Genul Mycobacterium: 50 specii cu

urmatoarele caracteristici:
forma bacilara;
imobilitatea;
acidoalcoolorezistenta;
multiplicarea lenta;
aerobioza.

Clasificarea micobacteriilor:
Complexul M. Tuberculosis-strict patogen:
M. tuberculosis;
M. bovis;
M. africanum.

Micobacterii netuberculoase potential patogene :

cu crestere lenta:
Complexul M.avium;
M. kansasii (F);
M.scrofulaceum (S);
M. ulcerans (N);
M. marinum (F);
M. xenopi (S);
M. szulgai (S);
M. simiae (F/N);
M. haemophilum (N).
cu crestere rapida:
M. fortuitum (N);
M. chelonei (N).
M. leprae.

 Micobacterii netuberculoase nepatogene:

cu crestere lenta:
M. gordonae (S);
M. gastri (N);
Complexul M. terrae;
M. flavescens (S).
cu crestere rapida:
M. smegmatis (N);
M. vaccae;
Complexul M. parafortuitum (N).

Principalul agent patogen la om este Myc. Tuberculosis.

M. Bovis intervine in 5-7% din imbolnavirile tuberculoase,
frecvent in localizari extrapulmonare (20%).

Morfologie si structura:
acidoalcoolorezistenta-proprietate caracteristica genului
Mycobacterium;
forma de bastonas fin cu lungime 1-5m, grosime 0,2-0,6m;
frecvent grupati sau izolati.

Structura microscopica:
perete format din 3 straturi (confera forma si elasticitate
corpului bacilar);
membrana celulara cu structura lipoproteica;
citoplasma;
structura nucleara: fibre de ARN, ce controleaza metabolismul
si multiplicarea germenilor;
vacuole,granulatii si incluziuni citoplasmatice.

Compozitie biochimica:
Organism complex constituit din:
apa;
lipide;
protide;
glucide.

Cantitatea de lipide este de 3 ori mai

mare fata de celelalte bacterii.

acizi grasi comuni: acidul palmitic (4%), oleoc (3%),

stearic 0,7%, lignoceric, cerotic;
acidul mycolic determina acidoalcoolorezistenta;
aminoacizi: acidul aspartic (2%), leucina (1,6%), alanina
(1,4%), glicina (1,1%), serina, prolina, valina, lisina,
histidina, arginina, etc;
fractiuni ceroase;
cord-factorul toxina glico-lipidica situata in perete,
raspunzatoare de patogenia tuberculoase;
protide - tuberculina ce induce hipersesibilitatea de tip
intarziat;
enzime: catalaza, aconidaza,izocitric dehidrogenaza,
fumeraza malic dehidrogenaza, piruvic dehidrogenaza,
mycolat sintetaza, etc.

Forma L, spheroplasts de micobacterii :

au peretii alterati;
sferoidale;
dimensiuni mici;
nu se dezvolta pe medii de cultura;
nu induc raspuns celular;
sunt persistente in organism;
isi pot dobandi forma bacteriana initiala;
raspunzatoare de reaparitia bolii prin revenirea la
forma initiala datorita cord-factorului din peretele
bacilar.

Proprietati generale ale Myc tuberculoase

se multiplica mult mai lentdecat bacteriile comune (bacilul
Koch- 20 ore; colibacil sau salmonella ore);
rezista la agentii fizici mult mai bine decat alte microorganisme;
bacilul Koch nu se dezvolta in afara unui organism animal;
prezinta o toxicitate foarte redusa pentru tesutul animal;
reactia specifica a organismului apare dupa
aproximativ 2 saptamani de la inhalarea bacilara;
absenta reactiei tisulare permite multiplicarea
germenilor fara obstacol timp de 2 saptamani;
reactia de aparare la 15 zile dupa inhalarea primului
b.K. si va impiedica multiplicarea nestingerita a
germenilor.
numai Myc. Tuberculosis, Myc. Bovis si Myc. Africanum
determina boala la om (astazi tipul bovin isi reduce considerabil
ponderea pretutindeni).

Punerea in evidenta a bacilului tuberculos

Metode microscopice;
Metode biologice.

