Fac. of Grad. Studies, Mahidol Thesis/ iv.

CLONING, EXPRESSION, PURIFICATION AND ENZYMOLOGICAL

CHARACTERIZATION OF NS2B/NS3 PROTEASE PROTEIN OF JAPANESE
ENCEPHALITIS VIRUS

CHAKARD CHALAYUT 4937165 MBMG/M

M.Sc. (MOLECULAR GENETICS AND GENETIC ENGINEERING)
THESIS ADVISOR COMMITTEE : GERD KATZENMEIER, Ph.D., ALBERT
KETTERMAN, Ph.D., CHANAN ANGSUTHANASOMBAT, Ph.D., CHARTCHAI
KRITTANAI, Ph.D.

ABSTRACT

Japanese Encephalitis Virus (JEV), a member of the Flaviviridae family, is a mosquito

borne neurotropic flavivirus causes severe diseases of the central nerve system. Currently, several vaccinces
are in clinical use, however, their use is restricted due to high costs and occasional adverse effects. The
development of small molecule drugs against viral target enzymes such as the NS2B-NS3 protease therefore
urgently required. This study is therefore aimed to analyze the differences on the mechanism of cofactor
activation between dengue virus and Japanese encephalitis virus virus NS2B(H)-NS3(pro) by
characterization of the two-component protease by establish a rapid, sensitive and easy to perform to assay
with the fluorogenic substrates. In this study, the peptide substrates incorporated with fluorogenic group
(amc) were used and general methodology for the cloning, expression and purification of the Japanese
encephalitis virus protease was developed. The sequence of NS2B-NS3 from JEV was obtained by synthetic
gene. The protease complex NS2B(H)-NS3pro was obtained by SOE-PCR. Constructs were cloned and over
expressed in E.coli, purified by metal affinity chromatography and size exclusion then the protein sample
were subjected to analysis by SDS-PAGE, Western Blotting and a fluorogenic assay with the synthetic
substrate RTKR-amc and GRR-amc. Kinetic studies revealed the kinetic parameters (Km, k ) and also
cat

demonstrated differences kinetic between dengue and Japanese encephalitis virus. However, the Japanese
encephalitis virus protease is similar in pH and ionic strength with Dengue virus. These novel finding make
a better understanding on the NS2B(H)-NS3(pro) of Japanese encephalitis virus to the related the Flavivirus
and provide a starting point to further characterization of substrate specificity and inhibitor design for the
JEV protease.

KEY WORDS: JAPANESE ENCEPHALITIS VIRUS/NS2B-NS3

PROTEASE/PROTEASE ASSAY/INHIBITOR/ FLAVIVIRUS

159 pages
Fac. of Grad. Studies, Mahidol Thesis/ v.

การศึกษาการโคลนนิ่ ง การแสดง การทำาให้บริสุทธิ์ และลักษณะทาง

เอนไซม์ของโปรตีนโปรตีเอส NS2B/NS3 จากไวรัสไข้สมองอักเสบ

(CLONING, EXPRESSION, PURIFICATION AND

ENZYMOLOGICAL CHARACTERIZATION OF NS2B/NS3

PROTEASE PROTEIN OF JAPANESE ENCEPHALITIS

VIRUS)

ฉกาจ ชลายุทธ 4937165 MBMG/M

วท.ม. (อณู พันธุศาสตร์และพันธุวิศวกรรมศาสตร์)

คณะกรรมการที่ปรึกษาวิทยานิ พนธ์ : Gerd Kazenmeier, Ph.D.,

Albert Ketterman, Ph.D., ชนั นท์ อังคุธนสมบัติ, Ph.D.,

ชาติชาย กฤตนั ย , Ph.D.

บทคัดย่อ

ไวรัสไข้สมองอักเสบ เป็ นไวรัสหนึ่ งในตระกูลไวรัส Flaviviridae ซึ่งเป็ นไวรัสที่มี

ยุงเป็ นพาหะนำาเชื้ อ ทำาให้ก่อโรคที่รุนแรงในระบบประสาทส่วนกลาง ในปั จจุบันมีวัคซีนที่ใช้

ในการรักษาแต่ก็มีข้อจำา กัดในเรื่องราคาที่สูงและมีโอกาสที่จะเกิดผลข้างเคียงกับร่างกายได้

การพัฒ นาโมเลกุลยาเล็ ก ๆ ที่ต่อ ต้านไวรัสโดยมี เป้ าหมายอยู่ท่ี เอนไซม์โ ปรตี เ อส NS2B-

NS3 นั้ นเป็ นสิ่งที่ต้องการอย่างเร่งด่วน ในการศึกษานี้ มีวัตถุประสงค์ท่ีจะวิเคราะห์ความแตก

ต่างในกลไกของโคเฟคเตอร์ในการกระตุ้น NS2B(H)-NS3(pro) ระหว่างไวรัสเดงกี่และไวรัส

ไข้สมองอักเสบ ด้วยการจำา แนกส่วนประกอบทั้ง 2 ของโปรตีเอสด้วยวิธีการที่รวดเร็ว ตอบ

Fac. of Grad. Studies, Mahidol Thesis/ vi.

สนองได้ไวและง่ายที่จะทำาการวิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้นแบบเรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งในการ

ศึกษานี้ ได้พัฒนาวิธีการโคลนนิ่ ง การแสดงออกของโปรตีนและทำา โปรตีนของโปรตีเอสไวรัส

์ ละใช้สารตั้งต้นที่เป็ นเปปไทด์ท่ีมีกลุ่มสารเรืองแสงฟลูออเรสเซนต์
ไข้สมองอักเสบให้บริสุทธิแ

(amc) ในการทดลอง ลำาดับพันธุกรรม NS2B-NS3 จากไวรัสไข้สมองอักเสบได้ถูกสังเคราะห์

และเป็ นต้ น แบบในการสร้ า งลำา ดั บ พั น ธุ ก รรมของโปรตี น NS2B(H)-NS3(pro) ด้ว ยวิ ธี ก าร

SOE_PCR ลำา ดั บ พั น ธุ ก รรมดั ง กล่ า วได้ ทำา การโคลนนิ่ ง และทำา การแสดงออกในแบคที เ รีย

E.coli และทำา ให้ บ ริ สุ ท ธิ์ ด้ ว ยวิ ธี metal affinity chromatography และ size exclusion

chromatography จากนั้ นโปรตี น ได้ ทำา การตรวจสอบวิ เ คราะห์ โ ดย SDS-PAGE, Western

Blotting และทำาการทดสอบวิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้น RTKR-amc และ GRR-amc การศึกษา

ทางจลศาสตร์แสดงให้เห็นถึงค่าจลศาสตร์ของโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอเสบและความแตกต่าง

ระหว่างโปรตีเอสของไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้สมองอักเสบ อย่างไรก็ตามโปรตีเอสของไวรัสไข้

สมองอักเสบมีการตอบสนองต่อค่า pH และ ionic strength ที่เหมือนกัน ซึ่งการค้นพบครั้งนี้

จะช่วยให้ เข้ า ใจในโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ของไวรัสไข้สมองอั กเสบต่ อไวรัสสายพัน ธ์ุ

Flavivirus ได้ ม ากขึ้ น และเป็ นจุ ด เริ่ม ต้ น ในการจำา แนกสารตั้ งต้ น ที่ มี ค วามเฉพาะและ

ออกแบบสารยับยั้งต่อโปรตีเอสของไวรัสไข้สมองอักเสบได้ต่อไป

159 หน้า