EXAMENUL CITOLOGIC

Raluca Balan

Citologia clinic reprezint o metod de diagnostic rapid, ieftin, efectuat cu disconfort

minim pentru pacient i cu o larg acceptabilitate i aplicabilitate. Specimenele citologice pot fi
obinute din fluide (sput, lichide pleurale, urin, LCR), din puncii biopsii cu ac fin (eng. fine
needle aspiration, FNA) a maselor solide, frotiuri i raclaje ale leziunilor superficiale (frotiul
Papanicolaou) sau n urma exciziilor chirurgicale (amprente).
Citodiagnosticul se bazeaz, astfel, pe patru categorii de tehnici de recoltare:
-

Citologie exfoliativ

Colecie de celule obinute prin periaj sau alte tehnici abrazive similare

Biopsia aspirativ (FNA) sau obinerea de celule de la nivelul unor mase palpabile i
profunde, cu ajutorul unui ac, cu sau fr sering

Citologie intraoperatorie.

Citologia exfoliativ i abraziv

Citologia exfoliativ se bazeaz pe descuamarea spontan a celulelor de tapetare a unui
organ, atunci cnd acestea pot fi ndeprtate prin metode neabrazive. Descuamarea celular
reprezint un fenomen bazat pe nlocuirea constant a unui epiteliu de tapetare.
Citologia abraziv are ca scop mbogirea frotiului cu celule obinute direct de pe
suprafaa organului int. Astfel au aprut numeroase metode i instrumente noi de recoltare a
materialelor cu localizri diferite.
Un exemplu tipic de citologie exfoliativ l reprezint frotiul vaginal recoltat de la nivelul
fundului de sac posterior vaginal. Celulele de la acest nivel provin din mai multe surse: epiteliul
scuamos de tapetare al mucoasei vaginale i poriunea vaginal a exocolului, epiteliul
endocervical i alte surse, ca: endometrul, trompele uterine, peritoneu sau localizri la distan.
Frotiurile vaginale conin frecvent leucocite i macrofage, care se pot acumula ca rspuns la un
proces inflamator, precum i bacterii, fungi, parazii care pot coloniza tractul genital inferior.
Citologia exfoliativ vaginal a reprezentat prima tehnic citologic cu ajutorul creia s-a
precizat un diagnostic prin examinarea la microscop a celulelor izolate, cu aplicabilitate practic
n diagnosticul neoplaziilor maligne de col uterin. Metoda a fost descoperit de Aurel A. Babe i
Constantin Daniel, care au publicat n 1928 prima comunicare intitulat: Posibilitatea
diagnosticului cancerului uterin prin frotiuri. Georgios Papanicolaou a perfecionat aceast
tehnic, transformnd-o ntr-o metod de laborator larg acceptat i utilizat - metoda citologiei
1

cervico-vaginale. Tehnica a fost ulterior extins i spre depistarea unor tumori cu alte localizri
(pulmonare, urinare).

Citologia cervico-vaginal

Primii cercettori care au demonstrat utilitatea folosirii frotiurilor n diagnosticarea rapid

a cancerului de col uterin au fost Aurel A. Babe i Constantin Daniel, care au artat c
diagnosticul precoce al cancerului cervical poate fi realizat pe frotiuri, prezentnd criteriile
citologice de malignitate ale celulelor tumorale i indicnd totodat modelul de studiere al
acestora pe frotiuri vaginale colorate prin metoda Giemsa.
Papanicolaou a avut meritul de a perfeciona metoda citodiagnosticului exfoliativ,
enunat anterior de Aurel Babe, prin clasificarea frotiurilor n cinci clase (clasele I-V Pap),
metod pe care ulterior a aplicat-o n screeningul cancerului colului uterin n marile colectiviti.
Medicii folosesc frotiurile Papanicolaou sub denumirea de testul Babe-Papanicolaou sau
testul Pap, ca test screening al displaziei scuamoase cervicale i al carcinomului scuamos precoce
invaziv al colului uterin. n acest scop, testul este folosit n cazul femeilor asimptomatice care au
colul uterin aparent normal clinic; cele care prezint o simptomatologie clinic pot de asemenea
beneficia de acest test, dar cel mai probabil necesit investigaie suplimentar.
Noiunea de screening a fost definit n 1957 de ctre United States Commission on
Chronic Illness ca fiind identificarea probabil a unei boli sau a unei leziuni inaparente clinic,
prin aplicarea unor teste, examinri sau alte proceduri care se pot efectua rapid. Un test screening
nu intenioneaz a fi un test diagnostic. Persoanele cu diagnostic pozitiv sau cu suspiciune de
diagnostic trebuie s se adreseze clinicianului pentru investigaii suplimentare i eventual
tratament. Testele screening fac trierea persoanelor cu col uterin aparent normal clinic, care
probabil au boala, de cele care probabil nu o au.
Avantajele testului Papanicolaou:
a. sensibilitate mare (reprezentat de procentul de paciente care au boal i care vor
avea un rezultat pozitiv al testului) i specificitate (procentul de paciente care au
boal i care vor avea un rezultat negativ);
b. risc sczut;
c. larg acceptat att de medici ct i de populaia int;
d. eficien n reducerea morbiditii sau mortalitii.

Utilizarea frotiurilor:
-

depistarea unor modificri microscopice la nivelul mucoasei colului uterin la femeia

asimptomatic

depistarea recidivei unor afeciuni anterioare ale colului

evaluarea unor anomalii hormonale suspicionate clinic

2

monitorizarea terapiei hormonale.

Etapele realizrii unui frotiu Papanicolaou:

-

vizualizarea colului

recoltarea de la nivelul acestuia, prin rzuire cu unul sau mai multe instrumente

transferul celulelor de pe dispozitivele de recoltare pe o lam de sticl.

Epiteliul cervical prezint hormono-dependen, fiind influenat n special la nivelul

zonei de tranziie scuamo-cilindric i de ali factori infecioi i inflamatori. Epiteliul
reacioneaz la aceti factori prin modificarea numrului de celule, a gradului de maturaie i de
difereniere a celulelor. Se prefer recoltarea la jumtatea ciclului deoarece n aceast perioad,
detaliile citologice nu sunt acoperite de hematii sau elemente inflamatorii.
Scopul recoltrii unui frotiu cervical este obinerea unui specimen reprezentativ pentru
jonciunea scuamo-cilindric (zona de transformare) deoarece majoritatea leziunilor precursoare
carcinomului scuamos invaziv al colului uterin au originea la acest nivel.
Moduri de recoltare i prelucrare ale frotiurilor cervico-vaginale
Vizualizarea colului i a zonei de transformare se realizeaz prin introducerea cu grij n
vagin a unui specul. nainte de recoltare, pacientele trebuie s evite timp de 48 h splturile
vaginale, s evite timp de 1 sptmn folosirea cremelor vaginale i s evite contactul sexual cu
24 h anterior procedurii.
Metode de recoltare
Exist mai multe modaliti i instrumente de recoltare a frotiului cervico-vaginal:
Ayre a introdus, n 1947, spatula cervical pentru rzuirea uoar a suprafeei
esuturilor de la jonciunea scuamo-cilindric, pe care a denumit-o spatula Ayre. Exist mai multe
tipuri de spatule, mai utilizat fiind spatula Ayresbury, care are un vrf mai alungit ce
faciliteaz recoltarea celulelor din canalul endocervical i o lam orizontal care permite
recoltarea pe o suprafa mai mare de la nivelul exocolului, acoperind i zona de transformare.
n 1986 a fost introdus un nou dispozitiv pentru obinerea frotiului endocervical,
numit Cytobrush. Frotiul endocervical este util nu numai pentru depistarea leziunilor
endocervicale, dar i pentru depistarea leziunilor intrauterine care altfel pot fi omise. Cytobrush
are peri circumfereniali care vin n contact cu ntreaga suprafa de inserie; se introduce n
canalul cervical, se rsucete dup care produsul recoltat este ntins pe o lam de sticl n strat
ct mai subire prin rsucirea periuei de-a lungul lamei.
Alte dispozitive utilizate pentru recoltare sunt: The Eisenstein Ecto-EndoCervical Scraper i Cervex-Brush. Cervex-brush este o periu de polietilen moale, flexibil, cu
lungimea de 20 cm, format din 57 epi de plastic semi-circulari de diferite lungimi. epii cei
mai lungi ptrund adnc n canalul endocervical, iar cei mai scuri ating n acelai timp suprafaa
exocolului i zona de transformare. Prin inserarea Cervex-brush n canalul cervical i rotirea ei n
sensul acelor de ceasornic, toate celulele necesare pot fi recoltate printr-o singur micare.
3

