MODUL 3

Isolasi DNA Kromosom

3.1

Tujuan
Memahami metode isolasi DNA kromosom dari sel prokariot berupa

bakteri Gram negatifmenggunakan GeneJETrM Genomic DNA Purification

3.2

Kit.

Prinsip
Sel bakteri Gram negatif dipecahkan menggunakan Proteinase

dan

Digestion Solution atau Lysis Solution RNA a@bggkg" dengan penambatran

buaihvo

glr\mno

trnF-FrJ drhrlongKen

kolom
9919!, lalu dituangkan.ke
tel Pult{lko ii$alam
1
iG[elonol
pada membran silika. Kolom dicuci
terikat
DNA
molekul
purifikasi, sehingga
KNase

A. Lisat dicampurkan dengan

kontaminan. DNA kromosom dielusi dari

W"tl,
wffuyrA+membuang
-----.-leqdur

dengan

dr opo ). bu11er NYa opq

membran

?,

silika pada kondisi kekuatan ionik yang rendah menggunakan Elution

Btffer.

33

Teori
DNA adalah

asam

nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perke,lnbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada

ryLbs, T{glgdttq dan kloroplas. Perbedaan diantara

ketiganya' adatatr: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat
dengan

protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk

sirkular dan tidak berasosiasi derigan protein histon. Selain itu, DNA

mitokondria

dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanva mewariskan sifat-sifu

dari garis ibg. Hal ini sangat berbeda dengan

DNA nukleus

yang

memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan

dan memiliki protein histon

DNA eukariot berbentuk linear

(Klug & Cummings 1994:. 31!316; Raven &

Johnson 2002:94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang

komponen-komponennya,

yaitu gula pentosa (deoksiribosa),

pasangan basa. Pasangan basa pada

dan

antiparalel dengan

pirimidin. 'Basa purin terdiri

gugus

fosfat, dan

DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin

atas adenin

(A) dan guanin (G) yang memiliki

struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin

terdiri atas sitosin (C) dan timin

(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan

Sitosin,

**1

akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin

berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen penrbangun (building block) DNA terdiri atas satu rylaJentelgr. satu

ryglrr

3:3,

dan satu pasang basa yang disebut nukleotida

(kwis 2003: 176-

178).

Sebuah sel memiliki

DNA yang merupakan materi

genetik dan bersifat

herediter pada seltruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap m-ateri

genetik (DNA) yang

dimiliki

suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. (Human Genome Project 2005: 1). DNA kromosom dari sel eukariotik

berukuran sangat panjang sehingga akan memiliki viskositas yang tinggr hila

berada pada larutan air. Karena sifat kromosom

proses ekstraksi perlu

pengocokan (Wink,

DNA

dapat

DNA yang rentan, maka

selama

dihindari penggunaan pipet tip berukuran sangat kecil serta

20ll).
diisolasi dari jaringan hidup, sel, partikel virus, atau sampel

lain. DNA adalah suafu asam nukleat yang larut dalam air, terpresipitasi sebagai

makromolekul dalam campuran alkohol dan air. Isolasi DNA dibagi menjadi 2
tahap yaitu desintegrasi sel dari dinding sel, serta ekstraksi fasa air menggunakan

fenol/kloroform atau agen ekstraksi hidrofobik lainnya (Wink, 2Ol1). Isolasi

DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat
dilakukan baik dengan cara mekanis seperti ynikasi, tekanan tinggr, beku-leleh
maupun den$an
adalah

cag@R

@?

f7n"rti

pemberian lisozim. langkah berikutnya

lisis sel. Batran-bahan sel yang relatif lunak

dapat dengan mudah

diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang

lebih kasar perlu diperlalarkan dengan deterjen yang kuat seperti
dengan sodium dodesil

riton X-100

atau

sulfat (SDS).

Pada eukariot langkah

ini

harus disertai dengan penrsakan membran

nukleus. Setelah sel mengalami lisis, rernukan-remukan sel harus dibuang.

Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang
tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform

untuk

"-ra*;,'3.*tugasi

dan

u,n"l"Llff

r**

eirzimatis dengair

proteinase.'DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih
tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan

DNA dari RNA. Molekul . DNA yang telah diisolasi tersebut

t0

kernucliarr

dimumikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau

dengan

sentrifugasi kerapatan menggunakan CaClz.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA

senomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di
kedua macilm molekul

antara

DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua

pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang
sangat kuat atau dikatakan mernpunyai bentuk covalently closed.

circular (CCC),

sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya

elan

mempunyai:Eishh-atkg'ra, yang sangat tinggr. Perbedaan tersebut menyebabkan

DNA plasmid jauh feUitr tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan

DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat
memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap

zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi

etidium bromid,

di

sela-sela basa

molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit
daripada jumlah yang diserap oteh DNA kromosom per satuan panjangtya.

Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan

kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan

DNA

plasmid

sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan-

Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan

dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan,

dan presipitasi. Tahap

purifikasi,

pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin

digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding" {an

t1

membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA

sel

ini

semua

mempunyaii membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang

membentuk penghalang mernisahkan

terdapat didalam suatu

dilakukan pernecahan
mechanical

isi sel dari lingkungan

ekstraseluler. DNA

sel sehingga untuk mengisolasi suatu DNA,

harus

sel secara fisik yurg diantaranya yaitu seperti

destruption,

liquid

homozigation, sonifikasi,

freeze

dan

marual grinding.
Disintegration of

eukaryotlc washing
(ethanol' salt)
celts

bacterlal or

,""-#Q

elution
(Hzo)

tr

1/
-S

r-C

{v
o zol I wilsvcr, wqmcm

wink - lir'oLiuLr SiotrchnoloEf

ISBN:978-l-527-326!7-2 Fit.09{3

Gambar

l. Skema Purifikasi DNA

dari

prokariot

atau

eukariot menggunakan kolom afinitas (Wink,

20tr).
nrcV
{olQ Pertuub'

tz-,6 JoM

-)
3.4

Bahan

1. Biakan bakteri E. coli Top 10 vans bnmur 18'24 jam.

@lupTrohrothon. 7 klonrg l<rn tlh dttvtut<''.tr

(Bt"sd.

# Jiilqil"
tTt vq
Til;ffi
beror ulsol Plq(l

2.

Medium Luria Bertani (LB) cair

3.

tcloramfenikol 100 pglml. dalam medium LB cair.'

4.

GeneJETrM Genomic DNA Purification Kit (Fermentas Life Science)

Proteinase

K Solution, RNase A

t2

'

-'

'

Solution, Digestion Solution, .Lysis

ffirI

Solution,

Wash Buffer

I,

Wash Bu/fer II,

Elution Buffer (10 mM TrisCl,

pH 9,0, 0,5 mM EDTA), GeneJETY Genomic

DNA Purification

Column dan tabuogkolektor 2mL-

' 5. Etanol50%
3.5

Alat

. Tabung Eppendorf 1,5 rnl-. QO

t 2. Mikrosentin g" O
l 3. Mikropipet 10G1000pL, 50-200pldan

.r

Q,.

Tip mikropipet biru dan kuning. @

'{ 5. Irmari es I buahdan freezer -25"C.

6.

Waterbaith. @

JM
' 8. Inkubator. @
J g. Sanurg tangan. O
v

10.

Bealcer glass.

.r 11. Pengocok

.5Pr

ntu

otbitat. (9

,,r-+2l}ursg
{ 13. Vortex. @

3.6

Periiapan

l.

PenyiaPan Pereaksi

13

10-l00pl.

(D

Etanol (96-100%) ditambahkan ke dalam Wash Buffer

Buffer

II

dan Wash

denganPerbandingan 3 : 1'

. Sebelum digunakan, Digest Solution, Lysis solution

Neutralization solution diperiksa

dati

untuk mengetahui adanya

pengendapangaram.Endapanyangterbentukdapatdilarutkan

kembali dengan memanaskan larutan pada suhu 37oc, lalu

didinginkan Pada suhu 25oC'
o Penangan

an Lysis solution

dan wash

Buffer,I harus menggunakan

sanrng tangan, karena keduanya mengandung zat pengiritasi'

2.

