atravs de um filme de Au, o qual exibe EOT devido SPR. Esta amostra foi
utilizada para a deteco de marcadores de cncer de ovrio atravs do mtodo de
aquisio de imagens, permitindo a deteco de diferentes concentraes do
marcador biolgico em medidas de tempo real. Este dispositivo pode ser futuramente
utilizado para avaliar a eficincia de tratamentos de cncer, j que pode detectar a
variao da concentrao dos marcadores tumorais durante o tratamento. Para
melhorar as propriedades analticas do sensor, recobriu-se o filme de ouro com SiOx,
sendo ambos perfurados posteriormente para a fabricao de nanoburacos. Desta
forma, h ouro exposto somente na parte interna do nanoburaco, consequentemente
os plasmns de superfcie se confinam no interior do buraco, onde feita a deteco
das molculas. Este dispositivo foi aplicado com sucesso na deteco de
quantidades attomolares de protenas, apresentando sensibilidade de 650 nm/UIR.
iii
Abstract
Title: pH Sensors based on conjugated polymer films and Biosensor based on
nanostructured gold films
Author: Jacqueline Ferreira
Supervisor: Emerson M. Girotto
Keywords: Optic sensor, polypyrrole, pH, biosensor, EOT, SPR
The present work is divided in two parts: i) the investigation of Ppi-AB films for
application as pH sensor and ii) the investigation of nanostructured gold films for
application as biosensor based on extraordinary optical transmission (EOT) through
surface plasmon resonance (SPR). In the first part, bromophenol blue doped
polypyrrole (Ppi-AB) films were electrochemically synthesized and then optically,
electrochemically and structurally characterized by in situ UV-Vis and Raman
spectroelectrochemistry, IR, EDS-MEV, and AFM. The interaction between dopant
and polymer was found both pH and oxidation level dependent. During the oxidation
of the ppy chains, the dissociation equilibrium of AB is shifted in order to neutralize
the positive charges created in the polymer matrix. As both optical and ohmic
properties of the ppy film are affected by the presence of AB, an investigation of
these properties at different pH was also perfomed. Ppi-AB presented pKa 7.4,
making possible for this system to be applied in the analysis of physiological
samples. In addition, Ppi-AB presents important characteristics of an efficient sensor
such as stability, reversibility, reproducibility and short response time. During the
second part of this work, a new approach for the detection of biomolecules based on
nanoholes milled through gold films was developed, which presents EOT due to SPR.
This sample was used to detect biomarkers of ovarian cancer by acquiring images,
allowing the detection of different concentrations of the biomarker during real-time
measurements. According to the results, this device can be applied to track the
efficiency of a cancer treatment. Aiming to improve the analytical properties of the
sensor, nanoholes were milled all the way through gold films covered with a SiOx
layer. Therefore, the only gold surface exposed is inside the nanoholes. As result the
surface plasmon is also confined in the nanoholes where the biomolecules detection
occurs. This approach was successfully applied to detect attomolar amounts of
protein, presenting sensitivity of 650 nm/RIU.
iv
Informaes Curriculares
Formao acadmica
Bacharelado e Licenciatura plena em Qumica (2000 2003).
Universidade Estadual de Maring, PR.
Iniciao cientfica com bolsa CNPQ (2000 2003).
Incio do mestrado em maro de 2004 com passagem direta para o doutorado em
agosto de 2005 (bolsa CAPES).
Estgio sanduche (setembro 2007 outubro 2008) realizado na University of
Victoria (Canada).
Produo Cientfica
Artigos:
1)
J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, In situ investigation of a chemical process

inside polypyrrole matrix by Raman spectroelectrochemistry, ACS Applied
Materials & Interfaces, 2009, submetido.
2)
J. Ferreira, E. M. Girotto, pH ohmic sensor based on bromophenol blue-doped

polypyrrole, Journal of the Brazilian Chemical Society, 2009, aceito.
3)
F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, X. Duan, E. M. Girotto, A. G. Brolo, R.

Gordon, D. Sinton, Nanoholes as nanochannels: flow-through plasmonic
sensing, Analytical Chemistry, 2009, 81, 4308.
4)
J. Ferreira, M. J. L. Santos, M. M. Rahman, A. G. Brolo, R. Gordon, D. Sinton,

E. M. Girotto, Attomolar Protein Detection Using in-Hole Surface Plasmon
Resonance, Journal of the American Chemical Society, 2009, 131, 436.
5)
M. J. L. Santos, J. Ferreira, E. Radovanovic, R. Romano, O. L. Alves, E. M.

Girotto,
Enhancement
of
the
Photoelectrochemical
Response
of
Poly(terthiophenes) by CdS(ZnS) Core-Shell Nanoparticles, Thin Solid Films,

2009, 517, 5523.
6)
J. Ferreira, E. M. Girotto, Optical pH sensitive material based on bromophenol

blue-doped polypyrrole, Sensors and Actuators, B Chem, 2009, 137, 426.
7)
A. G. Brolo, J. Ferreira, M. J. L. Santos, C. Escobedo, D. Sinton, E. M. Girotto,

F. Eftekhari, R. Gordon, Development of plasmonic substrates for biosensing,
Proceedings of SPIE, 2008, 7035, 703503.
8)
J. Ferreira, M. J. L. Santos, R. Matos, O. Ferreira, A. F. Rubira, E. M. Girotto,

Structural and electrochromic study of polypyrrole synthesized with azo and
anthraquinone dyes, Journal of Electroanalytical Chemistry, 2006, 591, 27.
Participaes em Congressos:
1)
J. Ferreira, E. M. Girotto, O. N. de Oliveira Jr., Biosensor Based on Surface

Plasmon for Earlier Diagnostic of Cancer, INEO 1st Workshop of the National
Institute for Organic Electronics, Atibaia, SP, Brasil, 2009.
2)
C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton,

Plasmonic Nanohole array sensors integrated in ELISA-type anf flow-through
array platforms, MicroTAS The 13th International Conference on Miniaturized
Systems for Chemistry and Life Sciences, Jeju, South Korea, 2009.
3)

E. M. Girotto, Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon
Resonance, BiopSys Network for Bioplasmonic Systems 1st All Network
Meeting of BiopSys, Toronto, ON, Canada, 2008.
4)

E. M. Girotto, Attomolar Protein Detection Using in-Hole surface Plasmon
Resonance,
PCCAM
Pacific
Centre
for
Advanced
Materials
and
Microstructures, Victoria, BC, Canada, 2008.

5)
C. Escobedo, J. Ferreira, F. Eftekhari, R. Gordon, A. G. Brolo, D. Sinton, Solid

and Fluid Mechanics of Flow-through nanohole array based sensing,
PCCAM - Pacific Centre for Advanced Materials and Microstructures, Victoria,
BC, Canada, 2008.
6)
F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.

Sinton,
Biaxial
Nanohole
Array
Sensing
and
Optofluidic
Integration,
IEEE/LEOS Summer Topicals Optofluidics, Acapulco, Guerrero, Mexico,

2008.
vi
7)
F. Eftekhari, C. Escobedo, J. Ferreira, P. Wood, R. Gordon, A. G. Brolo, D.

Sinton, Nanohole Arrays as Optical and Fluidic Elements for Sensing,
ASME-IMECE International Mechanical Engineering Congress & Exposition,
Boston, MA, United States of America, 2008.
8)
J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, Ppy/BPB Characterization by in situ

Raman spectroelectrochemistry, CSC 91st Canadian Chemistry Conference
and Exibition, Edmonton, AB, Canada, 2008.
9)
J. Ferreira, M. J. L. Santos, E. M. Girotto, Estudo de interferentes na resposta

ptica frente ao pH do polipirrol dopado com corantes, SIBEE XVI Simpsio
Brasileiro de Eletroqumica e Eletroanaltica, guas de Lindia, SP, Brasil,
2007.
10) M. J. L. Santos, J. Ferreira, A. G. Brolo, E. M. Girotto, Evolution of the Ppy

vibrational bands resulting from polaron and bipolaron states determined by in
situ Raman spectroelectrochemistry, SIBEE XVI Simpsio Brasileiro de
Eletroqumica e Eletroanaltica, guas de Lindia, SP, Brasil, 2007.
11) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, A. F. Rubira, J. Ferreira,
A. Pawlicka, D. C. Dragunski, Characterization of Amylopectin-Rich Starch
Plasticized
with
Glycerol,
10th
International
Symposium
on
Polymer
Electrolytes, Foz do Igua, Pr, Brasil, 2006.

12) R. F. M. S. Marcondes, P. S. D. Agostini, E. M. Girotto, J. Ferreira, A. Pawlicka,
D. C. Dragunski, Chemically Modified Cassava Starch Plasticized with Ethylene
Glycol and Sorbitol, 10th International Symposium on Polymer Electrolytes, Foz
do Igua, Pr, Brasil, 2006.
13) J. Ferreira, E. M. Girotto, Polipirrol Dopado com Indicadores cido-Base para
Aplicao de Sensores de pH, SIBEE XV Simpsio Brasileiro de
Eletroqumica e Eletroanaltica, Londrina, Pr, Brasil, 2005.
14) J. Ferreira, A. W. Rinaldi, E. M. Girotto, Sensores Condutimtricos de pH
Baseados em Polipirrol Dopado com Indicadores cido-Base, SBQ-Sul XIII
Encontro de Qumica da Regio Sul, Florianpolis, SC, Brasil, 2005.
vii
Lista de Abreviaes e Smbolos
comprimento de onda
tampo contendo
mobilidade relativa
interferente
comprimento de onda de
caminho ptico
corte
BC
banda de conduo
comprimento de onda
BNHS
biotina ster N-hidrxi
max
succinimidil
para o mximo de
transmisso
BSA
albumina de soro bovino
3-APTES
aminopropiltrietoxisilano
BV
banda de valncia
absorbncia
concentrao (mol.L-1)
A0
absorbncia do filme
velocidade da luz no
vcuo
imerso em soluo
tampo sem interferente
Ac
C.I.
interferncia
absorbncia da forma
cida
AB
azul de bromofenol
Abs
absorbncia da forma
coeficiente de
ca.
do latim circa =
aproximadamente
CCD
dispositivo de carga
acoplado
bsica
CG-MS
cromatografia gasosa
AC
anticorpo
AFM
microscopia de fora
acoplada a
atmica
espectrometria de massa
AG
antgeno
cols.
colaboradores
Ai
absorbncia da mistura
DMSO
dimetil sulfxido
contendo as formas
DNA
cido desoxirribunucleico
cidas e bsicas
DSU
ditiobis(succinimidil
undecanoato)
An
anilina
atto
prefixo do sistema
potencial aplicado
internacional de unidades
unidade de carga
eletrnica (1,6 x 10-19 C)
que denota um fator de

10-18
Ax
e.g.
= por exemplo
absorbncia do filme
imerso em soluo
do latim exempia gratia
E.T.
eletrodo de trabalho
E0redox
potencial redox padro

viii
ndice de Abreviaes e Smbolos

ECS
eletrodo de calomelano
IAB
saturado
EDS
energia dispersiva de
Raman para a forma AB

IAB-
energia dos nveis
IAB2-
valor de energia do gap
ELISA
Anlise-Enzima-ImuniAdsorvida
Intensidade da banda
Raman para a forma AB2-
eletrnicos
Egap
Raman para a forma AB-
raios-X
Eelet
Id
intensidade do campo
eletromagntico
Ind-
forma desprotonada de
EMF
evaporated metal films
EOT
extraordinary optical
IT
intensidade transmitida
transmission
IR
infrared
ressonncia
comprimento do vetor de
EPR
Erot
Evib
FDTD
um indicador cido-base
paramagntica eletrnica
onda da luz incidente
energia dos nveis
com comprimento de
rotacionais
onda fixo
energia dos nveis
kpara
vetor de onda do fton
vibracionais
paralelo ao plano de
Diferenas Finitas no
incidncia no prisma
Domnio de Tempo
ksp
vetor de onda do fton
FIB
feixe de ons focado
que excita os eltrons
FTIR
Infravermelho por
livres na superfcie
transformada de Fourier
FTO-vidro
LUMO
molecular orbital
vidro recoberto com

xido de flor dopado
MEV
com ndio
ATR
reflexo total atenuada
He-Ne
hlio-nenio
HInd
forma protonada de um
HOMO
lowest unoccupied
microscopia eletrnica de
varredura
MPTMS
3-mercaptopropiltrimetoxisilano
concentrao de
indicador cido-base
portadores livres no
highest occupied
material
molecular orbital
i
corrente eltrica
ix

na
ndice de refrao para
Ppi
polipirrol
uma camada com
Ppi-AB
polipirrol dopado com
espessura entre 0 e d
NA
abertura numrica
azul de bromofenol
Ppi-Cl
(numerical aperture)
nb
ndice de refrao para
cloreto
Ppi-ClO4
uma camada com

espessura entre d e

perclorato
Ppi-PVS
infinito correspondente

cido polivinilssulfnico
ao branco da medida
raio do buraco
neff
ndice de refrao efetivo
R0
resistncia do filme antes
NHS
ster
da imerso em soluo
N-hidroxisuccinimida
tampo
oPD
o-fenilenodiamina
SPR
ngulo de SPR
imerso em soluo
periodicidade = distncia
tampo contendo
entre o centro dos
interferente
Ri
resistncia do filme
buracos
RIU
refractive index unit
PA
poliacetileno
Rms
rugosidade mdia
PANI
polianilina
PAX8
pared box gene 8
quadrada
r-PAX8
recombinant pared box
(anticorpo para cncer de
gene 8 (antgeno para
ovrio)
cncer de ovrio)
STF
soluo tampo fosfato
Rx
resistncia do filme aps
PDMS
poli (dimetilsiloxano)
imerso em soluo
PEG
poli (etileno glicol)
tampo
PET
poli (tereftalato de
sensibilidade
etileno)
S%
sensibilidade hmica
Pi
pirrol
PICe
polmeros
SAM
camada auto montada
intrinsecamente
SP
plasmns de superfcie
condutores eletrnicos
SPR
ressonncia de plasmn
PiQH
3-(2,5-dihidroxibenzil)
(percentual) ao pH
de superfcie
x

T
temperatura
absortividade
UIR
unidade de ndice de
constante dieltrica do
refrao
meio
m
constante dieltrica do
uni. arb.
Unidade arbitrria
UV-Vis
ultravioleta-visvel
VC
voltametria cclica
eficincia de transmisso
distncia acima da
condutividade eltrica do
superfcie do ouro
metal
bulk
frequncia da luz incidente
xi
ndice de Figuras
Figura 1: Aplicaes tecnolgicas dos polmeros condutores.1 ...................................3
Figura 2: Estrutura da forma neutra de alguns polmeros conjugados com suas
respectivas condutividades para altos nveis de dopagem. Destaca-se o
polipirrol por ser o polmero utilizado neste trabalho. ...........................................4
Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrnsecas do material
como resultado da diferena de energia na regio do gap. ..................................6
Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e
positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11 ......................................7
Figura 5: Ilustrao hipottica de todos os possveis defeitos estruturais
apresentados pelo polipirrol.1 ............................................................................. 11
Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espcie X- representa um
on dopante......................................................................................................... 13
Figura 7: Mecanismo de polimerizao eletroqumica do pirrol. 42 ............................. 14
Figura 8: Esquema da evoluo da estrutura de bandas para o polipirrol. ................ 14
Figura 9: Evoluo do espectro de absoro do Ppi em funo do nvel de
dopagem.11 ......................................................................................................... 16
Figura 10: Equilbrio de dissociao do indicador de pH azul de bromofenol (AB).... 20
Figura 11: Ilustrao dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absoro no
infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os nveis de energia vibracionais.
........................................................................................................................... 27
Figura 12: Tpica excitao do sinal para voltametria cclica, potencial na forma de
onda triangular. ................................................................................................... 30
Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroqumicas e Raman in
situ. ..................................................................................................................... 35
xii
ndice de Figuras
Figura 14: Voltamograma cclico durante a sntese do Ppi-AB. Velocidade de
varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura. .......................................................... 37
Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o nmero de ciclos
utilizado durante a sntese eletroqumica por voltametria cclica vs ECS. .......... 38
Figura 16: Contraste ptico em funo do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados
eletroquimicamente com diferentes nmeros de ciclos durante a voltametria
cclica. Absorbncias correspondentes a 584 nm. ............................................. 39
Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o
indicador AB. ...................................................................................................... 40
Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da
superfcie do filme Ppi-AB, sendo b) distribuio de tomos nitrognio e
c) distribuio de tomos bromo. ........................................................................ 41
Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de
Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro. ...................................................... 42
Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 m x 2,55 m para o Ppi-AB e
2,81 m x 2,81 m para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade mdia quadrtica. ......... 44
Figura 21: Imagens de AFM (diferena na dureza da superfcie) na escala de
2,52 x 2,52 m para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 m para Ppi-ClO4. ........................... 45
Figura 22: Voltamogramas cclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em
detalhe: voltamograma cclico do AB em pH 1,5. Soluco tampo fosfato foi
utilizada como eletrlito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1. ....................... 46
Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em soluo tampo fosfato
de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0. .................................................................... 48
Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em soluo tampo fosfato de pH
a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0. ............................................................................ 50
xiii
ndice de Figuras
Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em
soluo tampo fosfato com diferentes pH. Fonte com emisso em 785 nm..... 52
Figura 26: Espectros Raman in situ em pH 3,0 dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4 (em
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emisso em
633 nm................................................................................................................ 53
633 nm................................................................................................................ 55
633 nm................................................................................................................ 56
Figura 29: Dependncia do equilbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0
e 8,0. As intensidades analisadas correspondem s bandas em 860 cm-1 (AB2-)
e em 893 cm-1 (AB)............................................................................................. 57
Figura 30: Dependncia do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os
equilbrios envolvendo as formas AB e AB - (curva em vermelho) e AB- e AB2(curva em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman
atribudas s formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V. .................... 58
Figura 31: a) Espectros de absoro do filme Ppi-ClO4 imerso em soluo tampo
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 temperatura ambiente. b) Curva
de calibrao para Ppi-ClO4 imerso em soluo tampo de diferentes pH para
valores de absorbncia em 680 nm. ................................................................... 69
Figura 32: a) Espectros de absoro do indicador AB solubilizado em soluo
tampo fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 temperatura ambiente. Em
detalhe: imagem das solues de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas
coloraes. b) Roda de cores desenhada por Newton. ...................................... 70
xiv
ndice de Figuras
Figura 33: a) Espectros de absoro do filme Ppi-AB imerso em soluo tampo
fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 temperatura ambiente. b) Curva
de calibrao para Ppi-AB imerso em soluo tampo de diferentes pH. .......... 72
Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em soluo tampo fosfato de
pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5............................................................................. 75
Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH. ....... 77
Figura 36: Estabilidade ptica dos filmes Ppi-AB imersos em soluo tampo fosfato
de diferentes pH. O desvio padro foi calculado utilizando diferentes filmes de
Ppi-AB. ............................................................................................................... 78
Figura 37: Absorbncia em 584 nm para Ppi-AB imerso em solues tampo de
diferentes pH em funo do nmero de medidas para determinao da
reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padro foram calculados
utilizando diferentes filmes de Ppi-AB. ............................................................... 80
Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes
temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta ptica do Ppi-AB em
584 nm imerso em diferentes pH. ....................................................................... 81
Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168 ....... 88
Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado
eletroquimicamente. Dimenso do substrato de vidro 2,5 cm2. .......................... 91
Figura 41: Sensibilidade hmica (resistncia relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB. ...... 93
Figura 42: Dinmica da resposta hmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e
meio cido (pH 3,0). ........................................................................................... 94
Figura 43: Estabilidade hmica do filme Ppi-AB imerso em tampo fosfato de pH 3,0,
7,0 e 8,0.............................................................................................................. 96
Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em soluo
tampo fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0. ................................................................ 97
xv
ndice de Figuras
Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistncia eltrica do filme Ppi-AB imerso
em solues tampo fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0................................. 99
Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a
distncia da superfcie metlica. ....................................................................... 109
Figura 47: Difrao e espectro de transmisso tpico de luz visvel atravs de um
buraco com sub-comprimento de onda em um filme metlico perfeito
infinitamente fino. ............................................................................................. 111
Figura 48: Transmisso ptica atravs de um nico buraco em um filme metlico de
prata. a) Buraco circular de 270 nm de dimetro em um filme com 200 nm de
espessura e b) seu espectro de transmisso.278 .............................................. 111
Figura 49: Guia de ondas cilndrico com raio r muito menor que o comprimento de
onda do campo eletromagntico incidente, perfurado em um filme metlico de
espessura h. A diminuio exponencial representa a atenuao do regime de
sub-comprimento de onda.278 ........................................................................... 112
Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmisso com incidncia
normal de luz branca atravs de arranjos quadrados contendo buracos com
sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram
utilizadas periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os dimetros
dos buracos so 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para mxima
transmisso ocorre em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um
filme de prata de 300 nm de espessura.276....................................................... 113
Figura 51: Esquema de imobilizao e deteco por bioafinidade das molculas
biotina e estreptavidina. .................................................................................... 119
Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos
periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm
de espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de
nanoburacos. c) Imagem ampliada mostrando a dimenso dos nanoburacos.
xvi
ndice de Figuras
Esta amostra foi utilizada durante as medidas por aquisies de imagens
(seo I.4.1)...................................................................................................... 127
Figura 53: Esquema e descrio do mtodo de fabricao de microestruturas por
litografia soft. .................................................................................................... 128
Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados atravs do
filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os
nanoburacos foram fabricados com 170 nm de dimetro e periodicidade de
500 nm.............................................................................................................. 129
Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmisso de luz atravs dos
arranjos de nanoburacos. ................................................................................. 131
Figura 56: Esquema experimental para a aquisio de imagens por transmisso de
luz atravs dos arranjos de nanoburacos usando uma cmera CCD. .............. 132
Figura 57: Espectros de transmisso para um arranjo de nanoburacos ilustrando a
diminuio da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda
equivalente a 633 nm. ...................................................................................... 134
Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida atravs de arranjos de nanoburacos para
diferentes ndices de refrao. b) Curva de calibrao obtida atravs do grfico
em a) Fonte utilizada: He-Ne. ........................................................................... 135
Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em
um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de dimetro e
periodicidade de 420 nm. b) Imagem da configurao da amostra com matrizes
de nanoburacos organizadas em 7 colunas espaadas por 150 m, contendo 4
linhas de arranjos espaados por 60 m. ......................................................... 135
Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinao da concentrao de
um analito atravs de uma curva de calibrao adquiridos durante experimento
em tempo real................................................................................................... 136
xvii
ndice de Figuras
Figura 61: Imagem fotogrfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas
(15 x 15 m2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 m de
largura. ............................................................................................................. 137
Figura 62: Imagem obtida por uma cmera CCD dos arranjos de nanoburacos
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados
para a deteco do anticorpo PAX8. ................................................................ 138
Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos aps a deteco do anticorpo PAX8. b) Intensidade mdia
transmitida em funo da diluio (calculada para os arranjos em cada
microcanal). ...................................................................................................... 139
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados
para a deteco do antgeno r-PAX8. .............................................................. 140
Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos
de nanoburacos aps a deteco do antgeno r-PAX8. a) amostra diluda e
b) amostra concentrada de r-PAX8. ................................................................. 141
Figura 66: Intensidade mdia transmitida em funo da diluio (calculada para os
arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal). .............................. 142
Figura 67: a) Representao de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de
100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiO x de 50 nm
de espessura. b) Esquema ilustrando a deteco das trs camadas de
molculas confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados
utilizando arranjos de 8 m x 8 m, contendo nanoburacos com 170 nm de
dimetro e periodicidade de 500 nm. ............................................................... 143
Figura 68: Voltamogramas em soluo aquosa de K 3[Fe(CN)6] utilizando como
eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificao e b) eletrodo de ouro
coberto com filme de SiOx obtido aps 120 h de deposio............................. 144
xviii
ndice de Figuras
Figura 69: Espectros de transmisso normalizados empregando solues de glicose
com ndices de refrao conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de
ressonncia a) (1,1) e b) (1,0). ......................................................................... 145
Figura 70: Curvas de calibrao resultantes dos deslocamentos dos mximos de
transmisso para a) banda (1,1) e b) banda (1,0). ........................................... 146
Figura 71: a) Espectro de transmisso para arranjos de nanoburacos periodicamente
organizados, obtidos atravs de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de
100 nm de ouro, quando a superfcie do ouro foi modificada sequencialmente
por uma monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos
deslocamentos do mximo de transmisso aps a adio de BNHS e
estreptavidina, relativos superfcie modificada com cisteamina. ................... 148
xix
ndice de Tabelas
Tabela 1: Anlise quantitativa por EDS dos tomos presentes no Ppi-AB
eletropolimerizado sobre FTO-vidro. .................................................................. 43
Tabela 2: Coeficientes de interferncia (C.I.) obtidos por medidas de absoro do
Ppi-AB imerso em solues tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes........................................................................................................ 83
Tabela 3: Coeficientes de interferncia (C.I.) obtidos por medida de resistncia para
o Ppi-AB imerso em solues tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes...................................................................................................... 100
Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao mximo de transmisso obtidos
atravs de clculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram
utilizadas solues de glicose com diferentes ndices de refrao. .................. 147
xx
Sumrio
Parte I..........................................................................................................................2
I. Consideraes Iniciais ...........................................................................................2
I.1. Introduo ............................................................................................................2
I.1.1. Polmeros Condutores ....................................................................................2
I.1.1.1. Polipirrol.................................................................................................. 10
I.1.2. Sensores ....................................................................................................... 16
I.1.2.1. Sensores baseados em PICe ................................................................. 17
I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe ................................................... 19
II. Objetivos Gerais .................................................................................................. 22
III. Caracterizao do filme polimrico .................................................................. 24
III.1. Introduo ........................................................................................................ 24
III.1.1.
Espectroscopia ultravioleta-visvel (UV-Vis)........................................... 25
III.1.2.
Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman ....................... 25
III.1.3.
Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS) ..................... 27
III.1.4.
Microscopia de Fora Atmica (AFM) .................................................... 28
III.1.5.
Voltametria Cclica ................................................................................. 29
III.2. Objetivo especfico .......................................................................................... 32

III.3. Parte Experimental .......................................................................................... 33
III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 33
III.3.2. Modificao do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposio de platina........... 35
III.3.3. Sntese dos filmes de polipirrol ................................................................... 36
III.4. Resultados e Discusso ................................................................................. 38
III.4.1. Medidas de Espessura ................................................................................ 38
III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV................................................................................ 39
III.4.3. Microscopia de Fora Atmica (AFM) ......................................................... 43
III.4.4. Voltametria Cclica (VC) .............................................................................. 45
III.4.5. Caracterizao in situ .................................................................................. 47
III.4.5.1. UV-Vis .................................................................................................. 47
III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman .................................................... 51
III.5. Concluses Parciais ........................................................................................ 60
IV. Caracterizao ptica para aplicao em sensor de pH ................................. 62
IV.1. Introduo ........................................................................................................ 62
IV.2. Objetivo especfico ......................................................................................... 66
xxi
Sumrio
IV.3. Parte Experimental .......................................................................................... 67
IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 67
IV.3.2. Modificao do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposio de platina e
Sntese dos filmes de polipirrol ................................................................................ 67
IV.4. Resultados e Discusso ................................................................................. 68
IV.4.1. Sensibilidade ptica ao pH......................................................................... 68
IV.4.2. Histerese..................................................................................................... 74
IV.4.3. Tempo de resposta ..................................................................................... 76
IV.4.4. Estabilidade ptica ..................................................................................... 77
IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade ptica ................................................ 79
IV.4.6. Efeito da Temperatura ................................................................................ 81
IV.4.7. Efeito de Interferentes ................................................................................ 82
IV.5. Concluses Parciais ....................................................................................... 84
V. Caracterizao hmica para aplicao em sensor de pH ................................ 86
V.1. Introduo ......................................................................................................... 86
V.2. Objetivo ............................................................................................................. 89
V.3. Parte Experimental ........................................................................................... 90
V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ........................................................ 90
V.3.2. Sntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro digitalizado .......... 90
V.4. Resultados e Discusso .................................................................................. 92
V.4.1. Sensibilidade hmica ao pH........................................................................ 92
V.4.2. Tempo de resposta ...................................................................................... 94
V.4.3. Estabilidade hmica .................................................................................... 95
V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade ptica ................................................. 96
V.4.5. Efeito da Temperatura ................................................................................. 98
V.4.6. Efeito de Interferentes ................................................................................. 99
V.5. Concluses Parciais ...................................................................................... 101
VI. Concluses Gerais ........................................................................................... 102
Parte II..................................................................................................................... 104
I. Consideraes Iniciais ....................................................................................... 104
I.1. Introduo ........................................................................................................ 104
I.1.1. Cncer ........................................................................................................ 104
I.1.1.1. Marcadores de Cncer ......................................................................... 106
xxii
Sumrio
I.1.2. Sensores biolgicos .................................................................................... 106
I.1.3. Ressonncia de plasmn de superfcie (SPR) ............................................ 107
I.1.3.1. SPR atravs de filme de ouro com nanoburacos ................................. 110
I.1.3.2. Aplicao de sensores baseados em SPR ........................................... 116
I.1.3.3. Aplicao de sensores baseados em SPR para deteco de cncer .. 117
I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR ......................................... 118
I.1.4. Estratgias para a melhora da sensibilidade............................................... 121
I.1.4.1. Fatores Geomtricos ............................................................................ 121
I.1.4.2. Mtodos de imobilizao ...................................................................... 122
I.1.5. Microcanais para fluxo de solues ............................................................ 123
I.2. Objetivos .......................................................................................................... 124
I.3. Parte Experimental .......................................................................................... 125
I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos ....................................................... 125
I.3.2. Fabricao dos nanoburacos ...................................................................... 126
I.3.3. Fabricao dos microcanais........................................................................ 127
I.3.4. Deposio de SiOx ...................................................................................... 129
I.3.5. Teste de sensibilidade ................................................................................ 130
I.3.6. Prova de conceito deteco de protena dentro do nanoburaco .............. 130
I.3.7. Medidas pticas e Sistema de Fluxo .......................................................... 130
I.4. Resultados e Discusso ................................................................................. 133
I.4.1. Deteco por imagens ................................................................................ 133
I.4.2. Deteco dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis............. 142
I.5. Concluses ...................................................................................................... 151
VII. Referncias Bibliogrficas ............................................................................. 152
xxiii
Parte I
Captulo I
Sensor de pH baseado em
filmes de polmero
conjugado
Captulo I - Introduo Parte I
Parte I
I. Consideraes Iniciais
I.1. Introduo
I.1.1. Polmeros Condutores
Uma das principais conquistas industriais da qumica no sculo XX foi a
fabricao em grande escala de polmeros sintticos, os chamados polmeros
convencionais.
Com
eles
foram
criados
materiais
fundamentais
para
desenvolvimento tecnolgico, como o plstico, as fibras sintticas e as resinas

artificiais. Devido ao grande interesse nas pesquisas envolvendo estes materiais
polimricos, desencadeou-se um avano na sua tecnologia, possibilitando o
desenvolvimento de novos produtos. Certamente, uma das propriedades mais
importantes dos polmeros convencionais est relacionada com sua capacidade de
se comportar como isolante eltrico tanto para altas frequncias quanto para altas
voltagens, o que confere a eles uma grande aplicabilidade. O estudo e compreenso
das propriedades destes materiais so de grande importncia no sentido de
possibilitar a proposio e desenvolvimento de novos materiais.
A partir da dcada de 70, polmeros com sistemas estendidos, tambm
conhecidos como polmeros conjugados, ficaram conhecidos por apresentarem
propriedades semicondutoras (ou seja, capacidade de conduzir eletricidade).
Inicialmente eles no despertaram interesse cientfico, uma vez que muitos deles
eram opacos, insolveis e infusveis, fatores que dificultavam seu processamento.
Neste aspecto, apresentavam propriedades principalmente mecnicas inferiores
quando comparadas com as dos polmeros at ento conhecidos.1-3 A descoberta
destes materiais ocorreu em meados dos anos 70 quando H. Shirakawa e cols.4
verificaram que o tratamento do poliacetileno com cido ou base de Lewis
aumentava sua condutividade em at dez ordens de grandeza. Esse fato despertou
grande interesse por parte de um nmero significativo de grupos de pesquisa criando
a
*
rea
de
Polmeros
Intrinsecamente
Condutores
eletrnicos (PICe)*
A especificao eletrnicos deve ser feita para diferenci-los dos Polmeros Intrinsecamente
Condutores inicos (PICi).

proporcionando ainda o prmio Nobel de qumica em 2000 a H. Shirakawa
(Universidade de Tsukuba, Japo), A. G. MacDiarmid (Universidade da Pensilvnia,
EUA) e A. J. Heeger (Universidade da Califrnia, Santa Brbara, EUA). Estes PICe
so caracterizados por uma seqncia de ligaes duplas conjugadas na cadeia
polimrica, passando de isolantes a condutores e vice-versa atravs de um processo
de oxidao-reduo, tambm chamado de dopagem e desdopagem.
O grande interesse em se estudar polmeros condutores resulta do grande
nmero de possibilidades de aplicaes destes materiais, incluindo o seu uso como
componente ativo em baterias, sensores, dispositivos eletrocrmicos, capacitores,
diodos emissores de luz (OLED), clulas solares, entre outros.1-8 A Figura 1
apresenta um diagrama esquemtico de propriedades e possveis aplicaes
tecnolgicas dos polmeros condutores eletrnicos.
Sensores
Micromotores
Transdutores
Estado Slido
Litografia
Led,
fotocopiadoras
Piezoeletricidade
Reaes fotoqumicas
no estado slido
Gravao
magntica
Fotocondutividade
Ferromagnetismo
Superfcie
Condutora
EMI/ESO
Polmeros
Condutores
Juno de Josephson Super condutores

Eletrocromismo
Condutividade
Computadores lgicos
Dispositivos
Geradores de alto
Compsitos
Processo
eletrocrmicos
campo magntico
condutores
ptico no-linear
Super capacitores
conectores
Baterias plsticas
Geradores
Harmnicos
Figura 1: Aplicaes tecnolgicas dos polmeros condutores.1

Os polmeros condutores, tambm conhecidos como metais sintticos, so
caractersticos por possurem longos sistemas conjugados, com ligaes duplas e
simples alternadamente ao longo da cadeia polimrica. Dentre os polmeros
condutores mais estudados esto o poliacetileno, a polianilina, o polipirrol e o
3

politiofeno, cujas estruturas em sua forma neutra e suas respectivas condutividades
POLMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
CONDUTIVIDADE
eletrnicas no estado altamente dopado9 esto representadas na Figura

Scm-1 2. Estes
materiais apresentam diferentes condutividades eletrnicas, a qual varia dependendo
do material e do seu nvel de dopagem. A condutividade eletrnica de105um PICe
tambm dependente
do mtodo de preparao e do contra-on usado como dopante.
poli(trans-acetileno)
Embora esteja apresentado o segmento das estruturas mais simples e suas
H
respectivas condutividades, derivados destes PICe podem apresentar condutividade

600
maior do que os valores apresentados na Figura 2.

