Proteina Lac Represor

n genetic, un operon este o unitate de funcionare a ADN genomic care con ine un
grup de gene (cistroni) sub controlul unui promotor unic. Genele sunt transcrise mpreun
ntr-o caten ARNm i sunt fie traduse mpreun n citoplasm, fie supuse unui proces de
trans-splicing pentru a crea molecule de ARNm monocistronic care sunt traduse separat, adic
mai multe catene de ARNm care codific fiecare un produs al unei singure gene. Rezultatul
acestui fapt este c genele coninute n operon sunt fie exprimate mpreun, fie deloc. Mai
multe gene trebuie co-transcrise pentru a defini un operon.
Iniial, se credea c operonii exist numai n procariote, dar de la descoperirea primilor
operoni la eucariote la nceputul anilor 1990, au aprut mai multe dovezi care sugereaz c
sunt mult mai frecveni decat a fost estimat anterior. n general, expresia operonilor la
procariote conduce la generarea de ARNm policistronic, n timp ce la eucariote duce la
ARNm monocistronic.
Un operon este format din mai multe gene structurale avnd un promotor comun i
reglate de ctre un operator comun. Este definit ca un set de gene structurale adiacente, plus
semnalele reglatoare adiacente care afecteaz transcrierea genelor structurale. Reglatorii unui
operon dat, inclusiv represorii, co-represorii i activatorii, nu sunt neaprat codificai de acel
operon.
Un operon este alctuit din 3 componente ADN de baz:
- Promotor - o secven de nucleotide care permite ca o gen s fie transcris.
Promotorul este recunoscut de ctre ARN polimeraz, care apoi iniiaz transcripia. n sinteza
ARN, promotorii indic ce gene trebuie utilizate pentru crearea de ARN mesager - i, prin
extensie, controleaz ce proteine produce celula.
- Operator - un segment de ADN la care se leag un represor. Este definit clasic n
operonul lac ca un segment ntre promotor i genele operon. n cazul represorului, proteina
represoare mpiedic fizic ARN polimeraza de a transcrie genele.
- Gene structurale - gene care sunt co-reglate de operon.
Nu ntotdeauna inclus n operon, dar important n funcionarea lui este o gen
reglatoare, o gen constant exprimat care codific pentru proteinele represor. Gena
reglatoare nu este necesar s fie n, lng, sau chiar n apropierea operonului pentru a-l
controla.

Operonul lac este un operon necesar pentru transportul i metabolismul lactozei n

Escherichia coli i multe alte bacterii enterice. Dei glucoza este sursa de carbon preferat
pentru cele mai multe bacterii, operonul lac permite digestia eficient a lactozei cnd glucoza
nu este disponibil. Reglarea genelor operonului lac a fost primul mecanism de reglare
genetic neles clar, astfel c a devenit un exemplu principal de reglare a genelor la
procariote.
Operonii bacterieni sunt transcripii policistronici care sunt capabili s produc mai
multe proteine dintr-un ARN transcript. n acest caz, atunci cnd lactoza este necesar ca o
surs de zaharide pentru bacterii, cele trei gene ale operonului lac pot fi exprimate i ulterior
traduse la proteinele lor: lacZ, lacY i lacA. Produsul genei lacZ este -galactozidaza care
scindeaz lactoza, un dizaharid, n glucoz i galactoz. LacY codific lactozo-permeaza, o
protein care se incorporeaz n membrana citoplasmatic pentru a permite transportul de
lactoz n celul. n cele din urm, lacA codific galactozid O-acetiltransferaza.

Ar fi inutil s se produc aceste enzime atunci cnd nu exist o lactoz disponibil sau
dac exist o surs de energie disponibil mai preferabil, cum ar fi glucoza. Operonul lac
folosete un mecanism de control dual pentru a se asigura c celula consum energie pentru a
produce enzimele codificate de operonul lac numai atunci cnd este necesar.
n absena lactozei, represorul lac oprete producia enzimelor codificate de operonul
lac. n prezena glucozei, proteina activatoare de catabolii (CAP), necesar pentru producia
de enzime, rmne inactiv, iar EIIAGlc blocheaz lactozo-permeaza pentru a preveni
transportul de lactoz n celul. Acest mecanism dublu de control determin utilizarea
secvenial a glucozei i a lactozei n dou faze distincte de cretere, cunoscut sub numele de
diauxie.

Structur: Operonul lac este alctuit din trei gene structurale, un promotor, un
terminator, un reglator i un operator. Cele trei gene structurale sunt: lacZ, lacY i lacA.
- lacZ codific -galactozidaza (LacZ), o enzim intracelular care cliveaz
dizaharidul lactoza n glucoz i galactoz.

