FERMENTASI KARBOHIDRAT

(UJI GULA GULA)

Kemampuan memfermentasikan karbohidrat dan produk fermentasi yang

di hasilkan merupakan ciri yang sangat berguna dalam identifikasi
mikroorganisme. Biasanya bila dalam proses fermentasi karbohidrat
menggunakan glukosa dalam media cair, maka hasil proses fermentasi bersifat
asam dalam fermentasi ini terjadi reaksi kimia yaitu :
1. Fermentasi Alkohol
C6H12O6
2C2H5OH + 2CO2 + 2NADH + 2 ATP
Glukosa
etanol
2. Fermentasi Asam Laktat
C6H12O6
2 C2H5OCOOH + 2 ATP
Glukosa
Asam Laktat
3. Fermentasi Asam Cuka
C6H12O6
2C2H5OH
2CH3COOH + H2O + 10 ATP
Glukosa
Etanol
Cuka
Dalam menguji fermentasi karbohidrat digunakan Glocose Agar, Sucrose Agar,
dan Lactosa Agar dan mannitol. indikator yang sering di gunakan adalah phenol
red atau BCP.
Hasil (+)

UJI INDOL

Untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memecah asam amino

triptofan. Asam amino triptofan merupakan asam amino esensial yang biasanya
terdapat dalam protein, dan merupakan sumber nitrogen bagi bakteri.
PRINSIP :
Untuk uji indol ini digunakan biakan E.coli dan E.aerogenes berumur 24 jam
sampai 48 jam pada medium TSB, di gunakan media Pepton dan Reagen Kovacs
Pertama siapkan media pepton dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri
pada tiap-tiap tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37 oC selama 24
sampai 48 jam, setelah itu teteskan reagen Kovacs pada tabung media yang
telah di inkubasi, jika hasil (+) maka akan terbentuk terbentuk cincin merah,
karena asam amino dalam media pepton akan terurai dengan reaksi :
Tryptofan

Indole + asam piruvat + amonia

Pembentukkan indol dari triptofan oleh mikroorganisme akan terindikasi dengan

penambahan indikator Kovacs, karena akan bereaksi dengan indol yang
menghasilkan senyawa tidak larut dalam air dan membentuk warna merah pada
permukaan media.

UJI METHYL RED

Untuk menentukan mikroorganisme dalam mengoksidasi glukosa dengan
menghasilkan asam dan juga untuk membedakan bakteri usus E.coli dengan
E.aerogenes
PRINSIP :
Untuk uji Methyl Red ini digunakan biakan E.coli dan E.aerogenes berumur 24
jam sampai 48 jam pada medium TSB, dan digunakan media MR-VP.
Pertama siapkan media MR-VP dan beri label. secara aseptik, inokulasikan bakteri
pada masing masing tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37 oC selama
24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan reagen Methyl Red pada tabung media
yang telah di inkubasi, jika warna media pink(+), maka pH dalam media sekitar
kisaran 4,0, karena indikator methyl red akan berwarna merah pada pH 4,0 dan
jika media berwarna kuning(-) maka pH dalam media sekitar 5,6, karena
indikator MR berwarna kuning pada pH tersebut.
Media dapat berwarna merah atau kuning , karena bakteri E. Coli dan
E.aerogenes dapat memfermentasi glukosa dengan reaksi :
1. E.coli
C6H12O6

asam laktat + asam cuka + asam format + CO 2 + H2O (pH

=4,0)
2. E.aerogenes
C6H12O6

asam laktal + asam cuka

asetilmetilkarbinol (pH = 6,5)

warna media merah, maka di dalam media (+) E.coli.
warna media kuning, maka di dalam media (+) E.aerogenes

