BIOKATALIS

TAQ DNA POLYMERASE

DISUSUN OLEH:
Diana Christina, 1306370902
Dyah Paramawidya Kirana, 1306447846
Faustina Prima Martha, 1306404802
Kamila Luthfia Putri, 1306412193
Nadira Putri Pinasthika, 1306370814
Syafira Andyah Putri, 1306371022

OUTLINE
Aplikasi TAQ DNA
Polymerase

Deskripsi
enzim
Polymerase

Referensi

Produksi TAQ DNA

Polymerase

Pembahasan Jurnal

DESKRIPSI ENZIM
JENIS-JENIS ENZIM POLYMERASE

DESKRIPSI ENZIM
DNA POLYMERASE
RNA
Merupakan
enzimdalam
sentral
yang berperan dalam proses
Enzim ini berperan
proses
pembentukan
mRNA,
replikasi
DNARNA
danberupa
reparasi
DNA, serta mengkatalisasi
rRNA dan
tRNA dari DNA
sebagai
reaksi
pembentukan
DNA
dalam sintesis protein.

cetakannya. RNA polymerase

Pada
proses
replikasi,
DNA polymerase hanya bisa
bekerja
melalui
3 tahap pada
menempel
gugus
OH (hidroksil) dimana gugus OH
proses yang pada
disebut
sebagai
transkripsi
RNA).
hanya
ada(pembentukan
pada ujung 3
sedangkan ujung 5 adalah ujung
fosfat
Fungsi RNA polymerase digunakan
di tahap inisiasi, elongasi, dan
Hanya
bisa mensintesis DNA dari arah 5-3 sehingga
terminasi

pertumbuhannya dari 5-3 karena penambahan pada

ujung 3, dimana pada ujung 3 terdapat ujung hidroksil.

DESKRIPSI ENZIM
RIBOSOMES
DNA
NUCLEOTIDYLEXOTRANSFERASE
REVERSE
TRANSCRIPTASE
DNA
Reverse
transcriptase
Nucleotidylexotransferase/Terminal
Ribosomadalah
salah
trasnferase
adalahyang
DNA Polimerase
adalah
enzim
satuorganelyang
berukuran
khusus
yang
diekspresikan
pada sel
digunakan
untuk
kecil
dan
padat
limpatik
pre-T
& pre-B
membentuk
cDNA
dari RNA
dalamselyang
berfungsi
Digunakan pada proses amplifikasi cepat
template
sebagai
sintesis nukleotida
cDNA
untuktempat
menambahkan
dapat
digunakan
sebgai template
protein.
Ribosom
berdiameter
supaya
Aplikasinya
sering
primer
pda
PCR Subsekuen
sekitar
20nmserta
terdiri
ditemukan
pada
Antibodi
TdT digunakan
untuk
atas 65%RNA
ribosom
pembuatan
Obat Anti
Virus,
menunjukkan
keberadaan
sel
(rRNA) dan 35% protein B & T
muda
serta untuk multipotensi
stem sel
Mempermudah
proses PCR,
ribosom
(disebut
hematopatik

dan Produksi Insulin

Ribonukleoproteinatau
RNP).

DESKRIPSI ENZIM
SUMBER ENZIM DNA
TAQ DNA
POLYMERASE
KARAKTERISTIK
POLYMERASE
DARI Themus
Pertama kali ditemukan pada Yellowstone National Park, USA pada suhu 55aquaticus
100C dan pH 5-9
Berupa bakteri gram-negative atau bakteri yang hanya memiliki sedikit
Continue
peptidoglikan <
pada
dinding selnya
Inhibitor

Titik Isoelektrik :
Bromophenol blue
Properti
Kegunaan
6.03 (Theoretical)
(Wittwer and Garling
fisis/kimiawi
1991)
dalam
bentuk filamen-filamen
pendek
Extinction
Mengoptimalkan MR = 94 Terdapat
kDa
Pyranicin (Takahashi et
Coefficient :
PCR
al. 2008)
pH optimal = 7.5 110,380 cm-1 M-1
DNA labeling
KCl (greater
than
[75 merah,
Ketika dikenakan
cahaya, Thermus terlihat
warna
kuning,
-9
(Theoretical)
yang melibatkan
mM]) bakteri tsb.)
atau merah
muda (karena pigmen dalam
Suhu optimal
=
E
=
11.75
1%, 280
primer
Urea, DMSO, DMF,
Thermus
aquaticus
80C (namun
(Theoretical)
formamide, and SDS
DNA Sequencing
juga tergantung
(Wittwer
and Garling
Dapat memiliki
flagella
atau: dapat
immotile
(tidak bergerak)
Waktu
Paruh
>40 berupa
Klasifikasi: Bacteria; Deinococcus- senyawa
1991)
buffer) menit, 95C
Thermus; Deinococci; Themales;
Thermophilus; Aquaticus