- lacY codific lactozo- permeaza (LacY), un simport transmembranar care pompeaz

-galactozide n celul utiliznd un gradient de protoni n aceeai direcie.
- lacA codific galactozid O-acetiltransferaza (LacA), o enzim care transfer o
grupare acetil de la acetil-CoA la -galactozide.
Doar lacZ i lacY par a fi necesare pentru catabolismul lactozei.
Reglare: Controlul specific al genelor lac depinde de disponibilitatea lactozei ca
substrat pentru bacterii. Proteinele nu sunt produse de ctre bacterii cnd lactoza nu este
disponibil ca surs de carbon. Genele lac sunt organizate ntr-un operon; aceasta nseamn c
ele sunt orientate n aceeai direcie, imediat adiacente pe cromozom i sunt co-transcrise ntro singur molecul de ARNm policistronic.
Transcrierea tuturor genelor ncepe cu legarea ARN polimerazei (RNAP), o protein de
legare de ADN, care se leag la un situs specific de legare ADN, promotorul, situat imediat n

amonte de gene. Legarea ARN polimerazei de promotor este ajutat de proteina legat de
cAMP activatoare de catabolii (CAP, de asemenea cunoscut sub numele de proteina receptor
de cAMP). Cu toate acestea, gena lacI (gena reglatoare pentru operonul lac) produce o
protein care blocheaz RNAP s se lege de promotorul operonului. Aceast protein poate fi
ndeprtat doar atunci cnd allolactoza se leag de ea, i-l inactiveaz Proteina care se
formeaz prin transcrierea genei IacI este cunoscut ca represorul lac.
Tipul de reglare pe care l sufer operonul lac este menionat ca fiind inductibil
negativ, ceea ce nseamn c gena este oprit de factorul de reglare (lac represorul) doar dac
nu se adaug unele molecule (lactoz). Datorit prezenei proteinei represoare lac, inginerii
genetice care nlocuiesc gena lacZ cu o alta gen vor trebui s creasc bacteriile
experimentale pe agar cu lactoz. n cazul n care nu fac acest lucru, gena pe care ncearc s
o exprime nu va fi exprimat deoarece proteina represor blocheaz RNAP de la legarea de
promotor i transcrierea genei.
Odat ce represorul este ndeprtat, RNAP trece apoi s transcrie toate trei gene
(lacZYA) n mARN. Fiecare dintre cele trei gene de pe catena ARNm are propria secven
Shine-Dalgarno, astfel nct genele sunt traduse n mod independent.
Primul mecanism de control este rspunsul reglator la lactoz, care folosete o
protein intracelular de reglare numit represorul lactozei care mpiedic producerea de galactozidaz n absena lactozei. Gena lacI care codific pentru represor se afl n apropiere
de operonul lac i este ntotdeauna exprimat (constitutiv). Dac lactoza lipsete din mediul
de cretere, represorul se leag foarte strns de o secven de ADN scurt chiar n aval de
promotor aproape de nceputul lui lacZ, numit operator lac.
Legarea represorului la operator interfereaz cu legarea RNAP la promotor, i, prin
urmare, ARNm care codific LacZ i LacY este sintetizat numai la niveluri foarte sczute.
Cnd celulele sunt crescute n prezena lactozei, totui, un metabolit al lactozei numit
allolactoz, format din lactoz prin produsul genei lacZ, se leag de represor, provocnd o
schimbare alosteric. . Lactoza este galactozo-(1->4)-glucoz, n timp ce allolactoza este
galactozo-(1->6)-glucoz. Astfel modificat, represorul este incapabil de a se lega la operator,
permind RNAP s transcrie genele lac i conducnd astfel la niveluri mai ridicate ale
proteinelor codificate.

Operonul lac: Sus:Represat, Jos:Activ.

