A. Mengkudu (Morinda citrifolia, L.

)
1. Klasifikasi

Gambar Buah Mengkudu (M. citrifolia, L.) (Redriguez, 2008).

Filum
Sub filum
Divisio
Family
Genus
Spesies
2. Nama Daerah

: Angiospermae
: Dicotyledoneae
: Lignosae
: Rubiaceae
: Morinda
: M. citrifolia, L. (Djauhariya, 2003)

Pace (Jawa), Cangkudu (Pasundan), Kodhuk (Madura), Bakudu

(Sumatra),

Wangkudu

(Kalimantan),

Bakulu

(Nusa

Tenggara)

(Suryowinoto, 1997).
3. Deskripsi
Mengkudu termasuk jenis tanaman pohon dan berbatang bengkok,
ketinggian dapat mencapai 3-8 m. Daun tunggal dengan ujung dan
pangkal kebanyakan runcing. Buahnya termasuk buah bongkol, benjolbenjol tidak teratur, berdaging, jika masak daging buah berair. Buah
masak berwarna kuning kotor atau putih kekuning-kuningan dengan
panjang 5-10 cm, lebar 3-6 cm (Suryowinoto, 1997).
Tanaman mengkudu berbuah sepanjang tahun. Mudah tumbuh pada
berbagai tipe lahan, dengan daerah penyebaran dari dataran rendah
hingga ketinggian 1500 dpl. Ukuran dan bentuk buahnya bervariasi, pada
umumnya mengandung banyak biji, dalam satu buah terdapat 300 biji,
namun ada juga tipe buah mengkudu yang memiliki sedikit biji. Bijinya
dibungkus oleh suatu lapisan atau kantong biji, sehingga daya simpannya
lama dan daya tumbuhnya tinggi. Dengan demikian, perbanyakan
mengkudu dengan biji sangat mudah dilakukan (Djauhariya dkk., 2006).

4. Kandungan Kimia
Buah mengkudu (M. citrifolia, L.) mengandung scopoletin, sebagai
analgesik, antiradang, antibakteri. Glikosida, sebagai antibakteri,
antikanker, imunostimulan. Alizarin, Acubin, L. Asperuloside, dan
flavonoid sebagai antibakteri. Vitamin C, sebagai antioksidan (Peter,
2005; Waha, 2000; Winarti, 2005).
5. Efek Anti Bakteri
Efek menghambat pertumbuhan bakteri dari ekstrak mengkudu
diduga berkaitan dengan senyawa flavonoid yang dikandungnya seperti
katekin, epikatekin dan epigalokatekin. Kandungan flavonoid pada
mengkudu sangat efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram
positif. Flavonoid merupakan senyawa antibakteri yang paling banyak
terdapat pada buah mengkudu (Djauhariya, 2003). Flavonoid bersifat
polar sehingga lebih mudah menembus lapisan peptidoglikan yang juga
bersifat polar pada bakteri Gram positif daripada lapisan lipid yang
nonpolar. Di samping itu pada dinding sel Gram positif mengandung
polisakarida (asam terikoat) merupakan polimer yang larut dalam air,
yang berfungsi sebagai transfor ion positif untuk keluar masuk. Sifat larut
inilah yang menunjukkan bahwa dinding sel Gram positif bersifat lebih
polar. Aktivitas penghambatan ekstrak mengkudu pada bakteri Gram
positif menyebabkan terganggunya fungsi dinding sel sebagai pemberi
bentuk sel dan melindungi sel dari lisis osmotik. Dengan terganggunya
dinding sel akan menyebabkan lisis pada sel (Dewi, 2010)
6. Pembuatan Simplisia (Pengeringan)
Setelah buah dipetik dari kebun, dipilih yang sehat dan segar, tidak
cacat, dicuci bersih di air mengalir, lalu ditiriskan sampai kering.
Selanjutnya dipotong-potong dengan ukuran 0,5 cm, kemudian
dikeringkan dimata hari terik waktunya dari jam 08.00 11.00 pagi. Pada
waktu dikeringkan sebaiknya ditutup dengan kain hitam untuk
mengurangi kerusakan bahan akibat teriknya sinar yang dapat
menurunkan mutu simplisia. Bila pengeringan menggunakan oven vacum
gunakan suhu 40C. Kadar air simplisia antara 10 - 13 %. Buah kering