Recoltarea produselor patologice

inaintea administrarii medicatiei antibacilare;
la bolnavii sub tratament dupa 3 zile de intrerupere;
in camere speciale;
In recipiente speciale:
-cu capac etans;
-cu benzi adezive pentru identificare.

examinarea a minim 3 produse patologice (5-10 produse

pentru leziuni paubacilare);
perioada de recoltare 2-3 zile consecutive;
prelucrarea produsului la cel mult 3-5 zile;
pastrarea produsului la frigider (la 4C).

RECIPIENT PENTRU RECOLTAREA SPUTEI

Tehnici de recoltare a produselor patologice

Pentru diagnosticul tuberculozei pulmonare
sputa expectorata spontan;
cantitate minima de 2-3 ml.
Metode de provocare a expectoratiei:
efortul voluntar de tuse;
tubajul gastric;
aerosoli expectoranti cu NaCl 10% timp de 10-15 minute;
spalatura laringo-traheala;
aspiratul bronsic in timpul bronhoscopiei.

Pentru diagnosticul tuberculozei extrarespiratorii

Tuberculoza renala:
toata urina de dimineata -toaleta externa anterioara;
interzis antihistaminice si vitamina C cu 24 ore anterior;
intreruperea tratamentului antibacilar minim 5-7 zile;
baloane de sticla 250 ml cu gatul lung si fundul plat.

Tuberculoza genitala:
la barbati: urina sau sperma;
la femei: -sange menstrual;
-fragment din chiuretaj uterin;
-secretii cervico-uterine;
-lichid de spalatura uterina.

Meningita tuberculoasa:
lichid cefalorahidian recoltat prin punctie rahidiana.

Tuberculoza abdominala, peritoneala, intestinala

lichid ascitic;
fragmente de peritoneu, intestin, ganglioni mezenterici
prin lapatotomie.

Tuberculoza osoasa
fragment din chiuretaj bioptic al leziunilor osoase;
punctate din abcesele osteo-articulare.

Tuberculoza ganglionara
puroi fistulizat;
punctat ganglionar;
fragment bioptic.

Conservarea si transportul produselor patologice

conservare la temperaturi de +4C;
pastrarea si transportul maxim 5-7 zile;
prevenirea uscarii pieselor biologice prin folosirea de apa
distilata;
transportul in conditii speciale.

Produsele bioptice nu se mentin in solutii

fixatoare sau dezinfectante.

I. Metode microscopice de evidentiere

Analiza frotiului efectuat -direct din produsul patologic;
-dupa omogenizarea si concentrarea produsului.

Tehnica frotiului direct

deschiderea recipientelor;
intinderea frotiului pe lama (cat mai subtire);
uscarea si fixarea frotiului pe lama.

Tehnica frotiului dupa omogenizare- concentrare

omogenizarea produsului patologic;
concentrarea bacililor prin centrifugare la 3000
rotatii/minut timp de 30 de minute;
intinderea frotiului din sediment;
uscarea frotiului.

Colorarea frotiului
coloratie Ziehl-Neelsen;
coloratie pentru microscopia cu fluorescenta
(colorant auramina-rhodamina) timp de 5 minute.

Examinarea microscopica a frotiurilor

microscop binocular cu obiectiv de
imersie (90X, 100X) si ocular cu putere
de marire moderata pentru frotiuri
colorate Ziehl-Neelsen;
microscop binocular cu sursa de
ultraviolete pentru frotiuri colorate cu
auramina-rhodamina.

Nr. BAAR

Nr. campuri de
citit

300

1-3/300
1-9/100
1-9/10
1-9/1
>9/1

300
300
100
50
25

Notarea rezultatelor
Cantitativ
BAAR negativ
Nr./300
(se repeta)
Nr./100c
Nr./10c
Nr./1c
Nr./1c

Semicantitativ
BAAR negativ

(se repeta)
1+(+)
2+(++)
3+(+++)
4+(++++)

Notarea rezultatelor pentru metoda Ziehl-Neelsen

Fluorescenta
(200-250X)

0
1-3/300c
1-9/10c
1-9/1c
10-90/1c
>90/1c

Notare semicantitativa

Ziehl-Neelsen
(800-1000X)

BAAR negativ

(se repeta)
1+(+)
2+(++)
3+(+++)
4+(++++)

