DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE

AMINOCIDOS, PPTIDOS Y
PROTENAS
Por: Andrs Felipe Lugo Vargas
Curso de profundizacin: Qumica de alimentos
Universidad de la Amazona
Florencia-Caquet
Septiembre de 2015

Aminocido
s Libres

Grupos:
Amino
carboxilo
son capaces de reaccionar
qumicamente con otras
molculas
orgnicas.

Protenas

Grupos R

Sulfhidrilo
Fenlico
Hidroxilo
Tioter
Imidazol
Guanidino

eacciones qumicas de los grupos funcionales de las protenas

Reaccin con Ninhidrina:
Se utiliza a menudo para cuantificar aminocidos libres, pptidos y protenas.
El aminocido reacciona con un exceso de ninhidrina, que le causa una desaminacin oxidativa y
la produccin de amoniaco.

producto color prpura

conocido como morado de
Ruhemanns

 Morado de Ruhemanns: absorbancia mxima a 570 nm

La prolina y la hidroxiprolina dan un producto amarillo que tiene una absorbancia mxima
a 440 nm

Estas reacciones coloridas son la base para las detecciones en cromatografa en papel y de
capa fina (TLC), as como para la determinacin colorimtrica de aminocidos que se utiliza
en los analizadores de aminocidos para lo cual la protena se hidroliza primero hasta
aminocidos libres. Los aminocidos libres son separados utilizando cromatografa de
intercambio inico/hidrofbica.

 Reaccin con fluorescamina:

Los aminocidos, pptidos y protenas que contienen aminas primarias producen, con
fluorescamina, un derivado altamente fluorescente con una mxima emisin a 475 nm cuando la
excitacin se hace a 390 nm
Este mtodo se puede utilizar para cuantificar
aminocidos, protenas y pptidos.
Mtodo muy sensible
Mtodo no destructivo

 Reaccin con Orto-ftalaldehdo

La reaccin de aminocidos con O-ftalaldehdo (1,2-benzeno dicarbonal) en la presencia de 2mercaptoetanol
produce un derivado fluorescente que tiene una excitacin mxima a 380 nm y una emisin de
fluorescencia mxima a 450 nm

Mtodo con alta sensibilidad: puede cuantificar aminocidos a niveles de picomoles (10 -12 mol).

Anlisis de los aminocidos de las protenas

Paso previo al anlisis:

Hidrlisis de la protena: tanto cida como bsica a condiciones drsticas
Hidrlisis cida: se somete la protena a una temperatura de 120C, con HCl 6N durante 10-24
horas.
El inconveniente que presenta la hidrlisis cida es que el Trp se destruye completamente, en
menor medida se destruyen Ser y Thr. Por otro lado Asn se desamida generando Asp. No se
presenta racemizacin excepto por el caso de la L-Cys.
Hidrlisis bsica: se lleva a cabo con NaOH a temperatura de ebullicin. No se destruye el Trp,
sin embargo se presenta racemizacin de la mayora de aminocidos y la destruccin de un
porcentaje de Cys, cistina, Ser, Thr, Asn, Gln y Lys.
Hidrlisis enzimtica: Evita las reacciones de degradacin de los aminocidos, sin embargo
este mtodo tambin presenta inconvenientes porque a veces es difcil lograr una hidrlisis
completa y las mismas enzimas deben eliminarse antes del anlisis.

Separacin de los aminocidos correspondientes:

Columnas de intercambio catinico: La resina mas utilizada es la de poliestireno sulfonado.
Este tipo de resina separa los aminocidos de dos modos: sus cargas negativas dejan pasar los
aminocidos cidos y retienen los bsicos.
La naturaleza hidrofbica del mismo poliestireno tiende a retener los aminocidos hidrofbicos
como la leucina y la fenilalanina.
HPLC: lleva a cabo la separacin cromatogrfica de los aminocidos y su cuantificacin.
Mtodo rpido y de alta resolucin.
Los aminocidos que salen de la columna se detectan con cualquiera de los tres reactivos
(Ninhidrina, fluorescamina y Orto-ftalaldehdo)
Microelectroforesis y deteccin de fluorescencia: Su sensibilidad est en el orden de atomoles
(amol, o 10-18 mol).

Cuantificacin de protenas
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas, todos ellos basados en alguna de
sus
propiedades tpicas, como puede ser la absorbancia de los grupos aromticos a 280 nm, la
reactividad
del enlace peptdico
o el contenido de nitrgeno total.
Absorbancia
a 280 nm:
Las protenas purificadas son fcilmente detectadas y cuantificadas por sus propiedades de
absorbancia
en UV a 280 nm.
La absorbancia depende del nmero y posicin de sus residuos de aminocidos aromticos
Phe (274.5 nm), Tyr (278 nm), y Trp (260 nm) y puentes disulfuro entre los residuos de Cys.
La absorbancia de una protena puede aumentar cuando se despliega, ya que expone sitios
aromticos que en condiciones normales no absorberan a 280 nm.
El desplegamiento hace posible calcular el coeficiente de absorcin molar si se conoce el
nmero de puentes disulfuro y el contenido de aminocidos aromticos, a su vez el
coeficiente de absorcin molar permite calcular la concentracin de protena.