dapat dimanfaatkan untuk kepentingan sendiri sebagai cadangan bahan

obat, atau dijual ke pabrik atau kepengolah jamu tradisional. Bila mau
disimpan, masukan kedalam kantong plastik dan ditutup rapat tidak
tembus udara dan disimpan ditempat yang sejuk dan kering, sehingga
dapat disimpan lebih lama sebelum dikirim ke tempat pengolah.
B. Standarisasi
Standardisasi

simplisia

meliputi

pemeriksaan

makroskopik,

pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air dengan metode azeotropi

(WHO, 1998), penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut
dalam etanol (Ditjen POM, 1979), penetapan kadar abu total, dan penetapan
kadar abu tidak larut asam (Ditjen POM, 2008).
1. Pemeriksaan Makroskopis
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati sifat
morfologi luar simplisia berupa irisan buah, berwarna cokelat, berbau
khas, rasa sedikit pahit, dengan ketebalan 1 cm, diameter 3-5 cm, dengan
tonjolan-tonjolan biji (Ditjen POM, 2008).
2. Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisa buah
mengkudu. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah
ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup,
kemudian diamati di bawah mikroskop. Fragmen pengenal adalah testa,
serabut, epikarp, dan endokarp (Ditjen POM, 2008).
Serbuk: Berwarna hitam kecoklatan.
3. Penetapan kadar air simplisia
Dimasukkan 5 gram simplisia yang telah ditimbang dengan seksama
ke dalam labu alas bulat yang berisi 200 ml toluen dan 2 ml air, lalu
dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan
tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi,
kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes setiap detik. Setelah
semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.
Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna,
volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air

yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen (Ditjen POM, 1979).
4. Penetapan kadar sari larut air
Ditimbang seksama 5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam labu
bersumbat, ditambahkan dengan 100 ml air jenuh kloroform, dikocok
berkali- berkali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam. Disaring,
diuapkan 20 ml filtrat hingga kering di dalam cawan berdasar rata yang
telah dipanaskan 105oC dan ditara. Dipanaskan sisa pada suhu 105oC
hingga bobot tetap. Dihitung kadar dalam % sari larut air (Ditjen POM,
2008).
5. Penetapan kadar sari larut etanol
Ditimbang seksama 5 g serbuk simplisia, dimasukkan ke dalam labu
bersumbat, ditambahkan 100 ml etanol (95% P), dikocok berkali-kali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring,
diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan berdasar rata yang telah
dipanaskan 105oC dan ditara. Dipanaskan sisa pada suhu 105oC hingga
bobot tetap. Dihitung kadar dalam % sari larut etanol (Ditjen POM, 2008).
6. Penetapan kadar abu total
Ditimbang seksama 2 sampai 3 g bahan uji yang telah dihaluskan
dan dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijar dan ditara,
dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang.
Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas,
diaduk, disaring melalui kertas saring bebas abu. Dipijarkan kertas saring
beserta sisa penyaringan dalam krus yang sama. Dimasukkan filtrat ke
dalam krus, diuapkan dan dipijarkan hingga bobot tetap. Kadar abu total
dihitung terhadap berat bahan uji, dinyatakan dalam % b/b (Ditjen POM,
2008).
7. Penetapan kadar abu tidak larut asam
Dididihkan abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total
dengan 25 ml asam klorida encer LP selama 5 menit. Dikumpulkan bagian
yang tidak larut dalam asam, disaring melalui kertas saring bebas abu,
dicuci dengan air panas, dipijarkan dalam krus hingga bobot tetap. Kadar

abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap berat bahan uji,
dinyatakan dalam % b/b (Ditjen POM, 2008).
Tabel Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Etanol Buah Mengkudu
Karakteristik