Folosirea Cervex-brush este suficient pentru realizarea unui singur frotiu. Aceast metod nu
produce sngerare, reduce costul frotiului cervico-vaginal i anxietatea pacientei.
Efectuarea frotiurilor
Materialul preluat de pe dispozitivul de recoltare este transferat pe suprafaa unei lame de
sticl pe care este scris fie numele pacientei, fie numrul de nregistrare a pacientei.
Numrul de frotiuri necesare pentru o evaluare citologic corespunztoare difer n
funcie de autori. Unii prefer recoltarea a dou frotiuri (exocervical, endocervical) sau a trei
frotiuri separate (vaginal, exocervical i endocervical). Alii prefer realizarea triplului frotiu
VCE, astfel:
-

se recolteaz, cu o spatul de lemn obinuit, material de pe peretele lateral al

vaginului, care se va ntinde lng marginea rugoas a lamei de sticl (V);

materialul recoltat de la nivelul exocolului se etaleaz la mijlocul lamei (C);

materialul recoltat de la nivelul canalului cervical se ntinde spre cealalt extremitate

a lamei (E).

Dezavantajul frotiului unic const n faptul c uneori nu se poate specifica locul de

origine al eventualelor celule displazice sau atipice identificate i diagnosticate pe frotiu.
Frotiurile recepionate n laboratorul de citologie trebuie s fie nsoite obligatoriu de un
bilet de trimitere care s cuprind: numele, prenumele i vrsta pacientei; data recoltrii; data
ultimei menstruaii; orice simptom clinic relevant; statusul endocrinologic al pacientei (sarcin,
postmenopauz, etc); istoric de tratamente hormonale sau administrri de contraceptive; prezena
dispozitivului intrauterin; dac este cazul: tipul i datele chimioterapiei, intervenii chirurgicale
ginecologice n antecedente, istoric de neoplazie, detalii privind testele Pap anterioare; numele,
semntura i parafa medicului care a examinat pacienta.

Criterii de respingere a frotiurilor:

-

frotiurile sunt sparte sau lipsesc datele de identificare ale pacientei

mai mult de 75% din celule sunt acoperite de exudat inflamator sau snge

numr mic de celule pe frotiu (mai puin de 1000)

frotiul conine mai ales celule glandulare endocervicale i nu este reprezentat zona
de tranziie

fixare necorespunztoare a celulelor.

Factori care reduc acurateea frotiurilor Papanicolaou:

-

contaminarea frotiului cu snge sau lubrefiani

4

istoric clinic neadecvat

recoltare inadecvat de la nivelul zonei de tranziie

frotiu etalat prea gros sau care ocup mai puin de 10% din suprafaa lamei (material
insuficient)

recoltarea testului Pap n ciuda infeciei evidente

confundarea frotiurilor sau a numelor pacientelor

neidentificarea celulelor displazice

interpretare greit a diagnosticului clinic

prelucrare tehnic deficitar.

Recoltarea de la nivelul altor zone anatomice ale tractului genital feminin

a. De la nivelul vulvei
Se utilizeaz pentru depistarea carcinomului vulvar in situ, pentru specificarea unei
leziuni vulvare sau vaginale sau pentru obinerea altei informaii utile diagnosticului clinic, cu
disconfort minim pentru pacient.
Leziunile vulvare de consisten moale pot fi evaluate citologic cu ajutorul amprentei
obinute prin aplicarea unei lame de sticl pe suprafaa leziunilor. n cazul leziunilor vulvare cu
consisten crescut recoltarea se face prin rzuirea suprafeei leziunii cu lama unui bisturiu.

b. De la nivelul vaginului
Pentru studiul leziunilor vaginale se utilizeaz recoltarea prin aspiraie din fundul de sac
vaginal posterior sau prin rzuirea uoar de sus n jos a pereilor vaginali anterior, posterior i
laterali.
n afara valorii lor n depistarea celulelor maligne, frotiurile vaginale sunt utile i pentru
evaluarea profilului hormonal al pacientei, pentru evaluarea unei posibile reacii inflamatorii n
vagin, pentru identificarea caracteristicilor microbiologice ale florei vaginale i pentru depistarea
citologic a adenozei vaginale i a carcinomului cu celule clare (frotiuri de pe fiecare perete al
vaginului).
c. De la nivelul cavitii uterine
Citologia endometrial aparine celor mai dificile domenii ale citologiei, deoarece:
-

exist dificulti n obinerea unui eantion celular reprezentativ endometrial

exist dificulti n interpretarea evidenei citologice i n recunoaterea celulelor

normale i anormale de origine endometrial.
5

Au fost descrise mai multe tehnici pentru recoltare de la nivelul endometrului, dar a cror
acuratee este variabil n depistarea citologic a carcinomului endometrial.
Pentru recoltarea din cavitatea uterin se recomand folosirea urmtoarelor metode:
1.
Frotiul V.C.E. folosit n screening-ul carcinomului cervical poate evidenia unele
anomalii endometriale dar are sensibilitate i specificitate reduse. Prin aceast metod se
evideniaz celulele endometriale descuamate spontan care se acumuleaz n fundul de sac
posterior. Pentru recoltare se folosete spatula Ayre modificat. Aceast metod este ineficient
n contextul depistrii celulelor endometriale, depinznd de ansa de a recolta aceste celule de la
nivelul originii orificiului extern al colului uterin n momentul n care se face recoltarea.
2.
Aspiraia fluidului cervical reprezint o metod practic i sigur de evaluare a
leziunilor endometriale, folosit de rutin n unele laboratoare atunci cnd este suspectat
carcinomul endometrial, cum ar fi cazul pacientelor cu vrsta peste 40 de ani, cu metroragie. Se
realizeaz prin introducerea n canalul endocervical a unei canule de plastic sau de metal la care
se ataeaz o par de cauciuc cu care se aspir. Produsul aspirat este ntins pe una sau mai multe
lame de sticl i fixat imediat.
3.
Frotiul endometrial descris de Isaacs. n cavitatea uterin se introduce o canul
de inox flexibil cu diametrul de 1,9 mm, cu aproximativ 40 perforaii, la care este ataat un
dispozitiv asemntor unui robinet. Canula este deplasat de la o extremitate a cavitii la
cealalt, n timp ce se aplic o presiune negativ cu ajutorul unei seringi de 10 ml. Materialul
aspirat se ntinde n strat ct mai subire pe una sau mai multe lame i se fixeaz imediat n alcool
95%.

4. Splarea n jet i lavajul endometrial

Metoda jetului Gravlee implic splarea cavitii uterine cu ser fiziologic sub presiune
negativ, pentru evitarea diseminrii eventualelor celule tumorale prin trompa uterin.
n uter se introduce un tub format din 2 cilindri cu multiple perforaii pe o parte, ajustat
astfel nct s ajung pn la 1 cm de fundul uterului. Un tampon cervical la nivelul orificiului
exterior creaz o cavitate nchis etan. Presiunea negativ se creeaz n cavitatea uterului cu
ajutorul unei seringi ataat unuia dintre cilindri. Aceasta duce la formarea unui jet prin cilindrul
perforat care spal cavitatea endometrial nainte de a se rentoarce n sering. Materialul se
filtreaz apoi se centrifugheaz, se ntinde pe lame i se coloreaz. Aceast metod nu necesit
anestezie i poate fi efectuat i la pacientele din ambulator.
Oricare ar fi valoarea recoltrii directe de la nivelul endometrului, trebuie subliniat faptul
c n cazul oricrei femei n postmenopauz, pe ale crei frotiuri Pap sunt prezente celule
endometriale, este necesar o investigaie suplimentar n absena anomaliei citologice. n plus,
prezena pe frotiuri a celulelor endometriale la orice femeie peste 40 de ani, dup ziua 14-a a
ciclului, n absena unui dispozitiv intrauterin, impune investigaie similar.
Prelucrarea frotiurilor
6

Fixarea
a. Aspecte generale ale metodelor de fixare
Fixarea imediat a materialului celular este primul pas esenial pentru acurateea
diagnosticului citologic. Scopul fixrii n citologie este pstrarea caracteristicilor citomorfologice
ct mai apropiate de cele in vivo i meninerea elementelor citochimice eseniale diagnosticului
citologic.
Fixatorul reprezint o substan utilizat pentru meninerea formelor i structurilor
celulare existente. Acest lucru se realizeaz prin fixarea imediat a frotiurilor dup ntinderea
materialului recoltat.
Fixarea prin uscare n aer, care apare n 10 sec de la ntinderea frotiului, poate face ca
frotiul s fie dificil sau imposibil de interpretat n coloraia Papanicolaou.
Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un fixator optim sunt:
-

penetrarea rapid n celule;

minimalizarea retraciei (micorrii) celulelor;

meninerea integritii morfologice;

inactivarea enzimelor autolitice;

s nlocuiasc apa intracelular;

s permit ptrunderea coloranilor n celule;

s permit aderarea celulelor la suprafaa lamei de sticl;

s corespund metodei de colorare care va fi folosit ulterior;

s fie bactericid;

s fie reproductibil.