1: ARN Polimeraza, 2: Represor, 3: Promotor, 4: Operator, 5: Lactoz, 6: lacZ, 7:
lacY, 8: lacA.
Gena este n esen dezactivat. Nu exist nici o allolactoz care s inhibe represorul
lac, astfel nct represorul leag strns operatorul, care obstrucioneaz ARN polimeraza de la
legarea de promotor, care rezult n lipsa transcripilor ARNm laczya.
Jos: Gena este activat. Allolactoza inhib represorul, permind ARN polimerazei s
se lege la promotor i s exprime genele, rezultnd n producia de LacZYA. In cele din urm,
enzimele vor digera toate lactoza, pn cnd nu mai exist nici o allolactoz care s se poat
lega la represor. Represorul va lega apoi operatorul, oprind transcrierea genelor LacZYA.
Al doilea mecanism de control este un rspuns la glucoz, care utilizeaz
homodimerul CAP pentru a crete foarte mult producia de -galactozidaz n absen a
glucozei. Adenozin monofosfatul ciclic (cAMP) este o molecul semnal a crui prevalen
este invers proporional cu cea a glucozei. Se leag la CAP, care la rndul su permite ca
CAP s se lege la situsul de legare al CAP (o secven ADN de 16 bp n amonte de promotor,
la aproximativ 60 bp n amonte de situsul de start al transcripiei), care asist RNAP n legarea
la ADN. n absena glucozei, concentraia AMPc este mare i legarea CAP-cAMP la ADN
crete semnificativ producia de -galactozidaz, permind celulei de a hidroliza lactoza i
elibera galactoz i glucoz.

Mai recent s-a demonstrat c excluziunea inductorului blocheaz exprimarea

operonului lac cnd glucoza este prezent. Glucoza este transportat n celul prin sistemul
fosfotransferazic dependent de PEP. Transportul glucozei este nsoit de fosforilarea sa de
ctre EIIBGlc, scond grupul fosfat de la alte proteine PTS, inclusiv EIIAGlc. Forma
nefosforilat de EIIAGlc se leag la permeaza lac i mpiedic aducerea lactozei n celul. Prin
urmare, dac ambele, glucoza i lactoza, sunt prezente, transportul glucozei blocheaz
transportul inductorului operonului lac.
Structura represorului: Lac represorul este un tetramer de subuniti identice, cu o
masa total de 154,52 kDa. Fiecare subunitate conine un motiv helix-turn-helix (HTH)
capabil de legare la ADN. Situsul operatorului unde se leag represorul este o secven de
ADN cu simetrie repetitiv inversat. Cele doua jumti ale situsului ADN de legare ale
6

operatorului mpreun se leag la dou dintre subunitile represorului tetrameric. De i

celelalte dou subuniti de represor nu fac nimic n acest model, aceast proprietate nu a fost
neleas muli ani.
n cele din urm s-a descoperit c mai sunt implicai doi operatori suplimentari n
reglarea lac. Unul (O3) se afl la aproximativ 92 pb n amonte de O1 la captul genei lacl, iar
cellalt (O2) este cu aproximativ 401 bp n aval de O1 n prima parte a lacZ.
Aceste dou situsuri nu au fost descoperite mai devreme, deoarece acestea au funcii
redundante i mutaiile individuale nu afecteaz represia foarte mult. Mutaii singulare fie la
O2 sau O3 au efecte numai de 2-3 ori. Cu toate acestea, importan a lor este demonstrat de
faptul c un mutant dublu defect att la O2 i O3 este dramatic derepresat(de circa 70 ori).
n modelul actual, lac represorul este legat simultan la principalul operator O1 i fie la
O2 sau O3. Dac represorul se desface de O1 temporar, legarea de un operator minor l
pstreaz n apropiere, astfel nct s poat relega rapid. Acest lucru ar crete afinitatea
represorului pentru O1.

LacI Tetrameric se leag la dou secvene operator i induce buclarea ADN. Dou
subuniti funcionale dimerice

LacI (rou+albastru i verde+portocaliu) leag fiecare o

secven de operator ADN. Aceste dou subuniti funcionale sunt cuplate n regiunea de
tetramerizare, astfel, LacI tetrameric se leag la dou secven e de operator. Aceasta permite
LacI tetrameric s induc buclarea ADN.

Mecanism: Represorul este o protein alosteric, adic poate asuma una din cele dou
forme uor diferite, care sunt n echilibru una cu cealalt. ntr-o form represorul se va lega la
ADN-ul operatorului cu nalt specificitate, iar n cealalt form a pierdut specificitatea.
Conform modelului clasic de inducie, legarea inductorului, fie allolactoz sau IPTG, la
represor, afecteaz repartizarea represorului ntre cele dou forme. Izopropil--Dtiogalactozidul (IPTG) este utilizat frecvent ca un inductor al operonului lac, fiind un analog
al lactozei. Astfel, represorul cu inductorul legat este stabilizat n conformaia care nu leag
ADN. Cu toate acestea, acest model simplu nu poate fi complet, pentru c represorul este
legat destul de stabil de ADN, dar este eliberat rapid prin adugarea de inductor. Prin urmare,
este clar c inductorul se poate lega de asemenea, la represor, atunci cnd represorul este deja
legat de ADN. Nu este nc cunoscut n ntregime mecanismul exact de legare.
Gena lac i derivaii si sunt frecvent utilizai ca gen reporter ntr-un numr de tehnici
de selecie bacteriene n care trebuie s fie determinat legarea cu succes a unui activator
transcripional la o secven specific de promotor.