N
N
POLMERO INTRINSECAMENTE
CONDUTOR
H
H
POLMERO INTRINSECAMENTE
CONDUTOR
polipirrol
Polmero Intrisecamente
Condutor
POLMERO
INTRINSECAMENTE CONDUTOR
S
S
POLMERO INTRINSECAMENTE CONDUTOR
S
S
polipirrol
politiofeno
H
H
H
H
N
N
N
N
NH
N
N N
H N
N
N
H
H H
N
N
H polipirrol
H
polianilina
H
H
N polipirrol
N
poli(p-fenileno)
N
N
H
H
S
S
N
N
polipirrol S
S
H S
H S
S
S
polipirrol
poli(p-fenileno)
S
S
politiofeno
politiofeno
politiofeno
S
S
S
S
N
N
N
S politiofeno
N
N
polianilina
politiofeno
polianilina
polianilina
N
N
N
H
H
N
H
N
CONDUTIVIDADE
CONDUTIVIDADE
-1
-1)
Scm-1
Condutividade
(S.cm
Scm
CONDUTIVIDADE
-1
Scm
1055
200
CONDUTIVIDADE
10
Scm-1
105
H
N
105
600
600
10-100
600
600
200
500
200
200
H
H
N
N
H
N
H
200
100
10-100
10-100
10-100
104
10-100
500 com suas
Figura 2: Estrutura da forma neutra de
H alguns polmeros conjugados
500
polianilina
respectivas condutividades
para altos nveis de dopagem. Destaca-se o polipirrol por
poli(p-fenileno)
poli(p-fenileno)
500
ser o polmero utilizado neste trabalho.
N
N
polianilina
poli(p-fenileno)
500
Os eltrons deslocalizados em sistemas ao longo da cadeia polimrica

poli(p-fenileno)
permitem que esta classe de polmeros tenha propriedades condutoras e

proporcionem habilidade para suportar os portadores de carga positivos e/ou
negativos com alta mobilidade ao longo da cadeia. As propriedades semicondutoras
4

destes materiais surgem da sobreposio de orbitais pz provenientes das ligaes
insaturadas. Esta sobreposio sobre vrios stios resulta na formao de bandas de
valncia (BV) e bandas de conduo (BC) *, com um pequeno gap de energia
entre elas (condio necessria para o comportamento semicondutor).3,10-14
A condutividade destes materiais pode ser aumentada muitas vezes atravs
do processo de dopagem. Este processo pode ser obtido atravs de mtodos
qumicos de exposio direta do polmero a agentes de transferncia de carga
(dopantes) em fase gasosa ou soluo, ou ainda por oxidao eletroqumica. A
dopagem tambm pode ser realizada utilizando substituintes como agentes
oxidantes ou redutores, ou ainda radicais, ons doadores ou aceptores de eltrons. O
termo dopagem utilizado em analogia aos semicondutores inorgnicos cristalinos,
uma vez que em ambos os casos a dopagem aleatria e no altera a estrutura do
material, contudo, na dopagem de polmeros condutores eletrnicos os dopantes no
so considerados apenas impurezas do ponto de vista de quantidade, pois esto
presentes em maior concentrao quando comparados com semicondutores
inorgnicos. A dopagem de polmeros condutores envolve a disperso aleatria ou a
agregao de dopantes em toda a cadeia, levando formao de defeitos e
deformaes na cadeia polimrica, resultando na formao de bandas eletrnicas
desocupadas, as quais so as responsveis pelo aumento da condutividade.3,12
A teoria de bandas no explica porque os portadores de carga, eltrons ou
buracos, possuem spin nulo no poliacetileno.2,10,11 Para explicar estes fenmenos,
alguns conceitos fsicos, como polarons, bipolarons e solitons, so utilizados em
polmeros condutores desde o incio dos anos 80.2
A interao de um monmero com suas vizinhanas, quando da formao do
polmero, leva formao de vrios nveis de energia muito prximos, ocorrendo a
formao de bandas eletrnicas. A banda de valncia (BV) abrange os nveis
eletrnicos ocupados, sendo designado como HOMO (Highest Occupied Molecular
Orbital) o estado eletrnico no topo da BV, ou seja o de maior energia, e a banda de
conduo (BC) constituda pelos nveis no ocupados, sendo designado LUMO
(Lowest Unoccupied Molecular Orbital) o estado eletrnico no fundo da BC, ou seja o
de menor energia. A regio do gap est relacionada com a diferena de energia
entre a BV e a BC e determina as propriedades eltricas intrnsecas do material,
como mostrado na Figura 3.
Energia
BC
LUMO
BC
BV
METAL
BC
GAP
BV
SEMICONDUTOR
GAP
HOMO
BV
ISOLANTE
Figura 3: Diagrama de energia mostrando as propriedades intrnsecas do material

como resultado da diferena de energia na regio do gap.
Polmeros condutores podem ser separados em duas classes, aqueles com
estado fundamental degenerado e aqueles com estados no-degenerados. O
poliacetileno (PA) um exemplo para o primeiro caso, possuindo um estado
fundamental de energia duplamente degenerado (devido s ligaes simples e
duplas que podem ser alternadas sem gasto de energia). Alguns polmeros como
polipirrol, polianilina, politiofeno se encaixam na segunda classe de polmeros
condutores, os quais possuem estados fundamentais no-degenerados de energia,
isso ocorre, por exemplo, no caso do polipirrol, devido diferena de energia entre
as formas quinide e benzide.
Com relao ao PA, Su e cols.15 propuseram um modelo baseado na existncia
de defeitos estruturais na cadeia originados durante a polimerizao, resultando na
formao de radicais no estado desdopado.16 Estes defeitos deslocalizados seriam
provenientes de alguns tomos de carbono da cadeia polimrica. Na configurao
cis este defeito, por unir duas estruturas de energia ligeiramente diferentes, seria
localizado, enquanto que na configurao trans o defeito por unir estruturas
exatamente de mesma energia (hbridos de ressonncia degenerados), permitiria um
rearranjo na cadeia do polmero envolvendo o radical livre e os eltrons- da ligao
dupla mais prxima. Este defeito (Figura 4) foi chamado de soliton,17 que em termos
de estrutura eletrnica, o responsvel pelo aparecimento de um nico nvel de

energia localizada exatamente no meio do gap, devido degenerescncia do
sistema no estado fundamental.
Reduo
Oxidao
BC
BC
BC
BV
BV
BV
Figura 4: Modelo do soliton no poliacetileno, ilustrando o soliton negativo, neutro e

positivo, da esquerda para a direita, respectivamente.11
Atravs de processos de oxidao ou reduo possvel remover ou adicionar
eltrons na cadeia polimrica, originando
solitons carregados positiva ou
negativamente. Estas espcies podem se mover ao longo da cadeia do PA

transportando a carga, no entanto com spin zero. Quando um eltron adicionado
ao ction ou removido do nion, um radical soliton neutro outra vez estabelecido.
Este modelo baseado nos solitons no explica o comportamento exibido por outros
polmeros condutores poli-heterocclicos, pois no possuem estado fundamental
degenerado.
O modelo polaron/bipolaron consiste em uma extenso do Modelo de Bandas,
sendo o modelo terico mais empregado para explicar a conduo eltrica nos
polmeros intrinsecamente condutores. Polaron18-20 o nome que se d ao ction
7

radical (buraco). Este ction radical, com spin associado a presena de um
estado eletrnico localizado no gap. Ele inserido na cadeia polimrica com ligaes
duplas conjugadas atravs de um processo de oxidao, levando ento formao de
uma carga localizada por um processo energeticamente favorecido. A presena deste
buraco na matriz polimrica, ou seja, o estado ionizado do polmero pode ser
estabilizado por uma distoro geomtrica local.1 Tomando a dopagem do tipo p como
exemplo, a remoo inicial de um eltron da cadeia polimrica leva a formao do
polaron associado com a mudana da cadeia da forma aromtica para a forma
quinide. Esse processo conduz formao de estados eletrnicos no gap (smbolo
Egap), (regio de energia entre o topo da BV e o fundo da BC), causando um
deslocamento energtico da BV e da BC.11 Os estados intermedirios de energia
criados no gap durante o processo de oxidao permitem transies eletrnicas que
induzem notveis mudanas na colorao devido a dopagem, este processo que
reversvel chamado de eletrocromismo.21
Quando um segundo eltron retirado da cadeia polimrica, podem ocorrer
duas situaes: (i) em nveis baixos de oxidao o eltron pode ser retirado de um
segmento diferente na cadeia polimrica, criando um novo polaron independente ou
(ii) o eltron retirado de um nvel polarnico j existente (remoo do eltron
desemparelhado), levando formao de um diction radical, que chamado de
bipolaron.2 Bipolarons, assim como polarons, esto associados com distores
geomtricas locais na cadeia. A formao do bipolaron indica que a energia ganha
na interao com o retculo maior que a repulso coulmbica entre as duas cargas
confinadas no mesmo espao.2,11 Idealmente assume-se a formao de mltiplos
estados diinicos termodinamicamente estveis (bipolarons) durante os processos de
ionizao associados com distores geomtricas locais da cadeia. A formao de um
bipolaron leva a uma diminuio da energia de ionizao do polmero, motivo pelo
qual um bipolaron termodinamicamente mais estvel do que dois polarons.11 Alm
disso, assume-se que o estado bipolaron localmente distorcido compreende somente
quatro ou cinco unidades monomricas de um segmento polimrico e que o ganho de
energia, em comparao a dois estados polarons, de 0,45 eV. Em termos de
energias redox, isso significa que o potencial redox E0redox para a formao do
bipolaron poderia ser menor que o E0redox para a formao de dois polarons. Ambos,

polarons e bipolarons podem mover-se ao longo da cadeia polimrica atravs do
rearranjo das ligaes conjugadas quando expostos a um campo eltrico.2
Os bipolarons criados na cadeia polimrica so responsveis pela conduo
eltrica. O transporte acontece via mobilidade ao longo dos segmentos da cadeia
conjugada polimrica e por saltos intercadeia (hopping). A condutividade eltrica do
bulk equivalente ao produto da concentrao dos portadores livres contidos no
material (n) e a sua mobilidade relativa (), (Equao 1), onde e a unidade de
carga eletrnica (1,6 x 10-19 C). Como a mobilidade do on dopante dentro do
material seco muito baixa, estes polmeros so verdadeiramente condutores
eletrnicos e no inicos.
.n.e
Equao 1
O fator limitante da condutividade a mobilidade do portador de carga e no a

concentrao. Existem no mnimo trs elementos que contribuem para a mobilidade
dos portadores: transporte intracadeia, transporte intercadeia e contato interpartcula.
Estes elementos compreendem uma complicada e resistiva rede, a qual determina
uma mobilidade efetiva dos portadores. Assim, a mobilidade e, portanto, a
condutividade determinada em ambos os nveis microscpico (intra e intercadeia) e
macroscpico (interpartculas).22 Dados experimentais sobre a mobilidade dos
portadores em filmes de PA confirmaram que o transporte intercadeia e interpartcula
so os fatores limitantes para a conduo.23 Desta forma, embora a teoria particular
da estrutura molecular possa prever uma menor condutividade baseada na
conjugao de uma cadeia simples, a condutividade observada um reflexo da
interao interpartcula e das interaes intercadeia.24,25
A condutividade em um slido causada por dois fatores: 1 o nmero de
portadores de carga (eltrons/buracos) e a mobilidade destes portadores, que como
mencionando anteriormente o fator limitante da condutividade. A condutividade
eltrica de muitos polmeros condutores est na mesma faixa de grandeza da
maioria dos semicondutores inorgnicos.26 No entanto, os semicondutores
inorgnicos possuem um baixo nmero de portadores (na ordem de 1016 a
1018 cm-3), mas possuem altas mobilidades (102 a 105 cm2.V-1.s-1). Esta alta
mobilidade ocorre devido ao alto grau de cristalinidade e pureza destes materiais,
bem como ao nmero relativamente baixo de defeitos presentes na sua estrutura.2
9

Os polmeros condutores, por outro lado, possuem um grande nmero de portadores
(1021 a 1023 cm-3), mas uma baixssima mobilidade (10-4 a 10-5 cm2.V-1.s-1), devido
principalmente
ao
grande
nmero
de
defeitos
estruturais
(reticulao
desordenamento das cadeias), como exemplificado para o polipirrol na Figura 5.

Desta maneira, a obteno de polmeros condutores com maiores condutividades
est diretamente relacionada ao aumento da mobilidade dos portadores. Isto pode
ser viabilizado pela obteno de materiais mais ordenados, ou seja, com melhor
orientao das cadeias, livre de reticulaes e defeitos.2
A influncia do arranjo estrutural do material, comparando condutores
orgnicos e inorgnicos, deve tambm ser levada em conta nos mecanismos de
transporte de carga. Em polmeros conjugados, como em todos os materiais
orgnicos, a ionizao resulta em uma substancial distoro do arranjo em torno dos
stios ionizados, o que leva a uma limitao do movimento dos portadores de carga e
portanto, a uma diminuio da mobilidade. Em semicondutores inorgnicos a
distoro menos evidenciada e como resultado estes materiais alcanam altas
condutividades. Como a desordem representa uma regra dominante, polmeros
conjugados so provavelmente mais anlogos a semicondutores amorfos do que a
semicondutores cristalinos.20
I.1.1.1. Polipirrol
O poliacetileno foi o primeiro polmero condutor a ser sintetizado.27 No
entanto,
este
polmero
possui
instabilidade
trmica
ambiental.
Como
consequncia, outros polmeros passaram a ser intensivamente investigados com o

intuito de superar estas limitaes. Dentre eles o polipirrol (Ppi) um dos que mais
se destacam, sendo muito promissor para aplicaes comerciais. Apesar de ser
conhecido h muito tempo (1916),28 ele passou por uma espcie de redescoberta
no final da dcada de 7029 quando foram descobertas suas propriedades
condutoras. Este polmero condutor um material que apresenta alto potencial para
aplicao em dispositivos eltricos e eletrocrmicos devido principalmente sua alta
condutividade eltrica, reatividade redox, facilidade de sntese, alta estabilidade
trmica, alm de boa estabilidade qumica em condies ambientais normais.30-35
Desde a descoberta das propriedades condutoras do polipirrol em 1979, numerosos
estudos foram realizados sobre este material. Sua condutividade e outras
propriedades
eltricas
como
efeito
eletrocrmico
atraem
muito
interesse,
10

principalmente devido ao possvel controle das propriedades eltricas atravs das
condies experimentais de sntese.30,34
A sntese do polipirrol pode ser feita atravs de diferentes mtodos, incluindo
polimerizao por oxidao qumica, eletroqumica30 ou fotoqumica.36 Os agentes
oxidantes mais utilizados durante a polimerizao por oxidao qumica so:
persulfato de amnio, perxido de hidrognio e sais de metais de transio (Fe3+,
Cu2+, Cr6+, Ce4+, Ru3+ e Mn7+).30 Durante este tipo de polimerizao, ocorre a
formao do ction radical intermedirio, extremamente reativo. O acoplamento
ocorre de maneira aleatria, resultando em um grande nmero de defeitos e
reticulaes, alm da falta de orientao entre as cadeias.
O
grupamento
carboxila
H
N
N
H
acoplamento
2,3
N
H
H
N
N
H
hidrogenao
N
H
H
H
H
N
N
H
N
H
H
N
n
H
N
OH
anis subsequentes
sem rotao
N
H
grupamentos
OH
NH
NH
Figura 5: Ilustrao hipottica de todos os possveis defeitos estruturais

apresentados pelo polipirrol.1
Idealmente, o crescimento das cadeias do polipirrol se d atravs dos tomos
de carbono nas posies 2 e 5 do anel pirrlico. Desta forma, a conjugao entre as
ligaes duplas e simples seria maximizada, uma vez que aumentam a mobilidade
11

dos portadores de carga.1,2 No entanto, verificado um grande nmero de
acoplamentos em outros tomos de carbono do anel, o que leva diminuio da
mobilidade dos portadores de carga. Cerca de 30% das ligaes C-C entre os anis
pirrlicos no so ideais.2 A Figura 5 mostra alguns dos vrios tipos de defeitos
possveis de serem encontrados no Ppi.
A polimerizao eletroqumica o mtodo de sntese mais usado,37 uma vez
que possibilita a formao de filmes sobre eletrodos. A eletropolimerizao tem
estequiometria eletroqumica38 entre 2,2 e 2,6 F.mol-1. No processo de polimerizao
so consumidos 2,0 F.mol-1 e a carga excedente usada no processo de dopagem
do polmero, o qual ocorre simultaneamente sntese. O mecanismo de
eletropolimerizao para heterocclicos considera a formao de um ction-radical
do monmero, seguida do acoplamento de dois ctions radicais, com sada de dois
prtons e reconstituio de ctions radicais do monmero e dos oligmeros
formados.
A estabilidade do ction radical do monmero o fator determinante para
obteno de um polmero com elevado grau de conjugao (ou comprimento de
conjugao). Um ction radical muito estvel pode difundir do eletrodo dando origem
a oligmeros solveis, enquanto que um muito reativo pode sofrer reaes
colaterais. As propriedades eltricas e fsico-qumicas do material eletrosintetizado
dependem fortemente das condies de sntese, tais como: concentrao do
monmero, natureza do meio eletroltico, temperatura, etc.37,39,40
A natureza do dopante tem um papel importante na estabilidade e
condutividade dos polmeros condutores. No polipirrol, uma alta concentrao de
dopante leva formao de espcies polarnicas paramagnticas. Aumentando-se o
grau de dopagem, estes polarons so convertidos a bipolarons, os quais se
estendem, cada um, sobre quatro anis pirrlicos. As estruturas esquematizadas do
polaron e bipolaron no polipirrol esto representadas na Figura 6. O fragmento
portador de carga, constitudo de quatro anis pirrlicos, pode viajar ao longo da
cadeia atravs de um rearranjo das ligaes duplas e simples.2 Scott e cols.,41
observaram a formao de filmes de polipirrol com altos valores de condutividade
obtidos eletroquimicamente. Essa observao levou esses autores a sugerir que a
ausncia de paramagnetismo observada por ressonncia paramagntica eletrnica
12

(EPR), associada com uma corrente de portadores pode ser explicada atribuindo
esses portadores a espcies bipolaronicas com spin nulo.20,41
H
N
H
N
H
N
X N
H
N
H
N
H
Polaron
H
N
H X
N
+
C
H
N
X N
H
N
H
Bipolaron
N
H
Figura 6: Modelos do polaron e bipolaron no polipirrol. A espcie X- representa um

on dopante.
A eletropolimerizao do pirrol (Figura 7) envolve uma etapa inicial, na qual
ocorre a oxidao do monmero formando um ction radical. Este pode se ligar a
outro ction radical ou a um monmero, seguida de uma transferncia de carga.
Nesta etapa so eliminados dois prtons, formando um dmero neutro. A reao
continua levando a um aumento da massa molar desse oligmero, at a formao
das cadeias polimricas. O polmero resultante da polimerizao eletroqumica
apresenta preferencialmente acoplamento 2-5, de acordo com o esquema ilustrado
na Figura 7.42
13
CH
+
N
H
C
H
N
H
N
H
C
H
N
H
H
N
-e
H
N
H
N
N
H
N
H
-e
H
N
N
H
N
H
H+
N
H
CH
N
H
N
H
N
H
N
H
2H+
Figura 7: Mecanismo de polimerizao eletroqumica do pirrol.42

A evoluo da estrutura de bandas proposta por Bredas e cols. 20 para o
polipirrol em diversos nveis de dopagem est mostrada na Figura 8. Quando uma
nica carga positiva introduzida na cadeia, ocorre a formao do polaron (energia de
ligao 0,12 eV). Sua presena na cadeia introduz dois nveis eletrnicos localizados
no gap: um estado polaron ligante, ocupado com um eltron e localizado 0,49 eV
acima da BV e um estado polaron antiligante vazio localizado 0,53 eV abaixo da BC.
BC
BC
BC
0,70 eV
0,53 eV
0,79 eV
0, 39 eV
3,16 eV
3,56 eV
0,45 eV
0,75 eV
0,49 eV
0,76 eV
BV
BV
POLARON
baixo nvel de oxidao
BIPOLARON
parcialmente oxidado
BV
BANDA BIPOLARON
altamente oxidado
Figura 8: Esquema da evoluo da estrutura de bandas para o polipirrol.

14

Os estados polarnicos no gap permitem que trs diferentes transies ocorram
(Figura 9) quando o polmero se encontra em baixos nveis de oxidao, (estado
parcialmente neutro, reduzido). Nestas condies, o polipirrol possui um mximo de
absoro intenso em 3,16 eV (400 nm) que ocorre devido Egap (energia de gap)
associada com a transio *. Dentro desta regio de gap possvel observar 3
bandas de absoro, relacionadas s trs diferentes transies mencionadas acima.
Uma destas bandas aparece em 0,7 eV (1771 nm) e pode ser atribuda transio da
BV para o estado polaron ligante. A banda em 1,4 eV (886 nm) associada com a
transio do estado polaron ligante para o polaron antiligante e finalmente a banda em
2,1 eV (590 nm) corresponde transio da BV para o estado polaron antiligante. As
diferentes localizaes do estado polaron antiligante e ligante comparado com a BC e
BV, respectivamente, ocorrem devido s diferentes contribuies dos orbitais do
nitrognio para as bandas de valncia e para as bandas de conduo.
O aumento do nvel de oxidao faz com que os estados polarnicos comecem
a interagir. Clculos tericos indicam que dois polarons, ao se aproximarem, se tornam
instveis com respeito a orientao de seus spins e ocorre ento a formao do
bipolaron duplamente carregado e com spin nulo. A extenso do bipolaron sobre 4
anis pirrlicos, mas a deformao da cadeia muito menor do que no caso do
polaron. Com respeito aos dois processos de ionizao, o ganho em energia total ao
formar o bipolaron 0,69 eV. Isto indica que a formao de um bipolaron favorecida
em relao a formao de 2 polarons por 0,45 (= 0,69 2 x 0,12) eV. Um bipolaron
introduz dois estados de transio na regio do gap em 0,75 eV acima da BV e 0,79 eV
abaixo da BC. O estado bipolaron ligante, ao contrrio do polaron ligante, encontra-se
vazio. Como resultado, somente duas transies sero possveis, ocorrendo, portanto,
o desaparecimento do modo de absoro em 1,4 eV, alm disso as demais transies
se deslocam para maiores valores de energia.
Em altos nveis de dopagem (por exemplo, um bipolaron para cada 6 anis de
pirrol) a Egap de aproximadamente 3,6 eV (344 nm), ou seja, 0,40 eV maior
comparada com a Egap do polmero desdopado. Alm desta, aparecem duas bandas de
absoro
intensas,
centradas
em
1,0 eV (1240 nm)
em
2,7 eV (459 nm),
relacionadas existncia de duas bandas bipolaron formadas na regio de Egap.
15
1,0
2,7
Densidade ptica
Aumentando o nvel de dopagem
3,6
3,2
0,7
0,0
1,0
1,4
2,1
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
E / eV
Figura 9: Evoluo do espectro de absoro do Ppi em funo do nvel de

dopagem.11
I.1.2. Sensores
Um sensor um dispositivo que mede ou detecta uma condio, convertendo
a resposta em um sinal que pode ser lido ou observado por um instrumento. 43 Um
exemplo simples de sensor o termmetro de mercrio, o qual converte a medida
de calor (temperatura) em expanso e contrao do lquido, registrando a resposta
em um tubo de vidro graduado. Sensores so usados diariamente em, por exemplo,
botes de elevadores e lmpadas, os quais so acesos ou apagados ao serem
tocados (sensveis ao toque). Existem inmeras aplicaes para sensores, tantas
que muitas vezes as pessoas no se do conta. Dentre estas aplicaes esto
includos sensores em carros, computadores, naves espaciais, fbricas e robs,
entre outros.
A tcnica de utilizao de sensores na rea cientfica tem algumas vantagens
sobre outros mtodos de anlise visto que no utiliza reagentes e no necessita de
16

qualquer tipo de pr-tratamento. Alm disso, possui bons nveis de sensibilidade e
especificidade e retorna um resultado de forma rpida ao analista. Esta tcnica
tambm pode ser utilizada em uma linha de controle de qualidade durante um
processo de fabricao, por exemplo. Entretanto, os sensores tambm tm algumas
desvantagens, principalmente no que diz respeito reprodutibilidade, recuperao e
os efeitos da umidade e da temperatura na resposta.
Atualmente, muitos sensores comerciais esto disponveis no mercado
juntamente com um grande nmero de prottipos de sensores que esto sendo
desenvolvidos por instituies de pesquisa. Todos estes tipos de sensores exibem
interaes fsicas e qumicas quando expostos aos compostos qumicos. Devido
grande quantidade de sensores disponveis, a opo de escolha portanto, muito
ampla.
I.1.2.1. Sensores baseados em PICe

O interesse em sensores baseados em polmeros conjugados aumenta ano
aps ano desde que Diaz e cols.44 desenvolveram o primeiro sensor de polipirrol. Na
forma mais simples, um filme fino de polmero depositado num substrato condutor
formado por dois eletrodos paralelos de platina ou ouro com uma base isolante como
xido de silcio ou vidro para formar o sensor.45
Os polmeros mais usados em sensores so:46-48 polipirrol, polianilina e
politiofeno, os quais so sintetizados na presena de agentes dopantes como cidos
ou sais.49 A cada dia, novos polmeros contendo sistemas de ligaes conjugadas
esto sendo sintetizados para ampliar as aplicaes em produtos microeletrnicos.50
As caractersticas desses tipos de sensores explicam o porqu de serem os mais
utilizados em conjuntos sensoriais. Eles so facilmente fabricados, seu consumo de
energia baixo, so robustos e podem trabalhar temperatura ambiente. Como
mencionado anteriormente, existem vrios tipos de polmeros, incluindo uma grande
variedade de derivados e alm disso, um grande nmero de polmeros novos surge
todos os anos. A possibilidade de modificar suas propriedades utilizando diferentes
dopantes,49 torna possvel o desenvolvimento de sensores especficos para
compostos volteis (e.g., cetonas, aldedos ou lcoois), ou para alguma aplicao
particular (caracterizao ou identificao). O estado de oxidao do polmero
tambm pode ser alterado aps sua deposio, para investigar sua caracterstica
sensvel.45
17

Os PICe so resistentes ao envenenamento por compostos que inativam
sensores fabricados com xidos semicondutores inorgnicos, mas o tempo de vida
de um sensor PICe cerca de apenas 9 a 18 meses, ou seja, bem menor que dos
sensores base de xidos metlicos. Este ainda um problema a ser resolvido.
Alm disso, a natureza randmica do processo de deposio um problema
no que diz respeito produo de sensores reprodutveis.45 Os sensores possuem
tambm outros inconvenientes como o longo tempo de resposta (de 20 a 40 s),49
tornando-os inaptos com o passar do tempo ou com mudanas na temperatura.
Entretanto, o principal problema que eles tambm so extremamente sensveis
umidade, contudo esse aspecto pode ser positivamente aplicado para o
desenvolvimento de sensores de umidade.51
Devido ao fato dos PICe serem sensveis a muitos tipos de volteis, muitas
aplicaes so descritas na literatura. Eles so sensveis a lcoois, cetonas,
benzeno e outros compostos polares. Diversas pesquisas mostram aplicaes dos
PICe em produtos alimentcios como cervejas e outras bebidas alcolicas,52,53 leo
de oliva,54 suco de laranja,55 peixe,56 leite,57 caf58 e vinho.59 Alm das aplicaes na
rea alimentcia, os sensores a base de PICe tambm podem ser aplicados no
monitoramento de hidrocarbonetos aromticos60 e na identificao de odores de
materiais plsticos utilizados em automveis,61 entre outras aplicaes.
O polipirrol especialmente promissor para aplicaes comerciais devido a
sua boa estabilidade ambiental e facilidade de sntese. A polimerizao
eletroqumica do pirrol em soluo aquosa permite o uso de um grande nmero de
nions como dopante,62-64 incluindo indicadores de pH.65,66 Desta forma, ele pode
atuar como matriz hospedeira para diferentes tipos de dopantes. Essa propriedade
tem sido explorada para fazer deste material um dispositivo sensvel a diferentes
tipos de analitos.67-75
A pesquisa baseada no polipirrol tem sido motivada devido s suas
importantes aplicaes como em baterias,76-78 membranas de separao de gs,79,80
sensores,81-84 dispositivos microeletrnicos,85 revestimento,86 compsitos87,88 e
sensores qumicos.89-95 Todos estes dispositivos tm propriedades pticas,
mecnicas e eltricas interessantes devido possibilidade de aplicao onde
materiais inorgnicos no so adequados.
18

I.1.2.2. Sensores para pH baseados em PICe
Pode-se dizer que o on hidrognio unipresente, j que pode ser encontrado
na maioria das reaes qumicas.96 Ele quantificado como pH atravs do logaritmo
negativo da sua atividade.
= log
Equao 2
O pH de uma soluo tem um efeito significante nas reaes qumicas, desta

forma as medidas e controle do pH so fundamentais na qumica, bioqumica,
qumica clnica e cincia ambiental, sendo usualmente feitas utilizando eletrodos de
vidro. O mtodo pioneiro para medidas de pH foi baseado na utilizao de
indicadores, por exemplo papel tornassol, o qual muda sua cor de acordo com o pH
da soluo, ficando na colorao azul em meio alcalino e vermelho em meio cido.
Para processos qumicos dependentes do pH importante que as amostras
aquosas tenham seu pH medido ou monitorado. Alm do mtodo ptico, onde a
medida resultante de mudanas de absorbncia,97,98 refletncia99,100 ou
fluorescncia101,102 de um indicador sensvel ao pH, que reage reversivelmente com
os prtons da amostra, existem outros sistemas comuns para medir o pH baseados
em dispositivos amperomtricos ou potenciomtricos. Membranas on-seletivas,
fibras pticas, sensores baseados em fluorescncia e dispositivos condutimtricos
sensveis a pH tambm foram desenvolvidos.103,104 No entanto, estes dispositivos
podem ser instveis e, portanto, requerem constante re-calibrao. Embora o
indicador tornassol e outros indicadores de pH mencionados anteriormente sejam
amplamente usados em vrias reas, um considervel interesse na pesquisa tem
sido focado no desenvolvimento de sensores qumicos ou biolgicos usando
polmeros conjugados. Como resultado, na literatura encontra-se revises completas
sobre a aplicao de polmeros em vrios dispositivos sensoriais 105 e, mais
especificamente, revises de vrios mtodos utilizados para as medidas.106
As propriedades de troca inica dos polmeros condutores so de especial
interesse para o desenvolvimento de sensores potenciomtricos.107-109 Muitos
polmeros condutores possuem grupos cidos e/ou bsicos, os quais podem ser
protonados ou desprotonados (por exemplo, polianilina e polipirrol). A desprotonao
destes PICe resulta na diminuio da concentrao de portadores de carga ao longo
da cadeia polimrica, a qual acompanhada de mudanas nas propriedades pticas
19

e eltricas do material. Levando em considerao o polipirrol, a protonao aumenta
a sua condutividade, enquanto que a desprotonao a diminui.105 Devido
desprotonao das cadeias de Ppi, a absorbncia entre 600 e 900 nm aumenta
quando o pH variado de 6 para 12, alm disso ocorre um deslocamento da banda
para menores valores de comprimento de onda.
Como dito anteriormente, o Ppi alm de ter suas propriedades pticas e
eltricas afetadas pelo pH do meio, pode ainda ser utilizado como matriz hospedeira
para a incorporao de diferentes dopantes, como por exemplo um indicador cido
base (e.g. Azul de Bromofenol (AB)). Este indicador (Figura 10) apresenta
grupamento sulfnico que contribui para sua solubilidade em gua, e ainda quando
altamente desprotonado se torna um contra-on diinico para o polipirrol,
proporcionando maior organizao do polmero, a nvel molecular. 110 Alm disso,
possui pKa cido (faixa de viragem 3,0 a 4,6),111-114 o qual difere do apresentado pelo
Ppi (8,6).115 Esta diferena de pKa apresentada pelo dopante e matriz polimrica
particularmente interessante para a compreenso da sensibilidade ao pH do sistema
e estudo do comportamento do dopante no interior da matriz polimrica em
diferentes condies.
OH
Br
Br
Br
O
Br
Br
SO3
pKa = 3,0
H
HO
Br
AB
H
O
SO3
pKa = 4,6
Br
S
Br
Br
Br
HO
Br
O
Br
AB-
AB2-
Figura 10: Equilbrio de dissociao do indicador de pH azul de bromofenol (AB).
20
Captulo II
Objetivos Gerais
21
Captulo II Objetivos Gerais Parte I
II. Objetivos Gerais

Na Parte I deste trabalho, objetivou-se a obteno de um material sensvel ao
pH baseado em Ppi dopado com o indicador cido-base AB (Ppi-AB) e o estudo e
compreenso da origem da sensibilidade ao pH deste material. Alm de investigar a
influncia do corante sobre a resposta do Ppi ao pH, explorando suas propriedades
pticas e eltricas, objetivamos o estudo do processo que ocorre no equilbrio
qumico de dissociao deste corante, quando no interior da matriz polimrica. A
partir destes estudos buscamos a aplicabilidade do Ppi-AB como sensor ptico e
hmico para pH.
22
Captulo III Caracterizao do filme polimrico Parte I

Captulo III
Caracterizao do filme
polimrico
23
III. Caracterizao do filme polimrico

III.1. Introduo
Durante o processo de dopagem de um PICe, ocorre a incorporao de ons
na matriz polimrica para que ocorra o balanceamento das cargas positivas geradas
ao longo da cadeia. Os polmeros podem ser sintetizados por processo qumico ou
eletroqumico. Durante a sntese qumica normalmente so utilizados agentes
oxidantes, como (NH4)2(S2O7) ou FeCl3, sendo frequentemente usados para a
preparao de polmeros intrinsecamente condutores eletrnicos (PICe) em soluo,
enquanto que a deposio eletroqumica principalmente usada para a deposio
de filmes de PICe sobre substratos condutores. Algumas das vantagens deste ltimo
mtodo esto relacionadas ao controle da espessura do filme, o que feito pelo
controle da carga que passa atravs da clula eletroqumica durante o crescimento
do filme; tambm possvel controlar o nvel de dopagem do polmero atravs do
ajuste do potencial eltrico. Ao contrrio, a dopagem qumica no proporciona a
mesma facilidade de controle do nvel de dopagem e da espessura dos filmes,
resultando em filmes com pouca reprodutibilidade quantitativa.
A possibilidade de se utilizar diferentes dopantes durante a sntese de um
PICe permite o ajuste das propriedades do filme, possibilitando sua aplicao em
vrios sensores qumicos e biolgicos. Materiais com propriedades crmicas podem
ser facilmente obtidos atravs da incorporao de corantes orgnicos no filme
polmerico. Muitos dos corantes tm pouca solubilidade em gua devido forte
interao intermolecular - e estrutura planar. Entretanto, corantes cidos
possuindo grupamentos sulfonato so mais solveis e como consequncia tm sido
usados como dopantes.116,117 O sistema conjugado de corantes pode interagir com o
sistema dos polmeros condutores, como o Ppi, levando a sistemas hbridos com
novas propriedades pticas e eletrnicas.66,118,119 Como a natureza do on dopante
tem influncia nas caractersticas estruturais, pticas e eltricas dos PICe, estas
propriedades tm sido extensivamente estudadas120,121 por diferentes tcnicas
espectroscpicas e eletroqumicas. Uma breve introduo sobre as tcnicas
utilizadas neste captulo ser apresentada a seguir.
24
III.1.1.
Espectroscopia ultravioleta-visvel (UV-Vis)
A regio do espectro eletromagntico correspondente ao ultravioleta fica entre