Iniial, Papanicolaou (1963) i Reider (1966) au utilizat, ca fixator, un amestec de eter i

etanol 95% n raport 1:1. Acest amestec a fost nlocuit n ultimii ani cu diverse soluii i spray-uri
fixatoare.
Exist trei metode de fixare:
1. Fixarea umed prin introducerea imediat a frotiurilor proaspt recoltate ntr-o
soluie fixatoare. Ele rmn n aceast soluie pn ajung n laborator unde sunt
numerotate i colorate. Celulele nu sunt expuse la aer.
2. Fixarea umed cu uscare n aer ulterioar - frotiurile se introduc imediat ntr-o
soluie fixatoare o anumit perioad de timp, dup care se scot din fixator, se usuc i
apoi se transport la laborator. Odat ajunse aici, se reintroduc n etanol 95% soluie
nainte de colorare.
3. Fixarea cu spray se realizeaz prin pulverizarea frotiurilor proaspete cu un spray
fixator.
7

Spray-urile fixatoare constau de obicei dintr-o substan de baz alcoolic i o substan

ceroas (Carbowax) care produce un strat protector ce acoper celulele. n acest caz, lama de
sticl se aeaz pe un plan neted i se pulverizeaz asupra frotiului de la o distan de 15-25 cm.
Dac distana este prea mic, jetul de pulverizare poate produce alunecarea pe lam a
materialului recoltat cu formarea de suprapuneri celulare sau chiar ndeprtarea definitiv a
acestuia .
n cazurile n care nu poate fi evitat fixarea frotiului prin uscare n aer i totui acestea
trebuie colorate prin metoda Papanicolaou, se poate obine rehidratarea lor prin introducerea
lamelor ntr-o soluie de 50% glicerol i ap. n aceste condiii, ns, rezultatele obinute prin
aceast metod sunt suboptimale.
nainte de colorare, se introduc frotiurile n dou bi separate de etanol 95%, pentru a
ndeprta etilen-glicolul (Carbowax) care acoper celulele. Frotiurile rmn n prima baie de
etanol aproximativ 30 de minute. n a doua baie de etanol 95% frotiurile sunt inute 10-15
minute. Folosirea acestor dou bi de etanol este de obicei suficient pentru a dizolva substana
ceroas.
Fixatorii alcoolici cei mai folosii sunt:
-

etanol 95% - acioneaz rapid i nu e toxic;

izopropanol 80%;

propanol 80%;

metanol 100% e toxic, se folosete mai ales pentru frotiurile uscate n aer;

alcool denaturat 95% (90 pari etanol 95%; 5 pri etanol absolut; 5 pri izopropanol
absolut)

alcool pentru analiz (metanol absolut, izopropanol 80%, aceton 90%)

Pentru ca fixatorul s penetreze suprafaa celulelor, frotiul trebuie ntins n strat ct mai
subire care este uor de fixat, de colorat, de montat i de examinat.
Prezena pe frotiu a hematiilor care acoper parial sau total celulele epiteliale trebuie
consemnat n rezultatul citopatologic, conform Sistemului Bethesda, ca frotiu optim sau
nesatisfctor. Exist diferite metode pentru fixarea i prelucrarea frotiurilor sau a probelor
hemoragice. Boschann recomand adugarea unei picturi de acid acetic n soluia de etanol 95%
n care se face fixarea frotiurilor, pentru liza hematiilor, dar i pentru fixare. Unele laboratoare
folosesc fixatorul Carnoy sau Clarke sau formule modificate ale acestora. Unii autori recomand
fixarea iniial a frotiurilor i ulterior introducerea lor ntr-o soluie de lizare, n timp ce alii
introduc frotiurile direct ntr-un mediu pentru liza hematiilor. Important este ca frotiurile s fie
bine splate dup scoaterea lor din aceast soluie, iar timpii de colorare n hematoxilin i
eozin s fie mai mici.
Fixatorul Carnoy se prepar ntotdeauna proaspt din etanol absolut, cloroform i acid
acetic glacial n proporii de 6:3:1. Reprezint un excelent fixator nuclear i are rol i n fixarea
glicogenului. Avnd n vedere c, dup un interval de timp, aceast soluie se transform n acid
clorhidric, se recomand nlocuirea lor dup fiecare utilizare i agitarea nainte de folosire.
8

Fixatorul Clarke este compus din etanol absolut i acid acetic glacial n proporie de 3:1.
Calitatea fixrii trebuie monitorizat de personalul mediu din laborator, iar frotiurile cu
fixare slab sau inadecvat trebuie raportate clinicienilor. Frotiurile fixate corespunztor sunt
apoi colorate prin diferite metode i examinate la microscop.

Tehnici de prelucrare a unor materiale din afara sferei ginecologice

Prelucrarea revrsatelor pleurale, peritoneale i pericardice

Prelucrarea revrsatelor pleurale, peritoneale i pericardice face parte tot din sfera
citologiei exfoliative.
Studiul citologic al fluidelor corpului reprezint una din cele mai vechi aplicaii ale
tehnicilor citologice, scopul su fiind determinarea cauzei acumulrii de fluid n cavitile
corpului, cum ar fi pleura, pericardul (efuziuni) i cavitatea abdominal (lichid de ascit).
Revrsatele seroase pot fi transudate sau exudate, clasificare care se bazeaz pe greutatea
specific, pe coninutul de proteine i ali parametri biochimici. Transudatele sunt fluide cu
greutate specific mic (sub 1010), cu coninut proteic sczut i cu celularitate redus. Exudatele
au greutate specific mare (peste 1010), un bogat coninut proteic i numeroase celule.
Deoarece revrsatele seroase pot avea diferite aspecte macroscopice n funcie de
mecanismul de producere i de istoricul clinic, se recomand precizarea acestor aspecte pe
buletinul citologic, precum i a volumului probei lichidiene trimise n laboratorul de citologie.
Celulele dintr-un exudat ader mai bine la suprafaa unei lame de sticl comparativ cu
celulele dintr-un transudat.
Citologia revrsatelor i-a extins utilitatea n evaluarea lavajelor peritoneale pentru
stadializarea neoplaziilor maligne ovariene, precum i n supravegherea pacientelor supuse
tratamentelor specifice.
Etiologia revrsatelor este foarte variat, putnd s apar n boli de colagen, afeciuni
circulatorii, neoplasme i infecii.
Recoltarea adecvat, conservarea i prelucrarea corespunztoare a revrsatelor seroase
sunt eseniale pentru o corect interpretare citologic.
Metoda de prelucrare poate fi aleas n funcie de rezultatele testului rapid cu albastru de
toluidin. n practic exist urmtoarele posibiliti:
1. Dac produsul este n cantitate mic, are aspect clar i conine puine celule (la testul
cu toluidin), atunci metoda de elecie este filtrarea cu ajutorul filtrelor citologice.
2. Dac produsul este tulbure, are puin sediment dup centrifugarea iniial i are
celularitate moderat, fie se efectueaz frotiuri direct din sediment, fie se prelucreaz prin
citocentrifugare sau filtrare. Frotiurile directe sunt fixate att uscat ct i umed pentru coloraiile
May-Grunwald Giemsa (MGG), Diff-Quick i Papanicolaou.
9