ethanol dan

UJI VOGES PROSKAUER

Untuk membedakan bakteri usus seperti ( E.coli, E.aerogenes dan
Klebsiella pneumonia) dalam menghasilkan hasil akhir berupa produk bukan
asam (asetoin) dengan substrat glukosa.
PRINSIP :
Untuk uji Voges Proskauer ini digunakan biakan E.coli, E.aerogenes dan Klebsiella
pneumonia berumur 24 jam sampai 48 jam pada medium TSB, dan digunakan
media MR-VP.
Pertama siapkan media MR-VP dan beri label. secara aseptik inokulaskan bakteri
pada tiap-tiap tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu 37 oC selama 24
sampai 48 jam, setelah itu teteskan reagen KOH 40 % dan alfa naftol 1 : 1 pada
tabung media yang telah di inkubasi, jika pada media terbentuk Cincin merah
muda pada permukaan tabung, maka (+) memfermentasi glukosa menjadi
senyawa 2,3 butanadiol (senyawa netral ) dengan reaksi :
Glukosa

asam asetat

asetylmethylkarbinol

2,3 butanadiol + CO2 + H2O (pH > 6,0)

Senyawa 2,3 butanadiol atau asetoin akan bereaksi dengan reagen KOH yang di
tambahkan akan membentuk warna merah muda dan penambahan alfa-naftol
untuk memperjelas perubahan warna.
Perubahan warna biakan terlihat jelas pada permukaan tabung, karena sebagian
2,3 butanadiol akan dioksidasi kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas

hasil reaksi, berdasarkan hal tersebut, maka tabung biakan di kocok hingga
berbuih.

UJI PENGGUNAAN SITRAT

Untuk

membedakan

bakteri

usus

berdasarkan

kemampuan

untuk

memfermentasikan sitrat.
PRINSIP :
Untuk uji Penggunaan Sitrat ini digunakan biakan E.coli, E.aerogenes dan
Klebsiella pneumonia berumur 24 jam sampai 48 jam pada medium TSB, dan
digunakan media Agar Simmons Sitrat.
Pertama siapkan media Agar Simmons Sitrat dan beri label. secara aseptik
inokulaskan bakteri pada tiap-tiap tabung biakan. Kemudian inkubasi pada suhu
37oC selama 24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan reagen BTB, jika warna
media menjadi biru maka (+) memfermentasikan sitrat. Kemampuan bakteri
memfermentasikan sitrat dengan reaksi :
Sitrat

oxsaloasetat

asam piruvat + CO 2 + Na

Senyawa natrium dan CO2 yang dihasilkan akan bergabung dengan air dalam
media membentuk senyawa Na2CO3 yang bersifat basa. Senyawa natrium
karbonat ini akan mengubah indikator BTB dalam perbenihan dari hijau menjadi
biru.

UJI TRIPLE SUGAR IRON AGAR (UJI H2S)

Untuk mengidentifikasi bakteri gram negatif kelompok enterobacteriaceae dalam
memfermentasi 3 jenis gula dan uji pembentukan H 2S.
PRINSIP :
Dalam TSIA ini digunakan biakan E.coli, Salmonella typphimurium, Shigella
dysentriae, Proteus vulgaris dan A.faecalis berumur 24 jam pada TSB dan
digunakan media TSIA.
Pertama siapkan media agar TSIA dan beri label. secara aseptik, inokulasikan
bakteri pada masing-masing tabung biakan dengan teknik Stab and Streak,tutup
tabung biakan jangan terlalu dikencangkan. Kemudian inkubasi pada suhu 37 oC
selama 24 sampai 48 jam, setelah itu teteskan reagen phenol red untuk uji
fermentasi 3 jenis gula dan FeSO 4 untuk uji H2S. Reaksi dibaca setelah kurun
waktu 24 48 jam.
Aktivitas fermentasi karbohidrat dapat dilihat sebagai berikut :
1. Lereng Merah dan dasar kuning = hanya glukosa yang di fermentasi