200 e 380 nm enquanto que o visvel corresponde faixa de comprimento de onda
() entre 380 e 780 nm, esta ltima a responsvel pela cor das substncias e
objetos. A absoro da radiao ultra-violeta ou visvel provoca a excitao de
eltrons da molcula, originando as transies eletrnicas, onde os eltrons de
valncia so promovidos de seu estado fundamental para um estado de mais alta
energia (estado excitado). A energia total de uma molcula corresponde soma de
sua energia eletrnica (Eelet), vibracional (Evib) e rotacional (Erot), sendo que a
magnitude destas energias diminui na seguinte ordem: E elet > Evib > Erot. As principais
caractersticas de uma banda de absoro so: posio e intensidade. A posio
corresponde ao comprimento de onda da radiao cuja energia igual quela
necessria para ocorrer a transio eletrnica. Por sua vez, a intensidade da
absoro depende das regras de seleo para a transio eletrnica.122
Embora sejam os eltrons que sofram a excitao do estado fundamental
para o estado excitado, o ncleo ao qual esses eltrons so mantidos presos atravs
das ligaes tambm tem sua importncia na determinao do comprimento de onda
da absoro. Assim, a energia caracterstica da transio uma propriedade de um
grupo de tomos conhecido como cromforo.
III.1.2.
Espectroscopia Infravermelho e Espectroscopia Raman
A espectroscopia estuda a interao da onda eletromagntica com a matria,

onde feito o estudo dos nveis de energia de tomos ou molculas. Geralmente, as
transies eletrnicas so situadas na regio do ultravioleta ou visvel, as
vibracionais na regio do infravermelho e as rotacionais na regio de microondas e,
em casos particulares, tambm na regio do infravermelho longnquo (ou distante).
Em uma molcula, o nmero de vibraes e a descrio dos modos
vibracionais em cada tipo de espectroscopia vibracional (infravermelho e Raman)
podem ser previstas a partir da simetria da molcula e da aplicao da teoria de
grupo. Embora ambas as espectroscopias estejam relacionadas s vibraes
moleculares, os mecanismos bsicos de sondagem destas vibraes so
essencialmente distintos em cada uma. Consequentemente, os espectros obtidos
apresentam diferenas significativas; quando ocorre a presena de um mesmo pico
nos espectros Raman e no infravermelho observa-se que o seu tamanho relativo nos
25

espectros muito diferente. Em muitos casos, certo pico aparece em um espectro e
totalmente ausente em outro. Devido a essas diferenas, a espectroscopia no
infravermelho mais eficaz em alguns casos e em outros a espectroscopia Raman
oferece espectros mais teis. De modo geral, pode-se dizer que as espectroscopias
Raman e infravermelho so tcnicas complementares.
A condio para que ocorra absoro da radiao infravermelha que haja
variao do momento de dipolo eltrico da molcula como resultado do seu
movimento vibracional ou rotacional (o momento de dipolo determinado pela
magnitude da diferena de carga e a distncia entre dois centros de carga). Somente
nessas circunstncias, o campo eltrico alternante da radiao incidente interage
com a molcula, originando os espectros. De outra forma, pode-se dizer que o
espectro
de
absoro
no
infravermelho
tem
origem
quando
radiao
eletromagntica incidente tem uma componente com freqncia correspondente a

uma transio entre dois nveis vibracionais. A vibrao dos tomos no interior de
uma molcula apresenta energia coerente com a regio do espectro eletromagntico
correspondente ao infravermelho (de 200 a 14290 cm-1).123 O espectro infravermelho
de um composto qumico considerado uma de suas propriedades fsico-qumicas
mais caractersticas e por conta disto, a espectroscopia na regio do infravermelho
tem extensa aplicao na identificao dos compostos.
Em um experimento Raman, a amostra irradiada com uma radiao laser
monocromtica de alta potncia, geralmente na regio do visvel do espectro
eletromagntico, sendo a frequncia desta radiao muito maior que as frequncias
das transies vibracionais. Quando uma molcula irradiada por radiao
eletromagntica, a energia pode ser transmitida, absorvida ou espalhada. No efeito
Tyndall a radiao espalhada por partculas enquanto que no efeito Rayleigh so
as molculas que espalham a luz, porm em nenhum destes efeitos ocorre qualquer
alterao do comprimento de onda da luz. Diferentemente do espalhamento
Rayleigh, onde a frequncia do fton espalhado a mesma do fton incidente, no
espalhamento Raman ocorre alterao na energia da molcula (E). Se a molcula
ganha energia, a frequncia do fton espalhado menor que a frequncia do fton
incidente, dando origem s linhas Stokes no espectro Raman. Quando a molcula
perde energia, a situao inversa e neste caso so originadas as linhas anti-Stokes
(Figura 11).
26
Estado
Virtual
Estado
Virtual
h(+vib)
Estado
Virtual
h(-vib)
vib
Rayleigh
Anti-Stokes
Estado
Virtual
vib
Stokes
h
Infravermelho
Figura 11: Ilustrao dos espalhamentos Rayleigh e Raman e da absoro no

infravermelho. As linhas 0 e 1 representam os nveis de energia vibracionais.
Na espectroscopia Raman convencional, a espcie analisada transparente
ao feixe da radiao incidente, diferentemente do que ocorre na espectroscopia
Raman Ressonante, onde o fton incidente absorvido pela molcula, acarretando
um aumento da intensidade das bandas associadas com a espcie ressonante.
O emprego da espectroscopia Raman Ressonante tem sido muito til em
estudos espectroeletroqumicos de polmeros conjugados,124-129 (j que o processo
redox destes leva mudanas estruturais de segmentos da cadeia polimrica), pois
alm de permitir a anlise do material sobre qualquer eletrodo, os sinais do solvente
e do eletrlito suporte praticamente no interferem. Alm disso, o emprego de
diferentes linhas de excitao, alm de distintos potenciais, um recurso bastante
utilizado para ressaltar diferentes segmentos da macromolcula que se tm
interesse.
III.1.3.
Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X (EDS)
A utilizao desta tcnica permite, atravs do mapeamento dos raios-X

emitidos pela amostra e gerados pelo impacto do feixe de eltrons primrios,
anlises qualitativa e semiquantitativa sobre a distribuio dos metais na mesma.130
Quando o feixe de eltrons incide sobre um material, os eltrons mais externos dos
tomos so excitados, mudando de nveis energticos. O decaimento destes
eltrons, liberam a energia adquirida que emitida em comprimento de onda no
espectro de raios-X. Um detector instalado na cmara de vcuo do microscpio
eletrnico de varredura (MEV) mede a energia associada a esse fton. Como os
eltrons de um determinado tomo possuem energias distintas, possvel, no ponto
de incidncia do feixe, determinar quais elementos qumicos esto presentes
27

naquele local e assim identificar em instantes que material est sendo observado. O
dimetro reduzido do feixe permite a determinao da composio em amostras de
tamanhos muito reduzidos (< 2,5 m), permitindo uma anlise quase que pontual.131
III.1.4.
Microscopia de Fora Atmica (AFM)
AFM uma tcnica que permite a observao da topografia da superfcie com

uma resoluo da ordem de nanmetros. O princpio de funcionamento do AFM
baseia-se na varredura da superfcie da amostra por um cantilever flexvel de
comprimento entre 100 a 200 m integrado com uma ponta piramidal (ponteira)
geralmente com menos de 20 nm de dimetro. A sonda (ponteira + cantilever) um
componente bsico e, para alcanar a resoluo atmica, a ponta tem que terminar
em um conjunto de tomos. A fora de interao entre a ponta e a superfcie da
amostra faz com que o cantilever se aproxime ou se afaste da superfcie, e essa
deflexo proporcional fora de interao. Quando a ponteira se aproxima da
amostra, primeiramente atrada pela superfcie, devido a uma gama de foras
atrativas existentes na regio, como as foras de van der Waals. Esta atrao
aumenta at que, quando a ponteira aproxima-se muito da amostra, os tomos de
ambas esto to prximos que seus orbitais eletrnicos comeam a se repelir. Esta
repulso eletrosttica predomina sobre a fora atrativa e medida que a distncia
diminui, as foras se tornam mnima, correspondendo a distncia entre os tomos
(na ordem de alguns ngstrons, na ordem da distncia caracterstica de uma ligao
qumica). Podemos dizer que os tomos da ponteira e da amostra esto em contato
quando as foras repulsivas predominam.
Um espelho presente na parte superior da haste, reflete a luz de um feixe de
laser. Aps a reflexo, o feixe de laser passa por uma lente e incide sobre um
fotodetector (fotodiodo) de quatro quadrantes, que mede as variaes de posio e
de intensidade da luz produzida pelas deflexes do cantilever. medida que a ponta
varre a amostra ou a amostra deslocada sob a ponta, os diferentes tipos de
acidentes geogrficos encontrados sobre a superfcie fazem com que a interao
mude. As variaes das interaes so os fatores que provocam as diferentes
deflexes. Essas diferenas, captadas no detector, so armazenadas e processadas
por um computador, que as transformam em imagens topogrficas da superfcie bi e
tridimensionais. A fora mais comumente associada com a AFM na deflexo do
cantilever a fora de van der Waals.
28

A tcnica de AFM pode ser operada em trs modos diferentes: contato,
no-contato e contato intermitente (tapping). No modo contato, o cantilever
mantido a poucos ngstrons da superfcie da amostra e a fora interatmica entre a
ponta e a amostra repulsiva. Neste modo de operao, a ponta faz um leve
contato fsico com a amostra, produzindo imagens com alta resoluo, mas a
compresso e as foras geradas, entre a ponta e a superfcie, podem causar danos
amostra, o que especialmente prejudicial s amostras biolgicas, as quais so
sensveis e nem sempre esto fortemente aderidas ao substrato. No modo de
no-contato, o cantilever mantido entre dezenas a centenas de ngstrons da
superfcie da amostra, e a fora interatmica entre a ponta e a amostra atrativa.
Neste caso, a ponta oscila em alta frequncia (100 kHz a 1 MHz) acima da
superfcie, e a fora total entre a ponta e a amostra muito baixa, geralmente em
torno de 10-12 N. Esta oscilao aumenta consideravelmente a sensibilidade do
microscpio, o que faz com que foras de van der Waals e foras eletrostticas
possam ser detectadas. O modo de no contato no sofre os efeitos do atrito sobre a
amostra, causado pela ponta, conforme observado no modo contato aps diversas
varreduras. Por outro lado, este modo no tem encontrado aplicabilidade geral,
devido instabilidade entre a ponta e as foras adesivas da superfcie, e a resoluo
reduzida pela distncia ponta-amostra, que relativamente grande. Esta limitao
tem sido contornada com a utilizao do modo intermitente. Este modo similar ao
de no-contato, exceto pelo fato de que a ponta vibrante fica mais prxima da
amostra, de forma que tenha um contato intermitente, e utilizado para contornar as
limitaes impostas pelo modo contato. A comparao das imagens nos modos
contato e intermitente mostra que as superfcies so menos modificadas no modo
intermitente.
III.1.5.
Voltametria Cclica
A voltametria uma tcnica eletroanaltica que se baseia nos fenmenos que

ocorrem na interface entre a superfcie do eletrodo de trabalho e a camada fina de
soluo adjacente a essa superfcie. Essa tcnica classificada como dinmica, pois
a clula eletroqumica operada na presena de corrente eltrica (i > 0) que, por sua
vez, medida em funo da aplicao controlada de um potencial. Assim, nessa
tcnica, as informaes sobre o analito so obtidas por meio da medida da
29

magnitude da corrente eltrica que surge no eletrodo de trabalho ao se aplicar um
potencial entre um eletrodo de trabalho e um contra-eletrodo.
O experimento de voltametria cclica (VC) consiste numa varredura cclica de
potencial, controlada por um potenciostato, registrando-se a resposta de corrente.
Essa varredura caracterizada por um potencial inicial (Figura 12), um potencial de
inverso e um potencial final com uma determinada velocidade de varredura. Para
conseguir isso, se aplica uma voltagem chamada onda triangular clula eletroltica.
A Figura 12 mostra o padro tpico da excitao do sinal para a tcnica de
voltametria cclica. A faixa de variao do potencial aplicado deve ser aquela onde a
espcie em anlise eletroativa e o solvente estvel. Dependendo do analito
pode-se fazer apenas um ciclo ou mltiplos ciclos. Um voltamograma cclico obtido
pela medida de corrente sobre o eletrodo de trabalho (E.T.) durante a variao de
potencial (grfico de corrente em funo do potencial). A corrente pode ser
considerada o sinal responsvel pelo sinal de excitao do potencial.
Einverso
-0,2
E / V (ECS)
0,0
0,2
Ciclo 1
0,4
0,6
Einicial
0,8
Efinal
10
20
30
40
Tempo / s
Figura 12: Tpica excitao do sinal para voltametria cclica, potencial na forma de
onda triangular.
30

A reao eletroqumica de interesse ocorre no eletrodo de trabalho e a
corrente eltrica devido transferncia de eltron a partir ou para o eletrodo
controlado pelo potenciostato, contrabalanceando o processo faradaico que ocorre
no eletrodo de trabalho, com uma transferncia de eltrons na direo oposta.
Finalmente, o voltamograma obtido um grfico de corrente em funo do potencial
aplicado.
31
III.2. Objetivo especfico

O
objetivo
do
trabalho
apresentado
neste
captulo
consistiu
nas
caracterizaes estrutural e morfolgica do filme Ppi-AB (polipirrol dopado com o

indicador azul de bromofenol). Alm disso, objetivou-se o estudo das interaes
entre polipirrol e o azul de bromofenol em diferentes nveis de oxidao do polmero
e diferentes pH. Para isso, foram utilizadas medidas espectroeletroqumicas de
Raman e UV-Vis in situ. Voltametria cclica tambm foi utilizada para verificar o
comportamento eletroqumico do filme Ppi-AB.
32
III.3. Parte Experimental

III.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodos de trabalho: vidro recoberto com filme de xido de estanho dopado com
flor (FTO-vidro), Flexitec Ltda. (Brasil), resistncia de 20 .cm-2 com espessura
total de 175 m e rea delimitada de 1 cm2 e vidro recoberto com filmes de ouro com
espessura de 100 nm e 5 nm de cromo depositado entre ouro e vidro para ajudar na
aderncia do filme de ouro ao substrato, EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova
Iorque, EUA).
Eletrodo de referncia: Ag|AgClCl-(sat) Aldrich Inc., dimetro de 0,25 mm, pureza de
99,99% e calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: fio de platina, Degussa S. A., dimetro de 0,5 mm, pureza de
99,99% e placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Pirrol (Pi) (Aldrich, p.a.), destilado sob vcuo e armazenado em atmosfera de nitrognio
a T 4C.
Azul de bromofenol (AB) (Aldrich), usado como recebido.
Hidrxido de sdio (98%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
cido fosfrico (85%, Merck), usado como recebido.
cido ntrico (70%, Synth), usado como recebido.
cido clordrico (Synth, p.a.), usado como recebido.
Fosfato de potssio (99%, Nuclear), usado como recebido.
Fosfato monobsico de sdio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Fosfato dibsico de sdio (99,99%, Aldrich), usado como recebido.
gua deionizada (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparao das
solues.
Equipamentos
Para a sntese do Ppi-AB, deposio de Pt e investigaes eletroqumicas,
utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para
termostatizao da clula durante as snteses, foi utilizado um acessrio de controle
33

de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibrao das solues tampo foi
utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.
Para medidas de espessura utilizou-se um perfilmetro Veeco, modelo
Dektak 3.
Medidas de EDS foram feitas utilizando um Sistema Noran Six, modelo
6714A-1SUS-SN (Thermo Electron Corp.) acoplado a um microscpio eletrnico de
varredura Jeol JSM 6360-LV. A espectroscopia no infravermelho foi realizada
utilizando um espectrofotmetro FTIR-ATR BOMEM, modelo MB-100. Durante as
medidas in situ foi utilizado um espectrofotmetro miniaturizado com fibra ptica
USB2000 (Ocean Optics) e um microscpio Olympus BHSM.
Para os espectros Raman utilizou-se um laser He-Ne (Melles Griot) com
emisso em 633 nm e um laser diodo (Melles Griot) com emisso em 785 nm. Uma
lente de 50X com longa distncia de trabalho e abertura numrica de 0,55 foi
utilizada para focar a luz sobre a amostra. Trabalhou-se no modo reflexo, desta
forma a mesma lente objetiva foi utilizada para incidir e coletar a radiao. Um filtro
notch Kaiser foi utilizado para filtrar a luz espalhada. A radiao restante foi
direcionada atravs de um espectrgrafo Kaiser Holospec f/1,4 acoplado a um
detector CCD Andor (modelo DV-401-BV). Uma clula eletroqumica de 3 eletrodos
com uma janela de vidro com 0,2 mm de espessura foi utilizada durante o
experimento. A luz incidente foi focada atravs da janela de vidro em direo ao
filme de polipirrol para as medidas in situ. Durante as medidas de UV-Vis, uma fonte
de halognio foi utilizada, conforme o arranjo experimental mostrado na Figura 13.
O equilbrio do sistema foi alcanado com a estabilizao da corrente
correspondente a um potencial especfico antes de cada espectro (Raman ou
UV-Vis).
34
Laser He-Ne
Fonte de halognio
Raman
UV-Vis
Fibra ptica
Filtro Notch
Lente objetiva
Plataforma de translao
Potenciostato
Figura 13: Arranjo experimental para as medidas espectroeletroqumicas e Raman in

situ.
III.3.2. Modificao do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposio de

platina
A modificao do eletrodo de FTO-vidro foi realizada aps observar-se a
perda de estabilidade do filme de Ppi quando exposto a processos de
oxidao/reduo sobre este substrato. De acordo com a literatura,132 essa perda de
estabilidade pode ocorrer devido degradao do material durante os processos
redox e/ou perda de aderncia do filme ao eletrodo de FTO-vidro por estresse
mecnico.
Buscando
soluo
para
este
problema,
previamente
eletropolimerizao dos filmes de Ppi-AB, realizou-se a modificao do eletrodo de

FTO-vidro por eletrodeposio de Pt, utilizando soluo de H2PtCl6.6H2O (cido
hexacloroplatnico) com a finalidade de aumentar a aderncia do filme superfcie do
eletrodo, uma vez que o filme se desprendia aps a aplicao de potenciais de
oxidao e reduo.
O H2PtCl6.6H2O foi obtido da seguinte forma:133
Uma chapa de platina (1,0557 g) foi limpa com cido ntrico concentrado a
quente (60C) durante 2h. Posteriormente a platina foi enxaguada com gua
deionizada e submetida ignio usando um bico de Bunsen. A platina foi ento
35

dissolvida,
com agitao e
aquecimento
(60C) em 20 mL
de
gua-rgia
(3:1 HCl:HNO3) utilizando um sistema de refluxo durante 7 dias. Aps a dissoluo, os

cidos foram evaporados utilizando-se um rota-evaporador, sendo que o resduo foi
lavado quatro vezes com pores de 20 mL de HCl concentrado. O resduo final, um p
marrom escuro o cido hexacloroplatnico. Este cido foi ento dissolvido em 100 mL
de gua deionizada, guardado em frasco mbar, fechado e vedado com parafilme.
Os eletrodos de FTO-vidro foram cortados de forma retangular (3 cm x 1 cm) e
limpos utilizando soluo aquosa contendo detergente comercial em banho de
ultra-som por 25 min. Em seguida foram enxaguados com gua deionizada e o banho
de ultra-som foi novamente utilizado para os eletrodos imersos em acetona.
Novamente foram enxaguados com gua deionizada e finalmente secos em estufa a
80C. Aps a secagem realizou-se a eletrodeposio galvanosttica de Pt com uma
corrente de -2,0 mA durante 60 s temperatura ambiente (ca. 25C) sobre uma rea
delimitada com fita adesiva de 1,0 cm2. Posteriormente realizou-se a deposio de um
filme fino de Ppi com rea delimitada de 1,0 cm2.
III.3.3. Sntese dos filmes de polipirrol

As eletropolimerizaes dos filmes foram realizadas atravs de voltametrias
cclicas entre -0,3 e 1,3 V (a 10C) sobre a superfcie do eletrodo de FTO-vidro e
Au-vidro de rea 1,0 cm2. Para isto utilizou-se solues aquosas contendo
0,05 mol.L-1 de pirrol (Pi) e 0,4 mmol.L-1 do corante azul de bromofenol (AB). Para
comparao, realizou-se a sntese do Ppi na presena de um eletrlito bastante
usado e conhecido, o LiClO4 (0,1 mol.L-1). A velocidade de varredura para as
snteses foi de 20 mV.s-1 e a espessura dos filmes foi variada atravs do nmero de
ciclos de sntese. Na Figura 14 est o voltamograma cclico de sntese do Ppi-AB,
onde uma soluo aquosa contendo somente o monmero Pi e o dopante AB foi
utilizada como eletrlito.
36

B
15,0
12,5
i / A
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
-0,3
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
E / V vs. ECS
Figura 14: Voltamograma cclico durante a sntese do Ppi-AB. Velocidade de
varredura 20 mV.s-1. Segunda varredura.
37
III.4. Resultados e Discusso

III.4.1. Medidas de Espessura
A espessura do filme polimrico deve ser otimizada pois um parmetro que
afeta diretamente o tempo de resposta ptico do sensor. A Figura 15 apresenta as
espessuras medidas para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB, as quais foram
controladas atravs do nmero de ciclos utilizados durante a eletropolimerizao.
Comparando-se filmes sintetizados com o mesmo nmero de ciclos voltamtricos,
observa-se que os filmes Ppi-ClO4 so mais espessos que os de Ppi-AB. Esse fato
deve ser devido maior mobilidade do dopante ClO4- comparado com o nion AB
(Figura 10) durante o processo de sntese.
20
Ppi-ClO4
15
Ppi-AB
Espessura / m
10
5
0,33
0,30
0,27
0,24
0,21
1
Nmero de Ciclos da Voltametria Cclica

Figura 15: Espessura dos filmes Ppi-ClO4 e Ppi-AB variando o nmero de ciclos
utilizado durante a sntese eletroqumica por voltametria cclica vs ECS.
Como esperado, observou-se que possvel ter um bom controle da
espessura do filme utilizando a sntese eletroqumica. Experimentos de variao de
absorbncia ( = 584 nm) em funo do pH do meio foram executados para os
38

diferentes filmes (Figura 16), onde foi possvel constatar que os filmes sintetizados
com 3 ciclos voltamtricos, com aproximadamente 0,23 m de espessura
apresentam maior contraste de cor em funo da mudana de pH. Por este motivo,
filmes sintetizados com 3 ciclos foram partir deste ponto, utilizados para o
desenvolvimento do sensor.
1 ciclo
3 ciclos
5 ciclos
Absorbncia / uni. arb.
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
10
pH
Figura 16: Contraste ptico em funo do pH para filmes de Ppi-AB sintetizados
eletroquimicamente com diferentes nmeros de ciclos durante a voltametria cclica.
Absorbncias correspondentes a 584 nm.
III.4.2. FTIR-ATR e EDS-MEV

Com a finalidade de confirmar a insero das molculas de AB na matriz
polimrica do Ppi, foram realizadas anlises de espectroscopia na regio do
infravermelho com acessrio de reflexo total atenuada (FTIR-ATR) dos filmes
Ppi-AB e Ppi-ClO4 depositados sobre FTO-vidro/Pt. (Obs.: para o indicador AB foram
preparadas pastilhas de KBr).
De acordo com a Figura 17, verifica-se a presena de algumas bandas
atribudas ao polipirrol,134 dentre elas: 1700 cm-1 que ocorre devido uma srie de
39

vibraes, como: deformaes C-N-C no plano e deformao angular N-H do anel no
plano; 1040 cm-1 que uma banda de natureza complexa de vibraes fora do
plano, podendo ser atribuda deformao angular C-H do anel, deformao angular
do N-H do anel, deformao C-N-C do anel e, finalmente, em 930 cm-1 que
relacionada ao estiramento da ligao C=C, estiramento C-C no anel, estiramento
C-N e deformao C=C-N no plano. Com relao ao indicador AB, a presena de
algumas bandas evidencia sua presena na matriz polimrica. Dentre estas bandas
esto:135 1476 e 810 cm-1, atribudas aos benzenos vicinais substitudos e a
1290 cm-1, atribuda ligao C-O do grupo hidrxi ligado ao anel aromtico. No
espectro do filme polimrico contendo o corante AB, esta banda desloca-se para
regio de maior energia, sugerindo uma interao qumica forte entre o polmero e o
indicador.
Ppi-ClO4
H
N
Transmitncia / uni.arb.
N
H
Ppi-AB
1700
1040
AB
930
OH
Br
Br
Br
1290
O
HO
S
Br
1750
1476
810
1500
1250
1000
-1
Nmero de onda / cm
750
Figura 17: Espectros de FTIR-ATR para filmes de Ppi-ClO4, Ppi-AB e para o

indicador AB.
Visualizando os espectros, verificamos que as bandas caractersticas do
indicador no so to intensas no espectro do Ppi-AB quanto no espectro do AB,
sugerindo que a quantidade de indicador presa na matriz polimrica relativamente
40

pequena quando comparada com a do polmero. Na tentativa de quantificar a
proporo destes materiais, foram realizadas anlises de espectroscopia de energia
dispersiva por microscopia eletrnica de varredura (EDS-MEV).
A microssonda de raios-X acoplada ao microscpio eletrnico de varredura,
permitiu a anlise da distribuio de tomos de nitrognio (presente nos anis
pirrlicos) e de tomos de bromo (presente nas molculas de AB). Os mapeamentos
destes tomos para o filme Ppi-AB esto apresentados na Figura 18. Pode-se
observar que o polmero est distribudo uniformemente sobre o substrato e ainda
que a dopagem ocorre de forma homognea, j que o bromo, presente no corante
(dopante), apresenta-se uniformemente distribudo.
Figura 18: a) Imagem por MEV para o filme Ppi-AB. Mapeamento por EDS da
superfcie do filme Ppi-AB, sendo b) distribuio de tomos nitrognio e
c) distribuio de tomos bromo.
Na Figura 19 esto as intensidades dos picos de cada tomo presente na
amostra Ppi-AB. Observa-se tambm a presena de tomos contituintes do FTO e
do vidro, como Si, In e Sn. A presena destes tomos no espectro indica que neste
caso, a tcnica de EDS, apesar de ser um mtodo de anlise de superfcie, pde ser
utilizada para indicar a composio do bulk, pois a profundidade de penetrao do
feixe (ca. 1 m),136 maior do que a espessura do filme Ppi-AB (0,23 m).
41

Sn
In
700
Intensidade / uni. arb.
600
500
Br
400
In
300
200
100
0
Si
Sn
N
In
F
0
In
S Cl Sn
S Cl
3
In
In
4
10
keV
Figura 19: Intensidades dos picos de N e Br no espectro de EDS da amostra de
Ppi-AB eletropolimerizado sobre FTO-vidro.
Atravs do espectro de EDS (Figura 19) obtiveram-se os resultados
quantitativos relacionados composio atmica destes tomos para o filme Ppi-AB.
Esta anlise (Tabela 1) mostrou uma proporo de ca. 15% de nitrognio para 6%
de bromo (porcentagens atmicas). Considerando que cada molcula de AB possui
4 tomos de bromo, um clculo simples mostra que existe 1 molcula de AB para
cada 9 unidades repetitivas de pirrol. Estes resultados sugerem que de fato, o
corante atua como um agente compensador de carga (dopante) no Ppi.
42

Tabela 1: Anlise quantitativa por EDS dos tomos presentes no Ppi-AB
eletropolimerizado sobre FTO-vidro.
Elemento
% Massa
% Atmica
Erro
NK
4,65
14,75
+/- 1,29
OK
19,15
53,15
+/- 1,62
FK
0,00
0,00
+/- 0,00
Si K
0,34
0,54
+/- 0,15
SK
0,66
0,91
+/- 0,16
Cl K
0,47
0,59
+/- 0,13
Br L
11,51
6,40
+/- 0,29
In L
0,82
0,32
+/- 0,31
Sn L
62,40
23,35
+/- 0,67
Total
100,00
100,00
III.4.3. Microscopia de Fora Atmica (AFM)

Utilizando a microscopia de fora atmica (AFM), investigamos a morfologia e
uniformidade das superfcies dos filmes de Ppi-AB e Ppi-ClO4, sintetizados sobre
FTO-vidro com Pt previamente depositada. As propriedades fsicas e qumicas dos
materiais polimricos podem sofrer grandes alteraes com a mnima variao em
seus processos de sntese e deposio, por exemplo, com a mudana do dopante
de ClO4- para AB.
A Figura 20 apresenta as imagens de AFM para o Ppi-AB e Ppi-ClO4. Com a
incorporao do indicador AB na matriz polimrica de Ppi, observou-se a
modificao do tamanho e forma dos grnulos, comparando-se com Ppi-ClO4,
apresentando dimetros e formas variadas, que resultou na diminuio da
rugosidade mdia quadrtica (Rms) na superfcie, de 69 para 40 nm.
Apesar do Ppi-AB possuir grnulos menores que o Ppi-ClO4, o que poderia
favorecer o aumento da rugosidade, estes se encontram bem empacotados,
resultando em menor rugosidade.
43

Ppi-AB
Ppi-ClO4
472.13
472,13
[nm]
276,01
[nm]
276.01
[nm]
Rms = 40,75 nm
2.55 x 2.55
um
2,55 x 2,55
m
1.00 um
1,00 m
Rms = 69,05 nm
ppi-bpb p83b-pt21
2,81
2,81 xx 2,81
2,81 m
m 0.00
0,00
0.00
0,00
1.00 um
1,00
m
2.81 x 2.81 um
ppi-clo4 p83b-pt71
Figura 20: Imagens de AFM na escala de 2,55 m x 2,55 m para o Ppi-AB e

2,81 m x 2,81 m para o Ppi-ClO4. Rms = rugosidade mdia quadrtica.
A aderncia do filme um fator importante a ser considerado, sendo que o
desprendimento dos filmes pode acarretar um comportamento falho em seu
desempenho. A aderncia depende bastante dos procedimentos de limpeza e da
rugosidade do substrato. Uma maior rugosidade pode aumentar a aderncia de um
filme (maior rea de contato) ou, por outro lado, pode gerar defeitos de cobertura
prejudicando a formao dos filmes. Experimentalmente, verificou-se que a
aderncia do filme Ppi-AB foi melhorada em relao aos filmes de Ppi-ClO4. Como o
substrato utilizado o mesmo para ambos os casos, podemos sugerir que esta
maior adeso esteja relacionada com a granulometria dos materiais obtidos, j que o
Ppi-AB possui granulometria de tamanho variado com aglomerados de partculas
menores comparadas com a do filme Ppi-ClO4, permitindo que haja uma maior rea
de contato entre o filme polimrico e o substrato.
A Figura 21 apresenta as imagens de AFM correspondentes ao Ppi-AB e
Ppi-ClO4, onde possvel visualizar a diferena de fase na superfcie da amostra.
Com relao ao Ppi-ClO4, praticamente no ocorre esta diferena de fase, que
relativa dureza da superfcie, sendo a superfcie bastante homognea. Com
relao ao Ppi-AB bem ntida a presena de diferentes fases na amostra, o que
pode estar associado com o processo de polimerizao utilizando um on dopante de
baixa mobilidade.
44

Ppi-ClO4
Ppi-AB
-0,27
-0.27
[V]
[V]
-6.17
1.00 um
1,00 m
ppi-bpb p83b-pt21
2.52 x 2.52 um
2,52 x 2,52 m -6,17
-2,74
-2.74
[V]
[V]
-6.68
1.00 um
1,00 m
ppi-clo4 p83b-pt71
2.81 x 2.81 um -6,68

2,81 x 2,81
m
Figura 21: Imagens de AFM (diferena na dureza da superfcie) na escala de

2,52 x 2,52 m para Ppi-AB e 2,81 x 2,81 m para Ppi-ClO4.
III.4.4. Voltametria Cclica (VC)

Foram obtidos os voltamogramas cclicos para os filmes de Ppi-ClO4 e Ppi-AB
sintetizados sobre ouro. A faixa de potencial foi variada entre -0,6 e 0,9 V com
velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 22 mostra os voltamogramas para o
Ppi-ClO4 e Ppi-AB medidos em pH 1,5 e 7,5. O polipirrol apresentou comportamento
eletroqumico dependente do pH, com maior corrente faradaica em menores valores
de pH (note a alta corrente em pH 1,5 na Figura 22a). Esta dependncia j foi
descrita na literatura,137 sendo atribuda principalmente desprotonao do Ppi em
solues alcalinas, que diminui o nvel de oxidao e portanto o nvel de dopagem
do
polmero
(diminuio
da
eletroatividade),
consequentemente,
com
desprotonao do polmero, o contra-on aninico move-se da matriz polimrica em

direo ao eletrlito. Por outro lado, em solues cidas, as cadeias de Ppi esto
altamente protonadas, permitindo que o on dopante mova-se para o interior da
matriz polimrica, restaurando a neutralidade de carga.138-140
45
a) Ppi-ClO4
pH 1,5
pH 7,5
pH 1,5
pH 7,5
AB
i / mA
2,4
b) Ppi-AB
1,8
+ 0,7 V
0,5
i / mA
0,2
1,2
0,6
0,7
0,8
(i)
0,9
0,1
E / V vs. Ag|AgCl
Eoxi
+ 0,6 V
0,0 V
(ii)
0,6
- 0,3 V
0,0
0,0
(i)
-0,6
-0,1
(ii)
-1,2
-0,6 -0,4 -0,2 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
-0,6 -0,4 -0,2 0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
E / V vs. Ag|AgCl
Figura 22: Voltamogramas cclicos do a) Ppi-ClO4 e b) Ppi-AB em pH 1,5 e 7,5. Em

detalhe: voltamograma cclico do AB em pH 1,5. Soluco tampo fosfato foi utilizada
como eletrlito. Velocidade de varredura de 20 mV.s-1.
Outra caracterstica interessante na Figura 22a a diminuio constante do
potencial de oxidao do Ppi quando o filme condicionado em meios mais
alcalinos, mudando de +0,0 V (pH 1,5) para -0,3 V (pH 7,5) no caso do Ppi-ClO4.
Durante o processo de oxidao, os ons presentes no eletrlito migram para o
interior da matriz polimrica com a finalidade de estabilizar as cargas geradas.140 A
alta atividade dos ons OH- em solues alcalinas fornece uma contribuio extra
para a estabilizao da forma oxidada do Ppi, abaixando o potencial de oxidao
(este comportamente ser discutido com mais detalhes na discusso da Figura 22b).
Tendncias similares descrita acima foram obtidas para Ppi auto-dopado (poli(3carboximetilpirrol)).141 Tambm neste caso, uma diminuio do potencial de oxidao
foi observado com o aumento do pH (at pH 6).
De acordo com a Figura 22b, o Ppi-AB apresenta um comportamento
eletroqumico diferente do apresentado pelo Ppi-ClO4. Em pH baixo, o par redox em
0,7/0,6 V (destacado na Figura 22) evidente no voltamograma do Ppi-AB. Os
voltamogramas do AB em soluo tampo de pH 1,5, tambm apresentaram um par
46

reversvel em ca. 0,7/0,6 V (em detalhe na Figura 22), portanto, este par redox do
filme pode ser diretamente relacionada ao processo redox do AB. Alm disso, dois
novos processos (i) e (ii) observados em 0,5/0,4 V e -0,2/-0,3 V, respectivamente,
no foram previamente observados para o Ppi e tambm no para o AB. Assume-se
que estes novos processos sejam resultados da interao entre o corante e o
polmero. O potencial de oxidao em -0,2 V podem resultar de uma estabilizao
mais eficiente dos ctions na cadeia de Ppi pelas molculas de corante presas na
matriz polimrica. As espcies negativamente carregadas do corante (Figura 10)
interagem com o Ppi oxidado (positivamente carregado), atuando como dopante e
esta interao estabiliza a cadeia polimrica no estado oxidado, diminuindo o
potencial de oxidao. Em pH 7,5 o processo redox relacionado ao AB (0,7/0,6 V) no
filme Ppi-AB (Figura 22b) no to evidente quanto em pH 1,5. Um pequeno
deslocamento para potenciais mais catdicos foi observado para o pico de oxidao
do AB em soluo alcalina. As VCs do Ppi-AB em pH 7,0; 8,0 e 11,0, apresentaram
comportamento similar ao pH 7,5.
III.4.5. Caracterizao in situ