Simplisia (%b/b)

Ekstrak (%b/b)

Kadar air

7,5 *

10*

Susut pengeringan

8,15

10,39

Kadar sari larut air

29,41

36,35

Kadar sari larut etanol

15,47

66,20

Kadar abu total

5,02

5,20

Kadar abu tidak larut asam

0,45

3,20

Keterangan: * = dalam v/b

C. Isolasi
1. Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan metabolit
sekunder dalam simplisia yang akan dianalisis yaitu simplisia buah
mengkudu. Untuk melakukan skrining fitokimia, simplisia mengkudu
diekstraksi agar dapat direaksikan dengan reagen yang digunakan untuk
melakukan skrining fitokimia. Ekstraksi simplisia mengkudu dilakukan
dengan cara simplisia dihaluskan terlebih dahulu unutk memperkecil
partikel sehingga luas permukaan sentuh semakin besar yang akan
mempercepat proses ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut air yang
dipanaskan, kemudian simplisia halus dimasukkan kedalam air panas
sambil diaduk hingga proses ekstraksi selesai. Ekstrak yang didapat
dipisahkan dari residunya dengan cara disaring dengan menggunakan
kertas saring. Filtrat (sampel) yang diperoleh dapat di reaksikan dengan
berbagai reagen untuk melakukan skrining fitokimia.
a. Skrining Senyawa Alkaloid
Skrining senyawa golongan alkaloid dilakukan dengan cara
sampel dibasakan dengan menggunakan ammonia encer kemudian
ditambahkan beberapa mL kloroform, filtrate dikocok dengan HCl 2N
dan lapisan asam dipisahkan kemudian dibagi menjadi 3 bagian,
bagian pertama digunakan sebagai blanko, bagian kedua direaksikan

dengan pereaksi mayer dan bagian ketiga direaksikan dengan pereaksi

dragendorf. Setelah diamati terbentuk endapan putih dengan
penambahan pereaksi mayer sedangkan terbentuk endapan jingga
coklat sehingga kunyit dinyatakan positif mengandung alkaloid.
Panambahan basa pada sampel dilakukan untuk membentuk alkaloid
dalam bentuk basanya karena pada tumbuhan alkaloid terdapat dalam
bentuk garamnya, alkaloid dalam bentuk basa tersebut dapat larut
dalam pelarut organic seperti kloroform sehingga ditambahkan
beberapa mL kloroform. Kemudian penambahan asam dilakukan
untuk membentuk kembali alkaloid kedalam bentuk garamnya karena
terjadi reaksi netralisasi antara alkaloid basa dengan asam klorida
yang ditambahkan sehingga alkaloid akan larut pada asam klorida
tersebut. Apabila dilakukan pengujian alkaloid yang terlarut dalam
pelarut organic maka reaksi tidak akan terjadi karena terdapat
perbedaan kepolaran antara kloroform (yang nonpolar) dengan
pereaksi uji yang digunakan yaitu pereaksi mayer dan dragendorf
yang berdifat polar. Pada bagian yang ditetesi peraksi mayer hasil
positif ditandai dengan terbentuknya endapan putih, endapan putih
tersebut merupakan kompleksi klium-alkaloid. Pereaksi mayer dibuat
dengan cara larutan merkurium (II) klorida ditambah kalium iodide
yang akan bereaksi membentuk endapan merah merkurium(II) iodide.
Jika kalium iodide yang ditambahkan berlebih makan akan terbentuk
kalium tetraiodomerkurat (II). Peraksi mayer dibuat dengan cara
mencmpur larutan bismuth nitrat dalam asam nitrat dengan larutan
kalium iodide. Alkaloid memiliki atom nitrogen yang biasanya
heterosiklik yang mempunyai pasangan elktron bebas sehingga dapat
digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion
logam. Pada uji alkaloid dengan menggunakan pereaksi mayer atom
nitrogen pada alkaloid bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium
tetraiodomerkurat