2. Lereng kuning dan dasar kuning = laktosa dan atau sukrosa yang di
fermentasi
3. Lereng Merah dan dasar merah = ketiga jenis gula tidak difermentasi
Untuk pembentukkan H2S, maka akan terbentuk endapan hitam pada dasar
tabung, karena reagen FeSO 4 yang di tambahkan akan beraksi dengan H 2S
membentuk FeS yang berwarna hitam dengan reaksi :
Sistein
H2S + FeSO4

asam piruvat + H 2S
FeS + H2SO4

UJI REDUKSI NITRAT

Untuk menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme dalam mereduksi
nitrat menjadi nitrit atau di luar bentuk nitrit sebagai aseptor elektron terakhir.
PRINSIP :
Untuk uji reduksi nitrat ini digunakan biakan E.coli, A.faecalis dan P.aeruginosa
berumur 24 jam sampai 48 jam pada medium TSB, di gunakan media kaldu
nutrien KNO3 0,5%
Pertama siapkan media kaldu nutrien KNO 3 0,5% dan beri label. secara aseptik
inokulaskan bakteri pada tiap-tiap tabung biakan dan gunakan tabung durham
untuk melihat pembentukkan gas N2, kemudian inkubasi 37oC selama 24 48
jam. Kemudian tambahkan reagen asam sulfanilat dan alfa-naftilamin 1 mL, jika
media bewarna merah atau merah muda maka, (+) mereduksi nitrat menjadi
nitrit, karena nitrit akan bereaksi dengan asam sulfanilat dan alfa-naftilamin
membentuk warna merah dengan reaksi :

Asam sulfanilat + alfa-naftilamin + nitrit

sulfobenzena azo-alfa

naftilamin (merah)
Apabila jika pada tabung tidak terjadi perubahan warna, maka tambahkan bubuk
Zn untuk melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Maka akan segera media berubah
warna menjadi merah, karena nitrit hasil reduksi nitrat oleh Zn akan bereaksi
dengan reagen.

UJI OKSIDASE
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam aktivitas sitokrom oksidase
PRINSIP :
Pada uji ini, digunakan Media perbenihan Agar plat dan reagen tetramethyl-pphenylenediamine dihydrocloride. Pertama buat media, kemudian dengan teknik
aseptik inokulasi tiap-tiap bakteri dengan teknik single line streak inoculation,
kemudian inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Reagen reagen
tetramethyl-p-phenylenediamine diteteskan pada kertas saring. Kemudian secara
aseptik, satu ose penuh koloni bakteri dioleskan diatas tetesan reagen. Jika
koloni berubah warna menjadi merah marun menunjukan tes (+) dan jika tidak
terjadi perubahan warna (-).

UJI KATALASE
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan Hidrogen peroksida
dengan enzim katalase
PRINSIP :
Dalam uji ini digunakan biakan S.aureus dan Strep.lactis yang berumur 24-48
jam dalam TSB, menggunakan media biakan agar plat dan reagen H 2O2 3%.
Pertama siapkan agar plate untuk inokulasi tiap-tiap

bakteri, kemudian

inokulasikan bakteri dengan teknik aseptik, inkubasi pada suhu 37 oC selama 2448 jam. koloni bakteri diambil satu ose penuh secara aseptis dan diinokulasikan
pada Object glass. Kemudian dipipet dengan pipet tetes, 3% H 2O2 diteteskan
pada Object glass secukupnya. Setelah itu diamati, jika hasil (+) terbentuk

gelembung. Hal ini dikarenakan H2O2 akan diuraikan oleh enzim katalase yang
dihasilkan oleh bakteri menjadi air dan oksigen dengan reaksi :
2H2O2

catalase

2H2O +

O2

UJI UREASE
Untuk menentukan kemampuan bakteri dalam menguraikan urea oleh enzim
urease.
PRINSIP :
Dalam uji ini digunakan media agar miring urea dan indikator Phenol red.
Pertama siapkan agar miring urea untuk di inokulasikan masing-masing bakteri
dan beri label. Kemudian inokulasikan bakteri dengan ose secara aseptik,
inkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam. Teteskan reagen phenol red, jika
terjadi perubahan warna menjadi merah (+) menguraikan urea. Hal ini
disebabkan karena urea di uraikan menjadi ammonia dengan reaksi :
Urea

CO 2 + H2O + 2NH3

sehingga pH media menjadi basa yang akan merubah indikator phenol red
menjadi merah.