Nesta
seo,
sero
discutidos
os
resultados
obtidos
atravs
das
caracterizaes espectroeletroqumicas in situ. Para isso utilizou-se tcnicas

espectroscpicas (Raman e UV-Vis) e eletroqumicas (cronoamperometria
aplicao de potencial em funo do tempo) objetivando a obteno de informaes
nvel molecular sobre as caractersticas do filme de Ppi dopado com AB.
III.4.5.1. UV-Vis
O espectro de absoro do AB e de suas formas desprotonadas (AB- e AB2-)
em soluo, foram coletados em diferentes pHs (Figura 23). O espectro de absoro
do corante em soluo apresenta duas bandas dependentes do pH, em 435 e
580 nm. A atribuio destas bandas no bem descrita na literatura, j que uma s
banda tem sido relacionada a diferentes formas do corante AB.142-146
47
Absorbncia / uni.arb.
1,0
11,0
a)
8,0
7,5
0,8
AB-
7,0
0,6
0,4
AB
0,2
AB2-
3,0
0,0
1,5
400
450
500
550
600
Comprimento de onda / nm
Figura 23: Espectros UV-Vis do corante AB solubilizado em soluo tampo fosfato
de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0.
O corante AB possui diferentes coloraes no espectro visvel, quando est
solubilizado em solues tamponadas de diferentes pHs. Baseando-se nesta
propriedade, utilizamos a roda de cores de Newton durante as atribuies das
bandas, j que a cor observada em uma espcie pode trazer informaes sobre sua
correspondente faixa de comprimento de onda de absoro atravs de sua cor
complementar (maiores detalhes sero dados no Captulo IV). Desta forma as
solues amarela, vermelha e azul deveriam ter absoro entre 400 e 430 nm, entre
490 e 560 nm e entre 560 e 620 nm, respectivamente.147
A Figura 24 mostra os espectros obtidos durante as medidas in situ para o
Ppi-AB em pH 1,5; 3,0; 7,5 e 11,0. Os espectros apresentam dois picos principais em
ca. 600 e 700 nm. Esta banda em 700 nm atribuda transio do estado polaron
ligante para os estados polaron antiligantes do Ppi.20 A banda em ca. 600 nm
atribuda forma AB2-. Em ambos os pHs, (1,5 e 3,0, Figura 24a e b,
respectivamente), a absoro desta banda aumenta quando o potencial se torna
mais andico. A absoro em ca. 700 nm tambm dependente do potencial em
48

meio cido, aumentando sua intensidade com o aumento do nvel de oxidao do
Ppi. Esta banda em pH 1,5, sempre mais intensa do que a banda relacionada
forma AB2- do dopante, entretanto, em pH 3,0, a banda relacionada ao corante
(600 nm), se torna mais intensa do que a banda do Ppi (700 nm) na escala de
potencial entre -0,4 e + 0,2 V. Uma banda em 525 nm tambm observada em
pH 3,0, podendo ser atribuda transio da banda de valncia para o estado
polaron antiligante no Ppi11 ou forma mono carregada do corante (AB -), ou
provavelmente
resultante
da
sobreposio
de
ambas
as
absores.
Comparando-se o comportamento do Ppi-AB em meio cido, nota-se que ocorre

mudanas drsticas no seu comportamento ptico quando este imerso em pH 7,5,
como mostrado na Figura 24c. A absoro do corante em 600 nm muito forte e a
banda relacionada matriz polimrica aparece como um ombro em 700 nm. Embora
ambas as bandas apresentem alguma dependncia com o pH, a banda em 600 nm
no muda significantemente em pHs neutro e alcalino (Figura 24c e d). A
dependncia dos espectros de UV-Vis do Ppi-AB com o potencial aplicado em pH
7,0; 8,0 (no mostrados) e 11,0 (Figura 24d) so similares aos observados para pH
7,5 (Figura 24c), onde a banda de absoro atribuda ao corante em ca. 600 nm
apresenta pouca dependncia com o potencial.
As medidas de UV-Vis apresentadas na Figura 24 fornecem uma idia sobre
a interao entre o corante e a matriz polimrica. Especificamente, possvel notar a
forte dependncia da intensidade da banda em 600 nm (atribuda ao corante na
forma AB2-) com o potencial em solues mais cidas. Em baixos valores de pH, o
equilbrio favorece a forma protonada da espcie, AB. No entanto, mesmo em pH 1,5
e 3,0 (Figura 24a e b), a absoro em 600 nm (devido forma carregada do corante)
aumenta quando o potencial variado em direo a valores mais positivos. Pode-se
explicar este comportamento considerando que medida que o polipirrol oxidado,
as formas carregadas do corante agem como contra-ons, estabilizando as cargas
positivamente carregadas presentes na cadeia polimrica. Assim, a oxidao do Ppi
afeta diretamente o equilbrio de dissociao do corante (Figura 10), devido ao
aumento da demanda por contra-ons para a estabilizao da cadeia polimrica
durante o processo de oxidao.
49
0,6
+0,4V
a)
+0,2V
0,5
Ppi-AB_pH 3,0
+0,4V
0,0V
-0,2V
0,4
+0,2V
-0,4V
0,3
b)
Ppi-AB_pH 1,5
0,0V
0,2
-0,2V
-0,4V
0,1
1,0
d)
c)
Ppi-AB_pH 7,5
0,9
Ppi-AB_pH 11,0
0,8
0,7
+0,4V
+0,4V
+0,2V
+0,2V
0,4
0,0V
-0,2V
0,0V
-0,2V
0,3
-0,4V
-0,4V
0,6
0,5
550
600
650
700
750
800
850
550
600
650
700
750
800
850
Comprimentos de onda / nm
Figura 24: Espectros UV-Vis para o Ppi-AB imerso em soluo tampo fosfato de pH
a )1,5; b) 3,0; c) 7,5 e d) 11,0.
A observao feita para estas medidas esto de acordo com a literatura, j
que estudos utilizando micro-balana de cristal de quartzo mostraram a difuso de
ons presentes no eletrlito em direo matriz polimrica a fim de alcanar
eletroneutralidade.148,149 Em nosso trabalho, sugere-se que as espcies carregadas
do corante agem como contra-ons e, portanto o equilbrio da Figura 10 se desloca
buscando compensar a demanda por contra-ons gerada durante a oxidao do Ppi.
Em altos valores de pH, o equilbrio do corante favorece a forma AB 2-, resultando em
uma alta absoro em 600 nm. Alm disso, ons OH-, os quais desprotonam as
cadeias de Ppi esto tambm presentes no meio e contribuem significantemente
para a estabilizao das cargas positivas do polmero aps a oxidao do filme.
Nestes casos, (pH maior que 7,0), a banda em 600 nm no significantemente
afetada pelo potencial aplicado, como mostrado na Figura 24c e d.
50

Nath e cols.65 estudaram a dependncia do pH no interior de microtubos de
Ppi-AB com potencial aplicado. Eles assumiram que a soluo de monmero
contendo concentrao de AB 8 x 10-4 mol.L-1 gera um filme com VCs similares
do filme de Ppi-ClO4. Em outras palavras, a presena do AB no micro-ambiente no
afeta o processo redox do filme polimrico. Estas observaes contrastam com os
nossos resultados (Figura 22), os quais mostram um claro efeito do corante no
comportamento redox do filme polimrico na superfcie do ouro (neste caso,
utilizou-se uma soluo do monmero contendo 4 x 10-4 mol.L-1 de AB).
III.4.5.2. Medidas por espectroscopia Raman

O comportamento do corante durante o processo redox do polmero tambm
foi avaliado por espectroscopia Raman in situ. A espectroscopia Raman uma
tcnica que tem uma maior especificidade molecular (transies vibracionais) que a
espectroscopia UV-Vis (transies eletrnicas).
A Figura 25 mostra os espectros Raman de solues aquosas contendo
4,0 x 10-4 mol.L-1 do corante AB em soluo tampo (STF) de diferentes pH (1,5; 3,0
e 8,0). Os espectros foram obtidos utilizando um laser com emisso em 785 nm para
evitar a interferncia da fluorescncia na resposta. As formas AB, AB - e AB2- do
corante foram unicamente caracterizadas, sendo que suas vibraes caractersticas
foram usadas como impresses digitais das molculas, para em seguida confirmar a
presena destas formas especficas do corante preso no filme de Ppi, em um certo
pH e potencial aplicado. A banda em 860 cm-1 atribuda deformao angular
(bending) fora do plano da ligao CH do anel aromtico,123 e se desloca para
maiores frequncias, alcanando 893 cm-1 em pH 1,5. Em pH 3,0, a banda
vibracional relacionada ao estiramento assimtrico do grupo SO32- observada em
1074 cm-1.150 Esta banda tambm atribuda ao grupo PO43-, presente na soluo
tampo. Em pH 7,5 e 8,0 esta banda ainda est presente, como esperado, e ainda
observado uma forte banda em 989 cm-1 relacionada ao modo de respirao do
anel
benznico151
estiramentos
simtricos
dos
grupos
SO32-
PO32-.
Consequentemente, os modos de vibrao em 860, 882 e 893 cm-1 (atribudos

deformao angular fora do plano da ligao CH do anel aromtico) sero usados
como marcadores para a presena das formas do dopante: AB 2-, AB- e AB,
respectivamente.
51
989
Azul de Bromofenol
1305
860
pH 8,0
2-
AB
882
1074
AB
893
AB
800
1000
1200
pH 3,0
pH 1,5
1319
1400
Deslocamento Raman / cm
1600
-1
Figura 25: Espectros Raman do corante AB (Azul de Bromofenol) solubilizado em

soluo tampo fosfato com diferentes pH. Fonte com emisso em 785 nm.
Os espectros Raman dos filmes Ppi-AB em baixo pH e com diferentes
potenciais aplicados esto apresentados na Figura 26. Os espectros do Ppi-ClO4
com diferentes potenciais aplicados esto mostrados como em detalhe nesta figura
para futuras comparaes. Em meio cido, o espectro do filme Ppi-AB em +0,4 V
(Ppi altamente oxidado) semelhante ao do Ppi-ClO4,129,152 apresentando duas
bandas intensas em 925 e 1620 cm-1, caractersticas do Ppi no estado oxidado. A
intensidade destas bandas diminui com o aumento do potencial catdico. As bandas
em 925 e 1620 cm-1 desaparecem quando valores de potencial mais negativos que
0,1 V so atingidos, sendo substitudo por novas bandas em 987 e 1560 cm-1
atribudos ao Ppi no estado reduzido. Os espectros em potenciais negativos
apresentam algumas diferenas interessantes comparando-se com o espectro do
Ppi-ClO4 no mesmo potencial.
A presena da banda em 1620 cm-1 no espectro do Ppi-AB em meio cido em
potenciais negativos, sugere um maior nvel de oxidao do Ppi no Ppi-AB do que no
Ppi-ClO4 nas mesmas condies.129 Esta observao pode tambm ser confirmada
52

comparando-se a corrente obtida nas VCs do Ppi-ClO4 e Ppi-AB nas mesmas
condies (Figura 22). Alm disso, a banda em 1560 cm-1, atribuda ao estiramento
C=C (caracterstica da forma neutra do polmero), domina o espectro do Ppi-ClO4 em
-0,4 V, sendo muito mais fraca no espectro do filme do Ppi-AB.134,153 Outro
comportamento observado nos espectros do Ppi-AB est relacionado presena da
banda em 882 cm-1 atribuda forma AB- do corante (ver Figura 25). Com a
oxidao do Ppi, um novo modo vibracional aparece em 860 cm-1, o qual
relacionado forma AB2- do indicador. Um ombro em 893 cm-1 atribudo forma
neutra AB aparece em +0,2 V. A demanda por cargas negativas na matriz polimrica
afeta o equilbrio, diminuindo a concentrao das espcies neutras no meio. Esta
dependncia com o potencial corrobora as anlises prvias por UV-Vis, onde foi
mostrado que o corante na forma carregada age como contra-on, interagindo com a
cadeia polimrica e afetando a posio do equilbrio cido-base do corante (Figura
10).
Ppi-AB_pH 3,0
925
990
-0,4 V
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
800
Ppi_pH 3,0
Ppi-ClO
4 _pH 3,0
1000
1200
1400
1600
-1
882
1560
1620
-0,4V
-0,2V
-0,1V
0,0V
860
987
+0,2V
+0,4V
800
1000
1200
1400
1600
-1
detalhe) aplicando potenciais entre -0,4 V e +0,4 V. Fonte com emisso em 633 nm.
53

A Figura 27 apresenta os espectros do filme Ppi-AB em pH 7,0. Neste caso,
quantidades significantes de ambos, AB2- e AB, caracterizados respectivamente
pelas bandas em 860 cm-1 e 893-1, parecem coexistir para todos os potenciais
aplicados, de forma similar aos resultados obtidos por UV-Vis (Figura 24). Os
espectros Raman do filme imerso em meio tamponado neutro apresenta um
equilbrio do corante independente do potencial aplicado, diferente do filme imerso
em meio cido. Nos espectros Raman do Ppi-ClO4 imerso em pH 8,0 (Figura 27),
nota-se a diminuio da intensidade do modo vibracional relacionado ao estado
bipolaron (1080 cm-1) do polmero comparado com o do Ppi-ClO4 em meio cido.
Este comportamento consistente com o efeito de desprotonao no mecanismo de
desdopagem, como discutido nas VCs (Figura 22). Com relao ao Ppi-AB,
observa-se que seu nvel de oxidao em meio alcalino no to dependente do
potencial aplicado quanto em meio cido. Em pH > 7,0 o modo vibracional
caracterstico do Ppi no estado intermedirio de dopagem,129,154 ca. 950 cm-1,
observado em todos os espectros do filme condicionado de +0,4 a -0,4 V, assim
como o modo de vibrao em 1590 cm-1 (atribuda forma polaron).129 Sugere-se
que em meio alcalino a presena das formas aninicas do corante presas na matriz
polimrica mantm o filme em um nvel intermedirio de oxidao. Estes resultados
sugerem uma diminuio da entrada de ons presentes no eletrlito, na matriz
polimrica, como OH-, os quais podem desprotonar o polmero levando diminuio
do nvel de oxidao, como discutido anteriormente.
54
Ppi-AB_pH 7,0
-0,4 V
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
Ppi_pH 7,0
Ppi-ClO
4 _pH 7,0
860
893
800
1000
1200
1400
1600
-1
-0,4V
-0,2V
-0,1V
0,0V
+0,2V
+0,4V
800
1000
1200
1400
1600
-1
O filme imerso em pH = 8,0 tambm apresenta-se independente do potencial
aplicado com relao razo entre as espcies AB- e AB2-. interessante destacar
a presena da forma neutra do corante, caracterizado pela presena da banda em
893 cm-1 quando o Ppi-AB imerso em meio alcalino (Figura 28). Esta forma do
corante (AB) desaparece completamente em solues com pH > 4,81146 (Figura 23).
A presena desta banda em meio alcalino sugere que ocorre um deslocamento no
pKa155 do corante devido interao deste com a matriz polimrica. Este um
exemplo perfeito de como o equilbrio cido-base de um indicador afetado pelo
ambiente que o cerca.
55
Ppi-AB_pH 8,0
860
893
-0,4 V Ppi-ClO
Ppi_pH 8,0
4 _pH 8,0
-0,2 V
0,0 V
+0,2 V
+0,4 V
800
-0,4V
-0.4V
1000
1200
1400
-1
1600
-0,2V
-0.2V
-0,1V
-0.1V
0,0V
0.0V
+0,2V
+0.2V
+0,4V
+0.4V
800
1000
1200
1400
1600
-1
A Figura 29 mostra a dependncia da intensidade das bandas caractersticas
das formas do corante com o nvel de oxidao do Ppi-AB em pH 3,0 e 8,0. O
Ppi-AB em pH 3,0 apresenta alta concentrao da forma neutra AB no estado
reduzido, a qual diminui com a oxidao do Ppi. Ao mesmo tempo, a concentrao
da forma AB2- (a qual no foi observada em -0,4 V) aumenta durante o processo de
oxidao. A comparao destes resultados por Raman com os obtidos por VC para o
Ppi-AB em meio cido (Figura 22b), confirma que ocorrem mudanas drsticas na
concentrao da forma AB dentro da regio de potencial relacionada formao de
ctions (polarons) na cadeia de Ppi.
O Ppi-AB em meio alcalino, em estado reduzido, apresenta bandas bem
definidas em 860 e 893 cm-1, atribudas s formas AB2- e AB, respectivamente.
observada uma diminuio sutil de ambas as bandas durante o processo de
oxidao, entretanto a razo entre as formas AB/AB2- praticamente no muda. Estes
resultados corroboram o mecanismo sugerido anteriormente pelos resultados de
UV-Vis (Figura 24), no qual a dependncia do equilbrio AB/AB2- com o potencial foi
56

explicada em termos do aumento da demanda por cargas durante a oxidao do Ppi.
Entretanto, em meio alcalino, devido alta concentrao de espcies aninicas no
interior da matriz polimrica, a dependncia da razo entre as formas do corante
com o potencial no observada.
pH 3,0
AB2-
AB
pH 8,0
AB2-
AB
-400
-200
200
400
E / mV
Ag|AgCl
E /vs.
mV
Figura 29: Dependncia do equilbrio do corante com o potencial aplicado em pH 3,0
e 8,0. As intensidades analisadas correspondem s bandas em 860 cm-1 (AB2-) e em
893 cm-1 (AB).
Considerando a interao entre as formas aninicas do corante e a cadeia
polimrica positivamente carregada, seria esperado um aumento do Ka para o
equilbrio do corante mostrado na Figura 10, diminuindo consequentemente o pKa do
57

sistema. O pKa foi determinado atravs das intensidades das bandas Raman
relacionadas s diferentes formas do corante AB (860, 882 e 893 cm-1). A razo
entre as formas neutra e monocarregada do corante foi calculada (IAB/IAB- e tambm
IAB-/IAB) com a finalidade de determinar o pKa para o equilbrio AB/AB -. Similarmente,
o pKa para o equilbrio AB-/AB2- foi determinado atravs das razes IAB-/IAB2- e
IAB-2/IAB- (em detalhe Figura 30).
A Figura 30 mostra a razo entre as espcies em funo do pH para cada
potencial aplicado. A dependncia do pKa com o potencial aplicado observado
para ambos os equilbrios. Entretanto, a partir de -0,2 at 0,0 V, a mudana do pKa
no to dependente quanto em meio cido, ao aplicar-se potenciais catdicos.
Esta observao corrobora os dados obtidos atravs de VC (Figura 22), os quais
mostram o processo redox ocorrendo fora da faixa de potencial entre -0,2 e 0,0 V.
1,02
O
Br
Br
SO3
pKa = 3.0
H+
O
Br
Br
1,01
1,00
1,00
Br
2-
AB - BPB
HO
AB
BPB
SO3
1,01Br
pKa = 4.6
IAB / I AB
Br
Br
HO
1,02
O
Br
2-
Br
Br
BPB
2-
0,99
0,99
0,98
0,98
OH
pKa
Br
Br
Br
pH
SO3
pKa = 3.0
O
Br
SO3
pKa = 4.6
H
O
Br
Br
7
Br
Br
Br
Br
HO
IAB / I AB
OH
Br
H
HO
Br
BPB
O
Br
AB
BPB-
2BPB
AB
2-
3
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
E / V vs. Ag|AgCl
Figura 30: Dependncia do pKa do Ppi-AB com o potencial aplicado para os
equilbrios envolvendo as formas AB e AB - (curva em vermelho) e AB- e AB2- (curva
em azul). Em detalhe: intensidades relativas das bandas Raman atribudas s
formas AB- e AB2- com potencial aplicado de -0,4 V.
58

Levando em conta sensores baseados em polmeros condutores, vrias
consideraes tm sido feitas com relao ao efeito e transporte de ons no
desempenho do sensor.156,157 Nesse sentido, nosso estudo mostra novas
perspectivas para o desenvolvimento de um sensor eficiente, onde a demanda para
o transporte dos ons presentes na soluo pode ser aliviado atravs das diferentes
formas do corante AB presente na matriz polimrica.
59
III.5. Concluses Parciais

De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, conclumos que a
presena do indicador AB exerceu um efeito significativo sobre as propriedades do
Ppi, sendo que a presena do AB foi evidenciada atravs das anlises de FTIR-ATR,
EDS-MEV, Raman e tambm por espectrofotometria UV-Vis. Atravs da anlise por
EDS-MEV, foi possvel sugerir uma proporo entre dopante e polmero sendo de
uma molcula de AB para cada 9 unidades pirrlicas. A presena do dopante AB
modificou a morfologia do material, permitindo a obteno de filmes menos rugosos
e mais aderentes. Alm disto, o mtodo de deposio eletroqumica permitiu a
obteno de filmes uniformes com o controle da espessura do filme sintetizado.
Pode-se dizer ainda, que o fato do material ser sintetizado eletroquimicamente
facilitaria a industrializao do sistema, j que fornece um bom controle durante a
sntese, podendo-se obter materiais com propriedades reprodutveis, sem correr o
risco de obter materiais com caractersticas indesejadas.
Adicionalmente, os resultados obtidos por Raman in situ com eletroqumica
mostram uma dependncia significante da interao entre corante e polmero tanto
com o pH quanto com o potencial aplicado, onde o equilbrio de ionizao do AB
desloca-se em busca da estabilizao das cargas positivas geradas no Ppi oxidado.
Sistemas como esse podem ser usados para minimizar a interferncia causada por
ons presentes no eletrlito, minimizando a migrao destes ons em direo matriz
polimrica. Alm disso, conhecimentos sobre o ambiente interno do polmero na
qumica do dopante fornecem novas perspectivas para o desenvolvimento de
sensores de pH baseados em polmeros.
60
Captulo IV
Caracterizao ptica
para aplicao em
sensor de pH
61
Captulo IV Caracterizao ptica para aplicao em sensor de pH Parte I
IV. Caracterizao ptica para aplicao em sensor de pH

IV.1. Introduo
A pesquisa envolvendo sensores pticos uma rea que tem crescido muito
nas ltimas trs dcadas. Como consequncia, durante os ltimos anos houve um
avano significativo no desenvolvimento de sensores e biosensores pticos para
determinao de espcies de interesse qumico e biolgico. Alm disso, muitos livros
e revises foram publicados, onde se destacam as vantagens da sensibilidade ptica
comparadas com os outros mtodos de transduo.158-162
Trabalhos recentes no campo dos sensores pticos tm focado a busca por
materiais com baixo custo, o desenvolvimento de dispositivos optoeletrnicos
miniaturizados (fontes de luz e detectores) e a deteco de multi-analitos. Novas
tecnologias tm surgido particularmente na rea de biosensores devido aos avanos
na tecnologia de microfludos e imagens.163 Embora os princpios pticos usados
nestes sensores no mudaram substancialmente com os anos, em muitos casos as
plataformas de transduo sofreram considerveis mudanas, gerando sensores
com melhores propriedades, incluindo sensibilidade, estabilidade e seletividade. A
melhora destas propriedades ocorre devido ao design da plataforma, o qual busca o
desenvolvimento de um sensor ptico integrado altamente eficiente que combine a
forma como a luz atinge a amostra e a funcionalidade intrnseca do sensor.
O primeiro sensor com transduo qumica ptica foi baseado na medida de
mudanas no espectro de absoro e foi desenvolvido para determinao de CO 2 e
O2.164 Desde ento, uma variedade de sistemas pticos de deteco esto sendo
utilizados em sensores e biosensores, incluindo entre outros, elipsometria,
espectroscopia
(luminescncia,
fosforescncia,
fluorescncia,
Raman),
interferometria (interferometria de luz branca, interferometria modal) e a ressonncia

de plasmn de superfcie (SPR). Nestes sensores, a quantificao da espcie de
interesse realizada por medidas do ndice de refrao, quantidade de luz
absorvida, propriedades fluorescentes das molculas analisadas ou por um meio de
transduo qumico-ptico.165
Medidas
de
pH
so
usualmente
realizadas
utilizando
um
eletrodo
potenciomtrico (eletrodo de vidro), no entanto, em algumas circunstncias, a

62

determinao de pH utilizando sensores pticos (optodos) mais vivel. 166,167 O
conceito bsico do mtodo ptico para medidas de pH consiste no fato que o feixe
de luz incidente passa atravs do sensor e portanto, interage com o indicador
qumico, o qual altera a intensidade do feixe de luz, normalmente por absoro ou
por fluorescncia.96 O sinal ptico modificado guiado para o detector e um
indicador normalmente confinado no sensor ptico, que pode ser chamado de
optodo.168
Os optodos de pH oferecem vantagens devido a algumas de suas
caractersticas favorveis, como tamanho, imunidade a interferncias eltricas,
ausncia da necessidade de um sensor de referncia, possibilidade de
monitoramento remoto, dentre outras.169-172 Estas caractersticas dos sensores
baseados em polmeros condutores explicam o porqu de eles serem os mais
utilizados em conjuntos sensoriais, podendo ser facilmente fabricados com baixo
consumo de energia, podendo tambm operar em temperatura ambiente.
Apesar das boas caractersticas dos optodos de pH, uma limitao sua
estreita faixa de operao. Isto ocorre porque o optodo no mede diretamente o pH,
mas usualmente, a concentrao de um corante indicador em suas formas cida ou
bsica. Deste modo, as medidas dependem do pKa do corante e a escala de pH
restrita a cerca de 3 a 4 unidades. Ento, esforos tm sido empregados para se
desenvolver sensores para um extensa faixa de operao (de pH). Os corantes que
apresentam mudana de colorao com o pH so os indicadores cido-base mais
comuns, sendo utilizados inicialmente nas titulaes volumtricas clssicas.173
Corantes orgnicos como vermelho de fenol,174 vermelho de cresol,175 azul de
bromofenol e outros98,176 tm sido apresentados como indicadores de pH
absorventes ou fluorescentes, enquanto a fluorosceinamina, 177 piranina,178 assim
como corantes azo,179 so indicadores de pH tipicamente fluorescentes.
Os indicadores de pH so cidos fracos com propriedades espectrais distintas
associadas com suas formas protonadas (HInd) e desprotonada (Ind-). As
concentraes das formas HInd e Ind- so relacionadas atravs da equao de
Henderson-Hasselbach (Equao 3), onde Ka a constante de dissociao, pKa
-log Ka, e os colchetes indicam a concentrao das respectivas formas.180
= + log
Equao 3
63

Vrios materiais foram estudados para permitir a imobilizao de indicadores.
Aqueles considerados teis na imobilizao do corante incluem vidros sinterizados
com porosidade controlada,181 materiais polimricos hidrofbicos,99 e materiais
hidroflicos como a celulose182 e a poliacrilamida.183,184 O mtodo de imobilizao
que parece ser mais eficiente aquele onde ocorre ligaes covalentes do corante
com uma matriz adequada, proporcionando membranas quase isentas de lixiviao
do corante.174-177 Embora bons resultados foram obtidos com a maioria destes
optodos de pH, eles requerem um mtodo de preparao longo e tedioso, o qual
envolve tratamento da matriz e imobilizao do corante.
Polmeros condutores que mudam de cor em funo do pH podem ser
empregados no desenvolvimento de optodos com uma extensa faixa de pH.185 Isto
possvel porque esses polmeros so basicamente polieletrlitos com mltiplos
valores de pKa. Existem vrios tipos de polmeros, incluindo uma grande variedade
de derivados e, alm disso, um grande nmero de polmeros novos surge todos os
anos. Recentemente, polmeros como o polipirrol, tm sido usados na preparao de
plataformas para sensores pticos.186 O espectro do polipirrol obtido por oxidao
qumica dependente do pH entre pH 6 e pH 12, com pKa em torno de 8,6. De
acordo com a literatura,156 filmes de polipirrol dopado com nions bissulfato
apresentam resposta mudana de pH. Em outro trabalho, Tamm e cols.187
verificaram o comportamento sensvel a ctions dos filmes de polipirrol dopado com
sulfato e naftalenosulfonato.187,188
Polmeros
conjugados
podem
ser
tambm
associados
diferentes
mecanismos de transduo. Por exemplo, sensores pticos podem ser fabricados

com PICe uma vez que estes polmeros apresentam mudanas espectrais na regio
do UV-Vis quando sofrem processos de dopagem e desdopagem.189 Recentemente,
foram desenvolvidos sensores pticos que incorporam polmeros condutores
sensveis amnia,67 umidade, pH e cido actico.68 Alm disso, polmeros
condutores proporcionam uma superfcie que pode imobilizar elementos biolgicos
como enzimas ou anticorpos, possibilitando-se assim sua aplicao em biosensores.
Saoudi e cols. propuseram um monitoramento dieltrico para estudar o processo de
adsoro de biomolculas em PICe, tais como DNA em polipirrol. 69 Outros exemplos
de aplicaes incluem medidas de pH fisiolgico,98,70,71 monitoramento do pH da
gua do mar,72,73 monitoramento de processos industriais,74 dentre outros.99,190
64

Destacando as aplicaes como sensores, o Ppi pode ser aplicado na
deteco de pH, j que suas propriedades pticas e eltricas so afetadas pelo pH
do meio. O pH tem um efeito significante nas reaes qumicas, deste modo o
controle e as medidas desta propriedade se tornam importantes em diferentes reas,
incluindo qumica, bioqumica e cincia ambiental. Rotineiramente estas medidas
so feitas utilizando o convencional eletrodo de vidro, devido sua confiabilidade,
boa preciso, medidas no destrutivas, rpidas e reversveis. A ampliao de seu
uso para outras reas, entre elas as biomdicas, ambientais e industriais, tem sido
limitada devido a fatores como tamanho, falta de flexibilidade, dependncia de um
dispositivo de referncia, conexes eltricas, entre outros.191,192 Desta forma, em
algumas circunstncias necessria a determinao do pH usando sensores
pticos,166 incluindo a aplicao em medidas de pH fisiolgico, 105 monitoramento do
pH da gua do mar,98,73 controle de processos industriais,99 entre outras.99 Nestes
casos, o optodo de pH oferece vantagens devido algumas de suas caractersticas
favorveis, como tamanho, segurana intrnseca, imunidade interferncia eltrica,
entre outras.169,170
65
IV.2. Objetivo especfico

O objetivo do trabalho apresentado neste capitulo foi o estudo e
desenvolvimento de um sensor opticamente sensvel ao pH. Foi utilizado o polipirrol
como matriz hospedeira e o indicador cido-base azul de bromofenol. A imobilizao
do corante foi realizada durante a polimerizao eletroqumica do pirrol. As
propriedades pticas do material obtido foram estudadas buscando a aplicabilidade
deste material como sensor ptico para pH.
66
IV.3. Parte Experimental

IV.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodo de trabalho: FTO-vidro (preparado como descrito no Captulo III)
Eletrodo de referncia: calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Os mesmos descritos no Captulo III, alm de:
Perclorato de ltio (95%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Pirofosfato de sdio decahidratado (99%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Cloreto de sdio (99,5%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Nitrato de sdio (99,0%, Sigma-Aldrich), usado como recebido.
Bissulfito de sdio (Nuclear p.a.), usado como recebido.
Soro fisiolgico comercial (JP Indstrias Farmacuticas).
Equipamentos
Para a eletrodeposio de platina (Pt) e sntese eletroqumica dos filmes
sintetizados sobre FTO-vidro utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB,
modelo PGSTAT-30. Para termostatizao da clula durante as snteses, foi utilizado
um acessrio de controle de temperatura Tecnal modelo TE-184. Na calibrao das
solues tampo, foi utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321.
Todas as medidas efetuadas nesta etapa foram realizadas em circuito aberto.
IV.3.2. Modificao do eletrodo de FTO-vidro por eletrodeposio de

platina e Sntese dos filmes de polipirrol
A modificao do eletrodo de FTO-vidro com platina foi realizada da mesma
forma como descrita na seo III.3.2 (Captulo III). A sntese dos filmes de Ppi est
descrita na seo III.3.3 (Captulo III).
67
IV.4. Resultados e Discusso

IV.4.1. Sensibilidade ptica ao pH
Apesar do Ppi ser bem conhecido como material sensvel a mudanas de pH,
suas propriedades podem ser afetadas pelas condies de sntese como tipo de
dopante e concentrao do mesmo. Baseando-se nestas informaes, filmes de
Ppi-ClO4 foram sintetizados nas mesmas condies de sntese dos filmes de Ppi-AB
para futuras comparaes.
Na Figura 31a esto mostrados os espectros de absoro dos filmes de
Ppi-ClO4 imersos em solues tampo com diferentes valores de pH. Os espectros
foram coletados em temperatura ambiente (ca. 25C). O filme de Ppi-ClO4 apresenta
mudanas na intensidade da banda de absoro em funo do pH de forma similar
ao trabalho previamente publicado na literatura para filmes de Ppi quimicamente
sintetizados.186 Esta banda de absoro que comea em 550 nm atribuda s
transies interbandas (modelo polaron-bipolaron), a qual possui o mximo
deslocado para menores comprimentos de onda ao ser exposto a pH > 7. De acordo
com a literatura193 este deslocamento para menores comprimentos de onda devido
a processos de desdopagem, que ocorre quando o filme de Ppi exposto a pH > 6.
Durante este processo os ons ClO4- so lentamente trocados por ons hidrxido. A
sensibilidade a mudanas de pH observada para o Ppi pode ser em parte explicada
atravs da dissociao de hidroxilas ligadas aos anis de pirrol, alm disso a
presena de ons hidrxido pode levar desprotonao da cadeia polimrica,
resultando em diminuio do nvel de oxidao do polmero. Esta observao pde
tambm ser feita atravs das anlises por Raman e VC (Captulo III).
A curva de calibrao para o Ppi-ClO4 imerso em solues de diferentes pHs
est mostrada na Figura 31b. Atravs desta curva de calibrao, estimamos o valor
de pKa do Ppi igual a 7,4, o qual pode ser comparado com valores obtidos para Ppi
sintetizados quimicamente186 (pKa = 8,6). Esta diferena mostra que o polipirrol
sintetizado eletroquimicamente neste trabalho possui maior acidez, podendo ser
desprotonado com maior facilidade.
68

a)
b)
pH 11,0
0,62
0,60
0,58
0,56
pKa = 7,4
0,54
0,52
0,50
pH 1,5
500
550
600
650
700
10
11
12
pH
Figura 31: a) Espectros de absoro do filme Ppi-ClO4 imerso em soluo tampo