(II) membentuk komplek kalium-alkaloid yang

mngendap. Reaksinya adalah sebagai berikut:

HgCl2 + 2KI

HgI2 +

HgI2 + 2KI

K2[HgI2]

2KCI

Kalium Tetraiodomerkurat (II)

+ K[HgI4]+

+ K2[HgI4]
N

N
K+
Endapan Kalium-Alkaloid

Pada uji alkaloid dengan menggunakan pereaksi dragendorf,

atom nitrogen bereaksi dengan

K+ dari pereaksi dragendorf

membentuk ikatan kovalen koordinat yang membentuk endapan

jingga coklat. Reaksi nya adalah sebgai berikut:
Bi(NO3)3 +

3KI

BiI3 + 3KNO3
Coklat

BiI3 + KI

K[BiI4]
Kalium Tetraiodobismutat
+ [BiI4]+

+ K[BiI4]
N

N
K+

Orange

Endapan Kalium-Alkaloid

b. Skrining Senyawa Flavonoid

Skrining fitokimia flavonoid sampel dipanaskan dengan
campuran logam magnesium dan HCl 5N kemudian disaring, apabila
filtrate yang dihasilkan berwarna merah yang dapat ditarik dengan
menggunakan amil alcohol. maka sampel positif mengandung
alkaloid, namun pada sampel simplisia kunyit filtrate yang dihasilkan
tidak berwarna merah yang artinya kunyit tidak mengandung
flavonoid. Penambahan logam Mg dan HCl akan terjadi reaksi
eksoterm yaitu reaksi yang melepaskan panas yang ditandai dengan
terbentuknya gelembung gas dan pelepasan kalor pada permukaan
tabung reaksi. Gelembung yang terbentuk merupakan gas H2. Reaksi
yang terjadi adalah sebagai berikut:
Mg + 2HCl

MgCl2 + H2

Produk yang dihasilkan pada reaksi diatas adalah MgCl2 dan H2.
Dimana MgCl2 berada dalam kesetimbangan. Reaksinya adalah
sebagai berikut:
MgCl+ + Cl-

MgCl2

MgCl+ akan bereaksi dengan gugus karbonil pada flavon yang

mengalami resonansi, sehingga akan terbentuk ikatan baru yaitu
pelepasan ikatan rangkap dan pembentukan gugus hidroksil. Reaksi
yang terjadi adalah sebagai berikut:
C
O

+ MgCl+

H
Amil alkohol
C
O MgCl

H
C
OH

Flavon

Reaksi yang terjadi merupakan pembentukan ikatan baru dimana

adanya MgCl+ mampu melarutkan flavon sehingga flavonoid dapat
dipisahkan

dari

golongan

senyawa

kimia

lain.

Penambahan

amilalkohol berfungsi untuk melarutkan flavonoid, karena flavonoid

bersifat polar dan sehingga dapat ditarik kedalam amilalkohol.
c. Skrining Senyawa Tanin dan Polifenol
Skrining fitokimia senyawa tannin dan polifenol dengan cara
sampel ditetesi dengan pereaksi FeCl3, apabila terbentuk warna biru
hitam maka positif untuk tannin dan polifenol. Penambahan FeCl 3
berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tannin merupakan ligan
yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks yang
stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat Fe3+ dengan
ligan tannin. Reaksinya adalah sebagai berikut:
O-H

O - Fe

2+

+ Fe3+
N

+ H+
N
Kompleks warna
Coklat Kehitaman

Untuk membedakan tannin dan polifenol digunakan sifat tannin

yang dapat mengendpkan larutan gelatin 1 % karena tannin dapat

mengendapkan protein pada gelatin. Tanin bereaksi dengan gelatin

membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air.
d. Skrining Senyawa saponin
Skrinig senyawa saponin dialakukan dengan cara sampel
dimsukkan kedalam tabung reaksi kemudian dikocok kuat selama 30
detik. Pembentukan busa sekurang kurang nya 1 cm dan tidak hilng
dengan penambahan asam klorida menunjukan adanya saponin. Uji
saponin diatas dinamakan uji forth. Timbulnya busa pada uji Forth
menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan
membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan
senyawa lainnya. Reaksi pembentukan busa pada saponin adalah
sebagai berikut:

CO
CH 2OH O

OH

OH
H2O

CH2OH
O
OH

CO2H
OH

OH

OH

Saponin merupakan senyawa yang mempunyai gugus hidrofilik

dan hidrofob. Pada saat digojok gugus hidrofil akan berikatan dengan
air sedangkan gugus hidrofob akan berikatan dengan udara sehingga
membentuk buih. Penambahan HCl bertujuan untuk menambah
kepolaran sehingga gugus hidrofil akan berikatan lebih stabil dan buih
yang terbentuk menjadi stabil. Apabila buih hilang maka sampel tidak
mngndung saponin.
e. Skrining Senyawa Monoterpenoid dan Seskuiterpenoid
Skrining senyawa monoterpenoid dan seskuiterpenoid dilakukan
dengan cara simplisia disari dengan eter kemudian disaring dan eter di
uapkan. Pada residu ditambahkan vanillin asam sulfat, apabila
terbentuk warna warna menunjukan hasil positif untuk monoterpenoid
dan seskuiterpenoid.
f. Skrining Senyawa Steroid dan Triterpenoid
Skrining senyawa steroid dan triterpenoid dilakukan dengan cara
simplisia disari dengan eter kemudian disaring dan eter diuapkan.
Pada residu ditambahkan pereaksi liberman bourchard apabila
terbentuk warna ungu makan positif unutk triterpenoid sedangkan

apabila terbentuk warna hijau biru positif untuk steroid. Uji

Lieberman-Burchard yang merupakan uji karakteristik untuk sterol
tidak jenuh dan triterpe. Hasil positif pada uji Lieberman-Burchard
ditandai dengan terbentuknya warna ungu untuk triterpenoid dan hijau
biru untuk steroid yang berasal dari reaksi antara sterol tidak jenuh
atau triterpen dengan asam (CH3 COOH dan H2SO4).
g. Skrining Senyawa Kuinon
Skrining fitokimia kuinon dialkuakn dengan caara sampel
ditetesi dengan naoH, apabila terbentuk warna kuning hingga merah
maka postif kuinon. Pengenalan senyawa ini didasarkan pada
kemampuannya membentuk garam berwarna antara hidrokuinon
dengan larutan alkali kuat seperti NaOH atau KOH. Reaksinya adalah
sebagai berikut:
O

OH

OH
NaOH

OH

ONa

2. Ekstraksi Simplisia (Metode Maserasi)

Prinsip maserasi adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan
cara merendam serbuk dan pelarut yang sesuai selam beberapa hari pada
temperature kamar terlindung dari cahaya, pelarut akan masuk kedalam sel
tanaman melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan
konsentrasi antara larutan didalam sel dengan diluar sel. Larutan yang
konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh pelarut dengan
konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut akan berulang
sampai terjadi kesetimbangan antara larutan didalam sel dan larutan diluar
sel.
Potongan buah yang sudah kering, berbentuk kepingan, dipisahkan
antara daging buah dengan bijinya. Bahan yang digunakan untuk
penelitian adalah daging buah yang kering, sedang bijinya disisihkan.
Daging buah yang kering selanjutnya dibuat serbuk (simplisia) dengan
cara dihancurkan dengan alat blender. Maserasi dilakukan dengan
merendam simplisia kedalam pelarut etanol 96%, sampai terendam
seluruhnya selama 24 jam, kemudian disaring dengan kertas penyaring.