3. Daca fluidul este hemoragic i nu are sediment, se poate folosi metoda cu saponin
combinat cu filtrarea produsului, frotiuri directe sau citocentrifugare.
Centrifugarea se realizeaz prin adugarea n eprubeta conic cu fluid a unei cantiti
egale de alcool etilic 95%, timpul i viteza de centrifugare fiind diferite, n funcie de produs:
-

revrsatele seroase 5-10 minute, 1500-3000 rot/min

lichidul cefalo-rahidian (LCR) 4-5 minute, 1500-2000 rot/min

urina 10 minute, 2000-2500 rot/min

sputa (cu fixator Carbowax) 5 minute, 1500 rot/min.

n general se efectueaz minim trei frotiuri din sediment, pentru diferite coloraii, iar
sedimentul rezidual poate fi inclus la parafin i prelucrat ca bloc celular. Coloraiile utilizate
sunt: Papanicolaou, MGG, Diff-Quick, Hematoxilin-Eozin. Probele proaspete pot fi prelucrate
imediat fr fixator. Se pot realiza i coloraii rapide supravitale (coloraia cu albastru de
toluidin, cu albastru de tionin).
Prelucrarea probelor obinute din tractul genito-urinar
Efectuarea citodiagnosticului urinar se recomand n urmtoarele situaii:
-

diagnosticul primar al tumorilor uroteliale

hematurie

pacieni operai pentru tumori vezicale

diagnosticul primar al tumorilor tractului urinar superior

pacieni cu tumori ale organelor pelvine cu invazie posibil n tractul urinar

pacieni cu tumori maligne prostatice invadante n trigonul vezical i uretra prostatic

infecii urinare cronice rebele la tratament

adenom de prostat i sindrom de obstrucie subvezical asociat frecvent cu tumori

vezicale

aciuni de screening citologic urinar la populaiile cu risc crescut pentru neoplazia

vezical

identificarea focarelor de adenocarcinom care se pot dezvolta la nivelul mucoasei

rezervorului de tip colic din vezica de substituie (citologie prin lavaj).

Tehnica citologic pentru citologia urinar:

-

Recoltarea din urina eliminat spontan (citologie exfoliativ) sau lavajul cilor
urinare, prin irigarea cu ajutorul unui cateter sau cistoscop cu 50-100 ml ser
fiziologic. Cantitatea minim de urin spontan recoltat pentru examenul citologic
este de 50 ml.

Fixarea celulelor pe lama de sticl

10

Fixarea uscat util n cazul coloraiilor Giemsa, Pappenheim sau Hemacolor. Dup
centrifugarea urinii proaspete se realizeaz frotiuri din sediment care trebuie uscate
ct mai rapid pentru minimalizarea artefactelor ct mai mult cu putin. Aceast fixare
este adecvat pentru cel mult 24 de ore. Efectul fixrii este accentuat i prelungit prin
introducerea lamelor fixate n aer n alcool metilic (5-10 minute), etanol absolut sau
amestec n pri egale de etanol i eter (20-30 minute).
Fixarea umed necesar pentru coloraia Papanicolaou i se poate realiza n alcool
(imediat dup ntinderea frotiurilor, timp de 15 minute) sau cu ajutorul spray-ului
fixator (pulverizarea frotiurilor nc umede).
-

Concentrarea celulelor n urin

Eantioanele de urin spontan i lavajele care sunt paucicelulare pot fi centrifugate
cu 2000 rot/min, timp de 10 minute. Se ndeprteaz supernatantul i apoi acesta se
pelucreaz n funcie de metoda de colorare folosit.
Citocentrifugarea metod prin care materialul celular este concentrat direct pe o
lam de sticl, cu ajutorul unor centrifuge speciale.
Avantaje: concentrarea celulelor se face ntr-o arie mic pe lam, ceea ce le face uor
de gsit i interpretat i astfel se economisete mult timp.

Metode de colorare

Coloraia cu albastru de metilen se centrifugheaz urina proaspt sau conservat,

se pune o pictur de sediment pe lam i se aeaz o pictur de colorant dup care
se acoper cu lamela. Interpetarea citologic se face dup 5-10 minute. Frotiurile se
pot pstra maxim 24 de ore la frigider ntr-un mediu umed.

Coloraia Giemsa rapid folosete un amestec de azur metilen, metilen violet,

albastru de metilen i eozin, dizolvate n metanol i glicerin.

frotiurile sunt uscate apoi fixate n alcool absolut, 30 minute

fr splare, se acoper cu amestecul colorant, 20-30 de minute

splare cu ap distilat neutr sau cu tampon fosfat la pH de 7,2

uscare i examinare

Coloraia Szczepanik (Cytocolor), variant a coloraiei Papanicolaou:

fixare umed a lamelor

splare n ap distilat, 10 secunde

colorare cu hematoxilin modificat, 60 secunde

splare n ap curgtoare, 5 secunde

trecere prin propanol, 2 secunde

colorare n soluia policrom modificat, 60 secunde

11

trecere prin dou bi de propanol, 5 secunde

clarificare i montare.

Prelucrarea lichidului cefalo-rahidian (LCR)

n mod normal, LCR este un lichid clar, cristalin, ce conine doar cteva celule sanguine
mononucleate i niveluri sczute de glucoz i proteine, comparativ cu nivelul seric al
acestora. Orice cretere a numrului de celule n LCR sau modificri ale nivelului glucozei i
proteinelor indic un proces patologic.
Aplicaiile examenului citologic al LCR:
-

component a evalurii neurologice complete a pacienilor cu cancer i a pacienilor

cu sindromul imunodeficienei dobndite (SIDA), ndeosebi dac exist suspiciune
clinic de implicare a sistemului nervos central (SNC)

etap esenial n monitorizarea pacienilor cu limfom i leucemie

diagnosticul proceselor infecioase, mai ales la pacienii cu SIDA.

Prelucrarea i colorarea LCR se face separat de alte probe lichidiene, folosindu-se o

metod de filtrare n care toat cantitatea de lichid este utilizat n scop diagnostic.
Metode de citoprelucrare:
-

metode cu filtre de celuloz i policarbonat

centrifugare simpl

frotiuri directe

citocentrifugare

nu se recomand prefixarea n alcool deoarece acesta poate precipita orice protein

din lichid.

Deoarece LCR normal conine puine celule, iar celulele maligne, eventual prezente, sunt
de asemenea n numr mic, cele mai bune rezultate se obin prin citocentrifugarea lichidului,
care se efectueaz similar cu citocentrifugarea probelor obinute din tractul genito-urinar. Pentru
evitarea contaminrii cu alte tipuri celulare din bateria de colorare, frotiurile din LCR se
coloreaz separat.

Prelucrarea probelor mucoide

Probele citologice provenite de la nivelul tractului respirator reprezint un procent
semnificativ din produsele prelucrate ntr-un laborator de citologie.
Sputa reprezint un alt exemplu de citologie exfoliativ. Sputa este compus din
secreii, predominant mucoide i celule de la nivelul cavitii bucale, faringe,
laringe, trahee, arborele bronhic i alveolele pulmonare i se poate obine prin tuse
12

profund. Este produsul cel mai uor de obinut, iar citodiagnosticul din sput este
testul iniial pentru evaluarea leziunilor pulmonare, mai ales pentru cele localizate
central i care prezint suspiciune clinic de degenerare malign; de asemenea,
sputa este folosit i pentru depistarea infeciilor de diverse etiologii, ndeosebi la
pacienii imunocompromii.
Dezavantaje: imposibilitatea localizrii leziunilor i sensibilitatea sczut n depistarea
microorganismelor.
Periajul i lavajul bronhic
Probele citologice se realizeaz prin introducerea unui bronhoscop care permite
recoltarea direct de la nivelul leziunilor dezvoltate la nivelul mucoasei bronhice, ajungnd pn
la nivelul bronhiilor segmentare.
Produsul de periaj bronhic poate fi etalat direct pe lame de sticl i apoi fixat uscat sau
umed; produsul de lavaj este recoltat dup instilarea a 3-5 ml de soluie salin izotonic. Acesta
din urm poate fi centrifugat, filtrat sau prelucrat cu ajutorul metodelor de citologie lichid n
monostrat.
Eantioanele citologice obinute prin periaj (citologie abraziv), cu sau fr ghidaj cu
instrument cu fibr optic, difer semnificativ de specimenele rezultate prin citologie
exfoliativ. Celulele sunt obinute direct din esutul de origine, fr a prezenta astfel
modificrile degenerative sau necrotice. Daca exist celule inflamatorii, acestea provin de la
nivelul leziunii i nu reprezint rezultatul unui eveniment inflamator secundar. Eantionul
obinut este n general srac celular, de aceea necesit o prelucrare atent pentru a prezerva
celularitatea existent. Specimenele obinute prin periaj reuesc s abordeze o arie mai larg
dect biopsia obinut cu instrumentar similar cu fibr optic. De asemenea, periajul permite i
abordarea leziunilor submucoase.
Lavajul bronhoalveolar (BAL)
Se realizeaz n cursul unei endoscopii efectuat dup metoda clasic i const n
instilarea, prin intermediul bronhoscopului introdus pn la nivelul unei bronhii segmentare sau
subsegmentare, a 150-300 ml de soluie salin izotonic steril (nclzit n prealabil la 37o C),
fragmentat n pri de 20-60 ml, urmat de recoltarea produsului dup fiecare instilaie, prin
aspiraie blnd, fie cu o sering, fie cu un aspirator.
BAL este testul cel mai indicat pentru depistarea citologic a agenilor infecioi la
pacienii imunocompromii (putndu-se realiza i culturi sau alte teste microbiologice); el este
util i n evaluarea pneumoconiozelor (azbestoza), a bolilor pulmonare induse de medicamente i
a leziunilor maligne (mai ales carcinomul bronhioloalveolar).
Puncia aspirativ transcutan
Este folosit n special n evaluarea leziunilor pulmonare periferice, fiind indicat n
situaiile n care sputa sau produsele de lavaj bronhic nu ofer un diagnostic satisfctor.