Penyiapan SusPensi Bakteri

o sebanyak 1

koloni bakteri E. coliTop

1O

diambil dari plate biakan

berumur l8-24jam, lalu diinokulasikan ke dalam 5 mL medium

LB yang telah ditambahkan antibiotik kloramfenikol 100 pdmL

(untuk 2

kelompok). Biakan diinkubasi selama 12-16 jam pada

suhu 37"C dengan pengookan 2oo-25} rpm. untuk hasil

4 kali
maksimal, volume labu Erlenmeyer yang digunakan minimal
volume biakan.

.Sebanyak 1,5

mL

biakan bakteri dimasukkan'dalam tabung

Eppendorfl,5mL,disentrifugasipadakecepatan6.000rpm(5.000
xg)selama5menit,lalusupematannyadibuang.Sebanyakl,0mL
biakan bakteri ditambahkan ke dalam pelet bakteri, disentrifugasi

pada kecepatan 6.000 qpm (5'000

suPernatannYa dibuang.

t4

x g) selama 5 menit' lalu

o Pelet

bakteri ditambahkan 1,0 mL aquabidest, disentrifugasi pada

kecepatan 8.000 rpm (5.000

x g) selama 5

menit,

lalu

2
supernatannya dibuang. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak

kali.
3.7

Prosedur

l.

Pelet sel bakteri diresuspensi dalam 90 pL Digestion Solution, laht

ditarnbahkan 10 pL Proteinase

K.

Campuran dikocok menggunakan

vortex atau melalui pernipetan berulang untuk

menglrasilkan

suspe,nsi yang homogen.

2.

atau
Suspensi diinkubasi pada suhu 56"C sambil sesekali divortex

dimasukkan dalam shaking

water bath sarryai sel lisis

secara

sempuma (kira-kira 30 menit).

3.

Sebanyak 10

pL

KNaseA Solution ditambahkan ke dalam suspensi,

lalu dikocok menggunakan vortex. Campuran diinkubasi selama

10

menitpada suhuruang.
4.

Sebanyak 100

pL

Lysis Solution dTtambahkan ke dalam campuran,

lalu dikocok menggunakan vortex selama 15 detik hingga diperoleh

campuran yang homogen.
5.

laiu
Sebanyak 2OA pL etanol 50% ditambatrkan ke dalam campuran,

dikocok menggunakan vortex atau melalui pemipetan berulang.

6.

Lisat dituangkan ke GeneJETrM Genomic DNA Purification Colunn

dalam tabung kolektor (2 kelompok). Kolom disentrifugasi selama

menit pada kecepatan 7.000 rpm (6.000

l5

x g)'

Supernatan dalam

tabung kolektor dibuang. Kolom dimasukkan kembali ke dalam

tabung
7.

kolektor

Sebanyak 500

yang sama.

pl

wash Buffer

ditambahkan ke dalam kolom, lalu

disentrifugasi selama I menit pada kecepatan 9.400 rpm (8000 x g)'

Supernatan dalam tabung kolektor dibuang lalu kolom purifikasi
ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama.

Sebanyak

500 pl

Wash

Buffer

II

(dengan penambahan etanol)

ditambahkan ke dalam kolom, lalu disentrifugasi selama 3 menit

pada

kecepatan 14.000 rpm (12.000 x g). Jika larutan residu masih

terlihat dalam kolom purifikasi, maka tabung kolektor dikosongkan

dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama I

menit. Supernatan pada tabung kolektor dibuang dan kolom

dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL baru9.

Sebanyak 200 pL Elution Buffer ditarlbahkan

membran kolom plasmid

diinkubasi selama 2 menit pada suhu

sebanyak

tengah

(tip mikropipet tidak boleh menyentuh

membran kolom). untuk mengelusi

kecepatan 9.400 rpn (8000

ke bagian

DNA kromosom- Kolom

frffi8, lalu disentrifugasi

pada

x g) selama I menit. Tahap ini dilalorkan

2kali.

Catatan:

Jika diperlukan konsenhasi DNA yang lebih pekat atau DNA

diisolasi dari sampel yang jumlahnya sedikit, maka volume Elution

16

Buffer dapat'dihnangi menjadi 50-100 pL. Semakin sedikit volume

Elution Buffer,semakin sedikit pula kadar DNA yang terelusi.

10. Kolom putifitasi

dilepaskan dari tabung Eppendorf. DNA mumi

dapat langsurydigunakan atau disimpan pada suhu -20"C-

17