Residu kembali dimaserasi lagi dengan cara yang sama, sampai 3x.
Ekstrak hasil maserasi atau filtrat yang dihasilkan, ditampung menjadi satu
dan diuapkan, untuk memisahkan pelarutnya. Penguapan dilakukan
dengan menggunakan alat Rotary evaporator pada suhu 45-50C, sampai
pelarut habis menguap, sehingga didapatkan ekstrak kental buah
mengkudu (M. citrifolia, L.).
3. Pemantauan Ekstak Dengan Metode KLT
Ekstrak yang didapatkan dari hasil ekstraksi metode maserasi
dipantau menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dengan tujuan
agar diketahui kandungan pada senyawa pada ekstrak dan juga untuk
mengetahui apakah senyawa target yang diinginkan (epigalokatekin galat)
telah terekstraksi dari simplisia.
Sebelum KLT dilakukan, plat silica gel diaktivasi dengan cara
dipanaskan dalam oven pada suhu 105oC. Aktivasi plat silica gel tersebut
dilakukan karena silica gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang
terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol
bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mempu membentuk
ikatan hydrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer / lingkungan yang diserap oleh permukaan silica
gel mampu mendeaktifkan permukaan silica gel karena air akan menutup
sisi aktif silica gel sehingga akan menggangu proses adsorpsi desorpsi
pada saat proses elusi.
Fase Gerak (Eluen) yang digunakan adalah n-butanolasam asetat
air (3:1:5) karena flavonoid merupakan senyawa polar sehingga eluen
yang digunakan cenderung bersifat semi polar lebih ke polar.
Fase gerak

: n-butanolasam asetatair (3:1:5)

Fase diam

: Silika gel GF254

Larutan uji

: 5% dalam etanol P

Volume Penotolan

: Totolkan 2 L larutan uji dan 2 L larutan standar

Epigalokatekin galat

4. Fraksinasi Dengan Metode Ekstraksi Cair-Cair

Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan komponen yang terdapat
dari ekstrak yang masih mengandung berbagai macam senyawa yang
berbeda sifat kepolarannya. Pada fraksinasi semua senyawa yang terdapat

dalam ekstrak akan larut kedalam pelarut dengan polaritas yang sama
sehingga akan dihasilkan beberapa fraksi ekstrak.
Metode fraksinasi yang digunakan adalah metode ekstraksi cair
cair dimana metode ini merupakan pemisahan komponen kimia diantara
dua pelarut yang tidak saling bercampur dimana sebagian komponen larut
pada fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua. Proses fraksinasi
ini dilakukan dengan menggunakan corong pisah. Prinsip corong pisah
adalah memisahkan zat atau senyawa tertentu yang teerdapat dalam
sampel berdasarkan perbedaan berat jenis antara dua fase pelarut yang tak
saling campur.
Ekstraksi cair cair pada praktikum kali ini menggunakan 3 jenis
pelarut yang dibedakan berdasarkan tingkat kepolaran nya. Pelarut yang
digunakan adalah air (polar), etil asetat (semipolar) dan n-hexane
(nonpolar). air bersifat polar karena molekul H2O (air) memiliki momen
dipol yang bernilai 1,84D. Nilai momen dipol ini didapatkan berdasarkan
jumlah vector dari momen ikatan H-O dan momen PEB. Atom O lebih
elektronegatif dari pada atom H sehingaa arah momen ikatan O-H akan
mengarah ke atom O. Sedangkan untuk arah momen pasangan electron
bebas mengarah dari atom O menuju pasangan electron bebas, kedua hal
tersebut menyebabkan air bersifat polar. Alasan dari pemilihan ketiga
pelarut tersebut adalah agar semua senyawa yang ikut tertarik dengan
menggunakan etanol dapt terpisahkan berdasarkan kepolarannya sehingga
dari hasil fraksinasi ini akan dihasilkan 3 fraksi yaitu fraksi air, fraksi etil
asetat dan fraksi n-hexane.
5. Pemantauan Fraksi Dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pemantauan fraksi dilakukan untuk melihat atau mengidentifikasi
pada fraksi mana zat aktif yang diinginkan berada (polar, semi polar atau
non polar) dan biasanya disertai dengan pengujian secara kualitatif dengan
menggunakan reangen pereaksi seperti pada skrining fitokimia flavonoid.
Pemantauan fraksi dilakukan dengan metode KLT menggunakan fase
gerak (Eluen) yang sama pada saat pemantauan ekstrak. Fraksi dengan Rf
yang paling mendekati Rf standar merupakan fraksi yang mengandung
senyawa aktif target.
Fase gerak