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0; e 11,0 temperatura ambiente. b) Curva de
calibrao para Ppi-ClO4 imerso em soluo tampo de diferentes pH para valores
de absorbncia em 680 nm.
O corante utilizado como dopante, AB, possui trs formas estruturais no
intervalo de pH estudado, cuja distribuio relativa obedece ao equilbrio cido-base
mostrado na Figura 10. De acordo com a literatura, o pKa do AB 4,0,194 sendo que
a colorao da soluo muda de amarelo (meio cido) para azul (meio alcalino).
A Figura 32 mostra os espectros de absoro UV-Vis das diferentes formas
do indicador AB em solues com diferentes pH. Como mencionado anteriormente
na seo III.4.5.1, utilizou-se as cores especficas de cada soluo com a finalidade
de determinar a absoro caracterstica de cada forma do indicador AB. Para isto,
uma simples relao foi feita com a roda de cores desenhada por Newton em 1666
(Figura 32b).195 A poro do espectro eletromagntico entre 380 e 780 nm
correspondente a regio do visvel. Ondas de luz com comprimentos de onda nesta
faixa so coloridas aos olhos humanos. Quando a luz branca difratada por um
prisma, resulta em um arco-ris, sendo violeta em um extremo e vermelha no outro.
Entretanto, o fenmeno da cor em compostos coloridos no to simples. Quando
um material iluminado por luz branca, possui uma colorao especfica, sendo
branco quando no absorver nenhuma faixa de comprimento de onda da luz visvel,
ou colorido quando absorver parte desta luz. Diferentemente de fontes coloridas,
como os lasers por exemplo, os compostos que absorvem luz na regio visvel do
69

espectro no possuem a cor correspondente ao comprimento de onda da luz
absorvida. Ao contrrio, existe uma relao inversa entre a cor observada (cor
caracterstica do material) e a cor absorvida (comprimento de onda de absoro).
Quando observamos a luz emitida de uma fonte, como em uma lmpada ou
laser, observamos a cor correspondente ao comprimento de onda da luz sendo
emitida. Uma fonte de luz que emite na cor violeta, emite luz correspondente ao
extremo mais energtico do espectro visvel, enquanto que uma fonte que emite
vermelho corresponde regio de mais baixa energia no espectro visvel.
Entretanto, quando observamos a cor de um objeto ou substncia, esta colorao
no resultante de emisso, j que o material no permanece com a mesma
colorao no escuro.
1,0
11,0
a)
1,5
3,0
b)
8,0
7,5
7,0
0,8
7,0
0,6
0,4
0,2
3,0
0,0
1,5
400
450
500
550
600
Figura 32: a) Espectros de absoro do indicador AB solubilizado em soluo

tampo fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 temperatura ambiente. Em
detalhe: imagem das solues de pH 1,5; 3,0 e 7,0 com suas respectivas coloraes.
b) Roda de cores desenhada por Newton.
Quando o material colorido iluminado por luz branca, uma faixa de
comprimento de onda absorvida e a poro restante refletida. Essa poro
restante d a cor caracterstica do material, a qual se assume como sendo a cor
complementar do comprimento de onda absorvido. As cores complementares esto
localizadas diametricamente em lados opostos na Figura 32b. Desta forma, as
solues coloridas podem indicar a faixa de comprimento de onda onde a banda de
absoro correspondente deve aparecer no espectro de absoro. Portanto, as
70

solues amarela, vermelha e azul deveriam apresentar uma banda de absoro
caracterstica destas cores na regio do violeta/azul (de 400 a 430 nm), verde
(de 490 a 560 nm) e alaranjado (de 580 a 620 nm), respectivamente. A banda de
absoro em 435 nm a dominante no espectro em pH 1,5; sendo que desaparece
para pH > 4,81.146 De acordo com a roda de cores de Newton, essa banda
resultante da soluo amarela e portanto caracterstica da forma neutra AB. A
banda de absoro em 580 nm se torna mais intensa para meios mais alcalinos,
como resultado a soluo alcalina azul e portanto atribuda a forma AB 2- do
indicador. Finalmente, a soluo vermelha o resultado do ombro em cerca de
525 nm presente na banda de absoro em 580 nm (Figura 32).
Na Figura 33 esto os espectros de absoro do filme Ppi-AB imerso em
solues tampo com diferentes pHs. Comparando estes espectros com os
espectros da Figura 31 e Figura 32, nota-se a maior semelhana do espectro do
Ppi-AB com a resposta ptica do dopante AB, sugerindo que: (i) a concentrao do
corante na matriz polimrica maior que a concentrao de Ppi, ou (ii) que a
resposta do Ppi esteja sendo mascarada pela resposta do indicador AB. No entanto,
as anlises de EDS (Espectroscopia de Energia Dispersiva de Raios-X) discutidas
no Captulo III, evidenciaram 15% de nitrognio para 6% de bromo (porcentagem
atmica), que leva proporo de 1 molcula de AB para cada 9 unidades
repetitivas de Pi. Portanto, descarta-se a primeira hiptese, podendo-se afirmar que
o corante est atuando como dopante para o Ppi e, portanto, est presente em
menor quantidade. Com relao segunda hiptese, nota-se que apesar do Ppi-AB
e do indicador AB possurem bandas de absoro na mesma regio, notvel a
diferena de sensibilidade em relao ao pH. Neste ponto importante destacar a
presena da banda em 439 nm mesmo em pH alcalino (pH 8,0), j que como
mencionado antes, esta banda desaparece para pH > 4,81146 quando a espcie AB
est em soluo. Este fato pode ser devido a dois fatores: (i) a absoro pode ser
resultante do indicador com uma contribuio da absoro do polmero, j que em
nveis intermedirios de oxidao, este apresenta bandas de absoro nesta
regio20 e (ii) a interao do indicador com a matriz polimrica, favoreceria o
deslocamento da reao mostrada na Figura 10 para a forma neutra do indicador
(cor amarela), favorecendo uma maior estabilizao da forma cida AB. Se isto
realmente for verdade, significa que ocorre uma diminuio da acidez do corante,
71

sendo esperado um aumento no valor aparente do pKa do material. O interessante
que este comportamento poderia ser usado eficientemente na aplicao do possvel
sensor no monitoramento de pequenas variaes de pH em amostras ambientais e
fisiolgicas.
b)
a)
439 nm
594 nm
Absorbncia
/ uni.
/ a.u.arb.
Absorbncia
1,2
11,0
1,0
soro
fisiolgico
1,5
0,8
soro fisiolgico
8,0
0,6
7,5
0,4
7,0
3,0
11,0
pH 7,4
1,5
400
450
500
550
600
650
10
pH
Figura 33: a) Espectros de absoro do filme Ppi-AB imerso em soluo tampo

fosfato com pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0 temperatura ambiente. b) Curva de
calibrao para Ppi-AB imerso em soluo tampo de diferentes pH.
Na Figura 33b esto mostradas as duas curvas de calibrao para os
comprimentos de onda em 439 e 594 nm. Como a absortividade das espcies AB e
AB2- so diferentes, optou-se em determinar o pKa do sistema atravs do mtodo
por clculos. Para um equilbrio cido-base do tipo representado na Figura 10, a
relao entre as concentraes das espcies para cada valor de pH varia de acordo
com a expresso de Henderson-Hasselbach. De acordo com a lei de Beer,196,197 a
concentrao da espcie absorvente proporcional sua absorbncia (A) segundo
a relao A = .b.C, onde a absortividade (molar, quando C a concentrao da
espcie em mol.L-1) e b o caminho ptico. Portanto, a equao de
Henderson-Hasselbach pode ser reescrita em termos de absorbncia (Equao 4),
onde Ac a absorbncia somente da forma cida, Abs a absorbncia somente da
forma bsica e Ai a absorbncia total da mistura (formas cida + bsica) para um
dado pH.
72

A Ac
pK a pH log i
Abs Ai
Equao 4
Desta forma a Equao 4 pode ser usada diretamente para cada uma das
solues e uma vez conhecido o pH e o termo logartmico, obtm-se algebricamente
os
valores
de
pKa.
Substituindo-se
os
valores
obtidos
dos
dados
espectrofotomtricos na Equao 4, obtm-se o valor de pKa em cada soluo

tampo para os comprimentos de onda 435 e 584 nm. Tomando-se a mdia entre os
valores, obteve-se como pKa aparente, o valor de 7,7. Este valor bem prximo do
pKa obtido para Ppi-ClO4 (7,4), o que corrobora a hiptese de que o polmero
contribui para a sensibilidade do material, facilitando a estabilizao da forma neutra
do indicador (AB), diminuindo a acidez aparente e consequentemente aumentando o
pKa do sistema. O aumento do pKa resultante do estado de oxidao do polmero,
como mostrado nas medidas in situ (seo III.4.5). Desta forma, o pKa observado
sugere que o polmero est parcialmente reduzido nas condies do experimento.
Esse estado parcialmente reduzido resultante do processo de sntese utilizado
neste trabalho. Como descrito na seo experimental (seo III.3.3), os filmes de Ppi
foram sintetizados por VC, sendo -0,3 V o potencial final de sntese. De acordo com
as VC mostradas no Captulo III, em -0,3 V o polmero est reduzido, possuindo
menor nmero de estados polaronicos/bipolaronicos na cadeia polimrica,
resultando em menor demanda por cargas negativas do dopante. Como resultado,
ocorre a diminuio da acidez do indicador AB, resultando em um aumento do pKa
do sistema, o qual prximo de optodos sensveis ao pH baseados em Ppi (8,6). 186
Desta forma, assume-se que ambos Ppi e AB participam da sensibilidade ao pH, e
portanto, a resposta do material resultado de um efeito sinrgico. Ao se aumentar o
pH, os ons hidrxido afetam ambas as espcies individualmente, assim como o
sistema Ppi-AB de forma geral. Com relao ao indicador em soluo, os ons
hidrxido provocam a desprotonao da molcula, deslocando o equilbrio (Figura
10) em direo s formas aninicas do indicador. Considerando o Ppi, os ons
hidrxido podem estabilizar as cargas positivas presentes na cadeia polimrica
parcialmente oxidada, e podem ainda desprotonar o polmero, levando diminuio
do nvel de oxidao do Ppi. Todos os efeitos do pH sobre as molculas do dopante
AB, sobre o Ppi e sobre as interaes entre molculas do corante presas na cadeia
polimrica, afetam o equilbrio do indicador AB.
73

De fato, o Ppi e o indicador AB so individualmente materiais sensveis ao pH,
possuindo pKa bem especficos, sendo alcalino para o Ppi e cido para o AB. Para o
material apresentado neste trabalho (Ppi-AB), o pKa foi observado em cerca de 7,7.
Este efeito sinrgico aumenta a faixa de trabalho do sensor onde o material
sensvel, comparando-se com a faixa sensvel mudanas de pH dos materiais
individualmente, possibilitando a sua aplicao no monitoramento de variaes do
pH de amostras biolgicas e ambientais.
Buscando a aplicao do material obtido neste trabalho como sensor de pH
para amostras reais, coletou-se o espectro de absoro para o Ppi-AB imerso em
soro fisiolgico. Esta amostra comumente usada para infuso intravenosa,
enxague de lentes de contato, entre outras aplicaes. De acordo com a Figura 33a,
o pH da amostra de soro fisiolgico analisada possui pH prximo a 7,5 (linha
vermelha pontilhada). Ao graficar os valores de absorbncia obtidos para a amostra
na curva de calibrao (Figura 33b), obtm-se um valor de pH em torno de 7,4. Este
resultado consistente com medidas experimentais usando pHmetro (igual a 7,43).
IV.4.2. Histerese
Na Figura 34 esto os valores de absorbncia medidos para Ppi-AB aps a
imerso em soluo tampo fosfato de pH 1,5 a 11,0 e de pH 11,0 a 1,5 (o filme
Ppi-AB ficou imerso durante 3 min em cada soluo tampo para que ocorresse o
condicionamento inicial do filme). Este experimento foi realizado em ciclo com a
finalidade de analisar a histerese do material. A histerese um fenmeno observado
em alguns materiais, no qual certas propriedades, em determinado estado,
dependem de estados anteriores. O estudo desta propriedade importante para a
caracterizao de um sensor devido confiabilidade das medidas, j que a resposta
depende da amostra analisada anteriormente, para materiais que apresentem
histerese.
De acordo com a Figura 34, os filmes de Ppi-AB apresentam uma pequena
histerese no comportamento ptico. A histerese observada na resposta ptica pode
ser relacionada desprotonao das cadeias de Ppi, a qual rapidamente ocorre
aps a imerso em meio alcalino. De fato, quando a medida foi realizada novamente
com o mesmo filme em um segundo ciclo, observou-se uma histerese similar,
74

entretanto a absorbncia registrada foi menor quando comparada com o primeiro
ciclo.
439nm
594nm
10
11
pH
Figura 34: Curva de histerese para Ppi-AB imerso em soluo tampo fosfato de
pH 1,5 a 11,0 e pH 11,0 a 1,5.
Essa observao sugere que a desprotonao da cadeia polimrica, que
possivelmente causa a histerese do comportamento ptico do Ppi-AB, tambm leva
perda de reprodutibilidade. Em meio muito alcalino, as ligaes N-H so rompidas,
levando desprotonao do Ppi.138,139 A desprotonao da cadeia polimrica diminui
o comprimento de conjugao , j que os ons OH- podem se ligar covalentemente
cadeia polimrica,198 levando diminuio dos portadores de carga e
consequentemente diminuio da condutividade do filme. O fato de filmes de Ppi
apresentarem histerese aps imerso em meio alcalino foi previamente estudado,
sendo que a resposta do filme aps imerso apresentou maiores valores de
resistncia hmica.199
75
IV.4.3. Tempo de resposta

O tempo de resposta definido como o tempo necessrio para que ocorra a
mudana de um sinal.200 Um tempo de resposta de 100% definido como o tempo
necessrio para atingir uma mudana total do sinal. No entanto, como na maioria
das vezes o tempo de resposta apresenta um perfil exponencial, a determinao
exata de 100% da variao do sinal difcil. Consequentemente, usualmente o
tempo de resposta analisado em termos de somente 63% a 90% da mudana do
sinal.201 O tempo de resposta depende da temperatura, da quantidade de indicador
imobilizado, da espessura do sensor, do material usado e do procedimento de
fabricao. Para optodos em geral, tm sido relatados tempos de resposta flutuando
desde poucos segundos,202 at vrios minutos.203
O tempo de resposta para o filme Ppi-AB foi analisado atravs de medidas de
absorbncia do filme de Ppi-AB ao ser variado o pH do meio. Para isso, utilizou-se
uma cubeta conectada a duas seringas. Uma das seringas foi utilizada para sugar a
soluo, enquanto que a outra foi usada para injetar a soluo tampo dentro da
cubeta. A Figura 35 mostra o tempo de resposta para o filme Ppi-AB, onde as
absorbncias em 594 nm foram normalizadas (variao de absorbncia de
1 unidade). O filme apresenta tempo de resposta mais curto quando prximo ao pKa
(ca. 1,0 s). De fato, a mudana de cor (Figura 33) pode ser facilmente visualizada,
ocorrendo com a mesma velocidade que a mudana de cor do corante em soluo.
No entanto, o tempo de estabilizao requerido para meio cido ca. 35 s, sendo
mais curto do que o observado para meio alcalino. Este longo tempo de
estabilizao em meio alcalino pode ser devido ao processo de desprotonao que
ocorre neste meio.186 Um comportamento similar foi observado para filmes de
PANI.204
Uma das grandes vantagens do material estudado (Ppi-AB) em relao a
sensores convencionais49 est relacionado ao tempo de resposta. Para que ocorra a
mudana de colorao no Ppi-AB (Figura 33a) necessrio um tempo muito curto,
(< 1,0 s, sendo estimado visualmente), pois o sensor mantm o tempo de resposta
do indicador, ou seja, semelhante ao seu tempo de converso da forma cida para a
O tempo para que ocorra a mudana de colorao muito curto, sendo difcil de ser registrado
experimentalmente, pois est abaixo do limite de deteco do equipamento. No entanto, pode-se

determinar experimentalmente o tempo para a estabilizao da mudana de cor no material.
76

forma bsica. Desta forma, o tempo de resposta do material uma das propriedades
que o viabiliza para a aplicao comercial, j que muito rpido, at mesmo quando
se compara com sensores de pH baseados em Ppi recentemente obtidos, cujo
tempo de resposta na ordem de 2 a 6 min.157,205
Figura 35: Tempo de resposta do filme Ppi-AB em 594 nm para diferentes pH.
IV.4.4. Estabilidade ptica

A estabilidade de um material um requisito importante para a aplicao
como dispositivo. Com a finalidade de testar a estabilidade ptica dos filmes de
Ppi-AB, espectros de absoro dos filmes mantidos em soluo tampo com
diferentes pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0) foram coletados por um perodo de 16
dias (Figura 36). A absorbncia foi monitorada em funo do tempo em 439 nm para
meio cido e 584 nm para meio alcalino, todos em funo do tempo.
De acordo com a Figura 36, observa-se que o filme bastante estvel em
meio cido, sendo que sua absorbncia praticamente no muda durante os 16 dias
em que esteve imerso nas solues tampo. Com relao aos demais (exceto
pH 11,0) verifica-se que o filme possui um comportamento inicial similar, ocorrendo
77

aumento da absorbncia, a qual permanece constante at cerca de 2 dias e depois
diminui gradualmente.
1,1
a)
435 nm
pH 1,5
pH 3,0
b)
607 nm
pH 7,0
pH 7,5
1,0
0,9
0,8
0,7
2,0
1,6
1,2
0,8
0,4
2,4
2,0
c)
607 nm
pH 8,0
595 nm
pH 11,0
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0
50
100
150
200
250
300
350
Tempo / horas
Figura 36: Estabilidade ptica dos filmes Ppi-AB imersos em soluo tampo fosfato
de diferentes pH. O desvio padro foi calculado utilizando diferentes filmes de
Ppi-AB.
O aumento inicial da absorbncia pode ser devido ao condicionamento do
filme, um fenmeno bastante conhecido e que est associado ao tempo necessrio
para homogeneizao da distribuio de carga e/ou transporte de massa no
material.206 Com relao desestabilizao do material caracterizada pela
diminuio gradual da absorbncia, pode-se sugerir que esta desestabilizao
ocorre devido ao efeito de desdopagem,193,207 onde as molculas de dopante (AB)
78

so lentamente trocadas por ons hidrxido. Este processo foi evidenciado pela
mudana de colorao da soluo tampo, observada principalmente para pH 11,0;
sendo espectroscopicamente medida durante os experimentos. Desta forma, os
diferentes comportamentos pticos observados para Ppi-AB imerso em meio cido,
neutro e alcalino podem ser relacionados principalmente ao processo de
desdopagem das cadeias de Ppi. Em meio neutro o processo de desprotonao
muito sutil, entretanto, quando o filme permanece imerso neste meio por mais de
100 horas, o corante comea a sair da cadeia polimrica para a soluo (lixiviao).
Em meios fortemente alcalinos, a desprotonao leva diminuio do comprimento
de conjugao, o qual afeta as propriedades pticas do filme antes mesmo de
ocorrer o condicionamento inicial.138,139
O material sintetizado neste trabalho (Ppi-AB) possui boa estabilidade,
principalmente em meio cido, semelhante a sensores baseados em compsitos de
polipirrol N-substitudo dopados com azul da prssia, 208 os quais so estveis em ar
e em solues de HCl por 150 dias e por 14 dias quando estocados em solues
etanlicas. Alm disso, so materiais obtidos com facilidade, baixo custo e com boa
estabilidade ambiental, a qual semelhante a materiais baseados neste polmero
condutor.207
IV.4.5. Reprodutibilidade e Reversibilidade ptica

Na Figura 37 esto os dados referentes reprodutibilidade e reversibilidade
da resposta ptica medidas por espectrofotometria UV-Vis do Ppi-AB. As
absorbncias em 584 nm foram sucessivamente registradas aps 2 min de contato
com as solues tampo em diferentes pH. A absorbncia foi primeiramente medida
para o filme imerso em pH 1,5; o filme foi ento enxaguado com gua deionizada e
posteriormente imerso na prxima soluo tampo, pH 3,0; pH 7,0; pH 7,5; e ento
pH 8,0. Finalizando o ciclo, aps a medida em pH 8,0, enxaguou-se o filme e
voltou-se a imergi-lo na soluo tampo de pH 1,5 e nas demais solues. Este
experimento realizado desta maneira permite a caracterizao simultnea da
reversibilidade e da reprodutibilidade do sistema.208 Somente aps 70 ciclos, o filme
de Ppi-AB foi testado em pH 11,0, j que sensores pticos de pH apresentam
irreversibilidade, perdendo completamente a sensibilidade ao pH quando mantidos
em solues com alto valor de pH.186 Como as medidas em pH 3,0 e 7,5 possuem o
79

mesmo comportamento que as medidas em pH 1,5 e 7,0, respectivamente, optou-se
em no mostrar estas curvas buscando um grfico com a visualizao mais fcil dos
resultados, Figura 37.
Aps o condicionamento do filme, a resposta reprodutvel e reversvel entre
o 20 o e o 70 o ciclo. Entretanto, aps imergir o filme na soluo tampo com pH 11,0
o sistema torna-se irreversvel, tendo sua reprodutibilidade afetada. Este
comportamento era esperado uma vez que j foi mostrado que ocorre a expulso do
corante da matriz polimrica em meios extremamente alcalinos (seo IV.4.2) devido
ao processo de desdopagem provocado pela presena dos ons hidrxido na
soluo tampo. Alm disso, a diminuio da absorbncia sugere que esteja
ocorrendo uma reduo irreversvel com parcial degradao e perda da
eletroatividade,209,210 j que o Ppi pode ser dopado ou desdopado reversivelmente
somente na escala de pH de 2 a 10.211,212
pH 1,5
pH 7,0
pH 8,0
pH 11,0
0,44
0,42
0,40
0,38
0,36
0,34
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Nmero de medidas
Figura 37: Absorbncia em 584 nm para Ppi-AB imerso em solues tampo de
diferentes pH em funo do nmero de medidas para determinao da
reprodutibilidade e reversibilidade do filme. Os desvios padro foram calculados
utilizando diferentes filmes de Ppi-AB.
80

Resultados similares foram obtidos para um compsito de Ppi N-substitudo
dopado com azul da prssia, sendo que este torna-se irreversvel quando imerso em
pH maior que 9,0.208
IV.4.6. Efeito da Temperatura

Para os estudos do efeito da temperatura sobre a determinao ptica do pH,
foram realizadas medidas de absorbncia do filme Ppi-AB em diferentes
temperaturas (15, 25 e 35 C). Na Figura 38a, esto os espectros correspondentes a
estas temperaturas para o filme imerso em pH 3,0. De acordo com o resultado
obtido, verifica-se que a temperatura praticamente no afeta a resposta do sensor
em meio cido.
Na Figura 38b est mostrada a variao da absorbncia em 584 nm do
Ppi-AB em diferentes temperaturas para os pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0. A interferncia
causada pela temperatura no to significativa em meio cido quanto em meio
neutro/alcalino.
0,18
15 C
25 C
35 C
a)
0,16
0,14
b)
0,9
0,12
pH 8,0
0,8
pH 7,5
0,7
pH 7,0
0,6
0,10
0,08
0,5
0,06
pH 3,0
0,04
0,4
0,02
0,3
pH 1,5
0,00
400
450
500
550
600
15
20
25
30
35
Temperatura / C
Figura 38: (a) Espectro UV-Vis do filme Ppi-AB imerso em pH 3,0 em diferentes
temperaturas e (b) efeito da temperatura na resposta ptica do Ppi-AB em 584 nm
imerso em diferentes pH.
81

A resposta do material em meio cido praticamente no sofre alterao,
enquanto que a interferncia torna-se significativa acima de pH 7,0. Acima deste pH,
o aumento da temperatura induz o aumento da absorbncia da banda em 580 nm.
Este comportamento pode ser explicado baseando-se na dissociao do indicador
AB. Como a dissociao endotrmica, ocorre aumento da concentrao da forma
aninica do indicador (AB2-). Com relao ao polmero, ocorre o aumento da
mobilidade intercadeia dos portadores de carga (hopping), favorecido pelo aumento
de temperatura, contribuindo assim para as transies interbandas.213,214
IV.4.7. Efeito de Interferentes

Para os estudos de interferncia de ons na resposta ptica do sensor, foram
preparadas diferentes solues contendo os ons bissulfito (HSO3-), cloreto (Cl-),
potssio (K+), nitrato (NO3-) e pirofosfato (P2O74-) com concentraes 0,01 e
0,15 mol.L-1 em diferentes pH. A anlise da interferncia foi realizada nos
comprimentos de onda de mxima absoro (584 nm) utilizando como base para a
comparao entre as medidas a Equao 5, onde C.I. o coeficiente de
interferncia, Ax a absorbncia do filme imerso na soluo tampo contendo o on
interferente e A0 a absorbncia coletada na ausncia do interferente.
C.I .
( Ax A0 )
A0
Equao 5
Na Tabela 2 esto mostrados os resultados obtidos para a anlise de

interferncia. Com relao a 0,01 mol.L-1, o comportamento do material na presena
dos interferentes foi semelhante, sendo que as interferncias mais significativas
foram observadas na presena de ons nitrato e bissulfito. Este fato pode ser
explicado pelo comportamento redox dos ons nitrato e bissulfito, que alteram o nvel
de oxidao do Ppi, levando a mudanas das propriedades pticas do filme Ppi-AB.
Em 584 nm os ons cloreto e potssio praticamente no interferiram, o que
torna o material interessante j que esses ons so comumente encontrados em
amostras como leite, plasma sanguneo e gua do mar. Ao aumentar a concentrao
do interferente 15 vezes, ocorre interferncia praticamente para os mesmos ons.
Esta observao sugere que a fora inica praticamente no interfere na resposta do
sensor Ppi-AB.
82

Tabela 2: Coeficientes de interferncia (C.I.) obtidos por medidas de absoro do
Ppi-AB imerso em solues tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes.
0,01 mol.L-1
0,15 mol.L-1
pH
P2O74-
Cl-
K+
NO3-
HSO3-
P2O74-
Cl-
K+
NO3-
HSO3-
1,5
0,01
0,03
0,03
0,03
0,25
0,01
0,05
0,05
0,09
0,30
3,0
0,06
0,03
0,03
0,00
0,25
0,06
0,05
0,06
0,08
0,25
7,0
0,05
0,05
0,00
0,14
0,20
0,04
0,06
0,04
0,27
0,24
7,5
0,04
0,00
0,04
0,32
0,16
0,06
0,06
0,04
0,32
0,25
8,0
0,03
0,03
0,03
0,30
0,23
0,01
0,07
0,07
0,30
0,31
Estes resultados podem ser comparados com a literatura, onde estudos de

interferncia para o Ppi na presena de metais pesados resultaram em C.I. de 0,16 e
0,18.186 Em outro trabalho, a interferncia do NaCl, LiCl e NaClO4 foi investigada
para sensores baseados em poli(o-metoxianilina), onde foram obtidos C.I. de 0,01;
0,13
0,31,
respectivamente,
para
solues
contendo
0,15 mol.L-1
dos
interferentes.215
83
IV.5. Concluses Parciais

O mtodo para a preparao do Ppi-AB descrito neste trabalho simples,
reprodutvel e ainda possui um baixo custo. O filme obtido responde sensivelmente
ao pH na escala de 1,5 a 11,0 com mudana reversvel da colorao em
comprimentos de onda fixos. Entretanto ocorre perda da reversibilidade quando o
material exposto a pH 11,0, contudo esta desvantagem no desvaloriza a
aplicabilidade do material, j que um material obtido com baixo custo. Uma das
vantagens deste material a maior faixa de deteco obtida quando comparado com
outros sensores pticos de pH,216 os quais usualmente so sensveis a somente
3 unidades de pH. Outra vantagem do material proposto se baseia na resposta
desde meio cido at meio alcalino, incluindo pH de amostras fisiolgicas, enquanto
que outros optodos apresentam sensibilidade somente em meio cido ou
alcalino.186,217
84
Captulo V
Caracterizao hmica
para aplicao em
sensor de pH
85
Captulo V Caracterizao hmica para aplicao em sensor de pH Parte I
V. Caracterizao hmica para aplicao em sensor de pH

V.1. Introduo
Muitos processos e reaes qumicas so dependentes do pH, portanto, o
desenvolvimento de dispositivos que forneam medidas rpidas e precisas do pH
uma linha de pesquisa bastante explorada.218-220 Como mencionado anteriormente, o
procedimento padro para medidas de pH feito utilizando o eletrodo de vidro, o
qual apresenta muitas vantagens, como resposta Nernstiana de pH 2 a pH 12, alta
reprodutibilidade, alta seletividade a ons hidrognio, longo tempo de vida e, alm
disso, interferentes redox no alteram sua sensibilidade.221 Por outro lado, os
eletrodos de vidro apresentam desvantagens relacionadas instabilidade em meios
fortemente cidos ou alcalinos, alto preo e dificuldade para a miniaturizao, sendo
inconveniente quando se trabalha com amostras fisiolgicas, por exemplo. 106 Desta
forma, existe uma clara necessidade na obteno de mtodos alternativos para
medidas de pH, principalmente na busca por um dispositivo capaz de trabalhar com
pequenas quantidades de amostra. Neste sentido, muitos sensores de pH tm sido
desenvolvidos, sendo alguns deles baseados em membranas, xidos metlicos,
fibras pticas, entre outros.103,104 No entanto, muitos destes dispositivos so
instveis, precisando de constantes re-calibraes. Estudos recentes mostram que
os eletrodos modificados eletroquimicamente com polmeros condutores so bons
candidatos para a substituio dos populares eletrodos de vidro. 222
Vrios trabalhos tm mostrado a aplicao de polmeros condutores
eletroativos no desenvolvimento de clulas solares,223,224 dispositivos emissores de
luz,225,226 e dispositivos eletroqumicos e eletrocrmicos.227-230 Entre esta variedade
de aplicaes, o uso desta classe de material em sensores de pH tm sido foco de
muitos trabalhos na ltima dcada,231,232 podendo ser utilizados na produo de
sensores
condutimtricos
devido
suas
propriedades
eltricas.
eletropolimerizao de compostos heteroaromticos em superfcies de eletrodos

um dos muitos modos efetivos para produo de eletrodos quimicamente
modificados com alta condutividade eltrica.233 Como exemplos de sensores
qumicos de pH usando eletrodos cobertos com filmes polimricos, alm dos obtidos
por eletropolimerizao do pirrol, tm-se os baseados em anilina, tiofeno, e
86

derivados de benzeno.42,199,204,234,235 Heineman e cols.236 foram os primeiros a usar
um eletrodo de platina recoberto com poli-(1,2-diaminobenzeno) eletropolimerizado
para aplicao em um sensor de pH. Oyama e cols.237 estudaram as respostas
potenciomtricas de eletrodos de platinas recobertos com polifenol, polianilina,
poli(1,2-diaminobenzeno) e poli(4,4-diaminodifenilter) obtidos por polimerizao
eletroqumica dos respectivos monmeros. Em outros eletrodos obtidos por
eletropolimerizao tambm foi possvel observar a sensibilidade ao pH. 238,239
Tambm podem ser encontrados alguns estudos da resposta potenciomtrica dos
eletrodos de polipirrol frente a solues contendo diferentes nions.240-242Como uma
propriedade inerente dos polmeros conjugados, no estado oxidado ele um ction
poliradical e atrai eletrostaticamente nions para o interior da matriz polimrica. Alm
disso, o Ppi apresenta distribuio de carga e de tamanho de poros, possuindo
portanto, certa funcionalidade para a identificao de nions e estes requisitos
estricos podem tambm controlar possveis interferncias de outros ons.156 Neste
sentido, sensores baseados em polmeros com propriedades extras para a
identificao de analitos, podem melhorar a seletividade do sensor quando
comparado com sensores de troca inica.156
Muitos polmeros condutores possuem grupamentos cidos e/ou bsicos, os
quais podem ser protonados ou desprotonados. A PANI e o Ppi so alguns dos
polmeros que pertencem a esta famlia. A desprotonao destes polmeros
conjugados resulta na diminuio dos portadores de carga ao longo da cadeia
polimrica, a qual acompanhada de mudanas nas propriedades redox do
polmero. A protonao aumenta a condutividade do Ppi, enquanto que a
desprotonao leva diminuio da condutividade.139
O efeito do pH no polipirrol dopado com ons cloreto (Ppi-Cl) e cido
polivinilssulfnico (Ppi-PVS) foi anteriormente descrito.199 Sensores potenciomtricos
miniaturizados para pH baseados em filmes de polipirrol eletroquimicamente
sintetizados foram recentemente desenvolvidos por Lakard e cols.231 Esses eletrodos
de pH consistem em 2 microeletrodos interdigitados, fabricados por fotolitografia,
como mostrado na Figura 39.
87
Figura 39: Esquema mostrando eletrodos com microarranjos interdigitados.168

Outros exemplos de eletrodos cobertos com polmeros sensveis ao pH, so
os baseados em pirrol (Pi), 3-(2,5-dihidroxibenzil) pirrol (PiQH), anilina (An) e
o-fenilenodiamina (oPD).75 Os polmeros so sintetizados utilizando como dopante
perclorato e albumina de soro bovino (BSA). As propriedades potenciomtricas do
filme resultante apresentaram resposta aproximadamente Nernstiana. Obtiveram-se
as seguintes sensibilidades para estes sensores: -43,2 mV.pH-1 para o Ppi,
-46,0 mV.pH-1 para o PpiQH, -42,1 mV.pH-1 para a Pan e -50,7 mV.pH-1 para PoPD.
Todos se apresentaram sensveis faixa de pH entre 3 e 10 e foi obtido um tempo
de resposta mdio de 3 a 5 min. Em um outro trabalho107 foi estudado o efeito do
dopante e do eletrlito na sensibilidade e tempo de resposta do Ppi atravs de
mudanas de pH da soluo. Foi observado que a resposta do Ppi dopado com
nions comuns (Cl-, NO3-, ClO4-) lenta. Em contraste, filmes de polipirrol
depositados na presena de nions de cidos fracos, como ftalatos, oxalatos e
salicilatos, foram caracterizados por resposta instantnea mudana de pH (< 1 s).
88
V.2. Objetivo
Esta etapa do trabalho teve como objetivo a sntese de um material cuja
resistncia eltrica seja afetada por mudanas do pH do meio. O material foi obtido
por polimerizao do pirrol como matriz hospedeira e o indicador cido-base azul de
bromofenol. A imobilizao do corante foi realizada durante a polimerizao
eletroqumica do pirrol. As propriedades hmicas do material obtido foram estudadas
buscando a aplicabilidade deste material como sensor hmico para pH.
89
V.3. Parte Experimental