0
1-3/300c
1-9/100c
1-9/10c
1-9/1c
>9/1c

Notarea rezultatelor la examenul microscopic prin fluorescenta si

echivalarea lor cu rezultatele metodei Ziehl-Neelsen

Avantajele metodei microscopice de diagnostic

rapida;
simpla;
ieftina;
usor de repetat.
Dezavantajele metodei microscopice de diagnostic:
aport informational limitat- evidentiaza BAARI
numai in produsele intens bacilifere (5000-10000
germeni/ml produs);
nu ofera informatii despre:
viabilitatea bacililor;
identitatea bacililor;
sensibilitatea la medicamente specifice.

Erori de tehnica si interpretare

Rezultate fals pozitive
alte particule acidoalcoolorezistente;
zgarieturi ale lamelor;
precipitate de coloranti vechi;
transportul de BAAR de la un produs patologic;
inversarea etichetelor.
Rezultate fals negative
recoltarea incorecta a produsului patologic;
pastrarea si transportul deficitar;
inversarea benzilor adezive de identificare;
nealegerea particulelor purulente din produsul
patologic;
frotiu prea gros intins;
nerespectarea tehnicii de fixare si colorare;
examinarea prea rapida si superficiala a lamelor;
defectiuni optice sau mecanice ale microscopului;

II. Metode biologice

Insamantarea pe medii de cultura specifice:
solide: Lwenstein-Jensen;
lichide: Joumans, Dubos, Middlebrook, Kirchner.

Etape:
omogenizare/decontaminare cu concentrarea germenilor prin
centrifugare;
insamantarea pe medii de cultura si intubarea la termostat;
controlul cresterii culturilor si interpretarea rezultatelor.

Controlul cresterii culturilor si interpretarea rezultatelor

incubare la termostat la 37C;
primul control la 24 sau 48 de ore;
al doilea control dupa 5-7 zile de la incubare- pentru
identificarea micobacteriilor atipice.
controalele ulterioare vor fi saptamanale pana la 8
saptamani de la incubare.

La fiecare control se vor nota mediile infectate total

sau partial si mediile pe care s-au dezvoltat
colonii; inclusiv caracterele morfologice ale coloniilor.

Cresterea gemenilor
Absenta coloniilor
Sub 50 colonii
50-100 colonii
100-200 colonii
Colonii numeroase (200-500)
Aproape confluente, nenumarabile
Colonii confluente (>500)

Notarea rezultatului
Negativ
Se noteaza numarul exact de colonii
+
++
+++
++++

Diagnosticul de cultura bK pozitiv se face prin

examenul morfologic al coloniilor si examenul
microscopic al frotiului efectuat din colonii si colorat
Ziehl-Neelsen.

Coloniile de Mycobacterium tuberculosis tipul uman au

urmatoarele caracteristici:
crestere eugonica (colonii bine dezvoltate);
colonii cu suprafata neregulata, aspect rugos (R=rough),
conopidiforme;
colonii uscate, de culoare galbuie;
crestere luxurianta.
Coloniile de Mycobacterium tuberculosis tip bovin se caracterizeaza prin:
pe medii de cultura solide sunt netede (de tip S=smooth), plate,
mai mici;
crestere disgonica;
culoarea coloniilor este albicioasa, cremoasa;
se disociaza usor in apa distilata;
Chimioterapicele specifice determina disgonia culturilor bacililor
de tip uman si cresteri eugonice la tulpinile bovine.
Culturile micobacteriilor atipice au aspect neted, lucios, disociaza rapid in
apa distilata. Unele micobacterii sunt pigmentate

Colonii de Mycobacterium Tuberculosis (hominis)

Diagnosticul de cultura pozitiva esre completat de:

microscopia germenilor cultivati;
testul inactivarii catalazei (negativ la M. bovis si
M. tuberculosis si pozitiv pentru micobacterii
atipice);
testul niacinei- pozitiv la M. tuberculosis.