: n-butanolasam asetatair (3:1:5)

Fase diam

: Silika gel GF254

Larutan uji

: 5% dalam etanol P

Volume Penotolan

: Totolkan 2 L larutan uji dan 2 L larutan standar

Epigalokatekin galat

6. Subfraksinasi Dengan Metode Kromatografi Kolom

Subfraksinasi dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
larut

dalam

fraksi

sebelumnya

agar

didapat

senyawa

tunggal.

Kromatografi kolom adalah system kromatografi yang menggunakan

kolom sebagai alat untuk memishkan komponen komponen dalam
campuran. Pemisahan yang terjadi pada kromatografi kolom didasarkan
pada mekanisme adsorpsi, dimana komponen komponen dalam campuran
akan terpisah karena memiliki afinitas adsorpsi yang berbeda beda
terhadap fase diam yang digunakan.
Fase diam yang digunakan pada kromatografi kolom ini adalah
serbuk silica. Sebelum digunakan silica ini harus diaktivasi terlebih dahulu
dengan cara dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC. Aktivasi silica
tersebut dilakukan karena silica gel merupakan jenis adsorben (fase diam)
yang terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol
bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mempu membentuk
ikatan hydrogen dengan solute-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer / lingkungan yang diserap oleh permukaan silica
gel mampu mendeaktifkan permukaan silica gel karena air akan menutup
sisi aktif silica gel sehingga akan menggangu proses elusi.
Kedalam kolom kromatografi di masukkan glass woll dan pasir.
Kemudian diatas pasir ditambahkan serbuk silica yang telah di aktivasi
keumidian ditambahkan kembali pasir. Penmbahan glas wol dan pasir
dilakukan untuk menyaring senyawa yang telah dipisahkan ketika di elusi
di fase diam sehingga akan di dapat fraksi yang lebih murni. Penyiapan
fase diam ini dilakukan dengan cara kering karena serbuk silica langsung
dimasukkan kedalam kolom secara perlahan lahan agar serbuk silica yang
dimasukkan merta dan akan terhindar dari gelembung gelembung udara,
adanya gelembung udara akan menyebabkan pecanya (breaking) fase diam
yang mengahambat proses pemisahan. Untuk menghilangkan gelembung