V.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Eletrodo de trabalho: Vidro coberto com filme de ouro digitalizado com rea de ca.
10 mm2 e separados por um intervalo de 10 m (fornecido pela Escola Politcnica da
Universidade de So Paulo).
Eletrodo de referncia: calomelano saturado (ECS).
Contra-eletrodo: placa de platina de 1,0 x 1,5 cm (99,99% pureza, Platilab Ltda).
Reagentes
Os mesmos descritos na seo IV.3.1 (Captulo IV).
Equipamentos
Para a sntese dos filmes sobre o eletrodo de ouro digitalizado (Figura 40),
utilizou-se um potenciostato/galvanostato AUTOLAB, modelo PGSTAT-30. Para
termostatizao da clula durante as snteses foi utilizado um acessrio de controle
de temperatura Tecnal modelo TE-184. Para calibrao das solues tampo foi
utilizado um pHmetro HANNA Instruments, modelo HI 9321. Durante as medidas de
resistncia utilizou-se um eletrodo programvel Keithley, modelo 617 interfaceado a
um computador.
V.3.2. Sntese dos filmes de polipirrol sobre eletrodos de ouro

digitalizado
As eletropolimerizaes dos filmes foram realizadas de forma similar
descrita anteriormente (seo III.3.3 Captulo III) sobre a superfcie do eletrodo de
ouro digitalizado (dedos de ouro, Figura 40). O filme foi depositado com 15 ciclos de
VC, sendo equivalente espessura necessria para fechar o contato eltrico entre
os dedos de ouro. Aps a sntese, o sensor foi seco a 45oC por 2 h e mantido em
dessecador sob vcuo.
90
Figura 40: a) Eletrodo digitalizado de ouro e b) com o filme de Ppi-AB depositado

eletroquimicamente. Dimenso do substrato de vidro 2,5 cm2.
91
V.4. Resultados e Discusso

V.4.1. Sensibilidade hmica ao pH
Os filmes Ppi-AB (Figura 40b) foram imersos durante 5 min em solues
tampo de diferentes pH (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A resistncia eltrica medida
durante estas imerses foi convertida para sensibilidade hmica (S%) utilizando a
Equao 6, onde Rx a resistncia obtida aps a imerso do sensor na soluo
tampo e R0 a resistncia antes da imerso.221
% =
0
0
100
Equao 6
Na Figura 41 esto os valores de sensibilidade hmica (S%) do filme Ppi-AB

em funo do pH. Observa-se que a sensibilidade aumenta ao condicionar o filme de
meio cido a meio neutro, e que de acordo com a Equao 6, um resultado da
diminuio da resistncia do filme. Este comportamento esperado j que a
concentrao das espcies com cargas negativas (corante AB) aumenta de pH 1,5 a
pH 7,5.146 Entretanto, a sensibilidade comea a diminuir aps a imerso em pH 7,5
at pH 11,0.
As medidas espectrofotomtricas mostradas no Captulo IV para filmes de
Ppi-AB mostram um deslocamento do pKa para 7,7243 quando comparado com o
corante em soluo (pKa 4,0).194 Desta forma, a inverso do comportamento da
sensibilidade mostrada na Figura 41 ocorre prxima ao pKa do sistema Ppi-AB.
Portanto, sugere-se que parte das mudanas na condutividade do filme polimrico
ocorra devido ao deslocamento do equilbrio apresentado na Figura 10 juntamente
com a desprotonao da cadeia polimrica do Ppi.
No pH correspondente ao pKa, as concentraes das espcies alcalinas e
cidas so as mesmas para um equilbrio simples. De acordo com os resultados
apresentados no Captulo IV, o pKa do Ppi-AB ocorre em 7,7, portanto em pH cido
a concentrao da forma neutra maior do que a concentrao da forma aninica
(AB2-). Aumentando-se o pH do meio, o equilbrio se desloca no sentido de aumentar
a concentrao da forma carregada do corante, resultando em um maior nvel de
dopagem do polmero,
e consequentemente
levando a um aumento na
condutividade do Ppi-AB. Baseando-se nesta explicao, esperaramos um

92

comportamento linear para a sensibilidade versus pH (Figura 41). Entretanto, em
pH 7,5 observada uma inverso do comportamento, onde a sensibilidade comea
ento a diminuir. Este comportamento pode ser explicado levando em considerao
que ocorre uma ruptura das ligaes N-H, em resultado do processo de
desprotonao em meio alcalino.138,139 Como discutido no Captulo IV, a
desprotonao diminui o comprimento de conjugao , levando diminuio da
mobilidade
dos portadores
de
carga
consequentemente
diminuio
da
condutividade (aumento da resistncia). De fato, durante as medidas em pH alcalino,

observou-se a sada do corante da matriz polimrica em direo ao eletrlito. Apesar
de ocorrer um aumento da concentrao das formas aninicas do indicador em
meios mais alcalinos, ocorrem tambm processos de desprotonao e desdopagem,
impedindo que o filme alcance maiores condutividades que a obtida em pH 7,5.
cia
n
ia
nc
t
sis
re
i
inu
18
da
ist
s
e
da
20
S/%
to
en
m
Au
22
m
Di
16
14
12
10
2
10 11
pH
Figura 41: Sensibilidade hmica (resistncia relativa) ao pH dos filmes Ppi-AB.
A inverso do comportamento da curva de sensibilidade dos filmes de Ppi-AB
em relao ao pH mostra uma desvantagem do sensor hmico quando comparado
ao sensor ptico (Captulo IV), j que o Ppi-AB com resposta hmica apresenta
menor faixa de deteco, sendo de pH 1,5 a pH 7,5 ou 7,5 a 11,0 (desde que se
93

conhea previamente se o meio cido ou bsico). As faixas de deteco
encontradas nesse trabalho podem ser comparadas a dados da literatura, 64,175 onde
foram estudados materiais baseados em Ppi dopado com Cl- e diferentes
indicadores, os quais apresentaram faixa de deteco entre pH 2 e 12.
V.4.2. Tempo de resposta

O tempo de resposta do filme Ppi-AB foi medido atravs das medidas de
resistncia versus tempo em meio alcalino e cido (Figura 42). Para essas medidas,
o Ppi-AB foi removido da soluo tampo de pH 8,0 aps 40 segundos e ento
imerso em meio cido (pH 3,0).
Figura 42: Dinmica da resposta hmica do Ppi-AB entre meio alcalino (pH 8,0) e
meio cido (pH 3,0).
O comportamento do Ppi-AB mostrado na Figura 42 corrobora os resultados
apresentados na Figura 41, onde o valor de resistncia para o filme imerso em meio
cido (pH 3,0) maior quando comparado com o mesmo filme imerso na soluo
com pH prximo ao pKa do sistema (pH 8,0).
94

Um resultado muito interessante obtido para este sistema o curto tempo de
resposta quando comparado com dados da literatura.
244-246
As mudanas nos
valores de resistncia foram observadas dentro de um intervalo de 10 segundos,

partindo de meio cido para meio bsico e vice-versa. Grant e Glass244 trabalharam
com o corante seminaftorodamina-1-carboxilado encapsulado por sol-gel, o qual
resultou em um sensor de pH com tempo de resposta de 15 s. Tempos de resposta
de 3 a 5 min foram obtidos para sensores de pH baseados em polmeros
sintetizados eletroquimicamente, como Ppi e polianilina.245 Porm, tempos de
resposta mais curtos, menores que 1 s, tambm foram obtidos para Ppi sintetizado
eletroquimicamente sobre eletrodos de platina.246
V.4.3. Estabilidade hmica

A estabilidade de um material um dos requisitos mais importantes para a
aplicao de um sensor. Neste trabalho a estabilidade foi analisada atravs de
medidas de resistncia dos filmes Ppi-AB imersos em solues tampo de diferentes
pHs (1,5; 3,0; 7,0; 7,5; 8,0 e 11,0). A Figura 43 mostra a variao da resistncia dos
filmes imersos em pH 3,0; 7,0 e 8,0 durante um perodo de ca. 225 horas.
De acordo com os resultados obtidos, o filme Ppi-AB pode ser considerado
estvel em meio cido e neutro, sendo pouco estvel em meio alcalino,
principalmente em pH 11, o qual perde a estabilidade durante os primeiros minutos
da medida (por este motivo os resultado no esto mostrados). A perda de
estabilidade ocorre principalmente devido perda de aderncia do filme ao
substrato. Para pH 7,0 e 8,0, a resistncia do filme diminui aps um certo tempo de
condicionamento. Este comportamento foi previamente explicado (seo IV.4.1) em
termos da maior disponibilidade de nions presentes neste meio, favorecendo o nvel
de dopagem e portanto a diminuio da resistncia.
As medidas em pH 1,5 e 7,5 apresentaram comportamentos similares s
medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos
para sensores pticos de pH baseados em Ppi,186 o qual possui maior estabilidade
em meio cido. importante ressaltar que o sensor obtido (Ppi-AB) possui maior
rea de trabalho (ca. 10 mm2) em relao espessura, e de acordo com a literatura,
esta maior rea pode ser favorvel para a estabilidade.204
95
2,5
R (Rtampo - Rar) /
2,0
1,5
pH 3,0
pH 7,0
pH 8,0
1,0
0,5
0,0
-0,5
-1,0
0,0
0,8
1,6
2,4
75
150
225
Tempo / h
Figura 43: Estabilidade hmica do filme Ppi-AB imerso em tampo fosfato de pH 3,0,
7,0 e 8,0.
V.4.4. Reprodutibilidade e Reversibilidade ptica

Durante este experimento, o mesmo filme foi imerso em solues de pH 1,5;
3,0; 7,0; 7,5 e 8,0, sucessivamente. A leitura da resistncia eltrica foi realizada aps
5 minutos de imerso do filme nas respectivas solues tampo. O filme foi ento
enxaguado com gua deionizada e imerso na prxima soluo tampo fosfato (STF).
Como as medidas em pH 1,5 e 7,5 possuem o mesmo comportamento que as
medidas em pH 3,0 e 7,0, respectivamente, optou-se em no mostrar estas curvas
buscando um grfico com a visualizao mais fcil dos resultados, que esto
mostrados na Figura 44.
No incio das medidas foi observada uma queda drstica da resistncia,
sendo este comportamento associado com o tempo de condicionamento do filme, 206
o qual necessrio para que ocorra a distribuio e homogeneizao das cargas na
matriz polimrica. Aps o tempo de condicionamento, o filme pode ser considerado
reversvel e reprodutvel entre a 25 o e a 59 o medida. Com a finalidade de avaliar se
o filme mantinha suas propriedades hmicas aps ser seco, um intervalo de 24 h foi
96

usado entre a 59 o e a 60 o medida para secar o sensor Ppi-AB. Os resultados
indicaram um comportamento reprodutvel, j que o sistema retorna sua resistncia
inicial, se recondiciona, e ento se tornar estvel, reprodutvel e reversvel
novamente. No entanto, a resistncia do filme em meio cido e neutro foi mais
reversvel do que aquela para os filmes em pH 8,0. Este comportamento pode ser
resultado do processo de desprotonao, que de acordo com a Figura 41, j ocorre
neste meio.
pH 3,0
pH 7,0
pH 8,0
950
Resistncia /
900
850
800
750
700
650
0
20
40
60
80
Nmero de medidas
100
120
Figura 44: Reversibilidade e reprodutibilidade do filme Ppi-AB imerso em soluo

tampo fosfato com pH 3,0; 7,0 e 8,0.
Estes resultados podem ser comparados com os da literatura,231,247 onde
foram estudados filmes de polipirrol sintetizados com diferentes dopantes, os quais
se apresentaram reversveis e reprodutveis. Esta caracterstica pode ser decorrente
da forte influncia dos processos de oxidao/reduo destes materiais, a qual
permite mudanas conformacionais reversveis no polmero.
97
V.4.5. Efeito da Temperatura

A Figura 45 mostra a resistncia relativa do filme Ppi-AB imerso em soluo
tampo de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0 em funo da temperatura (15, 25, e 35 C). A
resistncia diminui com o aumento da temperatura, sendo que as curvas
correspondentes em todos os pH apresentam aproximadamente a mesma
inclinao. A resistividade de um semicondutor convencional, como silcio, diminui
exponencialmente com o aumento da temperatura (T). Este mesmo fenmeno
tambm pode ser observado para polmeros conjugados, visto que so considerados
tambm semicondutores (dependendo do grau de dopagem podem ser considerados
desde isolantes at metais). Especificamente para polmeros conjugados a
resistividade diminui com o aumento da temperatura, variando relativamente
T-1/4.248
A diminuio da resistncia com o aumento da temperatura pode ser
explicado pelo aumento na excitao trmica dos eltrons da banda de valncia, que
so ento transferidos para a banda de conduo, tendo, portanto, maior mobilidade
e conseqentemente favorecendo o aumento da condutividade (que neste caso pode
ser traduzido em diminuio de resistncia eltrica).213-249 Poderamos esperar um
comportamento diferente em pH alcalino, j que este meio afeta a cadeia polimrica
devido ao processo de desprotonao. Entretanto, a cadeia polimrica mesmo aps
a desprotonao, permanece parcialmente dopada, possuindo bandas polarnicas e,
portanto, possibilita a migrao dos eltrons das bandas ligantes para as bandas
antiligantes.
98
pH 1,5
pH 3,0
pH 7,0
pH 7,5
pH 8,0
(Rtampo-Rar)/ Rar
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
15
20
25
30
35
Temperatura / C
Figura 45: Efeito da temperatura sobre a resistncia eltrica do filme Ppi-AB imerso
em solues tampo fosfato de pH 1,5; 3,0; 7,0; 7,5 e 8,0.
V.4.6. Efeito de Interferentes

Os efeitos de diferentes ons na resposta hmica do filme Ppi-AB foram
estudados adicionando-se 0,01 e 0,15 mol.L-1 dos ons pirofosfato (P2O74-), cloreto
(Cl-), potssio (K+), nitrato (NO3-), e bissulfito (HSO3-) nas solues tamponadas. Os
valores obtidos foram normalizados utilizando a Equao 7. Os coeficientes de
interferncia (C.I.) foram calculados a partir da resistncia do Ppi-AB imerso em
soluo tampo contendo o interferente (Ri) comparado com a resistncia do Ppi-AB
imerso em soluo tampo sem interferente (Rx). Valores de C.I. prximos de zero
equivalem a interferncia irrelevante.
C.I .(%)
( Ri Rx )
Rx
Equao 7
Os resultados obtidos esto mostrados na Tabela 3. De acordo com os

valores calculados, a resposta hmica do Ppi-AB foi afetada somente pela presena
dos ons nitrato e bissulfito a 0,15 mol.L-1, assim como observado para o efeito de
99

interferentes na resposta ptica do sensor. Estas mudanas podem ser relacionadas
s propriedades redutoras e oxidantes destes ons, respectivamente, j que eles
podem modificar o nvel de oxidao do Ppi e, portanto a resistncia do filme.
Entretanto, esta interferncia foi relativamente pequena quando comparada com
valores da literatura.186
Os ons cloreto e potssio no afetaram a resposta do sensor de forma
significativa. Considerando que estes ons esto normalmente presentes no leite,
soro e gua do mar, o filme Ppi-AB pode ser aplicado para analisar esse tipo de
amostra. Alm disso, a variao da concentrao dos ons interferentes no foi
significativa, sugerindo que a fora inica do meio no interfere na resposta hmica
do Ppi-AB.
Tabela 3: Coeficientes de interferncia (C.I.) obtidos por medida de resistncia para
o Ppi-AB imerso em solues tamponadas contendo 0,01 e 0,15 mol.L-1 de
interferentes.
0,01 mol.L-1
0,15 mol.L-1
pH
P2O74- Cl-
K+
NO3-
HSO3-
P2O74- Cl-
K+
NO3-
HSO3-
1,5
0,00
0,04
0,06
0,05
0,07
0,00
0,03
0,10
0,15
0,17
3,0
0,01
0,00
0,01
0,06
0,08
0,00
0,00
0,01
0,08
0,15
7,0
0,00
0,04
0,00
0,03
0,08
0,00
0,02
0,01
0,12
0,10
7,5
0,00
0,00
0,07
0,01
0,13
0,01
0,08
0,09
0,08
0,18
8,0
0,00
0,02
0,05
0,02
0,10
0,00
0,04
0,11
0,15
0,17
100
V.5. Concluses Parciais

O filme obtido atravs da dopagem eletroqumica do Ppi com AB responde a
mudanas de pH possuindo sensibilidade de 1,71 0,20 M.pH-1. Alm disso,
apresenta mudanas reversveis da resistncia na faixa de pH entre 1,5 e 7,5. O
Ppi-AB um material promissor para aplicao como sensor de pH, j que possui
importantes caractersticas de um sensor eficiente, como tempo de resposta curto,
estabilidade,
reversibilidade,
reprodutibilidade
adicionalmente
estas
propriedades, ele pode ser usado como um sensor miniaturizado para pH, permitindo
anlises em pequenos volumes de amostras.
101
Concluses Gerais
Parte I
VI. Concluses Gerais

Obteve-se um material com potencial aplicao para sensor de pH
utilizando-se um mtodo fcil, reprodutvel, eficiente e de baixo custo. O material foi
obtido atravs da dopagem eletroqumica do polipirrol com um indicador cido-base
(azul de bromofenol). Os filmes de Ppi-AB obtidos eletroquimicamente foram
caracterizados por diferentes tcnicas, as quais mostraram que as propriedades do
Ppi so afetadas de forma significante na presena do AB. Medidas de Raman
ressonante in situ permitiram a anlise do comportamento do corante no interior da
matriz polimrica de Ppi imerso em solues tampo de diferentes pH (eletrlito),
aplicando-se diferentes potenciais. Tanto as propriedades pticas, quanto hmicas
do Ppi-AB apresentaram-se como dependentes do pH do meio, desta forma,
estudou-se estas propriedades para a possvel aplicao do filme como sensor de
pH. De acordo com as anlises destas propriedades o sensor apresenta um bom
potencial de aplicao, j que ambos os comportamentos ptico e hmico
apresentam boa estabilidade, reversibilidade, reprodutibilidade e tempo de resposta.
No entanto, o sensor ptico apresenta uma vantagem sobre o hmico, apresentando
sensibilidade para uma maior faixa de pH, a qual inclui a faixa de pH de meios
fisiolgicos. O sensor hmico de pH apresentou inverso do comportamento da
curva de sensibilidade ao pH, acarretando na diminuio da faixa de sensibilidade.
102
Parte II
Sensor biolgico baseado

em filmes de ouro
nanoestruturado
103
Introduo Parte II
Parte II
I. Consideraes Iniciais
I.1. Introduo
I.1.1. Cncer
A palavra cncer tem origem no latim, cujo significado caranguejo. A doena
tem esse nome, pois as clulas doentes atacam e se infiltram em clulas sadias
como se utilizassem as garras de um caranguejo para isso.250 Esta doena tem um
perodo de evoluo inconstante, podendo muitas vezes, levar anos para evoluir at
ser descoberta. Atualmente, foram identificados mais de cem tipos de cncer, sendo
que a maioria tem cura, desde que tratados em um estgio inicial de
desenvolvimento. Esse conjunto de mais de cem doenas tem em comum o
crescimento desordenado (maligno) de clulas que invadem tecidos e rgos,
podendo espalhar-se (metstase) para outras regies do corpo. Estas clulas
tendem a ser muito agressivas e incontrolveis quando dividem-se rapidamente,
levando formao de tumores (acmulo de clulas cancerosas) ou neoplasias
malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma massa
localizada de clulas que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu
tecido original, raramente constituindo um risco de vida.251
A Agncia Internacional de Pesquisa do Cncer aponta para este ano a
descoberta de 12 milhes de novos casos, e mais de 7 milhes de mortes
decorrentes da doena, sendo que a previso s no Brasil, corresponde a mais de
460 mil novos casos de cncer. A projeo para 2030 de 20 a 26 milhes de
diagnsticos e de 13 a 17 milhes de bitos.252 As causas que levam ao cncer so
variadas, podendo ser externas ou internas ao organismo, estando ambas interrelacionadas. As causas externas esto relacionadas ao meio ambiente e aos
hbitos ou costumes prprios de um ambiente social e cultural. Dentre todos os
casos de cncer, cerca de 80% a 90% esto associados a fatores ambientais.253 As
causas internas so, na maioria das vezes, geneticamente pr-determinadas e esto
ligadas capacidade do organismo de se defender das agresses externas. Esses
fatores causais podem interagir de vrias formas, aumentando a probabilidade de
104
Introduo Parte II
transformaes malignas nas clulas normais. Alguns deles so bem conhecidos: o
tabagismo pode causar cncer de pulmo, de boca e de garganta; a exposio
excessiva ao sol pode causar cncer de pele, e distrbios hormonais podem levar
gerao de cncer de mama. O envelhecimento traz mudanas nas clulas que
aumentam sua suscetibilidade transformao maligna. Alm disso, as clulas das
pessoas idosas foram expostas por mais tempo aos diferentes fatores de risco para
o cncer,253 explicando em parte a razo de o cncer ser mais freqente nesses
indivduos. Outros fatores como alguns componentes dos alimentos que ingerimos,
ainda esto em fase de estudo, alm de vrios outros fatores que infelizmente ainda
so desconhecidos. So raros os casos de cncer que se devem exclusivamente a
fatores hereditrios, apesar de o fator gentico exercer um papel importante na
oncognese.
Desde o incio do sculo a postura da sociedade em geral acreditar que o
cncer sempre sinnimo de morte e, portanto o seu tratamento raramente leva
cura. Atualmente, muitos tipos de cncer podem ser curados, na verdade mais da
metade dos casos de cncer tem cura, desde que tratados em estgios iniciais. Esta
dependncia da chance de cura com o tratamento da doena na fase inicial
demonstra a importncia do diagnstico precoce. Um dos principais desafios no
diagnstico precoce que no h um marcador comum para os mais de 100 tipos de
cncer. Portanto, os mdicos no podem simplesmente utilizar um sensor para
detectar a presena de uma forma especfica de cncer. Devido a falta de sistemas
que proporcionem deteco eficiente e rpida, o diagnstico e prognstico de cncer
atualmente dependem de anlises que patologistas tm usado por mais de
100 anos.254 Estima-se que apenas nos Estados Unidos, cerca de R$ 206 bilhes
so gastos anualmente em tratamentos, em geral, para melhorar a chance daqueles
que esto nas fases avanadas. No Brasil, esse nmero gira em torno de R$ 1,2
bilho, de acordo com uma pesquisa realizada pelo Instituto Nacional de Cncer em
2007.252 Infelizmente, todo este investimento em muitos casos, aumentam apenas
marginalmente o tempo de sobrevida do paciente, ao custo de muito sofrimento. A
deteco precoce de cncer significa um avano muito importante na luta contra a
doena, possibilitando a aplicao de tratamento no estgio inicial do seu
desenvolvimento, aumentando assim a taxa de sobrevivncia dos pacientes.
105
Introduo Parte II
I.1.1.1. Marcadores de Cncer
Marcadores de cncer so substncias produzidas por clulas cancergenas e
por outras clulas do corpo em resposta ao cncer ou a tumores benignos. Estas
substncias podem ser encontradas no sangue, na urina, no tecido do tumor ou em
outros tecidos.255
Atualmente j foram identificados mais de 100 tipos de substncias que
podem ser encontradas em concentraes alteradas no organismo de pacientes
portadores de algum tipo cncer. Pesquisadores j encontraram marcadores para
todos os tipos de cncer, mas embora a medida de concentraes anormais destas
substncias sugira a presena de cncer, somente esta medida no suficiente para
o diagnstico da doena. Desta forma, medidas das concentraes dos marcadores
so combinadas com outros testes, como a bipsia, para um diagnstico indubitvel
do cncer.256 Alm disso, a medida da variao da concentrao destes marcadores
pode ser utilizada para checar a evoluo do paciente em resultado a um tratamento.
O desafio tecnolgico que separa os cientistas dos testes de diagnstico
precoce bem-sucedidos, no est mais relacionado com a procura de potenciais
marcadores genticos da doena, mas da dificuldade de deteco destes no
organismo, pois existe um abismo entre as quantidades que precisam ser detectadas
e a sensibilidade das tcnicas atuais.252
I.1.2. Sensores biolgicos

O estudo e desenvolvimento de biosensores para deteco de compostos
qumicos e biolgicos tem atrado pesquisadores da rea de qumica, fsica e de
materiais. Estes sensores tm se mostrado ferramentas muito importantes para a
anlise de produtos qumicos e biolgicos que contaminam o meio ambiente,
agentes patognicos presentes em alimentos, vrus, etc. 257-260 Os biosensores
apresentam
uma
srie
de
vantagens
quando
comparados
aos
mtodos
convencionais de cromatografia e bioqumicos como cromatografia gasosa acoplada

a espectrometria de massa (CG-MS) e Anlise-Enzima-Imuno-Adsorvida (ELISA,
enzyme-linked imunosorbent assay). Utilizando biosensores o tempo necessrio
para as anlises menor, os dispositivos so encontrados em tamanhos
Tumores bengnos podem crescer muito, mas so localizados, no se espalham para outras partes
do corpo.
106
Introduo Parte II
miniaturizados, com instrumentao compacta; so fceis de manusear, so
portteis, facilitando anlises de campo e ainda apresentam baixo custo. Uma
grande variedade de mtodos pticos tem sido investigada para uso em
biosensores,
incluindo
quimioluminescncia,
SPR
(ressonncia
interferometria
de
plasmn
elipsometria.261-264
de
superfcie),
Levando-se
em
considerao a grande quantidade de novos casos de cncer somada a limitada

disponibilidade de dinheiro do sistema de sade, fica clara a necessidade de um
sistema de deteco precoce da doena. Um biosensor integrado uma tecnologia
que tem grande potencial para resolver este problema. O sistema integrado pode ter
multiplicidade de resposta, possibilitando a deteco de vrias formas de cncer pelo
mesmo sensor e pode ser pequeno e de baixo custo. Esta uma grande vantagem
j que para proporcionar aos mdicos um perfil de biomarcadores, necessrio
produzir um conjunto de biosensores. O sistema de microfludos chamado
lab-on-chip tem sido adequadamente aplicado para este tipo de anlise. Tambm
chamados de sistemas completos de microanlise, estes dispositivos apresentam
muitas vantagens sobre aqueles em macro escala em termos de velocidade de
anlise, custo, eficincia e quantidade de reagente e amostras consumidas durante a
anlise.265 Uma vantagem a mais destes sistemas que usam microcanais a
possibilidade de serem integrados a biosensores baseados em ressonncia de
plasmn de superfcie, e que exploram este efeito atravs de um conjunto de
nanoburacos.266
I.1.3. Ressonncia de plasmn de superfcie (SPR)

O fenmeno da difrao em grades devido excitao de plasmns de
superfcie (SP) foi primeiramente descrito no incio do sculo XX por Wood. 267 No
final dos anos 60, a excitao ptica dos plasmns de superfcie foi demonstrada por
Kretschmann268 e Otto.269 Desde ento, os SP tm sido extensivamente
estudados.270,271
O SPR a oscilao de densidade de carga que pode existir na interface
entre dois meios com constantes dieltricas de sinais opostos, por exemplo, um
metal e um dieltrico. A densidade de carga associada a uma onda
eletromagntica,
cujo
vetor
de
onda
mximo
na
interface
decai
exponencialmente com a distncia (campo evanescente). Desta forma, o SPR pode
107
Introduo Parte II
ser afetado e afetar as regies prximas interface. De acordo com Hanken e
cols.272 o vetor de onda do campo evanescente dado pela Equao 8.
Equao 8
Onde kpara o vetor de onda do fton paralelo ao plano de incidncia, np o

ndice de refrao do prisma, o ngulo de incidncia do prisma, a frequncia
da luz incidente, c a velocidade da luz no vcuo. A constante de propagao do SP
na interface dieltrico|metal dada pela Equao 9, onde k sp o vetor de onda do
fton
que
entra
em
ressonncia
com
os
eltrons
livres
na
superfcie
(induz plasmns), e m e a so as constantes dieltricas do metal e do meio

dieltrico (ar ou gua), respectivamente.
=
Equao 9
importante ressaltar a necessidade dos dois meios da interface terem

constantes dieltricas () de sinais opostos (como o ouro de sinal negativo e a gua
de sinal positivo) para que ocorra a ressonncia plasmnica. Quando kpara se iguala
a ksp, o campo eltrico entra em ressonncia com os eltrons livres da superfcie
metlica (por isso o nome ressonncia plasmnica) e plasmns de superfcie so
criados, aumentando a intensidade do campo evanescente.
Geralmente, utiliza-se ouro como metal devido a sua grande resistncia
oxidao e boa condutividade eltrica. A incidncia de uma fonte luminosa com um
certo ngulo de incidncia faz com que os eltrons livres do metal oscilem,
absorvendo energia luminosa, gerando ondas evanescentes que se propagam
paralelamente interface metal|dieltrico (Figura 46). Nesta situao tem-se a
ressonncia de plasmn de superfcie, detectada pela diminuio na intensidade da
luz refletida (portanto, com mximo de condio ressonante). O ngulo de incidncia
no qual ocorre este fenmeno denominado ngulo de SPR (SPR) e utilizado para
quantificar a variao no ndice de refrao causado pela presena de diferentes
molculas na superfcie metlica.
Como mencionado anteriormente, a intensidade da onda evanescente decai
exponencialmente com a distncia da superfcie do ouro (Figura 46), sendo que a
extenso do decaimento varia conforme a espcie que est sendo analisada,
108
Introduo Parte II
correspondendo a cerca de 25 a 50% do comprimento de onda da luz utilizada, 273
que em equipamentos comerciais varia de 600 a 850 nm.
Figura 46: Decaimento exponencial da onda evanescente relacionada com a

distncia da superfcie metlica.
O decaimento obtido em nanmetros pela Equao 10,274 onde o
comprimento de onda utilizado pelo equipamento, neff o valor do ndice de refrao
monitorado pelo equipamento de SPR e a constante dieltrica do ouro
(-23,124)275 ou de outro metal utilizado. O valor do decaimento pode tambm ser
estimado em 0,4 0,1 (ou aproximadamente 25 a 50%) do comprimento de onda.274
4

2 +

Equao 10
O ngulo em que ocorre o mximo de ressonncia depende do ndice de

refrao do meio que est em contato com o metal, e varia proporcionalmente com a
concentrao de molculas na regio de propagao da onda evanescente. ,
portanto, uma ferramenta de extrema utilidade para detectar a associao e
dissociao de biomolculas em tempo real. Contudo, a tcnica de SPR
convencional apresenta uma grande desvantagem: trabalhar com o modo de
aquisio por reflexo experimentalmente muito difcil, principalmente devido
dificuldade de se alinhar o sistema ptico para encontrar o ngulo apropriado de
109
Introduo Parte II
incidncia de luz. Apesar da grande sensibilidade dos sensores baseados em SPR,
a dificuldade experimental da anlise um grande inconveniente que tem que ser
levada em considerao.
I.1.3.1. SPR atravs de filme de ouro com nanoburacos