13

Procedeul are mortalitate i morbiditate mult mai reduse comparativ cu biopsia

pulmonar deschis; la 7% din pacienii care fac pneumotorax se impune rareori introducerea
unui tub de dren, iar hemoptizia minim care poate s apar nu are semnificaie clinic.
Contraindicaii: pacieni necooperani, pacieni cu tuse necontrolabil, emfizem sever,
hipertensiune pulmonar, leziuni vasculare suspecte, diateze hemoragice, chisturi echinococice
sau pacieni aflai sub tratament cu anticoagulante.
Puncia aspirativ transbronhic (WANG FNA) se folosete n cazul leziunilor
aflate n vecintatea mucoasei bronhice, dar care nu o intereseaz direct.
Puncia se realizeaz cu ajutorul unui ac flexibil (ac Wang) introdus prin bronhoscop care
peneteraz peretele bronhic i prin care se aspir.

Metode de prelucrare
Deoarece la eantioanele mucoide nu se poate realiza concentrarea celular prin
centrifugare, datorit vscozitii importante a acestora, s-au dezvoltat metode alternative pentru
creterea randamentului diagnostic.
a.

Metoda alege i ntinde

Prelucrarea probelor proaspete, nefixate

se realizeaz patru frotiuri ct mai subiri, se adaug o pictur de soluie Hank sau
ap distilat, pentru a mpiedica uscarea i se ntinde pe lam ct mai uniform.
se fixeaz n etanol 95%, 15-30 minute

se coloreaz prin metoda Papanicolaou

Prelucrarea probelor recoltate n soluie de fixare

-

pentru fixare se folosete alcool etilic 50% sau 70% n proporii egale (fixeaz
celulele,
lizeaz
hematiile,
oprete
autoliza,
mpiedic
dezvoltarea
microorganismelor).

Dezavantaje: celulele se micoreaz, produsul se ntrete, nu mai ader la lama de sticl

i este dificil n obinerea unui frotiu ct mai subire.
Prelucrarea se face la fel ca pentru probele nefixate, cu deosebirea c pentru ntinderea
frotiurilor se utilizeaz lame prealbuminizate.

b.
Metoda de concentrare Saccomanno const n omogenizarea mecanic a probei
nainte de ntinderea produsului pe lama de sticl, cu reducerea cantitii de mucus i
concentrarea celulelor.
Tehnic:
-

se las proba ntr-o camer steril, 30 minute

14

se adaug un amestec fixator (Carbowax 2% i etanol 50%) la o cantitate dubl de

prob

omogenizare i fixare timp de o or, n camera steril

agitare n agitator electric, o perioad de timp variabil n funcie de tipul de produs

(apos, semimucoid, mucoid 2 secunde la vitez mic sau 6, 8 respectiv 10-30
secunde la vitez mare)

se mparte proba n dou pri egale care se pun n eprubete conice de 15 ml i se

centrifugheaz la 1500 rot/min, 5 minute

se ndeprteaz supernatantul, urmat de omogenizarea supernatantului (2 ml) rmas

mpreun cu sedimentul

cu pipeta Pasteur se aplic cte o pictur de sediment pe lam, n strat ct mai subire

fixare i colorare corespunztor cu metoda de fixare aleas.

Se recomand ca frotiurile obinute din sput s fie colorate cu hematoxilin Gilljumtate oxidat i soluii OG i EA modificate, astfel:
-

fixare n alcool 95%

ndeprtarea Carbowax n alcool 95%

splare n ap de robinet 2 bi, cte 10 scufundri n fiecare

colorare cu hematoxilin Gill-jumtate oxidat 1 minut

splare n ap de robinet 2 bi, 10 scufundri n fiecare

splare cu substituent Scott 2 minute

splare cu ap de robinet 2 bi, a cte 10 scufundri

etanol 95% - 10 scufundri

colorare cu OG modificat 2 minute

etanol 95% - 2 bi a cte 10 scufundri

colorare cu amestec EA modificat 10 minute

etanol 95% - 3 bi, cte 10 scufundri fiecare

etanol absolut 2 bi a cte 10 scufundri fiecare

clarificare n xilen 3 bi

montare.

Biopsia aspirativ
Puncia aspirativ cu ac fin (FNA)

15

Puncia este o manoper efectuat cu un ac subire, iar produsul rezultat din puncia
aspirativ reprezint materialul aspirat provenit din masa tumoral puncionat. Masa tumoral
poate fi lichid (chisturi) sau solid (cazul tumorilor propriu zise: fibroadenom, carcinom,
ganglion).
Materialul obinut prin aspiraie cu ac fin se etaleaz (ntinde) pe o lam sub forma unui
frotiu, ulterior colorat printr-o tehnic citologic de colorare i apoi interpretat la microscopul
optic de ctre medicul anatomo-patolog sau citolog, care va preciza diagnosticul n funcie de
populaia celular pe care o identific pe frotiu.
Avantaje: metod rapid, simpl, economic (cost mult mai sczut comparativ cu
biopsia), abordabil pentru diferite localizri i uor tolerat de pacient: glanda mamar, tumori
cutanate, glanda tiroid, ficat, plmn (rezultatul poate fi obinut ntr-o zi), nu necesit
spitalizare, putndu-se efectua n sala de operaie sau ntr-un simplu cabinet al serviciului de
policlinic sau ambulator, nu las cicatrici, spre deosebire de biopsii, ofer confort psihic mai
bun dect o intervenie chirurgical, fiind mai puin traumatizant dect o biopsie.
Tehnica
FNA este o investigaie cu caracter minim invaziv.
Prima etap o reprezint identificarea i localizarea masei tumorale, ce poate fi realizat
att de chirurg ct i de anatomopatolog. Puncia este precedat de dezinfecia local a
tegumentului cu soluie de alcool 70% sau iod. Echipamentul necesar include o sering de 10 sau
20 ml i ac fin, cu diametrul exterior mai mic de 1 mm, bine ajustat. De obicei se folosesc ace cu
diametrul de 19G, 20G sau 22G (0,57 mm), care se ataeaz unei seringi de 20 ml; aceast
sering poaste fi manipulat cu ajutorul unui dispozitiv port-sering (Comeco-Seringe Pistol)
care permite medicului s controleze seringa i acul cu o mn, iar cu cealalt s susin
formaiunea tumoral. Se susine tumora cu o mn n poziie fix, iar cu cealalt se
puncioneaz printr-o lovitur scurt, apreciindu-se n acelai timp i consistena formaiunii
tumorale. Apoi se efectueaz micri de aspiraie n sering prin deplasarea pistonului sus-jos, n
timp ce acului i se imprim cteva micri de du-te-vino i de rotaie. Se fac apoi noi prelevri n
spie de roat (puncie radial) plecnd din acelai punct central de la nivelul tegumentului.
Acul se retrage cnd materialul aspirat se observ la vrful seringii; principiul const n umplerea
cu celule a acului, nu a seringii (un ac poate conine mai mult de 100 000 de celule, ceea ce este
suficient pentru un diagnostic citologic). Ulterior se exprim coninutul acului pe una sau mai
multe lame.
Aprecierea calitii prelevatului (celularitate) se face imediat, la locul unde s-a efectuat
puncia, prin examinarea la microscop a unuia sau dou frotiuri colorate extemporaneu.
Rezultatele cele mai bune se obin atunci cnd exist o colaborare strns ntre chirurg i
anatomopatolog i cnd puncia se efectueaz n prezena anatomopatologului care poate aprecia
calitatea aspiratului prin coloraia extemporanee cu Hematoxilin-Eozin. Dac examinatorul
apreciaz c celularitatea este insuficient pentru citodiagnostic, punctia se repet imediat fr ca
pacientul (pacienta) s fie rechemat ulterior la medic.