Se usa usualmente como patrn la Albmina Srica Bovina (BSA), que es soluble en agua, para
construir curvas patrn que sirvan de referencia para cuantificar otras protenas, que sern ms
precisas mientras la protena en cuestin se parezca ms a la BSA.

Ventajas:
ste es el mtodo ms rpido, requiere de muy poca cantidad de protena y no se afecta por la
presencia de sulfato de amonio.
La muestra no se destruye y puede ser usada en otros anlisis.

Desventajas:
Tiene la limitante de que los cidos nucleicos absorben a 260 nm, por lo que si se conoce la
relacin de absorcin de la protena a 280/260 nm es fcil distinguir la interferencia de cidos
nucleicos.

La reaccin de Biuret:
Es especfica para la medicin del enlace peptdico, por lo que slo se recomienda para la
cuantificacin de protenas, mas no de hidrolizados, a menos que se conozcan los tamaos
moleculares y se adapte la protena estndar de la curva.
Se utiliza una solucin diluida de sulfato cprico en tartrato fuertemente alcalino, sta se
adiciona a la solucin de protena, resultando un compuesto de color entre prpura y violeta
que absorbe a 540 nm, obtenido probablemente por el acomplejamiento del Cu +2 con dos
enlaces peptdidos adyacentes.

Se llevan a cabo varias reacciones en condiciones alcalinas y el in cprico (Cu +2) tiende a oxidar
la cadena peptdica reducindose a Cu+.
Desventajas:
Dado que el grupo -NH del enlace peptdico est involucrado en la reaccin, los residuos de Pro no
participan y las protenas con alto contenido de la misma, producen respuestas bajas.
La tcnica de biuret tiene baja sensibilidad, pues se requiere de 20-40 mg de protena para una
adecuada deteccin y existen varios pigmentos que absorben a 540 nm, longitud de onda de la
medicin.
La presencia de NH4+ interfiere as mismo con la reaccin. El desarrollo de colores diferente para
cada protena, y los lpidos e hidratos de carbono interfieren al formar complejos con el in
coordinado.

Mtodo de kjeldahl para determinacin de N total:

Es el ms utilizado, e incluso se toma como referencia cuando se usan otras tcnicas. El mtodo
no hace distincin entre el N que proviene de protenas (de grupos amino y amida) y el no
protenico (urea, aminocidos), lo que da lugar a errores en clculo.
El mtodo consiste en la digestin de la muestra con H 2SO4 y la formacin de NH4OH que es
recibido en cido para ser titulado con un lcali de concentracin conocida. Los compuestos
nitrogenados no protenicos que causan una sobreestimacin de la tcnica son: glutatin,
carnitina, carnosina, dopamina, urea, ornitina, colina y cido aminobutrico.
Para reducir el error se deben aplicar factores de conversin especficos para cada protena
teniendo en cuenta el porcentaje de nitrgeno que poseen las protena. Se calculan al dividir 100
entre el porcentaje de N particular de la protena en cuestin.

El factor que se aplica sin discriminacin es 6.25 resultante de una generalizacin del
contenido de N de las protenas de 16%, por lo que su factor de conversin ser la 100/16 =
6.25.

Desventajas:

Puede haber prdidas de nitrgeno debido a la temperatura de digestin y al tipo de

catalizador utilizado.
Debe considerarse el N no-protenico medido junto con el protenico.
El proceso es largo y se utilizan reactivos y condiciones un tanto peligrosas.

 Mtodos de tincin de protenas:

R250
Azul brillante de Coomassie
G250

Tincin con nitrato de plata

Se utiliza principalmente para la tincin de protenas en

geles, esto hace que las protenas queden fijas e
insolubles
en
el
gel.
Es
posible
detectar
aproximadamente 0.1 mg de protena en geles de
poliacrilamida.
Se utiliza para cuantificar protenas en solucin ya que el
complejo cambia sus propiedades de absorbancia: en
condiciones cidas su absorbancia mxima va de 465 a
595 nm.

El ms sensible de los reactivos para teir protenas

fijadas en un gel es la tincin de plata, el cual puede
detectar menos que un nanogramo (10-9 g) de protena.

 Electroforesis:
ste es el mtodo analtico ms ampliamente usado para la separacin de protenas y es muy
til para el anlisis de proteomas.
Cuando las protenas se someten a un campo elctrico pueden migrar hacia el polo de carga
contraria a su carga neta a un pH determinado, por un fenmeno conocido como electroforesis.
La protena se desplaza hacia el ctodo o el nodo, dependiendo del balance global de grupos
positivos y negativos a un pH determinado.
Pueden realizarse electroforesis en condiciones nativas en las que las protenas migran
conservando su diversidad y propiedades fsicas, especialmente su punto isoelctrico y peso
molecular. Tambin puede llevarse a cabo en condiciones denaturalizantes si se utilizan tiolreductores fuertes como mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT) y un detergente desnaturalizante
fuerte: el dodecil sulfato de sodio (SDS)
Es posible utilizarla en una sola dimensin o en dos dimensiones (2D). Se les denomina 1D o 2DPAGE (por sus siglas en ingls, Electroforesis en Gel de Poliacrilamida).

SDS-PAGE (1D)

SDS-PAGE (2D)