O aumento no interesse em SP tambm devido aos avanos em mtodos
de nanofabricao, que tm permitido estruturar e caracterizar metais em escala
nanomtrica, resultando em materiais com propriedades qumicas e fsicas
incomuns. Estes materiais podem controlar as propriedades do SP, possibilitando
sua aplicao em ptica, microscopia, clulas solares, assim como em sensores
para marcadores biolgicos.276
No sculo XX comeou o interesse pela tecnologia envolvendo buracos de
sub-comprimento de onda (subwavelength). Com o aumento da importncia da
tecnologia de microondas nos anos 40, Bethe277 fez um estudo terico das
propriedades de difrao de um buraco que ele idealizou como tendo dimetro de
sub-comprimento de onda, em um filme metlico perfeitamente condutor com
espessura prxima de zero. Atravs destas observaes ele concluiu que a
transmisso de luz atravs deste buraco seria mnima. Com estas consideraes,
ele chegou a uma equao simples para expressar a eficincia de transmisso B
(normalizada para a rea de abertura), Equao 11, onde k = 2/ o comprimento
do vetor de onda da luz incidente de comprimento de onda e r o raio do buraco.
=
64 4
27 2
Equao 11
De acordo com esta equao, seria esperado que a transmisso ptica casse
rapidamente conforme se torna maior que r, como mostrado na Figura 47.
Buracos com dimetro nanomtrico, sendo menores que o comprimento de onda da luz incidente
110
Introduo Parte II
Figura 47: Difrao e espectro de transmisso tpico de luz visvel atravs de um

buraco com sub-comprimento de onda em um filme metlico perfeito infinitamente
fino.278
No entanto, a luz transmitida pode ter um comportamento completamente
inesperado.279 Atravs de alguns experimentos, Ebbesen278 mostrou que uma
abertura circular simples, como a mostrada na Figura 48 apresenta um espectro de
Intensidade
/ uni./ arb.
Intensidade
transmitida
uni. arb.
transmisso com uma banda que no era prevista pela teoria de Bethe. 277
Comprimento
deonda
onda
/ nm
Comprimento de
/ nm
Figura 48: Transmisso ptica atravs de um nico buraco em um filme metlico de
prata. a) Buraco circular de 270 nm de dimetro em um filme com 200 nm de
espessura e b) seu espectro de transmisso.278
O comportamento apresentado na Figura 48 revela a presena de um
fenmeno ressonante, o qual melhora a transmisso de luz atravs do nanoburaco,
ou seja, a gerao de plasmns de superfcie ligada s propriedades fsicas do
nanoburaco aumentam muito a quantidade de luz transmitida. Esta transmisso
pode ser definida como extraordinria (EOT Extraordinary Optical Transmission)
111
Introduo Parte II
quando a eficincia de transmisso maior que 1, em outras palavras, quando o
fluxo de ftons por unidade de rea transmitidos maior do que o fluxo incidente.
A teoria de Bethe muito idealizada para tratar de situaes onde so
envolvidos modos de superfcies e onde modos evanescentes e de propagao
podem ser excitados dentro da abertura.280 Uma abertura real caracterizada por
uma profundidade e, portanto possui propriedades de um guia de ondas. A
transmisso de luz atravs deste guia de ondas bem diferente da propagao da
luz em um espao vazio.
O espao confinado modifica a disperso do campo eletromagntico. As
dimenses laterais do guia de ondas definem o comprimento de onda no qual a luz
no se propaga atravs do buraco, conhecido como comprimento de onda de corte
c. Quando o comprimento de onda da luz incidente for maior que o comprimento de
onda de corte ( > c), a transmisso exponencialmente pequena, caracterizando o
regime de no propagao como mostrado na Figura 49. Com metais reais, o
comprimento de onda de corte no pode ser exatamente definido, pois com o
aumento do comprimento de onda ocorre a contnua converso do regime de
propagao para o regime evanescente.
Figura 49: Guia de ondas cilndrico com raio r muito menor que o comprimento de
onda do campo eletromagntico incidente, perfurado em um filme metlico de
espessura h. A diminuio exponencial representa a atenuao do regime de
sub-comprimento de onda.278
O espectro de transmisso de luz atravs de um nico buraco definido
somente pelo dimetro do buraco e pela espessura do filme metlico. Contudo ao
preparar-se um filme metlico com um arranjo de buracos periodicamente ordenados
112
Introduo Parte II
pode-se controlar o espectro de luz transmitida, controlando-se a periodicidade dos
I/I0 (uni. arb.)
buracos (distncia centro-centro).
370
470
570
670
770
Comprimento de onda (nm)
Figura 50: Imagens (esquerda) e espectros (direita) de transmisso com incidncia

normal de luz branca atravs de arranjos quadrados contendo buracos com
sub-comprimento de onda. Para os arranjos azul, verde e vermelho, foram utilizadas
periodicidades de 300, 450 e 550 nm, respectivamente, os dimetros dos buracos
so 155, 180 e 225 nm e o comprimento de onda para mxima transmisso ocorre
em 436, 538 e 627 nm. Os arranjos foram fabricados em um filme de prata de
300 nm de espessura.276
Entre outras aplicaes, estes arranjos podem atuar como filtros de luz, como
mostra a Figura 50, onde os arranjos de nanoburacos esto sendo irradiados por
trs com uma fonte de luz branca. O espectro dominado pelos modos de SP
devido periodicidade dos arranjos como mostrado na Figura 50. O formato e
dimenses
dos
buracos
no
arranjo
tambm
influenciam
espectro
de
transmisso.281,282
Os arranjos de nanoburacos foram caracterizados tanto teoricamente283-293
quanto experimentalmente.292-299 O conjunto de nanoburacos age como uma grade
de difrao bidimensional que converte os ftons incidentes em plasmns de
superfcie. Embora os mecanismos de como a luz transmitida atravs dos
nanoburacos ainda no sejam completamente conhecidos, geralmente aceita-se a
idia de que os ftons incidentes acoplam com os eltrons da superfcie metlica.309
Esta interao resulta em plsmons de superfcie, que acoplam atravs do filme
metlico, sendo re-irradiados do lado oposto ao incidente. Em outras palavras, a luz
incidente espalhada pelos conjuntos de nanoburacos produzindo ondas
113
Introduo Parte II
evanescentes que tunelam atravs dos nanoburacos. O plasmn de superfcie
intensifica o campo eletromagntico associado com as ondas evanescentes,
resultando num aumento da transmisso.276
A posio max das bandas de transmisso (Figura 50) para um ngulo normal
de incidncia pode ser estimada pela Equao 12, onde P a periodicidade do
arranjo, m e d so, respectivamente, as constantes dieltricas do metal e do
material dieltrico em contato com o metal e i,j so os coeficientes de difrao do
arranjo geomtrico.
=
4
3
2 + + 2
Equao 12
Como esta equao no leva em considerao a presena dos buracos e as

perdas associadas com a difrao, ela negligencia a interferncia que origina o
deslocamento do pico de ressonncia.290,291
As condies de ressonncia definidas pela Equao 12 so relacionadas
simetria do arranjo. Portanto, os SPs gerados nos arranjos se propagaro nos eixos
de simetria definidos com sua prpria polarizao dependendo de (i,j). Isto resulta
em um comportamento fortemente dependente da polarizao.300
Ambas as superfcies dos dois lados dos buracos podem sustentar os modos
de SP de forma independente devido diferena na a do material prximo
superfcie metlica (normalmente vidro e ar), como previsto pela Equao 12. Assim,
o espectro de transmisso das estruturas assimtricas contm dois picos de
ressonncia, onde cada pico pertence a uma interface. Quando as constantes
dieltricas entram em ressonncia (valores prximos), obtm-se um pico de
transmisso mais intenso. Em muitas aplicaes, arranjos de buracos de tamanho
finito so usados por razes prticas. Se o arranjo possui pequena quantidade de
buracos, ento a periodicidade no bem definida e a contribuio das
extremidades se torna significante, mudando o espectro e levando a re-emisses
no usuais.301
Como o efeito da transmisso ressonante ocorre atravs da excitao e
propagao de SP prximo interface metal|dieltrico, este efeito sensvel a
mudanas de ndice de refrao prximo interface, da mesma forma que ocorre em
sensores SPR convencionais baseados em um prisma.302,303
114
Introduo Parte II
A sensibilidade (S) da superfcie em detectar diferentes ndices de refrao
definida pela variao do comprimento de onda () em funo da variao do
ndice de refrao. Durante a adsoro de molculas sobre a superfcie do sensor
ocorrem mudanas no ndice de refrao, o qual passa a ser chamado neff e
admite-se como valor de nb o ndice de refrao atingido aps a injeo de uma
soluo tampo (eg. STF), correspondente ao branco da medida.
=
Considerando
decaimento
Equao 13
exponencial
caracterstico
do
campo
eletromagntico evanescente, a intensidade da luz decai em funo da distncia z

acima da superfcie do metal como o quadrado de uma exponencial, tal qual a
equao [exp(-z/Id)]2, o que implica no fator de ponderao a ser utilizado no clculo
do ndice de refrao neff ser igual a exp(-2z/Id) (Equao 14), na qual n(z) o ndice
de refrao a uma distncia z.
=
Equao 14
O uso desta equao no est restrito a estruturas de bicamadas, 274 podendo

ser empregado em sistemas de multicamadas. As multicamadas podem ser
consideradas como tendo n(z) = na para valores de z compreendidos entre 0 e d
(espessura dos filmes), e n(z) = nb para os valores de z compreendidos entre d e o
infinito, pode-se ento simplificar a integral da Equao 14. Obtm-se desta forma a
Equao 15, que substituda na Equao 13, fornece a Equao 16.
= +
=
Equao 15
Equao 16
O deslocamento espectral devido s ligaes das molculas sobre a

superfcie sensorial ento dado por = S() onde S a sensibilidade espectral
e depende dos parmetros geomtricos das matrizes de nanoburacos e das funes
dieltricas do meio. No caso de imagens SPR para deteco mltipla, pode ser mais
115
Introduo Parte II
til a medida em tempo real da variao da intensidade transmitida IT em um
comprimento de onda fixo, o qual dado por:
= d d . S
Equao 17
A dimenso da EOT depende de muitos parmetros, incluindo o ndice de

refrao do meio sobre a superfcie do filme metlico, o comprimento de onda da luz
incidente, a geometria do buraco e a periodicidade. Em 2002, foi apresentado a
possibilidade em se explorar a EOT e os arranjos de nanoburacos como sensores
biolgicos.304
I.1.3.2. Aplicao de sensores baseados em SPR

A EOT pode ser utilizada para monitorar a mudana do ndice de refrao
prximo superfcie, resultante, por exemplo, da modificao desta superfcie com
uma monocamada, pois dependente do ndice de refrao do meio em contato
com a superfcie do filme metlico. Este conceito induziu muitas pesquisas no estudo
de reaes qumicas ou interaes fsicas com filmes metlicos, acerca da
intensidade305 ou a respeito do espectro306-308,309 da EOT atravs de arranjos de
nanoburacos. A utilizao de plataformas com estes arranjos de nanoburacos tem
vantagens nicas, como:
i)
rea extremamente pequena, o que viabiliza a obteno de um sensor para

deteco mltipla, facilitando a integrao com microcanais e outros sistemas
miniaturizados para a deteco em tempo-real;
ii)
em contraste ao modo de deteco por luz refletida, como nos sensores

convencionais que no utilizam molculas marcadas, como prismas e grades
de difrao, este material detecta EOT, ou seja, luz transmitida atravs dos
nanoburacos. Esta mudana simplifica a integrao da instrumentao e a
miniaturizao;
iii)
a EOT atravs dos arranjos de nanoburacos afetada por muitos parmetros,

incluindo a forma e a periodicidade dos buracos. Estes parmetros podem ser
usados para moldar o sinal do sensor de acordo com vrias aplicaes;
iv)
os arranjos de nanoburacos podem ser produzidos em massa com alta

reprodutibilidade.
116
Introduo Parte II
Dispositivos baseados em SPR foram desenvolvidos para ser empregados em
vrios campos, incluindo diagnose mdica, monitoramento ambiental e anlise de
alimentos.309-311 Sensores baseados em SPR j esto disponveis comercialmente,
sendo usados na pesquisa biomdica e bioqumica para o monitoramento de
ligaes na superfcie de substratos,312 anlises biomdicas,313 deteco da
sequncia genmica de DNA,314 e deteco de materiais e organismos que
contaminam o ambiente.315 Liu e cols.311 demonstraram que conjuntos de
nanoburacos podem ser integrados em um sistema simples para uso como
biosensor ptico. Brolo e cols.309 demonstraram o uso de matrizes de nanoburacos
periodicamente organizados em filmes de ouro, como um sensor SPR para a
adsoro de biomolculas (operado no modo de transmisso). O mecanismo
explorado consistiu na mudana do ndice de refrao na interface ouro|soluo, o
qual resulta em um deslocamento do espectro de transmisso para maiores
comprimentos de onda. Conjuntos de nanoburacos tambm mostraram-se
promissores para a aplicao em biosensores na deteco com fluorescncia316 e
para SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy).309
I.1.3.3. Aplicao de sensores baseados em SPR para deteco de cncer

O diagnstico de cncer uma das reas mais pesquisadas em qumica
bioanaltica. Uma grande variedade de mtodos de deteco foram investigada.317 O
mtodo mais comumente utilizado em biosensores emprega a deteco de
marcadores tumorais que se ligam a anticorpos imobilizados sobre a superfcie do
sensor. A deteco da ligao geralmente feita atravs de vrios mtodos,
podendo-se utilizar molculas marcadas com fluorforos ou bioconjugados de
nanopartculas. A estratgia mais comum atravs do ELISA. Neste sistema, a
ligao anticorpo-antgeno (AC-AG) indicada por um anticorpo, que acoplado a
uma enzima produz um sinal que ento detectado.254 Um grande desafio nesta
rea desenvolver um mtodo que no precise de molculas marcadas e que ao
mesmo tempo possibilite um alto grau de sensibilidade e baixo limite de deteco.
Os biosensores baseados em SPR so utilizados para monitorar interaes
biomoleculares que ocorrem prximas superfcie do metal transdutor, sem a
necessidade de se marcar as biomolculas. Atravs desta tcnica, medidas em
tempo real podem ser realizadas para se estudar a ligao entre uma molcula
imobilizada sobre a superfcie do metal com um analito especfico presente em
117
Introduo Parte II
soluo (eg. anticorpo-antgeno). A resposta obtida atravs de medidas da
mudana do ndice de refrao, que alterado devido a ligao entre as espcies
imobilizadas e o analito.318-321 A literatura descreve vrios estudos onde biosensores
baseados em SPR foram eficientemente aplicados na deteco de marcadores de
cncer de pncreas, mama, colo-retal, pulmo e gastrointestinal.322-327
O desenvolvimento de um circuito integrado contendo biosensores baseados
em SPR com anlise de diferentes analitos acoplado a um leitor contendo um
controle de fluxo e equipamentos pticos, proporcionaria um sistema de deteco
eficiente e de fcil manuseio.266,328
I.1.3.4. Tecnologia de sensores baseados em SPR
Modificao qumica da superfcie do metal

Em sensores baseados em SPR a superfcie do sensor geralmente ouro ou
prata.329 Nesta superfcie, ocorrem interaes biomoleculares e ligaes so
convertidas em sinais ptico-eltricos. A seletividade de um teste imunolgico
baseado em SPR obtida atravs de reconhecimento biolgico do sistema
imobilizado sobre a superfcie do metal (deteco por interao chave-fechadura). A
superfcie do sensor modificada com molculas onde os analitos se ligam,
proporcionando resultados reprodutveis e consistentes. Para se obter superfcies
altamente sensveis, necessria a formao de uma camada de molculas
receptoras que seja organizada, de maneira a proporcionar stios de ligao, sem
restries de impedimento estrico. Diversos mtodos de imobilizao adequados
para testes imunolgicos baseados em SPR tm sido publicados. Os anticorpos so
imobilizados atravs de suas cadeias glicol oxidadas,330 ou atravs de suas ligaes
dissulfito.331 Os grupamentos steres N-hidroxisuccinimida (NHS) so usados em
monocamadas de alcanotiis de cadeia longa para a imobilizao de anticorpos e
protenas. Assim, estes alcanotiis possuem em uma extremidade grupos reativos
adequados para a imobilizao de biomolculas e em outra extremidade grupos tiis
que se ligam superfcie do ouro.332,333 Processos de silanizao utilizando
3-aminopropiltrietoxisilano (3-APTES) tambm tm sido usados para ligar anticorpos
superfcie de ouro atravs do ligante glutaraldedo.334 Contudo, para a ligao de
receptores mais especficos, o complexo biotina-estreptavidina tem sido amplamente
utilizado (Figura 51).335,336
118
Introduo Parte II
anticorpo
antgeno
estreptavidina
biotina
cisteamina
Figura 51: Esquema de imobilizao e deteco por bioafinidade das molculas

biotina e estreptavidina.
Biomolcula de Interao
A escolha da espcie a ser imobilizada sobre a superfcie do sensor depende
do mtodo de deteco que ser empregado. Quando se aplica o modo de deteco
direto, sanduche e competitivo, a molcula a ser imobilizada o elemento de
bio-reconhecimento; enquanto que no modo de deteco por inibio, a molcula a
ser imobilizada o analito, ou seja, a espcie alvo. A escolha do elemento de
bio-reconhecimento e do mtodo de imobilizao apropriado crucial para a
montagem de um sistema eficiente, afetando diretamente as caractersticas do
sensor como o limite de deteco, a sensibilidade e a especificidade.
Vrios tipos de elementos de bio-reconhecimento so empregados em
biosensores baseados em SPR. Os anticorpos so sem dvida os mais
freqentemente utilizados, pois apresentam alta afinidade e especificidade em
relao a molcula alvo. Alm disso, anticorpos que apresentam afinidade com
vrias molculas alvo esto disponveis comercialmente. Contudo, o processo de
desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade muito caro e trabalhoso.337
119
Introduo Parte II
Recentemente, fragmentos de anticorpos tm sido usados como elementos de
bio-reconhecimento.338 Estudos mostram que estes fragmentos de anticorpos
biotinilados (ligados a molculas de biotina) presentes em processo de fermentao,
podem ser detectados diretamente da soluo sem a necessidade de purificao da
amostra. Para tal deteco utilizado um sensor contendo estreptavidina imobilizada
sobre
superfcie.339
Os
peptdeos
so
outros
tipos de
elementos de
bio-reconhecimento que tm sido amplamente utilizados. Em comparao com os

anticorpos, os peptdeos so geralmente baratos, mais estveis e mais fceis de
manipular. Entretanto, nem sempre apresentam alta afinidade e especificidade em
relao a molcula alvo. Em biosensores baseados em SPR, os peptdeos so
principalmente aplicados para a deteco de anticorpos, por exemplo de
Hepatite G,340 herpes tipo 1 e tipo 2.341 Recentemente, aptmeros**,342 tm sido
tambm aplicados em biosensores baseados em SPR.343,344
Imobilizao de molculas biolgicas

A superfcie do sensor, ou seja, a superfcie do metal deve possibilitar a
imobilizao de um nmero suficiente de elementos de bio-reconhecimento, evitando
ligaes no especficas. Alm disso, os elementos de bio-reconhecimento devem
ser imobilizados na superfcie do sensor sem que esta imobilizao afete a sua
atividade biolgica. A princpio, as molculas podem ser imobilizadas diretamente
sobre a superfcie ou em uma matriz tridimensional. A imobilizao direta sobre a
superfcie mais simples, contudo o nmero de elementos de bio-reconhecimento
que podem se ligar superfcie limitado e ainda, se a densidade de elementos de
bio-reconhecimento alta demais, a resposta do sistema pode ser prejudicada pelo
impedimento estrico. Por outro lado, um sistema tridimensional geralmente
proporciona um maior nmero de stios de ligao para a imobilizao das
molculas.345 O sistema tridimensional mais comumente usado obtido atravs de
dextran carboximetilado.332 Para a imobilizao em duas dimenses sobre
superfcies de ouro, os mtodos mais comuns envolvem o uso de camadas auto
montadas (SAMs) de alcanotiolatos ou dissulfitos.346
**
Aptmeros so molculas de DNA ou RNA que agem como anticorpos, ligando-se com alta
afinidade a um particular alvo.
120
Introduo Parte II
As protenas representam a classe de molculas mais comumente usada
como elementos de bio-reconhecimento. O mtodo mais utilizado para imobilizao
de protenas via ligao covalente formada entre grupos funcionais nucleoflicos
presentes nos aminocidos das protenas e grupos eletroflicos presentes na
superfcie do sensor.332,347 A imobilizao atravs de ligao covalente estvel,
contudo a grande quantidade de grupos funcionais presentes nas protenas resulta
em imobilizao de orientao randmica, a qual pode bloquear os grupamentos
ativos da protena.
Outro mtodo utilizado para a imobilizao de protenas baseado na
afinidade bioqumica das espcies. O exemplo mais comum deste mtodo a
reao estreptavidina-biotina (Figura 51). Atravs deste mtodo de imobilizao, a
protena estreptavidina imobilizada sobre a superfcie do sensor (imobilizada
covalentemente ou via biotina pr-imobilizada) proporcionando stios de ligao para
subseqente ligao de protenas conjugadas com a biotina. A protena pode ser
biotinilada atravs de vrios mtodos objetivando a deteco de diferentes grupos
funcionais presentes nas protenas. A orientao das protenas imobilizadas
depende da orientao das molculas de estreptavidina, do mtodo de biotinilao
empregado e das propriedades da protena.347
I.1.4. Estratgias para a melhora da sensibilidade

I.1.4.1. Fatores Geomtricos
Vrios fatores geomtricos influenciam as propriedades pticas dos
nanoburacos: simetria da estrutura, razo entre o dimetro e a profundidade do
buraco, rea, e periodicidade. Estas variveis determinam a distribuio do campo
eletromagntico sobre a superfcie do metal, as dinmicas de propagao das ondas
sobre a superfcie e a eficincia com que elas se espalham. O tamanho do
nanoburaco, a periodicidade e a organizao do arranjo afetam a posio e a
intensidade do pico de ressonncia. A profundidade dos buracos, ou seja, a
espessura do filme metlico, importante devido a diversas razes: se o filme
metlico for muito fino ele parcialmente transparente luz incidente e, portanto, a
transmisso de luz no ocorre preferencialmente pelos nanoburacos, especialmente
se a superfcie rugosa e esta rugosidade propicie a ressonncia da luz.348,349 O
121
Introduo Parte II
metal deve ser opaco, (opticamente espesso), para se obter um grande contraste
entre a luz que passa atravs dos nanoburacos e a luz que passa atravs do metal.
Isto implica no fato de que a espessura do filme deve ser vrias vezes maior que a
profundidade de penetrao da luz no metal. Mesmo em filmes espessos, os modos
de energia em ambos os lados do filme metlico podem interagir, se desacoplar e
originar novos modos de energia. Este efeito pode ser observado atravs de estudos
onde conjuntos periodicamente ordenados de nanoburacos so obtidos em filmes
metlicos com vrias espessuras. Observa-se que o aumento da espessura dos
filmes leva os modos de energia em ambos os lados do filme a se desacoplarem.286
I.1.4.2. Mtodos de imobilizao

A adsoro de protenas sobre a superfcie do sensor um dos fatores mais
importantes no desenvolvimento de biosensores para aplicaes biolgicas e
biomdicas. Vrios estudos mostram que os processos de adsoro no especfica
de protenas sobre a superfcie um problema chave e que deve ser corrigido para
melhorar a interao entre a molcula imobilizada e o analito presente na
soluo.350,351 A formao de ligaes no especficas um inconveniente ainda
maior quando se analisa amostras de sangue e fludos com partes de clulas
destrudas.352,353 Em biosensores extremamente importante a obteno de
superfcies com alta organizao e que proporcionem um grande nmero de stios
de ligao para imobilizao de elementos de bio-reconhecimento. Durante a
imobilizao importante evitar processos de modificao da superfcie que
possibilitem a adsoro no especfica sobre o sensor (fouling), levando
diminuio da quantidade de stios de ligao e podendo ainda gerar um
falso-positivo.
Vrios mtodos tm sido aplicados no desenvolvimento de superfcies:
polmeros hidroflicos como o poli(etileno glicol) (PEG) e seus derivados so
empregados no desenvolvimento de superfcies resistentes a protenas, ou seja,
superfcies que no permitem que as molculas de protena se liguem com a
monocamada e que no se deitem sobre a superfcie. Os fatores que influenciam
as propriedades de organizao geradas por superfcies cobertas com PEG incluem
a barreira estrica e o alto grau de hidratao.354 Pasche e cols.355,356 utilizaram
poli(L-lisina) enxertada em PEG para minimizar adsores no especficas de
122
Introduo Parte II
protenas sobre a superfcie. Atravs deste sistema eles observaram a adsoro de
soro sanguneo em concentrao menor que 2 ng/cm 2. A imobilizao de elementos
de bio-reconhecimento nestas amostras foi possvel atravs da ligao de biotina
superfcie. As superfcies biotiniladas se mostraram muito resistentes a adsores
no especficas de molculas presentes na amostra de soro, permitindo a ligao da
protena correspondente ao seu stio ativo (estreptavidina) e posteriormente a
ligao de molculas biotiniladas.357-359
I.1.5. Microcanais para fluxo de solues

A litografia soft, particularmente usando poli(dimetilsiloxano) (PDMS), uma
tcnica muito utilizada em fabricao de microcanais de fluxo na montagem de
sensores biolgicos.360,361
O PDMS apresenta propriedades fsico-qumicas como durabilidade, baixa
reatividade e transparncia ptica, que o tornam um material adequado para a
fabricao de microestruturas moldadas.362 Alm disso, possvel fazer o selamento
reversvel da pea de PDMS, contendo os microcanais, com o substrato. A natureza
elstica do PDMS permite que ele se ajuste a imperfeies da superfcie planar
atravs de foras de van der Waals.363 O selamento reversvel suporta fluxos com
baixa presso, (at 5 psi)360 e permite o re-selamento sem danos ao PDMS ou
superfcie ao qual est selado.
123
Objetivos Parte II
I.2. Objetivos
O objetivo nesta parte do trabalho foi o desenvolvimento de um sensor
biolgico para a deteco de marcadores biolgicos de cncer de ovrio, baseado
em filmes finos de ouro nanoestruturado com arranjos de nanoburacos. O dispositivo
explorou o fenmeno de Transmisso ptica Extraordinria (EOT) resultante da
ressonncia de plasmns de superfcie (SPR) e foi integrado a microcanais com
funcionamento automatizado. O mtodo de deteco utilizado foi baseado em
medidas de transmisso utilizando uma cmera CCD e um espectrofotmetro
UV-Vis.
Neste estudo, o foco foi o desenvolvimento de dois tipos de sensores:
1)
Os mtodos de deteco para sensores baseados em SPR normalmente

utilizam espectros de transmisso para a anlise. Neste trabalho, utilizou-se o
modo por deteco de imagens, o qual detecta a mudana na intensidade da
luz transmitida atravs dos nanoburacos em resultado da imobilizao de
molculas sobre a superfcie do sensor. Este mtodo viabiliza a aplicao do
sensor para a deteco mltipla (eg. de vrios marcadores tumorais) durante
uma medida em tempo real.
2)
At o momento, a imobilizao em todos os biosensores baseados em SPR

utilizando nanoburacos feita sobre toda a superfcie de ouro, j que os
plasmns de superfcie se propagam em toda a regio do arranjo de
nanoburacos (dentro dos nanoburacos e ao redor deles, Figura 52). Neste
trabalho, objetivou-se o desenvolvimento de algo novo, para isto, cobriu-se o
filme de ouro com uma camada isolante (SiOx) e posteriormente os arranjos
de nanoburacos foram fabricados. Este procedimento foi realizado com o
objetivo de se obter uma plataforma sensvel que confinasse tanto os
plasmns de superfcie quanto as molculas biolgicas dentro dos
nanoburacos.
124
Resultados e Discusso Parte II
I.3. Parte Experimental

I.3.1. Materiais, Reagentes e Equipamentos
Materiais
Lmina de vidro coberto com filme de ouro de 100 nm de espessura (uma camada
de 5 nm de cromo foi previamente depositado sobre o vidro para ajudar na aderncia
do filme de ouro ao substrato), EMF (Evaporated Metal Films, Ithaca, Nova Iorque,
EUA).
Reagentes
Anticorpo para cncer de ovrio PAX8 (Pared Box Gene 8) (Instituto de Cncer de
British Columbia, Canad).
Antgeno para cncer de ovrio r-PAX8 (recombinant Pared Box Gene 8) (Instituto
de Cncer de British Columbia, Canad).
Albumina de Soro Bovino (BSA, Sigma-Aldrich).
lcool isoproplico (99,5%, Sigma).
Acetona (p.a., Aldrich).
Biotina ster N-hidrxi succinimidil (BNHS, 95%, Fluka).
Cisteamina (98%, Sigma-Aldrich).
Cloreto de potssio (99%, ACP).
Cloreto de sdio (99%, ACP).
Ditiobis (succinimidil undecanoato) (DSU, 92,7%, Laboratrios Dojindo).
Dimetil sulfxido (DMSO, 99,9%, Caledon).
Etanol anidro (99,5%, Sigma-Aldrich).
Estreptavidina de Streptomyces avidinii (Sigma-Aldrich).
Fosfato dibsico de sdio (99%, ACP).
Fotoresiste SU-8 50 e revelador (Microchem, Newton, MA).
Glicose (99,5%, Sigma-Aldrich).
3-Mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTMS, 95%, Sigma-Aldrich).
Polidimetilsiloxano e agente de cura Sylgard 184 (PDMS, Dow Corning).
Poli (tereftalato de etileno) (PET, SK Chemicals).
Wafer de silcio (Silicon Quest International, Santa Clara, CA).
125

gua nanopura (18,1 Mcm, Barnstead) foi utilizada para a preparao das
solues.
Equipamentos
Fabricao e imagem dos nanoburacos: FIB (feixe de ons (glio) focado), e
Microscopia eletrnica de varredura (MEV).
Fabricao dos microcanais: Spincoater SCG/G3P-8 (Specially coating systems,
Coakson Electronics Equipments), expositor luz UV OAI Hybralign Series 200 e
controles de exposio (Tamarack Scientific Co), cmara de vcuo e limpador com
plasma PDC-32G (Harrick) e forno Isotemp modelo 280A, (Fisher Scientific).
Experimentos: Bomba de seringa (Havardi), microscpio Leica (Microsystems
(DMLM)), com lente objetiva de 50X de longa distncia de trabalho, acoplado a uma
fibra ptica e espectrofotmetro UV-Vis (USB2000), cmera CCD (Photometrics
HQ2), refratmetro porttil (ATAGO, modelo 3850).
I.3.2. Fabricao dos nanoburacos

Vrios arranjos de nanoburacos foram empregados em diferentes estgios
deste trabalho. As micrografias obtidas por MEV de alguns arranjos de nanoburacos
esto mostradas na Figura 52. Neste trabalho dois tipos de amostras foram
fabricados:
1) os arranjos de nanoburacos foram fabricados for FIB atravs de um filme
de ouro de 100 nm de espessura depositado sobre uma lmina de vidro. Estas
amostras foram usadas para deteco de marcadores tumorais de cncer de ovrio
atravs de imagens obtidas por uma cmera CCD. Os nanoburacos foram fabricados
com aproximadamente 200 nm de dimetro. O tamanho dos arranjos foi de
aproximadamente 15 m x 15 m.
2) os arranjos de nanoburacos foram fabricados por FIB em um filme de SiOx
e de ouro (Figura 67). O filme de SiOx (50 nm de espessura) foi depositado sobre o
filme de ouro (100 nm de espessura) e este sobre uma lmina de vidro. Esta
amostra foi usada para medidas onde tanto as molculas quanto os plasmns se
encontravam confinados dentro dos nanoburacos, j que a superfcie de ouro
exposta somente dentro dos nanoburacos. A fabricao e micrografias (MEV) dos
Os nanoburacos foram perfurados atravs de ambos filmes de SiOx e ouro.
126

arranjos de nanoburacos foram realizadas na Simon Fraser University, Vancouver,
Canad. O feixe de ons glio foi programado para 30 keV com uma taxa de
remoo de ouro de 1,6 nm/s, e a corrente do feixe foi de 300 nA. Os nanoburacos
foram fabricados com aproximadamente 170 nm de dimetro. O tamanho dos
arranjos foi de aproximadamente 8 m x 8 m, correspondendo a uma rea de
deteco muito pequena, viabilizando o uso do substrato para a montagem de um
dispositivo miniaturizado.
a)
b)
c)
Figura 52: Micrografias obtidas por MEV de a) arranjos de nanoburacos

periodicamente ordenados, fabricados por FIB em um filme de ouro de 100 nm de
espessura. b) Imagem ampliada mostrando o tamanho do arranjo de nanoburacos.
c) Imagem ampliada mostrando a dimenso dos nanoburacos. Esta amostra foi
utilizada durante as medidas por aquisies de imagens (seo I.4.1).
I.3.3. Fabricao dos microcanais

Os microcanais foram fabricados em uma pea de PDMS atravs da tcnica
de litografia soft360,361 (Figura 53). O primeiro passo foi a obteno de uma
fotomscara da estrutura dos microcanais, sendo criada usando o AutoCAD 2006.
Posteriormente foi impressa em filmes de PET (poli (tereftalato de etileno)),
utilizando-se uma impressora com alta resoluo (Islands Graphics, Victoria, BC). O
fotoresiste SU-8 50 foi depositado por spin coating sobre um wafer de silcio sob
rotao de 500 rpm em 5 s, mantendo por 8 s. Em seguida, aumentou-se a
velocidade para 2000 rpm em 5 s, mantendo por 25 s. Este procedimento produz
filme com espessura uniforme de 50 m. A espessura do fotoresiste determina a
altura dos microcanais resultantes.364 Os wafers de silcio foram usados devido a sua
superfcie extremamente plana, onde o fotoresiste adere facilmente. O wafer de
127

silcio coberto foi pr-aquecido a 65 C por 6 min, e ento a 95 C por 25 min para
eliminar o solvente, deixando o fotoresiste mais denso. A fotomscara foi
posicionada sobre o wafer de silcio. Ambos foram ento expostos a luz UV colimada
(320 a 380 nm), durante 45 s. A funo da mscara proteger determinadas partes
do substrato contra a luz UV. Este passo foi seguido por aquecimento da amostra,
sendo primeiramente em 65 C por 1 min e a 95 C por 5 min para promover a
polimerizao do fotoresiste. O sistema foi ento imerso no revelador de SU-8 at
todo fotoresiste, no exposto a luz UV, ser removido. Em seguida, o wafer de silcio
foi imerso em lcool isoproplico para remover o excesso do revelador. Depois disto,
o wafer de silcio contendo a microestrutura foi limpo rapidamente em acetona e
seco em seguida. Sendo assim, um molde foi criado.
Passo 1:
Exposio do fotoresiste (SU-8) usando
luz UV que passa atravs de uma
transparncia
com o desenho da
estrutura desejada.
Passo 2:
O fotoresiste no exposto dissolvido,
levando a um modelo positivo do
desenho em um substrato.
Passo 3:
Sobre o modelo positivo colocado o
polmero PDMS e levado para cura em
uma cmara de vcuo.
Passo 4:
A remoo do molde leva a estrutura
negativa, onde os canais esto
presentes no PDMS.
Figura 53: Esquema e descrio do mtodo de fabricao de microestruturas por

litografia soft.
128

Os microcanais foram criados atravs da cura do PDMS sobre o molde.
Aproximadamente 30 g de PDMS e agente de cura foram misturados em uma razo
10:1 (m:m) respectivamente. A mistura foi ento espalhada sobre o molde e o
sistema foi colocado na estufa a 900C por 30 minutos. A pea de PDMS, j no
estado slido e flexvel, foi removida do molde criando-se assim um sistema de micro
canais. Os 30 g de PDMS foram usados para criar uma pea com espessura de
aproximadamente 4 mm. Esta pea foi ento alinhada aos arranjos de nanoburacos
para orientar o fluxo das solues sobre estes.
I.3.4. Deposio de SiOx

Filmes finos de SiOx foram preparados sobre os filmes de ouro de 100 nm de
espessura, os quais foram previamente depositados sobre lminas de vidro. A
lmina de vidro coberta com filme de ouro, foi montada em uma clula de teflon de
ca.
15 mL,
com
rea
exposta
de
1 cm2.
Uma
camada
de
MPTMS
(3-mercaptopropiltrimetoxisilano) foi aplicada entre o ouro e o SiOx para servir de

adesivo. Foi adicionada soluo 1 mmol.L-1 de MPTMS na clula, o qual
permaneceu por 24 h sem agitao. A adsoro inicial rpida, levando apenas
alguns minutos. No entanto, o sistema foi deixado em repouso por 24 horas para se
obter um alto nvel organizacional da monocamada. Aps a montagem da
monocamada, uma soluo contendo 0,54% de silicato de sdio, com pH em torno
de 9,5 foi adicionada clula de teflon e deixado em repouso por 120 h.365-367
Figura 54: (a e b) Imagens MEV de arranjos de nanoburacos perfurados atravs do

filme de SiOx (50 nm de espessura) e de ouro (100 nm de espessura). Os
nanoburacos foram fabricados com 170 nm de dimetro e periodicidade de 500 nm.
129

Aps a obteno da camada de 50 nm de SiOx, os nanoburacos foram obtidos
por FIB seguindo o mesmo procedimento descrito na seo I.3.2, amostra 2 (Figura
54).
I.3.5. Teste de sensibilidade

A sensibilidade dos arranjos de nanoburacos foi estudada utilizando solues
de glicose com ndices de refrao conhecidos, variando entre 1,320 e 1,358.
Durante estas medidas utilizou-se uma clula de fluxo simples, contendo uma
entrada e uma sada para a soluo. Esta clula construda em teflon, possuindo
uma cmara de 2,54 cm x 2,54 cm, onde a amostra contendo nanoburacos, foi
colocada para que as solues flussem sobre sua superfcie.
I.3.6. Prova de conceito deteco de protena dentro do nanoburaco