16

Produsul aspirat poate fi prelucrat fie sub forma frotiurilor directe, fie sub forma
suspensiilor celulare. Frotiurile directe sunt fixate uscat sau umed i colorate corespunztor
metodei de fixare aleas.
Complicaii:
- posibilitatea implantrii celulelor tumorale pe traiectul acului de puncie, mai ales n
cazul tumorilor osoase
- mastit i hematoame (la nivelul glandei mamare); hematoamele pot determina
apariia rezultatelor fals pozitive, de aceea se recomand ca mamografia s fie
realizat fie naintea punciei, fie la dou sptmni dup aceasta
-

pneumotorax (n cazul punciei aspirative cu ac fin la nivelul glandei mamare, a

ganglionilor axilari sau supraclaviculari).

n cazul patologiei tiroidiene, principala indicaie pentru puncia aspiraie o reprezint

nodulul tiroidian recent aprut, cu diametrul peste 1 cm, rece la examenul scintigrafic i/sau
hipoechogen, contur neregulat i microcalcificri. Puncia aspiraie tiroidian poate fi efectuat
de clinician, chirurg, radiolog sau anatomopatolog. Cnd puncia nu este efectuat de
anatomopatolog este important colaborarea cu acesta, deoarece este medicul care va realiza
interpretarea frotiurilor.
n cazul leziunilor mamare, puncia aspirativ cu ac fin a devenit un procedeu clinic de
cvasi-rutin, frecvent nlocuind biopsia tisular preoperatorie. Acest procedeu este utilizat n
diagnosticul leziunilor palpabile solide sau chistice sau leziunilor nepalpabile detectate
mamografic, ultrasonografic sau prin rezonan magnetic (MRI sau RMN). Pentru rezultate
optime, leziunile palpabile trebuie s fie aspirate de ctre un anatomopatolog cu experien, ce
poate obine istoricul direct de la pacient/pacient. Se sugereaz c interogarea pacientei asupra
localizrii leziunii este uneori mai util dect palparea n sine. FNA este util de asemenea dup
rezecia segmentar a leziunii mamare, deoarece permite separarea sechelelor benigne ale
procedurii de carcinomul recurent.
Puncia fin aspirativ ecoghidat endoscopic (EUS-FNA)
EUS-FNA reprezint o metod simpl, sigur i sensibil care permite diagnosticul
specific i corect al leziunilor cu localizare profund la nivelul abdomenului i/sau toracelui.
Probele pot fi obinute din leziunile mici (sub 25 mm), indiferent de organ.
Indicaii:
-

tumori pancreatice (sub 2 cm)

tumori care detrmin compresiunea extrinsec a peretelui gastric

leziunile mici ale lobului hepatic stng

tumori recidivate

limfoganglionii celiaci (sub 3 cm)

tumori i limfoganglioni mediastinali

tumori submucoase
17

pliuri gastrice intens hipertrofiate cu biopsii endoscopice negative.

Contraindicaii relative:
-

leziuni mai mici de 5 mm

leziuni la distan mai mare de 6-7 cm de prob

tulburri de coagulare a sngelui

Consideraii tehnice
Pentru efectuarea punciei fine aspirative ghidate ecoendoscopic se folosesc ace de
diferite lungimi i calibru: 5cm/25; 5 cm/22; 6 cm/22 ac tip-eco (ajustabil).
Pentru puncia fin aspirativ se folosete de rutin un ac cu diametrul de 25 pentru
majoritatea leziunilor, cu ajutorul cruia se obine material celular suficient, iar cantitatea de
snge coninut de acesta este minim. Cnd se dorete obinerea de fragmente tisulare se
folosete un ac de 19 cu ajutorul cruia se obine o cantitate mai mare de material celular. De
asemenea, acele de 19 i 22 sunt preferate pentru aspirarea coleciilor lichidiene i a
limfoganglionilor mediastinali cu scleroz.
Modul de prelucrare al materialului aspirat
-

etalarea pe lam a materialului aspirat

fixarea frotiului prin uscare (pentru coloraia rapid MGG) sau fixare umed (pentru
coloraia Papanicolaou)

colorarea frotiurilor prin metodele amintite

produsul rmas dup etalare mpreun cu cel obinut prin splarea acului de puncie
cu alcool etilic absolut este utilizat pentru realizarea blocurilor celulare (centrifugare
n alcool etilic urmat de fixare n formol 10% pn a doua zi i prelucrare prin
metoda clasic a includerii la parafin)

secionarea blocurilor celulare coloraii uzuale (HE, PAS) i speciale

(imunocitochimie)

efectuarea de teste suplimentare (testare ADN, flow-cytometrie, culturi pentru agenii

infecioi, etc).

Citologia intraoperatorie
Frotiurile se obin prin presarea forat a unei lame de sticl pe suprafa a de sec iune a
esutului. Frotiuri adecvate se realizeaz i prin rzuirea suprafeei de seciune a biopsiei sau prin
strivirea unor mici fragmente tisulare ntre dou lame i tragerea lor n afar (n cazul leziunilor
SNC).
Ca i n cazul punciei aspiraie, frotiurile pot fi uscate la aer i colorate cu o colora ie
rapid hematologic sau fixate i colorate cu coloraiile Papanicolaou sau Hematoxilin-Eozin.
18

Citologia intraoperatorie este aplicabil tuturor organelor i esuturilor. Biopsiile mamare,

paratiroid, colul uterin i multe alte esuturi int pot fi studiate. Exist comunicri care au
evaluat rezultatele citologiei limfoganglionului santinel n cancerul mamar i melanomul
malign.
Avantaje i dezavantaje:
Comparativ cu o seciune la ghea, frotiurile sunt mult mai uor, mai rapid i mai ieftin
de preparat. Astfel, principala valoare a citologiei intraoperatorii este diagnosticul rapid. Aceast
tehnic este foarte valoroas dac specimenul este foarte mic i fragil (biopsiile SNC) sau n
cazul unor organe care nu se preteaz la ngheare i secionare (pancreas).

Metode de colorare a frotiurilor

Metoda May-Grunwald-Giemsa
Aceast metod folosete dou soluii colorante:
-

Soluia May-Grunwald care este eozinat de albastru de metilen dizolvat n metanol

absolut

Soluia Giemsa care este un amestec de doi colorani (un colorant bazic Azur II i un
colorant neutru Azur II eozin) dizolvai n metanol absolut i glicerin.

Tehnic
-

fixare n alcool metilic 15 minute

uscare n aer 15 minute

colorare cu soluia May-Grunwald buffer (soluie tamponat) 5 minute

colorare cu soluia Giemsa tamponat 25 minute

splare sub jet de ap de robinet 5 minute

uscare

Soluia tamponat May-Grunwald - 50 ml soluie May-Grunwald cu 50 ml soluie

tamponat (se prepar sptmnal)
Soluia Giemsa tamponat - 10 ml soluie Giemsa cu 90 ml soluie tamponat (se prepar
zilnic).
Soluia tamponat pentru lucru - 20 ml soluie A + 21 ml soluie B + 960 ml ap distilat
se aduce la pH de 7.
Soluia A 9,078g KH2PO4/1L
Soluia B 11,876g NO2HPO42H2O/1L.
Rezultatul coloraiei: nuclei violet, citoplasmele cu nuane de albastru sau rou n funcie
de tipul de celul.
Metoda de colorare Papanicolaou
19

Metoda a fost introdus pentru vizualizarea optim a celulelor maligne exfoliate de la

nivelul suprafeelor epiteliale ale corpului. Ea nu are specificitate pentru nicio substan ntlnit
n aceste celule; mai mult, reprezint o reacie de colorare policrom care evideniaz multiplele
variaii ale morfologiei celulare ce prezint diferitele grade ale maturitii celulare i ale
activitii metabolice.
Principalele avantaje:
-

evidenierea detaliului nuclear printr-o fixare corespunztoare i o colorare

corespunztoare a nucleilor

transparena citoplasmatic prin folosirea coloranilor alcoolici i o clarificare optim

posibilitatea evidenierii diferenierii celulare datorit coloranilor policromatici.

