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Manual de Anlisis en Fresco y Bacteriolgico en Camarn.

LASA

INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA


DIRECCION DE RECURSO NATURALES
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRONOMICAS Y VETERINARIA

Laboratorio de Anlisis de Sanidad Acucola

Manual de Anlisis en Fresco


y anlisis Bacteriolgico en
Camarn.

Manual de Anlisis en Fresco y Bacteriolgico en Camarn.

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Anlisis en fresco
El anlisis en fresco es la tcnica que se utiliza para monitorear el estado de
salud de los organismos y la realizacin de diagnsticos presuntivos en
laboratorio y campo. Consiste en la diseccin del camarn para observar las
alteraciones que presenten en rganos y tejidos del mismo.

Equipo y material para anlisis en fresco.


* Caja de portaobjetos.
* Caja de cubreobjetos.
* Estuche de diseccin.
* Guantes de ltex.
* Solucin salina al 2.0%.
* Papel secante.
* Balanza de precisin.
* Microscopio compuesto con objetivos de 10, 20, 40 y 100X.

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Preparacin de material
El material a utilizar consiste en portaobjetos, cubreobjetos y equipo de
diseccin y estos debern estar en condiciones de asepsia para evitar
cualquier tipo de contaminacin.
El rea de trabajo deber estar limpia y despejada, con excepcin de los
materiales que sern utilizados.
El personal deber de asearse las manos, as como usar bata, cubre bocas y
guantes de ltex.

Procedimiento
1. Los organismos se pesan, para sacar el peso promedio.
2. Se anotan grado de pigmentacin, si presenta alguna coloracin
anormal, tiempo de coagulacin, si presenta alguna laceracin o
necrosis.
3. Se selecciona una pequea porcin de cada tejido u rgano. Cada
porcin se coloca en un portaobjetos separados y limpios, se les
adicionan unas gotas de solucin salina al 2% y se pone el
cubreobjetos.
Las muestras a tomar son:

a) Branquias: Con tijeras finas se toma una pequea porcin y se coloca en el


portaobjetos para buscar: cuerpos de inclusin viral, epibiontes, hongos,
bacterias, melanizaciones, deformaciones, etc.

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b) Hepatopncreas: Se elimina todo el exoesqueleto el cefalotrax para


descubrir el hepatopncreas y el estmago. Se observa la coloracin (color
normal, verde oscuro), el tamao del hepatopncreas para decidir si hay
atrofia (reduccin de tamao) o hipertrofia (aumento de tamao) de este
rgano. Con un bistur se parte por la mitad y se observa la coloracin del
fluido. Se toma una pequea muestra y se coloca en un portaobjetos para
buscar; BP, MBV, gregarias, bacterias y cantidad de lpidos presentes.

c) Intestino: El abdomen, se separa del cefalotrax, telson y urpodos para


facilitar la extraccin del intestino. Por la parte posterior se localiza el
intestino que puede o no contener hilo fecal, con una pinza fina se extrae con
cuidado, se pesa y se coloca en el portaobjetos de la siguiente manera: uno
de los extremos del intestino se detiene con una pinza con el portaobjetos
ligeramente inclinado, se presiona ligeramente el intestino y con las pinzas se
jala para extraer el contenido que se analiza al microscopio para buscar:
gregarinas, nematodos, MBV y BP.
d) Msculo: Se toma una pequea muestra de msculo, especialmente que
muestre opacidad de tipo lechoso, se coloca en un portaobjetos y se presiona
para facilitar la bsqueda de microsporidios.

e) Cefalotrax: se corta una muestra de cefalotrax con unas tijeras, se le


retira la cutcula para que permita observar en el microscopio, se coloca en

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un portaobjetos con una gota de solucin salina, en el se van a observar


cuerpos de inclusin (WSSV).
4. Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio iniciando con
el objetivo de menor aumento y finalizando con el de mayor.
Se anotan todas las observaciones.

