JOURNAL REVIEW

Judul Jurnal: The Effect of Turmeric (Curcuma longa) Extract on the Functionality of
The Solute Carrier Protein 22 A4 (SLC22A4) and Interleukin-10 (IL-10) Variants
Associated with Inflammatory Bowel Disease
Mark J. McCann, Sarah Johnston, Kerri Reilly, Xuejing Men, Elaine J. Burgess, Nigel B.
Perry, Nicole C. Roy
www.mdpi.com/journal/nutrients
Latar Belakang
Inflammatory Bowel Disease (IBD) merupakan peradangan di usus dikarenakan kelainan
pada respon imun, fungsi barrier gastrointestinal, serta kemampuan mukosa untuk merespon
perubahan lingkungan.
Beberapa mekanisme yang terlibat dalam patogenesis IBD antara lain Solute Carrier Protein
22A4 (SLC22A4) dan Interleukin-10 (IL-10). SLC22A4 merupakan protein pembawa yang
tersebar di membran plasma epitelium usus. Fungsi dari protein ini adalah membawa kation
organik memasuki sel epitelium. Pada penyakit IBD gen yang mengkode SLC22A4
mengalami mutasi di exon 9 di mana cytosine digantikan oleh thymidine sehingga
menyebabkan pergantian asam amino dari Leucine (L) menjadi Phenylalanine (F) pada posisi
503 dari protein SLC22A4. Mutasi tersebut menyebabkan peningkatan aktivitas transport dari
kation organik melewai barrier epitelial usus. Hal ini diperkirakan berkontribusi dalam
patogenensis penyakit IBD.
IL-10 merupakan sitokin yang menekan respon imun setelah terjadi inflamasi. Sitokin ini
menekan aktivitas sitokin pro-inflamasi yang berlebihan. Pada penyakit IBD, IL-10
mengalami SNP pada region promotor di mana Adenin (A) digantikan oleh Guanin (G) pada
posisi 1082. Variasi ini (1082-A) telah dikaitkan dengan menurunnya transkripsi IL-10 dan
produksi sitokin.
Tujuan Utama
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek turmeric terhadap dua variasi gen yang
berperan pada patofisiologi IBD.
Metode Penelitian
1. Kultur Sel
Sel yang digunakan yaitu Flp293 dan 293TLR4. Kedua jenis sel tersebut dikultur
dalam high glucose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) yang
disuplementasi dengan 10% foetal bovine serum, 1% penStrep, dan 100 g/ ml
normocin. Tekanan selektif dipertahankan menggunakan 100 g/ml Zeocin atau 10 g/
ml Blasticidin dan 50 g/ ml Hygro Gold. Antibiotic-free medium digunakan untuk
pengujian SLC22A4 dan IL-10.