Att metoda de baz ct i variantele sale necesit patru etape principale:

-

fixarea

colorarea nucleilor

colorarea citoplasmelor

clarificarea

ntre acestea se interpun o serie de etape secundare cu soluii care hidrateaz (pentru a
favoriza fixarea colorantului nuclear), deshidrateaz (pregtind celulele pentru fixarea
coloranilor citoplasmatici) i spal celulele.
Principiu
Hematoxilina Harris sau Gill, colorant nuclear albastru foarte selectiv este combinat cu
amestecul policrom EA (eozin, verde lumin i brun Bismarck), un colorant citoplasmatic ce
difereniaz celulele cianofile (citoplasm albastru-verde) de cele eozinofile (citoplasm rou
deschis). Ultimul compus este soluia OG, care coloreaz elementele keratinizate (de la roz la
portocaliu).
Tehnica de colorare
- alcool 96o 1 min
- ap distilat 2 min
- hematoxilina Harris 1-2 min
- ap curgtoare 5min
- alcool 95o 15 sec
- OG6
2 min
o
- alcool 95 15 sec
- alcool 95o 15 sec
- EA50
5 min
- alcool 95o 15 sec
- alcool absolut
30 sec
- alcool absolut
30 sec
- xilen
2 min
- xilen
2 min
20

Rezultatul coloraiei:
- celule epiteliale - nuclei albastru nchis sau violet nchis, citoplasma roz-rou (celulele
eozinofile) sau verde albastru (celulele bazofile)
- hematiile rou-strlucitor (dac nu sunt hemolizate)
- leucocitele albastru deschis cu nucleii albastru nchis-negru
- bacteriile cenuii
- trichomonadele albastru cenuiu palid
- monilia- hifele roz, sporii rou strlucitor
- mucus benzi bleu sau roz.
Metoda de colorare Diff-Quick
Este o coloraie diferenial rapid ale crei rezultate sunt similare cu cele din coloraia
Wright-Giemsa. Aceast metod folosete trei soluii: un fixator pe baz de metanol, un colorant
pe baz de eozin i un amestec constituit din tiazin, xanten i triarilmetan.

Tehnic
-

fixare 20 sec

colorare cu soluia I 20 sec

colorare cu soluia II 20 sec

ap distilat 10 sec

etanol 95% - 10 sec

etanol absolut 15 sec

xilen 15-20 sec

montare

Fixatorul i cele dou soluii sunt achiziionate gata preparate de la firma

productoare.
Aceast tehnic poate fi folosit att ca metod de colorare rapid ct i permanent.
Frotiurile colorate cu Diff-Quick sunt uor recolorate cu coloraia Papanicolaou. Nu este
necesar decolorarea.

Metoda de colorare cu albastru de toluidin

Albastru de toluidin ofer un bun detaliu nuclear, favoriznd evidenierea structurilor
tridimensionale i a vacuolelor proeminente.
-

se pune o pictur de sediment pe o lam de sticl

21

lng aceasta, se pune o pictur de soluie de albastru de toluidin (0,5 mg albastru

de toluidin n 20 ml etanol 95% i 80 ml ap distilat, filtrat i pstrat la frigider
ntr-un recipient ntunecat)

se amestec cele dou picturi

se aplic lamela

examinare la microscop

Ca substitueni pentru albastru de toluidin se pot folosi albastru de tionin (1 mg albastru

de tionin, 100 ml etanol 25% i 2 picturi de acid acetic glacial) i albastru de metilen (1,5 mg
albastru de metilen, 30 ml etanol 95%, 2 ml hidroxid de potasiu 0,1N). Soluiile se filtreaz i se
pstreaz la frigider ntr-un recipient ntunecat.

Erori de colorare i modaliti de evitare a acestora

-

despinderea celulelor de pe lam pentru evitare se realizeaz splarea cu atenie a

frotiurilor

ndeprtarea colorantului care a penetrat celulele lamele s nu stea prea mult timp n
soluii alcoolice dup OG i EA

xilenul trebuie filtrat zilnic

contaminarea cu soluia urmtoare lamele (frotiurile) trebuie bine scurse dup

fiecare substan

nivelul soluiilor trebuie meninut constant pe toat durata etapelor de colorare

pentru rezultate foarte bune, pH-ul amestecului EA trebuie s fie ntre 4,5-5

soluiile trebuie pstrate n recipiente nchise la culoare i etane atunci cnd nu sunt
folosite.

Metode citologice moderne

Una din cele mai moderne metode de citodiagnostic este tehnica citologiei lichide n
monostrat (eng. liquid based cytology, LBC) aprut ca o alternativ a frotiului convenional
Papanicolaou utilizat n citologia exfoliativ cervico-vaginal. Aceasta reprezint o metod mai
performant de prelevare i prelucrare a produsului recoltat, cu obinerea unui monostrat celular,
asigurndu-se astfel condiii mai bune de citire i de interpretare a frotiurilor.
Avantaje:
- nu se pierde nimic din produsul recoltat
- se obine o mai bun omogenizare a produsului biologic, reducnd suprapunerile
celulare i elementele care pot obstruciona interpretarea citologic (snge, leucocite,
mucus)
22

sunt eliminate artefactele de uscare prin fixarea imediat dup recoltare prin
introducerea lor n lichidul de conservare

frotiurile pot fi refcute fr a fi necesar o nou recoltare iar din produsul rmas se
pot realiza o serie de teste suplimenatre (imunocitochimice, depistare ADN HPV).

n prezent se cunosc trei metode de citologie lichid: Cytoscreen, Cytyc ThinPrep2000,

AutoCyte PREP (Tripath). Prima folosete, pentru obinerea monostratului celular, metoda
centrifugrii, a doua metoda filtrrii i a treia metoda sedimentrii conform gradientului de
densitate. Toate cele trei metode coloreaz frotiurile obinute prin metoda Papanicolaou iar
interpetarea citologic se face cu ajutorul Sistemului Bethesda.
Metoda Cytoscreen prezint avantajul c poate fi aplicat i altor produse dect cele
ginecologice care sunt prelucrate n mod asemntor, cu deosebirea c se folosesc alte camere
citologice. Aceast metod se bazeaz pe patru etape principale:
-

prelevarea probei cu dispozitivul Cytoprep, n mediu lichid (lichidul de conservare

CYTeasy)

citirea automat a densitii celulare a probei cu ajutorul unui nefelometru

(standardizarea n cinci clase, A, A2, B, B2, C, conform cantitii de celule recoltate,
de la densitate foarte mic la densitate foarte mare)

depunerea celulelor n monostrat pe lama de sticl (prin centrifugare, ntr-o camer

citologic special care se ataeaz lamei)

citirea i interpretarea frotiurilor, cu posibilitatea examinrii de preparate

cvasiidentice obinute ulterior din acelai produs de prelevare (screening morfologic)
sau a efecturii de teste complementare.

Principii de baz n interpretarea i raportarea produselor citologice

Diagnosticul citologic, frecvent mai dificil dect diagnosticul histopatologic, trebuie s se
bazeze pe o sintez a tuturor datelor disponibile, nu doar pe modificrile celulare individuale.
Astfel, datele clinice sunt indispensabile n realizarea diagnosticului citologic. De
asemenea, innd cont de alterrile minime nucleare i citoplasmatice care pot aprea datorit
modului de prelucrare a frotiului, este foarte important meninerea unei uniformiti a metodelor
tehnice folosite de fiecare laborator n parte.
Sistemul Bethesda, elaborat de ctre Institutul Naional de Cancer (National Cancer
Institute, Bethesda, Maryland) n 1988 i modificat n 2001, include o serie de criterii de
diagnostic pentru interpretarea frotiurilor cervico-vaginale. Se consider c acest sistem, dei util
n realizarea unor baze de date epidemiologice i de cercetare, mpiedic uneori flexibilitatea
diagnosticului realizat de anatomopatolog.
n realizarea citodiagnosticului este foarte important a se cunoate aspectele normale i
variaiile fiziologice ale celulelor. Acestea pot prezenta o serie de modificri morfologice care, n
absena cancerului, se prezint ca anomalii celulare substaniale (procese inflamatorii diverse,
modificri proliferative, metaplazice, degenerative, procese neoplazice benigne, alterri celulare
iatrogene).
23

Buletinul de diagnostic citologic trebuie s con in urmtoarele date, conform

Sistemului Bethesda 2001.
Modul de prezentare a raportului de citodiagnostic depinde de fiecare laborator n parte.
Date de identificare pacient
Medic
Diagnostic
Data si ora recoltarii probei
Data si ora primirii probei
SISTEM BETHESDA 2001 FROTIU CONVENIONAL / CITOLOGIE CERVICAL N
MEDIU LICHID

Satisfctor pentru evaluare celule endocervicale prezente /absente

Nesatisfctor pentru evaluare deoarece ....................................................................
I. Negativ pentru o leziune intraepitelial sau malign
Organisme: Trichomonas vaginalis
Herpes simplex Altele .................