Integraza
Integraza retroviral (IN) este o enzim produs de un retrovirus (cum ar fi HIV),
care permite ca materialul genetic al acestuia s fie integrat n ADN-ul celulelor infectate.
IN este o component cheie n complexul de pre-integrare retroviral (PIC).
Toate IN retrovirale din proteine conin trei domenii canonice, legate prin linkeri flexibili:
-

un domeniu N-terminal HH-CC de legare a zincului (un pachet de trei elice stabilizat

printr-o coordinare a unui cation Zn (II)) numit asa pentru motivul su zinc-finger HX37HX23-32CX2C. Domeniul HHCC este critic pentru formarea unui complex stabil cu ADN
viral, iar domeniul poate fi implicat n multimerizarea integrazei.
-

un domeniu de centru catalitic localizat ntr-un miez rezistent la proteaze, care este extrem
de conservat n retrovirusuri i elemente retrovirale. Miezul central este important pentru
cataliza zi dimerizare.

un domeniu C-terminal de legare a ADN care reprezint cea mai puin conservat regiune
pentru integrazele virale. Domeniul C-terminal este capabil de legare a ADN nespecific i se
crede c ar conine situsul pentru legarea ADN int.

O trstur caracteristic a integrrii ADN-ului retroviral este c multe situsuri de pe

ADN int pot fi folosite pentru integrare. Cu toate acestea, frecvena i distribuia integrrii
nu sunt ntmpltoare, i exist puncte fierbini i reci ale integrrii asupra ADN int.
Integrarea survine dup producerea de ADN dublu catenar viral de ctre revers
transcriptaza ADN polimeraza ARN/ADN dependent viral.
Funcia principal a IN este de a introduce ADN-ul viral n ADN-ul cromozomial
gazd, un pas care este esenial pentru replicarea HIV. Integrarea este un punct fr ntoarcere
pentru celul, care devine un purttor permanent al genomului viral (provirus). Integrarea este
n parte responsabil pentru persistena infeciilor retrovirale. Dup integrare, expresia genelor
i producia particulelor virale poate avea loc imediat sau la un moment dat n viitor.
Momentul, se presupune, depinde de activitatea locusului cromozomal care gzduiete
provirusul.
IN retrovirale catalizeaz dou reacii:
-

procesarea 3', n care dou sau trei nucleotide sunt ndeprtate din una sau ambele capete 3
'ale ADN-ului viral pentru a expune dinucleotidele CA invariante la ambele capete 3' ale
ADN-ului viral.

reacia de transfer a lanului, n care capetele prelucrate 3' ale ADN-ului viral sunt covalent
legate la ADN-ul cromozomial al gazdei.
Ambele reacii sunt catalizate de ctre acelai centru activ i se efectueaz prin
transesterificare, fr un intermediar covalent protein-ADN, n contrast cu reac iile catalizate
de Ser i Tyr recombinaze.
Integraza HIV este o protein de 32 kDa produs din poriunea C-terminal a
produsului genei Pol i este o int atractiv pentru noi medicamente anti-HIV.

Structura complet a HIV-integrazei cu aminoacizii catalitici prezentai n form de bile i

filamente

Izolarea i purificarea proteinelor

Un vector de expresie, cunoscut i sub numele de construct de expresie, este de obicei
o plasmid sau virus proiectat pentru exprimarea proteinelor n celulele. Vectorul este utilizat
pentru a introduce o anumit gen ntr-o celul int, i poate fora mecanismul celulei de
sintez a proteinelor pentru a produce proteina codificat de gen. Plasmida este proiectat s
conin secvene care acioneaz ca regiuni reglatoare i promotor i conduc la transcripia
eficient a genei transportate pe vectorul de expresie. Scopul unui vector de expresie bine
conceput este producerea de cantiti semnificative de ARN mesager stabil, i, prin urmare
proteine
Alegerea vectorului de expresie
Vectorii de expresie conin:
- un promotor la care se leag ARN-polimeraza pentru a ncepe transcrierea
- operatorul
- situsul de legare a ribozomilor
- situsul de clonare
- originea de replicare
- gena de selecie care d rezisten la un antibiotic (de exemplu la ampicilin)
De cele mai multe ori vectorul conine i o secven de mrime cunoscut
tag - care va simplifica foarte mult izolarea, purificarea i detectarea proteinelor de interes.
Proteinele obinute prin acest proces sunt numite proteine de fuziune.
Clonarea genelor de interes n vectori de expresie si punerea lor sub controlul unui
promotor puternic permite producerea proteinelor codificate de aceste gene n gazde precum
Escherichia coli. Prin alegerea unui promotor a carei activitate este cunoscut i u or de indus
apare un avantaj foarte mare: sinteza proteinei poate fi ordonat la momente de timp strict
controlate si de asemenea, cantitatea de proteina obinut poate fi extrem de mare comparativ
cu gazda nativ.
Promotorul T7. Polimeraza ADN-dependent de ARN a bacteriofagului T7 (T7
RNAP) este tot mai mult utilizat pentru a exprima o gam larg de proteine din gazde
bacteriene. In acest sistem, genele int sunt clonate n aval de promotorul T7 bacteriofag pe
un nr mediu de copii de plasmide. Deoarece gena int nu utilizeaz polimeraza gazdei,
expresia bazal de produse genetice toxice nu poate avea loc n absena T7.