Erori de tehnica si interpretare a culturii

Rezultate fals negative:
erori de identificare a produsului patologic;
produs patologic incorect recoltat si pastrat;
omogenizare/decontaminare deficitara;
nerespectarea indicatiilor centrifugarii;
medii incorect prelucrate (vechi, uscate);
timp insuficient de incubare, cu variatii de temperatura;
contaminarea mediilor inoculate.
Rezultate fals pozitive:
micobacterii netuberculoase sau alte microorganisme etichetate
drept M.tuberculosis;
contaminari de laborator in cursul prelucrarii produsului patologic.
Examen microscopic pozitiv neconfirmat prin cultura:
eroare de tehnica si interpretare;
instrumentar de prelevare a sputei sterilizat chimic, dar imperfect
curatat cu persistenta de BAARI morti si identificati la examenul
microscopic;
bacili morti sau cu viabilitate compromisa la pacientii cu tuberculoza
pulmonara aflati sub tratament specific (bacili colorabili);
BAAR- dar necultivabili.

Testarea sensibilitatii bacililor tuberculosi

=compararea cresterii bacililor pe mediul martor (fara
medicamente) si pe mediul-test (cu medicamente
incorporate), dupa insamantarea unui esantion din
populatia bacilara de testat (INOCUL).
METODE:
Metoda concentratiilor absolute;
Metoda proportiilor;
Metoda raportului rezistentei.

Metoda concentratiilor absolute

foloseste inocule standardizate
turbidimetric ce contin 5X103-104 unitati
viabile care dezvolta colonii confluente pe
mediul martor;
pe mediul-test cresterea este nula sau
nesemnificativa pentru tulpini sensibile si
semnificativa pentru culturi rezistente.

Metoda proportiilor
insamantarea de suspensii bacilare cu mai multe
dilutii zecimale pentru a obtine la cel putin una din
dilutii colonii numarabile.

Metoda raportului rezistentei

determina concomitent sensibilitatea tulpinii test si
pe cea a unei tulpini standard sensibile iar
rezultatul exprima raportul dintre concentratia de
medicament necesara inhibarii tulpinii test fata de
cea martor.

Metode moderne de diagnostic micobacteriologic

Metoda BACTEC
monitorizeaza cresterea micobacteriilor in medii de cutura lichide
prin dozarea radiometrica a CO2 marcat cu carbonradioactiv (14C)
produs de metabolismul bacterian;
rezultat cu 7 zile mai rapid;
testeaza si chimiosensibilitatea in timp scurtat.

Metoda MB/BacT
elimina dezavantajul radioactivitatii ;
monitorizeaza colorimetric cresterea micobacteriilor;
foloseste detectorul colorimetric a carui culoare vireaza de la
verde la galben pe masura acumularii de CO2;
rezultatul cu 10-15 zile mai rapid fata de mediile de cultura solide
clasice.

Cromatografia acizilor micolici

determina profilul acizilor micolici din peretele bacilar cu
identificarea speciei in mai putin de 24 ore.
metoda pur stiintifica, laborioasa si costisitoare

Sonde genetice
bazate pe identificarea AND micobacterian cu sonde
moleculare.

Serodiagnosticul si detectarea antigenelor in

produsele patologice
au fost clonate gene pentru identificarea majoritatii
antigenelor micobacteriene recunoscute de anticorpii
monoclonali;
metoda nu are specificitate pentru micobacteria de tip
uman;
reactia de polimerizare in lant produce replicarea naturala a
acizilor nucleici cu inalta specificitate pentru micobacteria
de tip uman (PCR).

Micobacteriile atipice
microorganisme acidoalcoolorezistente caracterizate
prin aspectul coloniilor;
de obicei saprofite pentru om;
uneori pot devenii patogene determinand
micobacterioze;
tabloul clinic similat tuberculozei;
rezistenta obisnuita la medicamentele anti
tuberculoase;
dificultati terapeutice.

Clasificare
Fotocromogene
Coloniile sunt incolore la intuneric
M. kansasii
pigmentandu-se in galben-portocaliu M. marinum
dupa o expunere de 1-2 ore la lumina M. simiae
Scotocromogene
Colonii colorate si la intuneric
M.scrofulaceum
M. szulgai
Nefotocromogene
Coloniile nu se coloreaza la intuneric M. avium
si nici la lumina
M. inracellulare
M. ulcerans
M. xenopi
Cu crestere rapida
Colonii dezvoltate sub 10 zile M. fortuitum
M. chelonei
M. abcessus