2. Kimia
Pengukuran SLC22A4 menggunakan transport buffer (methyl 14C-betaine), L-(+)ergothioneine 100nM digunakan untuk kontrol positif. Pengukuran IL-10
menggunakan ultra-pure lipopolysaccharides sebanyak 1 g/ ml untuk induksi
spesifik TLR-4, Dexamethasone digunakan sebanyak 1 M untuk kontrol positif.
Curcumin digunakan untuk mengkalibrasi analisis HPLC ekstrak turmeric dan fraksifraksinya, Etoposide digunakan sebagai kontrol positif pengukuran.
3. Persiapan ekstrak ethanol dan Fraksi Fase Terbalik dari Turmeric
10 gram turmeric diekstrak dengan 100 ml etanol selama semalam dengan digojog.
Ekstrak etanol disaring sebelum difraksinasi menggunakan 5g C18 Isolute SolidPhase Extraction (SPE) cartridge yang dikondisikan dengan 10 ml etanol, 10 ml 1:1
etanol/air, 10 ml air. Alikuot dari ekstrak (50ml) ditambahkan pada 5gr C18 melalui
rotary evaporation dengan suhu 30oC dan ditambahkan ke cartridge SPE. Kemudian
dielusi dengan 2x10ml masing-masing H2O,1:4 EtOH/ H2O, 1:1 EtOH/ H2O, 4:1
EtOH/ H2O, EtOH dan etil asetat.
Alikuot (1mL) dari ekstrak dan fraksi dikeringkan dengan suhu 20 oC di Tabung
Eppendorf dan disimpan pada suhu -200C. Sebelum pengujian, alikuot ekstrak (E) dan
fraksi 6-12 diresuspensi dalam 250L dimetil sulfoxide (DMSO) dan difortex 2 kali
selama 30 detik. Fraksi 1-6 diresuspensi dalam 250L dimetil sulfoxide (DMSO) dan
750L sterile UltraPure water dan difortex dua kali selama 30 detik.
4. Kuantifikasi kurkumin pada ekstrak dan fraksi turmerik
Kurkumin pada ekstrak dan fraksi turmerik dianalisis dengan Agilent 1200 HPLC,
dengan software EziChrom Elite. Puncak grafik kromatograf dideteksi pada panjang
gelombang 210, 254, dan 280 nm.
5. Toleransi pelarut pada sel HEK-293
Toleransi sel HEK-293 pada pelarut DMSO (0%, 0,06%, 0,13%, 0,25%, 0,50%, 1%,
dan 2%) diuji sebanyak delapan kali pada 9.103 sel/sumuran, dalam 96 sumuran kultur
jaringan. Etoposide 20M digunakan sebagai kontrol positif.
6. Ekspresi variasi gen SLC22A4 rs 1050152 dalam sel Flp-293 dan pengujian
transporter SLC22A4
Kedua jenis variasi gen (503F dan 503L) ditransfeksikan ke dalam sel Flp-293,
selanjutnya kemampuan trasnport SLC22A4 pada masing-masing variasi dilihat
berdasarkan masuknya methyl 14C-bethaine ke dalam sel dan diukur dengan Liquid
Scintillation.
7. Ekspresi variasi gen IL-10 rs 1800896 dalam sel 293TLR4 dan pengujian aktivitas
promoter IL-10
Region promotor pada Il-10 diperkuat, dan di mutasi dari G menjadi A menggunakan
GeneArt. Sel 293TLR4 ditransfeksi menggunakan pMetLUC2 reporter plasmid yang
mengandung variasi IL-10-1082A dan pSEAP2 untuk menormalisasi transfeksi.
Setiap variasi IL-10, 1,5.105 ditransfeksi dengan masing-masing pMetLUC2-IL-10
(GCC) atau pMetLUC2-IL-10(IBD-assc-ACC) dan pSEAP2 dalam opti-MEM

sebelum ditumbuhkan dalam kultur jaringan 96 sumuran. Selanjutnya diinkubasi pada

suhu 370C dengan 5% CO2 dalam atmosfer yang telah dilembabkan selama 24
jam.Setiap medium pada masing-masing sumuran diganti dengan hanya
medium(kontrol negatif) atau larutan uji (dalam medium). Transkripsi IL-10
diinduksi dengan 1g/mL LPS dan diinkubasi 37 0C dengan 5% CO2 dalam atmosfer
yang telah dilembabkan selama 2 jam. Setelah itu 2 alikuot 50L dari setiap sampel
dipisahkan dalam wadah 96 sumuran. Luciferase diukur pada 1 set sampel, sedangkan
satu set sampel yang lain diukur alkaline fosfatase yang disekresi.
8. Analisis statistik
Signifikansi data dianalisis menggunakan one-way ANOVA, sebaran data dianalisis
dengan Shapiro-Wilk dan kesetraan variansi diukur menggunakan Leven Median test.
Distribusi data yang tidak normal diurutkan dan dianalisis menggunakan KruskalWallis ANOVA. Selain menggunakan ANOVA signifikansi juga diukur menggunakan
Dunnetts post-hoc test. P-value<0,05 dianggap terdapat perbedaan yang signifikan.
Hasil
1. Kandungan Curcumin pada Ekstrak dan Fraksi Turmeric
Hasil analisis HPLC menunjukkan konsentrasi Curcumin yang efektif terdapat pada
fraksi 7 dan 8, yaitu dilarutkan dalam EtOH/H2O 4:1.