10

RNAP pot fi furnizate prin ncorporarea genei T7 RNAP n genomul tulpinii gazd (de
exemplu, E. coli BL21). Expresia T7 RNAP n aceast tulpin este de la promotorul lacUV5IPTG inductibil.
Cu toate acestea, utilizarea unui promotor bazat pe lac duce la prezena unei
expresii de baz n absena inducerii (de care ne-am folosit pentru obinerea i izolarea
lacR cu activitate de legare ADN, fr inducie cu IPTG s-ar fi legat de el i l-ar fi
inactivat, i fr HisTag, dat fiind ca Histidinele constitutive ale lacR sunt astfel orientate
in spaiu nct au afinitate pentru coloana cu Ni)
Promotorul tac. Acesta este un promotor puternic, obinut prin fuzionarea regiunii -35
de la promotorul operonului responsabil de calea de sintez a triptofanului cu regiunea -10 de
la operonul lac 5. Este capabil s induc expresia genei int ntr-o asemenea masur nct
aceasta se acumuleaz n proporie de 20-30% din proteinele totale. Vectorii de expresie care
au acest promotor poart de asemenea i gena lacO si lacI. Acestea sunt necesare deoarece n
lipsa lor ar avea loc expresia genei de interes n lipsa inductorului, numrul de molecule de
represor produse de copia cromozomial a genei lacI nefiind suficiente pentru a represa
numarul mare de promotori existeni datorit plasmidelor.

Promotor T7
Operator lac
GenaT7 10 Situs de legare al ribozomilor
His-tag
Polylinker
Promotor SP6
Terminatorul transcrierii T7
Gena LacI
Gena -Lactamaz (care confera rezistena la Amp)
Originea replicrii

1-17
21-42
50-80
92-109
111-179
184-202
281-322
732-1813 (inversat)
2583-3433
3507-4203

11

Harta vectorului pGEX-4T-1

Sistemul de vectori de expresie PET

Procesul de expresie a fost monitorizat prin electroforez denaturant SDS-PAGE.

12

Celulele competente BL21 (DE3) sunt celule competente chimic E. Coli i sunt
purttori ai lizogenului (fag dormant) lambda DE3. Prin urmare, tulpina BL21 (DE3) conine
gena T7 a ARN polimerazei controlat de promotorul lacUV5 n ADN-ul ei cromozomial.
ARN polimeraza T7 este exprimat dup adugarea de izopropil-1-tio--D-galactopiranozida
(IPTG) care induce un nivel nalt de expresie proteic de la vectorii de expresie cu promotorul
T7 (de exemplu, PET).

Transformarea bacterian

Avem nevoie de:

-

Plasmid ex pHAT2-integraz

Celule competente BL21 (DE3) se gsesc la -80C se pun pe ghea pentru a se dezghea.
Se adaug 1l plasmid (cca 200-400 ng ADN) n tubul Eppi cu celule competente. Se
incubeaz pe ghea 10 min.
Se face oc termic prin incubare 1 min la 42C pentru permeabilizarea celulelor i o
mai eficient nglobare a ADN-ului plasmidial.
Se incubeaz pe ghea 2 min.
Peste celulele ocate se adaug 900 l mediu LB lichid fr antibiotic deoarece nc nu
au apucat s exprime genele de rezisten la antibiotic.
Incubare 1 h la 37C.
Se distribuie 100 l cultur pe placa cu mediu solid LB cu agar i antibiotic (Amp).
Incubare O/N la 37C max 16 h deoarece coloniile cu rezisten secret enzime care
descompun antibioticul i se formeaz astfel zone fr rezisten n jurul coloniilor principale
pe care se dezvolt colonii mai mici satelit..

13