Grados de severidad

Grado

SIGNOS CLINICOS

No presenta signos clnicos de infeccin por patgenos, parsitos o


epicomensales. No presentan lesiones caractersticas de sndromes.
Presencia muy baja de patgenos, parsitos o epicomensales. En
aquellos donde tiene un nmero estndar permitido, este se
encuentra justo arriba del lmite normal. Se observan muy pocas
lesiones caractersticas del sndrome.
Se observa la presencia baja y moderada de patgenos, parsitos o
epicomensales. Se observan muchas lesiones caractersticas del
sndrome. Incremento en la mortalidad.
Se observa la presencia moderada de patgenos, parsitos o
epicomensales. Se observan muchas lesiones caractersticas del
sndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento.
Se observa gran cantidad de patgenos, parsitos o epicomensales. Se
observan severas lesiones caractersticas del sndrome. Muy letal con
altas mortalidades.

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Fuente: Lightner, 1996.

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Pesado de los organismos

Muestra de Branquias

Muestra de Hepatopncreas

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Registro de observaciones

Muestra de Cefalotorax

Muestra de intestino

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ANALISIS BACTERIOLOGICO
Las bacterias del genero Vibrio, se han reportado a menudo como patgenas oportunistas
para camarn, tanto en la fase larvicultura como en la engorda.
Vibriosis: Se puede definir como una enfermedad ocasionada por bacterias del genero
Vibrio en organismos acuticos. Esto por consiguiente, tambin es vlido para infecciones
ocasionadas por este gnero en camarones, independientemente del estadio de
desarrollo de estos.
La vibriosis conocida tambin como el sndrome de la gaviota, ha sido la causa de
grandes prdidas econmicas en la industria camaronera, quizs por un desconocimiento
de las tcnicas de diagnstico, as como de los tratamientos frente a estos problemas. En
este negocio que es de gran riesgo el tiempo es fundamental, por eso por medio de
tcnicas de diagnstico de campo, se tomarn los correctivos (medicacin) antes de que
ocurra la mortalidad masiva en el estanque. Esta enfermedad es producida por bacterias
Gram negativas del gnero Vibrio, las especies ms comnmente asociadas con este
problema son:
-

V. parahaemoliticus

V. vilnificus

V. harveyi

V. alginolyticus

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Se presentan ocasionalmente:
-

V. damsela

V. fluvialis

V. spendidus

Equipo y material para anlisis bacteriolgico


Materiales:
*Tubos de ensayo con tapn de rosca de 16 x 150 mm.
*Matraces Erlenmeyer de 500 ml
*Matraces Erlenmeyer de 1000 ml.
*Probeta graduada de 100 ml.
*Probeta graduada de 500 ml.
*Vasos de precipitado de 100, 500 y 1000 ml.
*Cajas petri desechables.
*Asas microbiolgicas.
*Esptula con mango de madera.
*Recipientes para pesar medio de cultivo.
*Gradilla de plstico para tubos.
*puntillas para micropipetas.
*Micropipetas.
*Estuche de diseccin.
*Varilla de vidrio acodada.

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*guantes de ltex.
Agares y reactivos:
* Agar TCBS (Tiosulfato Citrato Bilis sacarosa)
*Agar Muller Hinton
*Agar TSA (Tripticasa Soya Agar)
*Cloruro de sodio
*Citrato de sodio
*Alcohol al 96
*Antibiticos: Oxitetraciclina, Enrofloxacina, Florfenicol (Sensidiscos).

Equipo:
*Parrilla de calentamiento.
*Mechero de alcohol o gas.
*Balanza de precisin.
*Incubadora de 20 a 40 C.
*Olla de presin de 25 litros.