Ketahanannya terhadap suhu tinggi, TAQ DNA Polymerase dari Thermus

aquaticus sering digunakan untuk PCR

STRUKTUR
TAQDNA
DNAPOLYMERASE
POLYMERASE
HARGA TAQ
SKU-Pack Size

D1806-5KU

D1806-250UN

D1806-1.5KU

D1806-20X250UN

D1806-10X1.5KU

Availability

Estimated to ship on 17.01.16

Estimated to ship on 04.12.15

Estimated to ship on 17.01.16

Estimated to ship on 04.12.15

Estimated to ship on 17.01.16

Price (SGD) Quantity

3,780.00

260.50

1,370.00

3,910.00

10,500.00

DESKRIPSI ENZIM
MEKANISME KERJA TAQ DNA POLYMERASE

Sumber:
http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.html

PRODUKSI ENZIM
KLONING GEN TAQ DNA POLYMERASE
Isolasi genom DNA
Thermus aquaticus dan
plasmid DNA nya

Medium LB
mengandung100ug/ml
ampicilin diinokulasi
dengan 1% seed culture
ditumbuhkan pada
37OC

Ekspresi protein
rekombinan diinduce
oleh 0,52 mM IPTG pada
kultur dengan OD600 0,60,8 (fase mid-log)
yield enzim maksimal

Primer :
E.coli rekombinan
dalam
10 ml
LB GTA ACA TGA GGG -3
F 5 - CGGdikultur
AAT TCT
GAG
GAG
Amplifikasi gen
broth 1 malam pada
Thermus aquaticus DNARE: EcoRI
Pemanenan sel
37OC, mengandung
polymerase dengan PCR
100ug/ml
ampicilin
R 5-CGT CGA
CTA GAT
CAC TCC TTG GCG GAG AG -3
sebagai
seed
culture
RE: SalI

Ligasi fragmen amplikon

ke dalam vektor
ekspresi pET yang
sudah didigest dengan
EcoRI dan SalI

Hasil ligasi
ditransformasikan ke sel
kompeten E.coli TOP10
dengan CaCl2 & heat
shock pada 42oC (45
menit)

Ekstraksi dan purifikasi

mid-log
phase
yield enzim
maksimal

PRODUKSI ENZIM
EKSTRAKSI DAN PURIFIKASI TAQ DNA POLIMERASE
1. Pemanenan
Sel sel
4. Pemisahan
padatan

Dicuci dengan 50 ml buffer A per liter volume

7. Penambahan etanol

Sentrifugasi
pada 16.000 x g selama 10 menit padakultur
suhu 4C
Sentrifugasi

Supernatan dipindahkan ke botol plastik

Ditambahkan etanol sampai

konsentrasinya 55%

2. Pelarutandigestive
sel kembali
5. Penambahan
solution

Dilarutkan
kembali
50 ml buffer
1% digestive solution dengan PMSF ditambahkan
ke larutan
untukdengan
menghilangkan
DNA
Sentrifugasi
kembali
dan RNA setelah suhunya turun menjadi suhu ruangan
A

8. Pengambilan Taq Polimerase

3. Penambahan lisozim
Mendenaturasikan
Dnase
I
Sentrifugasi 16.000 x 6.
g selama
15
Endapan
dilarutkan
pada 25 ml buffer
Sebelumnya
didinginkan
dua kali4C
menit
pada water
suhu
lalu16.000
disimpan
pada
suhu
Direndam
dalam
bathuntuk
pada
suhu 1 ml penyimpanan
Sentrifugasi
x g 75C
selama
10
Diinkubasi
pada
selama
Ditambahkan
lisozim
dan 1 pada
dengan nitrogen cair, lalu dicairkan
ml lysis buffer
memperoleh
Taq30
Polimerase
-20C
30 menit
75C
selama
menit
menit pada
suhu
4C
pada
suhu ruang

APLIKASI ENZIM
Sequencing
ALIKASI

Taq
Polymera
se

Mutagenesis

PCR
Kloning

POLYMERASE CHAIN REACTION

Skema Reaksi Taq DNA
Polimerase
polimerase membantu

proses sintesis. Dimana enzim

ini akan "memeriksa" apakah
nukleotida yang benar telah
dimasukkan ke dalam template.
Jika ketidakcocokan terdeteksi
DNA ditransfer dari domain
polimerisasi ke 3'
5'exonuclease domain Nterminal dari polimerase.
Nukleotida salah dimasukkan
dipotong dan DNA pindah
kembali ke domain polimerisasi,
proses penyalinan dilanjutkan.