A deteco da protena dentro do buraco envolve um procedimento de
3 passos.306 Primeiramente, o substrato imerso em uma soluo aquosa contendo
6,2 mmol.L-1 de cisteamina por 72 horas. Esta molcula contm grupamentos tiol, os
quais se ligam fortemente ao ouro, alm disso possui grupos amino que se ligam
covalentemente grupos NHS. Desta forma, aps a montagem da monocamada
dentro dos buracos, a amostra foi enxaguada com gua nanopura e etanol para a
retirada das molculas que no foram adsorvidas sobre a superfcie de ouro. A
amostra foi ento colocada em uma clula de fluxo e atravs de uma bomba
peristltica, injetou-se STF (pH 7,5) sobre o arranjo de nanoburacos. O espectro
UV-Vis foi ento registrado (ver esquema na Figura 55). Aps esta etapa, uma
soluo contendo 6 mg.mL-1 de biotina modificada com grupos NHS em DMSO foi
injetada sobre a amostra, mantendo o fluxo por 45 min. A amostra foi ento
enxaguada com STF e o espectro UV-Vis foi em seguida registrado. Finalmente,
fluiu-se uma soluo contendo 0,25 mg.mL-1 de estreptavidina (protena) em STF
sobre a amostra por 15 min, o espectro UV-Vis foi registrado enquanto a amostra era
enxaguada com STF.
I.3.7. Medidas pticas e Sistema de Fluxo

Uma bomba de injeo com controle fino de fluxo foi utilizada para fluir as
solues, a um fluxo constante de 20 L.min-1, sobre a superfcie do arranjo de
nanoburacos. As amostras foram caracterizadas utilizando luz branca de uma fonte
130

de halognio, a qual foi direcionada perpendicularmente sobre o arranjo de
nanoburacos utilizando um microscpio com lente objetiva de longa distncia de
trabalho . Coletou-se a luz transmitida atravs nos nanoburacos utilizando-se um
cabo de fibra ptica, que conectado a um espectrofotmetro UV-Vis (Figura 55).
Luz branca
Lente objetiva
Plataforma de
translao
Espectrofotmetro
UV-Vis
Fibra ptica
Figura 55: Arranjo experimental para as medidas de transmisso de luz atravs dos
arranjos de nanoburacos.
Obteno de imagens de SPR
Para a obteno das imagens de SPR montou-se um circuito integrado
contendo a amostra de ouro com nanoburacos selada com a pea de PDMS
contendo microcanais. Estes microcanais foram alinhados com os arranjos de
nanoburacos (Figura 61). Utilizou-se como fonte de excitao um laser de He-Ne
(emisso em 633 nm). O feixe de luz foi expandido e espalhado uniformemente
sobre o arranjo de nanoburacos atravs de lentes plano-convexas. A luz transmitida
foi coletada por um microscpio, sendo direcionada para uma cmera CCD. As
imagens foram ento registradas em um computador (Figura 56), utilizando um
tempo
de
aquisio
de
20 ms.
As
imagens
obtidas
foram
analisadas,
131

quantificando-se a intensidade da luz transmitida atravs dos nanoburacos atravs
do software Image J (desenvolvido por National Institutes of Health).
He-Ne
Laser
Microscpio
CCD
Figura 56: Esquema experimental para a aquisio de imagens por transmisso de

luz atravs dos arranjos de nanoburacos usando uma cmera CCD.
132
Resultados e Discusses Parte II
I.4. Resultados e Discusso

I.4.1. Deteco por imagens
Utilizou-se os arranjos de nanoburacos perfurados atravs do filme de ouro
para a deteco da presena de anticorpo e antgeno do cncer de ovrio. Para isso,
imagens da superfcie do dispositivo foram adquiridas atravs de uma cmera
CCD.368 O CCD, ou dispositivo de carga acoplado, extremamente sensvel luz. A
exibio dos dados de uma determinada imagem realizada pela transformao da
luz refletida em sinais eltricos, que so convertidos em bites, atravs de um
conversor analgico-digital. Este tipo de cmera permite a obteno de imagens da
luz transmitida atravs dos nanoburacos.
A quantidade de luz transmitida dependente do ndice de refrao prximo
superfcie do ouro. A presena das molculas muda o ndice de refrao efetivo,
acarretando o deslocamento do mximo de transmisso para maiores comprimentos
de onda (Figura 57). Considerando um determinado comprimento de onda
(eg. 633 nm, fonte He-Ne), a variao do ndice de refrao leva mudanas na
intensidade da luz transmitida atravs dos nanoburacos. Um fator interessante do
mtodo de deteco por imagens, a possibilidade de se obter a visualizao de
uma extensa rea da superfcie do sensor contendo os vrios arranjos de
nanoburacos. Estes arranjos podem ser modificados diferentemente, atravs da
funcionalizao diferenciada em cada um dos conjuntos. A variao na transmisso
devido interao molecular (ou biomolecular) em cada um dos conjuntos ento
registrada pela cmera CCD atravs de uma fotografia da superfcie.
Neste trabalho utilizou-se uma amostra com arranjos de nanoburacos de
200 nm de dimetro os quais foram fabricados atravs de um filme de ouro de
2,54 cm x 2,54 cm com 100 nm de espessura. Esta espessura cerca de duas
vezes maior que a profundidade de penetrao do SP no filme de ouro, o que
significa que os SP de um dos lados do filme tem mnima comunicao com os SP
do outro lado do filme.305 Cada arranjo possui uma rea de 15 x 15 m2 e a distncia
entre os nanoburacos de 420 nm (periodicidade). Esta periodicidade foi
previamente determinada para que a transmisso atravs dos nanoburacos
estivesse em ressonncia com a fonte monocromtica utilizada (laser He-Ne)
durante as medidas (Figura 57). Trabalhou-se com luz vermelha porque nesta regio
133

no ocorre significante fluorescncia de amostras biolgicas. Alm disto, este
comprimento de onda compatvel com muitos materiais, facilitando a construo do
dispositivo.
1,05
Aumentando o
ndice de refrao
Intensidade / uni. arb
0,90
0,75
0,60
0,45
Diminuio da
Intensidade
em 633 nm
0,30
0,15
500
550
600
650
700
750
800
850
Figura 57: Espectros de transmisso para um arranjo de nanoburacos ilustrando a
diminuio da intensidade da luz transmitida no comprimento de onda equivalente a
633 nm.
Previamente
s medidas
de
deteco
por
imagens,
analisou-se
sensibilidade da amostra frente a variaes do ndice de refrao do meio. Durante

este experimento, utilizou-se solues de glicose com diferentes concentraes.
Como resultado, obteve-se os valores de intensidade de luz transmitida mostrados
na Figura 58. A Figura 58b mostra a curva de calibrao obtida atravs destas
medidas, a qual resultou em uma sensibilidade de 316 UIR-1, sendo semelhante
obtida por espectroscopia UV-Vis.306
134
21
18
15
a)
15
1,3324
1,3331
1,3350
1,3444
1,3568
1,3778
b)
Coeficiente angular = 316
12
I / uni. arb.
24
12
9
9
6
3
6
3
0
1,3377
1,3468
1,3559
1,3650
1,3741
ndice de Refrao
Pixel
Figura 58: a) Intensidade da luz transmitida atravs de arranjos de nanoburacos para

diferentes ndices de refrao. b) Curva de calibrao obtida atravs do grfico em
a) Fonte utilizada: He-Ne.
A Figura 59b mostra uma imagem por MEV dos arranjos de nanoburacos, os
quais se encontram organizados em 7 colunas e 4 linhas. Esta organizao foi
estabelecida com o objetivo de possibilitar a realizao de um experimento em
tempo real para a deteco de anticorpos e antgenos presentes em diferentes
concentraes na amostra.
b)
a)
Figura 59: Micrografias obtidas por MEV das matrizes de nanoburacos criadas em
um filme de ouro. a) Imagem dos buracos com 200 nm de dimetro e periodicidade
de 420 nm. b) Imagem da configurao da amostra com matrizes de nanoburacos
organizadas em 7 colunas espaadas por 150 m, contendo 4 linhas de arranjos
espaados por 60 m.
Para a distribuio da amostra em diferentes concentraes sobre a
plataforma sensvel, utilizou-se um sistema de microcanais (Figura 60), o qual
135

consiste de 7 canais diferentes. Cada canal foi alinhado com uma coluna de arranjos
de nanoburacos (Figura 59 e Figura 61). Este sistema de microcanais chamado de
sistema de diluio, pois 6 (seis) dos 7(sete) canais so alimentados por duas
cmaras de entrada (Figura 60). Na cmara 1, uma soluo contendo o analito
(antgeno, por exemplo) com concentrao conhecida injetada ao mesmo tempo
em que na cmara 2 injetada uma soluo tampo.
Sada
Amostra
Soluo
Nanoburacos
STF
Figura 60: Sistema de microcanais utilizado para a determinao da concentrao de

um analito atravs de uma curva de calibrao adquiridos durante experimento em
tempo real.
O sistema de microcanais funciona de forma a misturar as solues injetadas
em ambas as cmaras, resultando em solues com diferentes concentraes
136

fluindo em cada canal. A concentrao de antgeno em cada canal ou sobre cada
coluna de arranjo de nanoburacos ser diferente. Atravs de uma imagem da
superfcie da amostra, pode-se analisar a intensidade de luz transmitida atravs de
cada arranjo de nanoburacos. Esta imagem fornece dados suficientes para se
graficar uma curva de calibrao, que mostra a variao da intensidade transmitida
em funo da concentrao do analito. Na cmara 3, tem-se um microcanal
independente, o qual no faz parte do sistema de diluio. Esta cmara utilizada
para injetar a amostra contendo concentrao desconhecida do analito. A idia final
determinar a concentrao do marcador tumoral de cncer de ovrio, atravs da
curva de calibrao obtida durante uma medida em tempo-real.
Os arranjos de nanoburacos foram limpos em banho de ultra-som por 3 min,
enxaguados com etanol, gua e ento secos com N2. Aps a limpeza do substrato,
uma monocamada de DSU (ditiobis (succinimidil undecanoato) foi montada sobre a
superfcie de ouro atravs da imerso da amostra em uma soluo contendo
2 mmol.L-1 de DSU em DMSO, ficando em repouso por 72 horas. Aps a montagem
da monocamada, a amostra foi enxaguada para eliminar as molculas no
adsorvidas e s ento foi alinhada com a pea de PDMS contendo microcanais.
Estes foram previamente modificados com BSA (albumina de soro bovino) para
evitar adsores no especficas das molculas analisadas. Para isso, fluiu-se
soluo 0,1 mmol.L-1 de BSA em STF com velocidade de fluxo de 10 L.min-1 por
2 horas (Figura 61).
Figura 61: Imagem fotogrfica (lente objetiva 10X) das matrizes quadradas
(15 x 15 m2) de nanoburacos alinhadas com os microcanais de 100 m de largura.
137
Deteco do Anticorpo PAX8

Trabalhou-se com o anticorpo PAX8 porque recentemente o Instituto de
Tecnologia de Cncer de Ovrio de Atlanta descobriu que esta protena, PAX8, est
envolvida no desenvolvimento das trompas falopianas e est presente nas clulas
cancergenas do ovrio, no estando presente nos tecidos normais deste.369
O sistema de microcanais foi utilizado para diluir uma soluo contendo
27 g.mL-1 de PAX8 em STF. A Figura 62 apresenta a imagem obtida atravs do
esquema experimental mostrado na Figura 56. A amostra foi iluminada no lado
oposto ao ouro utilizando uma fonte de luz monocromtica em 633 nm (laser He-Ne).
ntida a mudana na intensidade da luz transmitida atravs dos nanoburacos
presentes nas diferentes colunas (Figura 62), o que resultante de diferentes
quantidades de espcies detectadas. De acordo com a literatura, 303,370 a diminuio
da intensidade transmitida seria esperada devido ao aumento do ndice de refrao
para amostras com a periodicidade maior que 405 nm. Portanto, o resultado
mostrado na Figura 62 sugere que esteja ocorrendo um aumento do ndice de
refrao a partir da coluna 1 em direo coluna 6. Como a soluo de PAX8 uma
soluo diluda, o ndice de refrao do meio (STF) e da soluo contendo o
anticorpo (PAX8 em STF) o mesmo (1,3333 a 22,1 oC). Assim, assume-se que as
mudanas que ocorreram na intensidade de luz transmitida atravs dos arranjos de
nanoburacos sejam decorrentes da imobilizao do anticorpo sobre a plataforma do
sensor.
Amostra
B
C
D
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a
deteco do anticorpo PAX8.
138

A Figura 63 mostra as intensidades de luz transmitida atravs dos arranjos de
nanoburacos para uma das linhas presentes na Figura 62, a qual contm matrizes
presentes em diferentes microcanais (de 1 a 6 e a amostra). O ltimo pico na Figura
63a referente amostra analisada. O mximo de intensidade transmitida
normalizada observado para o microcanal 1, no qual flui a soluo mais diluda
sobre os nanoburacos e, portanto, o mximo de intensidade transmitida observada
resultante do menor ndice de refrao efetivo.
Na Figura 63b esto apresentadas as intensidades mdias obtidas para os
arranjos presentes em cada coluna em funo da diluio. Atravs das intensidades,
obtm-se uma curva de calibrao (Figura 63b), a qual permite a determinao em
tempo-real, da concentrao da espcie presente na amostra. Utilizando a curva de
calibrao obtida e, sabendo que a maior e menor intensidades de luz transmitida
correspondem respectivamente a STF e a soluo de marcador biolgico de partida
(de concentrao conhecida), estimou-se a concentrao de PAX8 presente na
soluo como sendo 16,50 g.mL-1 0,05, o qual prximo da concentrao real da
amostra (15,70 g.mL-1).
0,8
0,6
Amostra
0,4
0,2
b)
1,0
a)
EOT Normalizada / uni. arb.
1,0
0,8
0,6
Amostra
0,4
0,2
0,0
0
200
400
600
800
1000
Pixel
1200
1400
Microcanal
Figura 63: a) Intensidades normalizadas da luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos aps a deteco do anticorpo PAX8. b) Intensidade mdia
transmitida em funo da diluio (calculada para os arranjos em cada microcanal).
Deteco do Antgeno r-PAX8

Para a deteco do antgeno foram seguidos os mesmos passos, descritos
para deteco do anticorpo PAX8. Entretanto, toda a superfcie da amostra foi
139

homogeneamente modificada com o anticorpo para s ento ser feita a deteco do
correspondente antgeno.
O sistema de microcanais foi utilizado na diluio de uma soluo contendo
8,5 g.mL-1 de r-PAX8 em STF, a qual fluiu sobre a amostra em uma velocidade de
10 L.min-1. Como descrito anteriormente para a deteco do anticorpo, utilizou-se o
arranjo experimental da Figura 56 para a deteco do antgeno. A Figura 64 mostra
a imagem adquirida com uma cmera CCD do dispositivo integrado, onde ocorreu a
diluio da soluo a partir da coluna 6 at a coluna 1. A amostra que consiste de
uma soluo contendo concentrao desconhecida do marcador biolgico fluiu
sobre a ltima coluna com arranjos de nanoburacos ( direita). Embora as mudanas
de intensidade sejam visveis, elas no foram to intensas quanto aquelas obtidas
para o anticorpo PAX8. Este comportamento pode ser relacionado a dois fatores: i) a
concentrao do AG menor do que a do AC e ii) o AG consiste em uma molcula
pequena quando comparada com o AC, e portanto a imobilizao do AC sobre o
biosensor tem maior efeito no ndice de refrao efetivo, resultando em maiores
mudanas na intensidade.
Amostra
B
C
D
alinhados com os microcanais. Os arranjos de nanoburacos foram utilizados para a
deteco do antgeno r-PAX8.
A Figura 65 apresenta as intensidades normalizadas da luz transmitida pelos
nanoburacos dentro do microcanal. O ltimo pico ( direita na Figura 65a)
relacionado amostra analisada de concentrao desconhecida. De fato,
observam-se intensidades diferentes para cada microcanal. O mximo de
intensidade normalizado para 1,0 (ca. 50 pixels), da mesma forma que para o AC,
possui a soluo mais diluda fluindo, resultando em menor ndice de refrao
140

efetivo. Alm disso, atravs da Figura 65 verifica-se que o biosensor capaz de
detectar diferentes concentraes de r-PAX8, sendo que uma amostra menos
concentrada foi detectada na Figura 65a e outra mais concentrada na Figura 65b.
Atravs destes resultados, pode-se afirmar que o mtodo apresentado neste
experimento permite uma anlise quantitativa da amostra.
b)
Amostra diluda
EOT Normalizada / uni. arb
1,0
a)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,8
Amostra concentrada
0,6
0,4
0,2
0,0
0
200
400
600
800
1000
1200
Pixel
200
400
600
800
1000
1200
Pixel
Figura 65: Intensidades normalizadas de luz transmitida para a linha B de arranjos

de nanoburacos aps a deteco do antgeno r-PAX8. a) amostra diluda e
b) amostra concentrada de r-PAX8.
A partir das imagens obtidas para a deteco do r-PAX8, plotou-se uma curva
de calibrao para a deteco quantitativa do AG (Figura 66). Comparando esta
curva de calibrao com a obtida para o AC (Figura 63b), observam-se
comportamentos diferentes. Este fato pode ser explicado levando-se em
considerao o tamanho das molculas. Como os AC so maiores do que o AG,
seria mais fcil detectar uma pequena mudana da concentrao do AC do que do
AG, j que o tamanho da molcula levado em considerao durante os clculos do
ndice de refrao efetivo.
A concentrao do AG na amostra pode ser ento estimada utilizando a curva
de calibrao presente na Figura 66. Como foi utilizada uma soluo contendo
8,5 g.mL-1 de AG para a construo da curva de calibrao e, sabendo que a maior
e menor intensidades de luz transmitida correspondem respectivamente a STF e a
esta soluo com 8,5 g.mL-1 de AG, pode-se estimar que a amostra diluda de
r-PAX8 contm 2,53 g.mL-1 0,08, enquanto que para a amostra concentrada
141

obteve-se 4,73 g.mL-1 0,09. Estes valores obtidos atravs da medida ptica
experimental so prximos da concentrao real das amostras, sendo 2,10 e
5,30 g.mL-1, respectivamente. Estas concentraes so muito maiores do que a
presente no paciente com a doena. No entanto, tanto o dispositivo para microfludo
quanto a plataforma sensorial foram eficientes. O primeiro na distribuio da amostra
em vrios canais contendo diferentes concentraes e o segundo na deteco no
somente do marcador tumoral, mas tambm das diferentes concentraes deste.
Desta forma, neste ponto avanos devem ser feitos para melhorar tanto a
sensibilidade quanto o limite de deteco do chip.
EOT Normalizado / uni. arb.
1,0
Amostra diluda
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Amostra concentrada
0,2
1
Pixel
Figura 66: Intensidade mdia transmitida em funo da diluio (calculada para os
arranjos de nanoburacos presentes em cada microcanal).
I.4.2. Deteco dentro dos nanoburacos por espectrofotometria UV-Vis

Os resultados aqui apresentados so provenientes de um dispositivo para
sensor SPR baseado em EOT atravs de arranjos de nanoburacos periodicamente
organizados. Neste dispositivo, a sensibilidade baseada na deteco dentro do
nanoburaco. A Figura 67 mostra o esquema do sensor utilizado, onde os
142

nanoburacos foram perfurados atravs do filme de SiOx e de ouro, confinando a rea
sensvel somente no interior do nanoburaco.
a)
b)
SiOx
Au
50 nm
170 nm
100 nm
Substrato de vidro
Figura 67: a) Representao de um nanoburaco, ilustrando a camada de ouro de

100 nm (amarelo) entre o substrato de vidro e uma camada de SiO x de 50 nm de
espessura. b) Esquema ilustrando a deteco das trs camadas de molculas
confinadas dentro do buraco. Os experimentos foram realizados utilizando arranjos
de 8 m x 8 m, contendo nanoburacos com 170 nm de dimetro e periodicidade de
500 nm.
A eficincia do filme de SiOx em bloquear a superfcie de ouro foi testada
atravs de medidas de voltametria cclica (VC), utilizando soluo 1 mmol.L-1 de
K3[Fe(CN)6] e velocidade de varredura de 20 mV.s-1. A Figura 68 mostra os
voltamogramas utilizando o eletrodo de ouro no coberto por SiO x (a) e o eletrodo de
ouro coberto com o filme de SiOx (b). A curva (a) mostra o processo redox do
K3[Fe(CN)6] com os picos caractersticos de oxidao em 0,34 V e reduo em
0,18 V. Quando o filme de SiOx depositado sobre o eletrodo de ouro (b), a corrente
faradaica diminui drasticamente devido difuso limitada das espcies Fe(CN)63- em
direo superfcie do ouro. De acordo com a curva (b), o processo redox do
K3[Fe(CN)6] foi praticamente bloqueado pela camada de SiOx. O pequeno efeito de
capacitncia de fundo na curva relacionado capacitncia formada entre o ouro e
a soluo eletroltica. Alm disso, a curva (b) no apresenta ondas de forma
sigmoidal como anteriormente mostrado na literatura, este comportamento uma
forte indicao de um filme compacto, ou seja, com poucos defeitos.371,372
De acordo com os resultados de VC, foi possvel confirmar que o filme de
SiOx cobre eficientemente a superfcie do ouro.373 Isto significa que aps a obteno
dos nanoburacos atravs dos filmes de SiOx e ouro, somente a superfcie de ouro no
interior dos nanoburacos estar disponvel para a imobilizao de molculas. A
143

grande vantagem deste sistema que a quantidade de analito a ser detectada
5 vezes menor do que em sistemas onde a superfcie do ouro no est bloqueada,
(para os parmetros mostrados na Figura 67), devido rea limitada de ouro
exposta. Esta uma estimativa feita sem considerar o fato de que as ondas de SP
se propagam (e, portanto, so sensveis) alm da rea das matrizes de nanoburacos
Densidade de corrente / A.cm
-2
para o substrato no coberto.374,375
100
50
0
-50
-100
-150
-0,2
0,0
0,2
0,4
E / V vs. Ag|AgCl
0,6
Figura 68: Voltamogramas em soluo aquosa de K3[Fe(CN)6] utilizando como

eletrodo de trabalho: a) eletrodo de ouro sem modificao e b) eletrodo de ouro
coberto com filme de SiOx obtido aps 120 h de deposio.
Sensibilidade
A sensibilidade do sensor em detectar variaes de ndice de refrao
prximas superfcie foi analisada atravs de medidas de transmisso de luz do
sensor em contato com solues de glicose com ndices de refrao diferentes
(Figura 69). A banda em 600 nm (Figura 69a) relacionada ao modo de ressonncia
(1,1) que ocorre devido interface ouro|vidro, e a banda em cerca de 730 nm (Figura
69b) relacionada ao modo (1,0) que ocorre devido interface ouro|soluo dentro
do buraco. O mnimo de absoro observado em todos os espectros ocorre devido
144

anomalia de Wood,376 sendo resultante da luz difratada que emerge paralelamente
superfcie do metal. Como previsto para sensores baseados em SPR, ocorre um
deslocamento do mximo de transmisso para maiores comprimentos de onda ao
aumentar o ndice de refrao prximo superfcie.
Como a superfcie do ouro encontra-se bloqueada pela camada de SiOx, a
resposta do sensor resultante das mudanas de ndice de refrao dentro dos
nanoburacos. O deslocamento para maiores comprimentos de onda da banda (1,1)
semelhante resposta de outros arranjos, estando de acordo com a conhecida
teoria da luz transmitida atravs de nanoburacos.306 No entanto, o deslocamento da
banda (1,0) presente na Figura 69 b, representa uma melhora da sensibilidade
quando comparada com a deteco onde a imobilizao feita sobre toda a
superfcie, ou seja, em torno dos buracos e dentro deles.
1,3320
1,3331
1,3371
1,3447
1,3584
0,8
0,6
1,0 b)
1,0 a)
0,4
Banda (1,1)
0,2
1,3320
1,3331
1,3371
1,3447
1,3584
0,8
0,6
0,4
Banda (1,0)
0,2
0,0
0,0
560
580
600
620
640
660
680
680
700
720
740
760
780
800
Figura 69: Espectros de transmisso normalizados empregando solues de glicose

com ndices de refrao conhecidos. Bandas relacionadas aos modos de
ressonncia a) (1,1) e b) (1,0).
Atravs dos espectros apresentados na Figura 69 plotou-se curvas de
calibrao para a amostra, referente s duas bandas de transmisso (Figura 70).
Atravs do grfico de variao da posio do mximo de transmisso (comprimento
de onda) versus ndice de refrao, variando de 1,3320 a 1,3584 (variao de
0 a 2%), obteve-se um deslocamento da banda para maiores comprimentos de onda,
correspondendo a 10 nm para a banda (1,1). A sensibilidade pode ser obtida atravs
do coeficiente angular da curva, resultando em 360 nm/UIR. Como a banda muito
145

larga, optou-se por medir o deslocamento usando o lado curva (em menores
comprimentos de onda), ao invs de utilizar o mximo de transmisso para o clculo
do deslocamento. Com relao banda (1,0), a mudana no mximo de
transmisso, para a faixa de ndice de refrao que se trabalhou (de 0 a 2% de
variao), foi calculada como sendo 19 nm, caracterizado por uma sensibilidade de
650 nm/UIR, a qual pode ser comparada com experimentos sem o filme de SiO x
(ca. 400 nm/UIR).306
Os resultados mostram que a deposio de SiOx sobre o ouro no diminuiu a
sensibilidade do sensor em comparao com a superfcie no coberta. Este efeito
no esperado ser discutido posteriormente ao se considerar a influncia do ndice
de refrao da camada adsorvida nas propriedades de guia de onda de menor
ordem dentro do buraco.
10
20
= 10 nm
Banda (1,1)
15
nm
/ nm
b)
a)
= 19nm
Banda (1,0)
10
2
0
0
1,335
1,340
1,345
1,350
1,355
ndice de Refrao
1,335
1,340 1,345
1,350
ndice de refrao
1,355
Figura 70: Curvas de calibrao resultantes dos deslocamentos dos mximos de

transmisso para a) banda (1,1) e b) banda (1,0).
Utilizou-se simulaes atravs do mtodo das Diferenas Finitas no Domnio
de Tempo (FDTD)377 para a avaliao das mudanas efetivas de ndice de refrao
devido presena de diferentes espcies, sendo feita atravs de clculos do campo
eltrico dentro do nanoburaco. A Tabela 4 mostra os valores correspondentes ao
mximo de transmisso obtidos experimentalmente e atravs de clculos por FDTD
para diferentes ndices de refrao.
146

Tabela 4: Comprimentos de onda referentes ao mximo de transmisso obtidos
atravs de clculos por FDTD, comparado a valores experimentais onde foram
utilizadas solues de glicose com diferentes ndices de refrao.
Dados Experimentais (nm)
Simulao FDTD (nm)
ndice de Refrao
Banda (1,1)
Banda (1,0)
Banda (1,1)
Banda (1,0)
1,3320
564
720
601
732
1,3331
565
724
601
732
1,3371
567
727
603
734
1,3447
569
731
604
737
1,3584
574
739
607
743
Para as medidas de deteco dentro dos buracos utilizou-se a ligao entre

as molculas de biotina e estreptavidina devido sua alta constante de bioafinidade
(Ka 1013M-1).378 Esta propriedade uma das principais razes para a aplicao deste
esquema na deteco de biosensores, j que ele permite a utilizao de condies
mais severas durante a anlise bioqumica. Alm disso, a especificidade da
interao permite a imobilizao da protena de forma uniformemente orientada,
fornecendo uma importante vantagem sobre outros mtodos de imobilizao.379 O
sistema biotina-estreptavidina tem sido estudado com detalhes por espectroscopia
SPR.380,381 A estreptavidina uma protena tetramrica, podendo ser ligada a quatro
molculas biotiniladas (por exemplo, anticorpos, cidos nuclicos, etc.) com mnimo
impacto em sua atividade biolgica.382 Desta forma, este esquema fornece uma
plataforma pronta para a deteco de analitos dentro do buraco (ver Figura 51). A
Figura 71 apresenta os resultados relacionados imobilizao das protenas no
biosensor.
147

a)
10
0,8
8
/nm
Intensidade / uni.arb.
12 b)
Cisteamina
Biotina
Estreptavidina
1,0
0,6
6
4
0,4
2
0,2
700
725
750
775
800
Biotina
Estreptavidina
Figura 71: a) Espectro de transmisso para arranjos de nanoburacos periodicamente

organizados, obtidos atravs de um filme de 50 nm de SiOx e um filme de 100 nm de
ouro, quando a superfcie do ouro foi modificada sequencialmente por uma
monocamada de cisteamina, BNHS e estreptavidina. b) Medidas dos deslocamentos
do mximo de transmisso aps a adio de BNHS e estreptavidina, relativos
superfcie modificada com cisteamina.
O espectro de transmisso para cada passo no processo de montagem foi
medido durante o fluxo de STF sobre a amostra, atravs da clula de fluxo. Como a
banda relacionada ao modo (1,0) mais sensvel e mais estreita, optou-se em
trabalhar com esta banda para a deteco das diferentes camadas de molculas
sobre o sensor. Os deslocamentos do mximo de transmisso () foram calculados
usando o espectro de transmisso da superfcie de ouro modificada com a
monocamada de cisteamina como referncia. O processo de imobilizao de todas
as camadas de molculas sobre a superfcie (cisteamina-BNHS-estreptavidina)
corresponde a um deslocamento para maiores comprimentos de onda de ca. 10 nm,
indicando um aumento no ndice de refrao efetivo, como esperado para a
adsoro de protenas.383 Com relao banda (1,1) ocorreu um deslocamento total
de ca. 7 nm. Os resultados foram analisados para 16 arranjos de nanoburacos com
as mesmas caractersticas (dimetro do buraco e periodicidade) em 4 experimentos
separados. As barras de erro presentes na Figura 71b correspondem ao desvio
padro calculado para as medidas. A reprodutibilidade para cada arranjo de
nanoburaco, estimada para o deslocamento do comprimento de onda relacionado
imobilizao da protena, foi de cerca de 20%.
148

Considerando que cada molcula de estreptavidina cobre uma rea de
25 nm2, possvel estimar que somente 2000 molculas foram detectadas em cada
buraco. Como cada arranjo contm 900 buracos (30 x 30 nanoburacos), os 10 nm de
deslocamento do comprimento de onda visualizados na Figura 71 foram resultante
de cerca de 3 attomols (3 x 10-18 mols) de protena. A deteco desta pequena
quantidade de amostra s foi possvel devido ao fato de que o filme de SiO x no
diminuiu a sensibilidade dos arranjos investigados. A quantidade de protena
detectada pode ainda ser diminuda atravs da reduo do tamanho dos arranjos
(diminuio do nmero de nanoburacos), sem afetar a sensibilidade do dispositivo. 305
Experimentos de controle negativo foram empregados para verificao de
ligao no especfica da estreptavidina sobre o filme de SiO x. O espectro de
transmisso dos arranjos no modificados antes e aps imerso em soluo de
estreptavidina no apresentaram nenhum deslocamento relativo ao STF.
O fato de que a camada de SiOx no afete a sensibilidade da amostra pode
ser explicado atravs da anlise do campo eltrico dentro do buraco, comparando-se
uma mudana uniforme do ndice de refrao dentro do buraco com a mudana no
ndice de refrao resultante das camadas do sistema cisteamina-BNHS e
estreptavidina. Resolvendo-se a equao de Helmholtz384 para o campo longitudinal
do modo de menor ordem, encontrou-se ndice de refrao efetivo de 1,3518 para as
multicamadas de cisteamina-BNHS-estreptavidina com 7 nm de espessura ( = 1,45)
e STF ( = 1,3376). Estes clculos tericos corroboram nossos experimentos. O
modo de menor ordem foi o nico modo considerado durante os clculos j que ele
domina o processo de transmisso ptico nestas condies.385 bvia a alta
sensibilidade do modo dentro do buraco em relao adsoro de espcies na
superfcie, a qual resulta da componente do alto campo longitudinal na superfcie.
Resumidamente, o isolamento da superfcie de ouro buscando a deteco
confinada dentro do nanoburaco permitiu a obteno de uma plataforma com boa
sensibilidade e deteco de poucas molculas dentro dos nanoburacos (na ordem
de attomols). A sensibilidade do dispositivo foi de 650 nm/UIR, sendo comparvel a
valores previamente descritos na literatura para deteco em toda a superfcie.306 No
Controle negativo: consiste em um experimento para verificao de mudanas na resposta em
funo de ligaes no especficas, o termo negativo utilizado pois espera-se que no ocorram
mudanas na resposta.
149

entanto, o conceito de deteco dentro do buraco permite a deteco de uma menor
quantidade de molculas devido reduo (5 vezes) da rea sensvel e ao
confinamento do plasmn na regio onde as molculas foram imobilizadas. Como as
medidas de EOT atravs de menores arranjos de nanoburacos so simples, o
processo descrito aqui pode ser facilmente aplicado para a deteco de quantidades
sub-attomolares de protenas, principalmente se for integrado a um sistema de
microfludo para fluxo atravs dos nanoburacos. Sendo assim, a quantidade de
amostra analisada tambm seria reduzida, facilitando a deteco de marcadores
tumorais presentes em amostras de pacientes com cncer no estgio inicial de
evoluo da doena.
150
Concluses Parte II
I.5. Concluses
O substrato baseado no modo de deteco por EOT permite que seja utilizado
um arranjo experimental simples e de fcil alinhamento. O mtodo de deteco por
aquisio de imagens uma opo que viabiliza a aplicao do material para a
deteco mltipla e em diferentes concentraes, de forma similar ao ELISA, mtodo
comumente utilizado na deteco de marcadores biolgicos. Neste trabalho foi
possvel a deteco quantitativa tanto do anticorpo (PAX8) quanto do antgeno
(r-PAX8) atravs de uma medida em tempo real, a qual realizada pela aquisio de
imagens fotogrficas do substrato. A deteco destes marcadores biolgicos de
suma importncia j que eles so relacionados ao cncer de ovrio e sua deteco
na fase inicial da doena diminuiria os riscos de morte de forma significativa. Alm
disso, a deteco quantitativa dos marcadores tumorais permite a aplicao do
dispositivo para a verificao da eficincia do tratamento de cncer utilizado no
paciente. Um tratamento adequado resultaria em diminuio da concentrao destes
marcadores tumorais. O mtodo desenvolvido neste trabalho possui a vantagem de
no trabalhar com molculas marcadas, o que acontece no caso do ELISA.
Os resultados referentes amostra onde os plasmns de superfcie foram
confinados dentro dos nanoburacos, mostraram que esta possui semelhante
eficincia quando comparado com sensores cuja deteco dada por toda a
superfcie. O dispositivo integrado foi aplicado com sucesso na deteco de
mudanas do ndice de refrao, apresentando sensibilidade de 360 nm/UIR e
650 nm/UIR para as bandas de ressonncia (1,1) e (1,0), respectivamente. Esta
ltima amostra consiste em excelente melhora ao se comparar com valores
previamente descritos,306 principalmente ao se levar em conta a rea sensvel da
plataforma. Alm disso, o substrato plasmnico desenvolvido neste trabalho foi
aplicado com sucesso na deteco de multicamadas de molculas, o qual resultou
em um dispositivo que permitiu a deteco de quantidades attomolares da protena
estreptavidina em resultado da diminuio da rea sensorial da plataforma e
confinamento do plasmn de superfcie.
151
Referncias Bibliogrficas
VII. Referncias Bibliogrficas

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energia dos nveis

vetor de onda do fton

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que excita os eltrons

vidro recoberto com

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