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Materiales empleados para el diagnstico por Bacteriologa

Preparacin de la solucin Salina


Esta solucin se realiza para la dilucin de la muestra que generalmente
deber tener una salinidad similar a la del medio en que se est
desarrollando el cultivo de camarn, por lo general se prepara al 2% y 2.5%.
Preparacin del Citrato de Sodio
Esta solucin es preparada al 10% y acta como anticoagulante, esta se
emplea al momento de extraer la hemolinfa de los organismos y como medio
de transporte para trasladar la muestra de la granja al laboratorio.

Preparacin de agar TCBS.


Este medio es especfico para el crecimiento de bacterias del gnero Vibrio
spp, aunque en la prctica tambin se ha observado que tambin pueden
crecer otros tipos de bacterias como Pseudomonas spp y Aeromonas spp. Es
un medio diferencial entre el gnero Vibrio, las especies que utilizan la
sacarosa

para producir cido, producen colonias de color amarillo: V.

alginolyticus, V. cholerae, V. angillarum, V. fluvialis. Las que crecen sin utilizar


la sacarosa son verdes V. parahaemolyticus, V. damsella, V. fisheri, V.
mimicus, V. bollisea, V. harveyi.

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Para la preparacin del agar TCBS se deben seguir los siguientes pasos:

1. Se requiere agua destilada


2. Se pesa en rea estril 88 gr/l de agua destilada
3. Se disuelve el agar con el agua
4. Se procede a calentar hasta que hierva (tener cuidado que no se riegue
al hervir)
5. Dejar enfriar a 45C
6. Se vierte en cajas previamente esterilizadas
7. Se deja solidificar y debe tener cuidado que no quede humedad en las
cajas
8. Guardar en un lugar seco y estril
9. Es importante recordar que este agar NO necesita esterilizarse en el
AUTOCLAVE

Preparacin de agar TSA.


Este es un medio donde crecen todo tipo de bacterias, se emplea
comnmente para aislar y purificar bacterias.
1. Se pesa la cantidad requerida de acuerdo al nmero de placas a
utilizar.
2. Para este medio se agrega 2.0 gr de NaCl por cada 100 ml.

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3. Se disuelve el medio en agua destilada en un matraz y se calienta en


una parrilla hasta punto de ebullicin para que se disuelva por
completo.
4. Se esteriliza en autoclave a 120 C por 15 minutos.
5. Se deja enfriar hasta alcanzar una temperatura de 45C, y
posteriormente se vaca en cajas de petri, se espera a que solidifique y
se guarda en un lugar seco y estril.

Preparacin de agar Mueller Hinton.


En este medio de cultivo crece todo tipo de colonia y es un medio ideal para
realizar

pruebas

de

sensibilidad

de

antibiticos

(empleado

para

antibiogramas).

1. Pesar la cantidad requerida de acuerdo al nmero de placas a utilizar.


2. Agregar 2.0 gr de NaCl por cada 100ml.
3. Se disuelve el medio en agua destilada en un matraz y se calienta en la
parrilla hasta punto de ebullicin para que se disuelva completamente.
4. Se esteriliza en autoclave a 120 C por 15 minutos.
5. Se deja enfriar hasta que alcance una temperatura de 45C y
posteriormente se vaca en cajas petri, se espera a que solidifique y se
guarda en un lugar seco y estril.

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Nota: (*) El agar

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TSA (para purificaciones) y el MULLER-HINTON (para

antibiogramas) deben ser ajustados a una salinidad final similar a la de la


muestra analizada, y ser esterilizados.

Tcnicas de siembra
Siembra directa
El anlisis bacteriolgico se realiza en hepatopncreas o en mercado,
dependiendo del tamao del camarn, as tenemos que en camarones con
peso de hasta 0.8 gramos se realiza macerados y en camarones superiores a
un peso de un gramo, se le realiza extraccin de hepatopncreas para el
anlisis y extraccin de hemolinfa.