PEMBAHASAN JURNAL

DNA polymerase berfungsi untuk manipulasi DNA secara in vitro

seperti cloning, sekuensing, DNA labeling, mutagensesis, dll

DNA polymerase dari Thermus aquaticus (Taq Polimerase)

merupakan enzim yang paling sering digunakan diseluruh dunia
untuk proses PCR

Untuk meningkatkan performance PCR yang menggunaka taq

polymerase sebagai enzimnya, perlu dilakukan mutagenesis

Sebelum dilakukannya mutagenesis, DNA polymerase

diamplifikasikan dengan PCR dari DNA microorganism yang
didapat dari tanah

Kemudian corresponding region gen pol untuk taq polymerase di

ganti dengan fragment gen yang telah diamplifikasi dan
membandingkannya dengan beberapa chimeric DNA polymerase
untuk mencari titik kritis untuk kemampuan elongasinya

MATERIAL DAN METODE

Purifikasi
Wild-type
dangen
mutan
DNA
Amplifikasi
fragment
pol dari
Analisis
hasil
Konstruksi
mutan
Taq amplifikasi
Polimerase
Polimerase
metagenomic
DNA

Host dilakukan
yang membawa
plasmid
rekombinan
pada LB
Medium
PCR
dalam
reaksi
50l,ditumbuhkan
mengandung
10ng
100g/ml
pTV-Taw
Konstruksi
plasmid
plasmid
kemudian primer,
dimutagenesis
pada
DNA,
25pampicillin
mol masing-masing
0.2mm dNTP,
dan
bagian
E742
dan
A73
1 unit
PFU
polimerase
DNA Ultra (Stratagen).
Setelah
untuk
chimeric
Taq
Ekstraksi
DNA
Sel dikulturdari
inkubasi
campuran
tanpa enzim
untuk
hingga
nilaicampuran
absorbansinya
mencapai
0,2-0,33 menit
Pada
reaksi
PCR
mengandung
20ngdi
Polimerase
95C, tiga puluh siklus PCR, dengan profil suhu 30-an di
DNA
template, 1 PCR buffer
KOD-Plus-Neo,
95C, 30sat 55C, dan 1 menit Ekstraksi
pada 72C,
dilakukan.
DNA
1.5mm
Pol gen kemudian
Mg2SO4,
0.2mm
dNTP,
0.3M
di kultur
selama 3setiap
jam lagi dengan
kehadiran
IPTG
Vector:
Enzim untuk
manipulasi
DNA
mikroorganisme yang
pTV-Taq
(asal:
primer
masing-masing,
dan berada
0,5 Unit
KOD-Plus-Neo
in vitro
dibeli
dari New
di tanah
pTV118N)
DNA
polimerase
(TOYOBO,
Osaka
, Jepang)
dalam
Sel dipanen
dan(Ipswich,
dihancurkan
dengan proses
sonifikasi
pada UltraClean
larutan
lysis (50
England
Biolabs
menggunakan
RE:volume
B1pI
dan
Bg1II
mM Tris-HCl,
pH 8.0,
1 mM Campuran
DTT, 1 mM EDTA,dipanaskan
1 mM PMSF)
akhir
20l.
MA,USA). [metil-3H]
TTP
Soil DNA Isolationpada
Kit (MO
95C
30-an
detik dan
kemudian
mengalami
dibeli
dariuntuk
Amersham
Untuk
San
Diego,
CA,diperoleh
USA)
persiapan
WT dan polimerase
TaqBIO,
mutan,
ekstrak
sel
larut,
dengantermal
sentrifugasi
pada
12.000 95C
x g selama
20 menit,
dipanaskan
pada
(Buckinghamshire,
Inggris)

siklus
(14
siklus
untuk
30-an,
55C
Ekstrak
DNA
diseleksi
suhu 75 C selama 30 menit.
danselama
[32-P]
dibeli dan
dari 68 C dengan
1ATP
menit,
untuk 8elektroforesis
menit). Produk
Nen
Science
Produk
Life
Hasildirawat
akhir dari purifikasi
ini berupa
protein
yang
terelusi
pada 0,81h
M NaCl di
PCR
dengan
DpnI
pada
37
C
untuk
kromatografi
kolom hidrofobik
(Boston,
MA, USA).

Meligasi
Persiapan
fragment gen dari
metagenomic
Enzyme dan DNA ke plasmid
dan
host
Substrat
Host: E.coli JM109

HASIL
Pemanjangan
Primer lebih
Cepat dan
Kenaikan
Kinerja PCR
dengan
Mutan Taq
Polimerase

REFERENSI
Chen, Sique, dkk. 2015. A Simple and Efficient Method
for Extraction of Taq DNA Polymerase. Tiongkok:
Electronic Journal of Biotechnology.
http://www.worthington-biochem.com/DNAPTAQ/default.
html
https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Thermus_aqua
ticus*
http://eol.org/pages/974560/overview
http://bioinfo.bact.wisc.edu/themicrobialworld/LAHT/b27
.html

THANK
YOU!