Candida

Cocobacili Gardnerella Actinomyces Virus

Modificri celulare reactive asociate cu: inflamaia metaplazie DIU iradiere/chimioterapie

atrofie
II. Anomalii ale celulelor epiteliale
Cel. scuamoase: ASCUS (Celule Scuamoase Atipice de Semnificaie Nedeterminat)
ASC-H (Celule Scuamoase Atipice care nu pot exclude o leziune intraepitelial
de grad nalt)
LSIL: (Leziune intraepitelial de grad sczut)

cu atipii HPV

HSIL: (Leziune intraepitelial de grad nalt)

Carcinom cu celule scuamoase
Cel. glandulare: AGC Cel.glandulare atipice endocervicale / endometriale
AGUS (celule glandulare endocervicale atipice cu semnificatie nedeterminata)
Celule endometriale benigne n climax
Adenocarcinom: endocervical endometrial extrauterin
Alte neoplasme. ..
24

III. Evaluare citohormonal: Aspect hormonal corespunztor cu vrsta i anamneza

Aspect hormonal necorespunztor cu vrsta i anamneza
Nu poate fi evaluat
IV. Caracterizare general: Frotiu in limite normale
celulelor epiteliale

Modificari celulare benigne Anomalii ale

Diagnostic citopatologic:
Descriere citologic:
Recomandri

Controlul de calitate n citologie

Asigurarea calitii diagnosticului citologic (QA) presupune monitorizarea sistematic a
parametrilor de calitate i a rezultatelor controlului calitii, aspecte cuprinse n programul de
cretere continu a calitii (continuous quality improvement program) care implic un efort
multidisciplinar, calitatea recoltrii frotiului avnd efect direct asupra performanei laboratorului
de citologie.
Elementele specifice monitorizate sunt urmtoarele:
-

etichetarea probei

informaia clinic

timpul scurs pn la aducerea probei n laborator

calitatea i timpul necesar prelucrrii citologice

calitatea interpretrii frotiului de ctre citopatolog (incluznd acurateea, claritatea

diagnosticului, timpul necesar elaborrii acestuia)

calitatea i timpul scurs pn la eliberarea rezultatelor

Criteriile minime pentru acceptarea sau respingerea frotiurilor:

-

numele i prenumele pacientei sau alte date de identificare

vrsta sau data naterii

istoric de frotiuri anormale n antecedente, biopsie, tratamente; precizarea zonei de

unde s-a recoltat frotiul i data recoltrii.

Menionarea datei ultimei menstruaii nu mai este obligatorie deoarece nu se mai

recomand precizarea pe frotiuri a celulelor endometriale la femeile n premenopauz.
Se consider c cel mai bun control de calitate n citologie este generat de monitorizarea
pacienilor. Citologia de diagnostic trebuie conceput i practicat ca i ramur a anatomiei
25

patologice i a medicinei. Orice alt abordare a acestei discipline nu este benefic pentru
pacieni.

BIBLIOGRAFIE
Anastasiadis PG, Romanidis KN, Polichronidis A, Koutlaki NG, Tamiolakis D, Simopoulos K. The
contribution of rapid intraoperative cytology to the improvement of ovarian cancer staging. Gynecol Oncol 2002;
86: 244-249
Ayre JE. Selective cytology smear for diagnosis of cancer. Am J Obstet Gynecol 1947; 53: 609-617
Babes A., Daniel C. Diagnosis of Cancer of the Uterine Cervix by Smears. La Presse Mdicale,
1928,36: 451-454
Blumenfeld W, Hashmi N, Sagerman P. Comparison of aspiration, touch and scrape preparations
simultaneously obtained from surgically excised specimens. Effect of different methods of smear preparation on
interpretive cytologic features. Acta Cytol 1998; 42: 1414-1418
Ciobanu Apostol DG. Tehnica Punciei, Calitatea Prelevatului i Interpetarea Frotiurilor. In: Puncia
Aspiraie Citologic Tiroidian. Ghid Diagnostic. Ed. Performantica, 2007, 18-21
Commission on Chronic Illness: Prevention of chronic illness. In: Chronic Illness in the United States,
Cambridge, MA, Harvard University Press 1957; 45
Creager AJ, Shiver SA, Shen P, Geisinger KR, Levine EA. Intraoperative evaluation of sentinel lymph
nodes for metastatic melanoma by imprint cytology. Cancer 2002; 94: 3016-3022
Esteban JM, Zaloudek C, Silverberg SG. Intraoperative diagnosis of breast lesions. Comparison of
cytologic with frozen section technics. Am J Clin Pathol 1987; 88: 681-688
Koss LG, Melamed MR. Diagnostic Cytology: Its Origins and Principles. In: Koss Diagnostic Cytology
and Its Histopathologic Bases. Fifth ed. Philadelphia: Lippincott, 2006, 6-20

26

Ku NNK, Mela NJ, Fiorica J, Cox CE, Reintgen DS, Greenberg HM, Clark RA, Nicosia SV. Role of fine
needle aspiration after lumpectomy. Acta Cytol 1994; 38:927-932
Lester S. Cytology specimens. In: Manual of Surgical Pathology. Second ed. Philadelphia: Elsevier, 2006,
291-292
Llatjos M, Castella E, Fraile M, Rull M, Julin FJ, Fust F, Rovira C, Fernndez-Llamazares J.
Intraoperative assessment of sentinel lymph nodes in patients with breast carcinoma: Accuracy of rapid imprint
cytology compared with definitive histologic workup. Cancer 2002; 96: 150-156
Mogoanta L, Popescu CF, Georgescu CV, Comanescu V, Pirici D. Tehnici de citologie. In Ghid de Tehnici
de Histologie, Citologie si Imunohistochimie, Editura Medical Universitar, Craiova, 2007, 155-299
National Cancer Institute Committees. The Bethesda system for reporting cervical/vaginal cytologic
diagnoses. Acta Cytol 1993; 37:115-124
Oneson RH, Minke JA, Silverberg SG. Intraoperative pathologic consultation: An audit of 1000 recent
consecutive cases. Am J Surg Pathol 1989; 13: 237-243
Papanicolaou GN, Traut HF. Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear. New York Commonwealth
Fund, 1943
Raica M. Citologie Clinic. Ed. Mirton, Timioara, 1998
Sanchez MA, Stahl RE. Fine-needle aspiration of the breast. Pathol State Art Rev 1996; 4: 253-286
Sasano H, Geelhoed GW, Silverberg SG. Intraoperative cytologic evaluation of lipid in the diagnosis of
parathyropid adenoma. Am J Surg Pathol 1988; 12: 282-286
Solomon D, Nayar R. The Bethesda System for reporting Cervical Cytology. Definitions, Criteria, and
Explanatory Notes. Second ed. New York: Spinger, 2004
US Department of Health and Human Services, Regulatory Closure for Cervical Cytology Laboratories:
Recommendations for a Public Health Response. Morbidity and Mortality Weekly Report 1997; 46: RR-17
Viale G, Bosari S, Mazzarol G, Galimberti V, Luini A, Veronesi P, Paganelli G, Bedoni M, Orvieto E.
Intraoperative examination of axillary sentinel lymph nodes in breast carcinoma patients. Cancer 1999; 85: 2433243
Wied GL, Bahr GF. Vaginal, cervical and endocervical cytologic smears on a single slide. Obstet Gynecol
1959; 14: 362-367

27