Tcnica para macerado

1. Seleccionar de 10-15 camarones juveniles o 25 post-larvas para el anlisis


(camarones de hasta 0.8 gramos)
2. Desinfectar los animales a macerar, enjuagndolos con alcohol al 70%.
Permitir que el exceso de alcohol se evapore hasta que no quede olor al
mismo.

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3. Desinfectar un mortero y adicionar solucin salina estril (2%) en una


relacin de 1:1 con respecto al peso de los animales.
4. Colocar las post-larvas juveniles en el mortero previamente desinfectado
y con la solucin salina.
5. Se procede a macerar hasta que todos los camarones estn
completamente triturados.
6. Mezclar el inoculo.
7. Usando la micropipeta con puntillas, previamente esterilizadas, tomar la
muestra y sembrarla en agar TCBS.
8. Secar con una varilla acodada previamente esterilizada al mechero y
enfriada.
9. Incubar en forma invertida la caja petri inoculada por un tiempo de 18 a
24 horas a temperatura 28-30C.
10.Luego del perodo de incubacin, se realiza la lectura de las colonias tanto
verdes como amarillas y se multiplica por los 10 ml de solucin en que se
macero, se divide entre el nmero de larvas maceradas, se divide entre
los ml sembrados.
11. se calcula el porcentaje de verdes, dividiendo las colonias verdes entre el
total, y multiplicndolo por 100 (%).
12.Se registran los resultados y se evalan para completar el diagnstico.

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Tcnica para macerado de hepatopncreas

1. Seleccionar de 10-15 camarones juveniles o 25 larvas para el anlisis


(camarones de hasta 0.8 gramos)
2. Desinfectar los animales, enjuagndolos con alcohol al 70%. Permitir que el
exceso de alcohol se evapore hasta que no quede olor al mismo.
3. Se extraen varios hepatopncreas hasta completar un gramo.
4. Desinfectar un mortero y adicionar solucin salina estril (2%) en una
relacin de 1:1 con respecto al peso de los hepatopncreas.
5. Colocar los hepatopncreas en el mortero previamente desinfectado y con
la solucin salina.
6. Se procede a macerar hasta que todos los hepatopncreas estn
completamente triturados.
7. Mezclar el inoculo.
8. Usando la micropipeta con puntillas, previamente esterilizadas, tomar la
muestra y sembrarla en agar TCBS.
9. Secar con una varilla acodada previamente esterilizada al mechero y
enfriada.
10. Incubar en forma invertida la caja petri inoculada por un tiempo de 18 a
24 horas a temperatura 28-30C.

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11. Luego del perodo de incubacin, se realiza la lectura de las colonias tanto
verdes como amarillas y se multiplica por los 10 ml de solucin en que se
macero, se divide entre el peso de los hepatopncreas, se divide entre los ml
sembrados.
12. se calcula el porcentaje de verdes, dividiendo las colonias verdes entre el
total, y multiplicndolo por 100 (%).

Materiales necesarios

Pesado de hepatopncreas

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Extraccin de hepatopncreas

Muestra con solucin salina al 2%

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Macerado de hepatopncreas

Siembra de la muestra

Incubacin de la muestra

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Toma de muestra

Secado de la muestra

Conteo de UFC/gr a las 24 hrs.

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Tcnica de siembra de hemolinfa


1. Se limpia toda la cutcula del camarn con una torunda de algodn
impregnada con alcohol al 96 %; poniendo nfasis en la asepsia de las
reas cercanas al corazn o lo periopodos; segn sea el caso.
2. Se procede a hacer la extraccin de hemolinfa con una jeringa de
insulina (aproximadamente 50 microlitros, dependiendo del tamao
del camarn), de tal manera que la aguja entre al corazn sin llegar a
tocar el hepatopncreas. Otro sitio donde se puede extraer la
hemolinfa es el seno ventral y en la base del cuarto o quinto
pereipodo.
3. La hemolinfa extrada es cuantificada y sembrada en una placa de
TCBS, teniendo cuidado de distribuirla por toda la placa con la ayuda
de una varilla acodada de vidrio por toda la superficie del agar.
4. La placa se incuba de 28 a 30 C por 18 a 24 horas.
5. Pasado el tiempo de incubacin se procede a realizar el conteo de
colonias para establecer las unidades formadoras de colonia por
mililitro (UFC/ml). Es importante saber la cantidad de hemolinfa que
fue sembrada.
6. Para sacar la estimacin se divide el nmero de colonias entre el
volumen de hemolinfa sembrada en ml.