2. Toleransi Pelarut dari Sel HEK293

Toleransi pelarut DMSO yang paling efektif dalam pengujian yaitu pada konsentrasi
0,25%, memberikan kontribusi 0,05-1% pada aktivitas metabolik sel HEK293 yang
diukur menggunakan pengujian WST-1.
3. Turmeric menurunkan transport abnormal dari variasi SLC22A4 pada IBD

a. Fraksi turmeric 1,3,4,7,dan 10 pada DF 100 dan fraksi 7,8, 10 pada DF 250
signifikan menurunkan transport 14C- betaine.
b. Pada fraksi 1 (DF 100 dan DF 250) menurunkan transport 14C- betaine dengan
jumlah yang sama bila dibandingkan dengan UNT (tidak diberi intervensi),
padahal memiliki konsentrasi curcumin yang berbeda.
c. Pada figur 1, konsentrasi curcumin pada F7 dan F8 yang tinggi ternyata
memiliki aktivitas yang tidak berbeda jauh dari fraksi 1, 3, 4 walaupun pada
fraksi 1, 3, 4 pada figure 1 tidak terdeteksi konsentrasi curcumin.
d. Data menunjukan bahwa berkurangnya fungsi transport dari varian 503F tidak
berkaitan dengan konsentrasi curcumin terutama ditandai dengan adanya
pengurangan fungsi transport pada fraksi yang konsentrasi curcuminnya tidak
terdeteksi.
4. Turmeric meningkatkan Fungsi Promoter Varian IL-10 berhubungan dengan IBD

a. Pada Figure 3, fraksi 7 dan 8 efektif meningkatkan transkripsi dari variasi IL-101082A jika dibandingkan dengan ekstrak dan fraksi Turmeric yang lain
b. Pada DF 100, fraksi 8 lebih signifikan meningkatkan transkripsi daripada fraksi 7,
pada DF 1000 dan DF 10000 fraksi 7 lebih aktif meningkatkan transkripsi
daripada fraksi 8.

c. Terdapat hubungan yang kuat antara konsentrasi curcumin pada turmeric terhadap
kapasitas untuk meningkatkan transkripsi pada variasi IL-10-1082A.
Diskusi dan Kesimpulan
Penelitian ini menunjukkan bahwa curcumin dalam turmeric dapat memberikan manfaat pada
penyakit IBD yang berkaitan dengan variasi 2 gen spesifik yaitu SLC22A4 dan IL-10.
Curcumin dapat memberikan efek terhadap SLC22A4, yaitu menurunkan fungsi transport .
Dengan menurunkan fungsi transport pada SLC22A4 yang mengalami mutasi, kation-kation
organik seperti antigen dapat dihambat untuk memasuki sel epitelium usus. Akan tetapi hasil
penelitian menunjukkan bahwa penurunan fungsi transport tidak berkaitan dengan
konsentrasi curcumin. Hal ini menggambarkan bahwa terdapat komponen lain dalam
turmeric selain curcumin yang dapat menurunkan fungsi transport SLC22A4.
Mutasi pada gen IL-10 mengakibatkan turunnya transkripsi dan konsentrasi sitokin anti
inflamasi sehingga menjadi salah satu faktor yang memperparah IBD. Curcumin dapat
meningkatkan transkripsi IL-10 yang mengalami mutasi. Peningkatan transkripsi IL-10 yang
mengalami mutasi berhubungan dengan konsentrasi curcumin. Akan tetapi pada penelitian
ini, hanya melihat tingkat transkripsi sehingga tidak diketahui mekanisme pada level gen
keseluruhan maupun level protein.