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Citrato de sodio al 1%

Siembra en placa de TCBS

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Extraccin de hemolinfa

Secado con varilla acodada

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INTERPRETACION DE RESULTADOS
Interpretacin tentativa de los tipos de colonias bacterianas obtenidas de
camarones en agar TCBS.

Juveniles y adultos de camarn


Tipos de UFC en
agar TCBS

Verdes Luminiscentes
100 %

Larvas y postlarvas
>103
<103

grave

serio

Verdes > 50 %

serio

Verdes < 50 %

elevado-serio

Amarillas

elevado normal-elevado

FUENTE: GMEZ-GIL

20

elevado-serio
elevado

Hepatopncreas
(UFC/gr)
>105

>105

grave

serio

serio

elevado-serio

elevado normalelevado
normal-elevado
normal

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Purificacin de bacterias en TSA


La purificacin de bacterias en el cultivo de TCBS es importante realizarla
siempre, pero principalmente cuando las colonias no estn bien aisladas o el
cultivo supera las 24 horas, para evitar contaminacin y errores en la
identificacin. Por ello se procede a:

a) Seleccionar las colonias para la resiembra


b) La resiembra se realiza en agar TSA (ajustado a la salinidad del
medio) Incubar a 28-30C por 18-24 horas
c) Las colonias que crecen en TSA, nos servirn para realizar
antibiogramas, as como para la identificacin bacteriana.

Toma de muestra

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Siembra por estra cruzada

Cultivo a las 24 horas

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Pruebas de sensibilidad a antibiticos Antibiogramas


a) Las colonias para este anlisis deben ser tpicas, aisladas y purificadas
b) Para el anlisis tomamos 4 a 5 colonias y las colocamos en 5 ml de
solucin salina al 2%, agitamos e igualamos a un MacFarland 0.5 a 1.0
(Estndar de turbidez)
c) Luego humedecemos un hisopo con esta solucin
d) Pasar el hisopo por toda la superficie del agar MULLER-HINTON (ajustado
a la salinidad del medio)
e) Dejar absorber el inoculo de 5 a 10 minutos
f)

Aplicar los antibiticos correspondientes con ayuda de un dispensador o


pinza esterilizada. Slo debern aplicarse de 5-6 antibiticos por placa de
agar MULLER-HINTON

g) Incubar las placas en posicin invertida a 28-30C por 24 horas


h) Despus de la incubacin, se procede a medir los dimetros de los halos
de sensibilidad en milmetros correspondientes a cada uno de los
antibiticos colocados para luego compararlos con las tablas indicadas
para cada tipo de antibitico y establecer la sensibilidad o resistencia de
las bacterias aisladas.

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Toma de la muestra

Toma de la muestra con hisopo

Aplicacin de sensidiscos

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Dilucin de la muestra

Siembra de la muestra

Resultados

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INTERPRETACIN DEL DIMETRO EN LA LECTURA DE LOS TEST DE


SENSIBILIDAD

Grado de sensibilidad

Dimetro de inhibicin

Muy sensible

17 mm

Sensible

12-16 mm

Intermedio

8-11 mm

No sensible

< 7 mm

Fuente: AVIMEX 2008


Enro-blend* Aqua (Enrofloxacina blindada)
Flor-blend*Aqua (Florfenicol blindado)
Oxi-blend* 50 grado acuicola (Oxitetraciclina)

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