udara yang mungkin ada diantara fase diam maka fase diam yang
dimasukkan harus dimampatkan sedemikian rupa dengan cara kolom di
ketuk-ketuk atau dengan bantuan batang pengaduk untuk memampatkan
fase diam. Kemudian fase diam (serbuk silica) di basahi dengan
menggunakan kloroform. Pembasahn ini dilakukan untuk menjenuh kan
silica dengan eluen yang bersifat nonpolar. Setelah fase diam dibasahkan
dilanjutkan dengan menambahkn ekstrak yang telah di gerus bersama
serbuk silica.
Proses elusi dilakukan dengan menggunakan fase gerak berupa
campran antara n-butanol : asam asetat : air dengan gradient yang berbeda.
Proses elusi dengan perbandingan eluen yang berbeda beda disebut dengan
elusi secara gradient. Teknik ini dipilih karena dapat memisahkan komponen
dalam suatu cmpuran berdasarkan kepolarannya sehingga akan didapat
fraksi fraksi yang mengandung komponen yang sesuai dengan polaritasnya
masing masing. Perbandigan eluen tersebut adalah n-butanol : asam asetat :
air dengan perbandingan (10:1:0); (9:1:1); (8:1:2); (7:1:3); (6:1:4); (5:1:5);
(4:1:6); (3:1:7); (2:1:8); (1:1:9) dan (0:1:10). Fase gerak yang pertama di
masukkan kedalam kolom adalah fase gerak yang paling non polar yaitu nbutanol : asam asetat : air dengan perbandingan (10:1:0) karena karena
apabila yang digunakan adalah eluen semipolar, maka ditakutkan eluen
semipolar akan menarik semua senyawa yang terdapat dalam ektrak dan
tidak terjadi pemisahan karena eluen semipolar cenderung dapat malarutkan
senyawa polar maupun non polar. Sehingga digunakan pelarut non polar
terlebih dahulu karena pelarut non polar hanya dapat melarutkan senyawa
non polar, sehingga dapat terjadi pemisahan senyawa berdasarkan tingkat
kepolarannya.
Dalam kolom komponen akan terpisah membentuk pita pita yang
pada elusi seterusnya akan keluar meninggalkan kolom sebagai fraksi
fraksi komponen yang terpisah. Agar terjadi pemisahan yang sempurna,
kolom yang digunakan harus sepanjang dan ketinggian dari pita pita yang
dihasilkan harus pendek . karena semakin panjang kolom yang digunakan
maka proses elusi akan manjadi semakin lama yang akan menghasilkan

pemisahan yang optimal. Setiap eluen yang keluar ditampung kedalam vial
yang berbeda.
7. Pemantauan Subfraksi Dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Pemantauan subfraksi dilakukan untuk mengetahui berada di
subfraksi manakah senyawa aktif target. Pemantauan subfraksi dilakukan
dengan metode KLT menggunakan fase gerak (Eluen) yang sama pada saat
pemantauan ekstrak. Subfraksi dengan Rf yang paling mendekati Rf
standar merupakan subfraksi yang mengandung senyawa aktif target.
Fase gerak

: n-butanolasam asetatair (3:1:5)

Fase diam

: Silika gel GF254

Larutan uji

: 5% dalam etanol P

Volume Penotolan

: Totolkan 2 L larutan uji dan 2 L larutan standar

Epigalokatekin galat
8. Kromatografi Lapis Tipis Preparative
Subfraksi pada pemantauan subfraksi yang memberikan nilai R f
paling mendekati nilai Rf standar di satukan. KLT preparative merupakan
KLT yang dilakukan dengan menggunakan lapisan fase diam yang lebih
tebal yakni sekita 0,5 mm 2 mm dan ukuran plat kromatografi biasanya
20 cm x 20 cm. Namun, pada praktikum digunakan plat KLT biasa dengan
ukuran tinggi 9 cm dengan lebar 4cm. Fase diam yang digunakan adalah
silica gel. Senyawa senyawa yang yang telah terpisahkna pada plat KLTP
dapat diperoleh kembali dengan mengerok penjerap ditempat yang sesuai
pada plat yang telah dikembangkan dan dilarutkan dalam pelarut.
9. Uji Kemurnian
Uji kemurnian dilakukan dengan meggunakan metode Kromatografi
Lapis Tipis 2 dimensi. Uji kemurnian dilakukan pada hasil pengerokan
pada KLT preparative yang telah dilakukan sebelumnya. Uji kemurnian
dilakukan untuk mengetahui apakah hasil pengerokan tersebut telah
menghasilkan analit murni atau belum.
Eluen yang digunakan pada KLT 2 dimensi terdiri dari 2 eluen yang
berbeda kepolaran. Penggunaan fase gerak dengan tingkat kepolaran yang
berbeda tersebut berguna untuk memastikan keberadaan senyawa tunggal
dalam sampel.
Plat silica yang digunakan memiliki tinggi 4 cm, penanndaan pada
plat silica dilakukan pada 0,5 cm dari bagian bawah plat dan 0,5 dari bagian

atas plat yang artinya jarak rambat eluen adalah 3 cm. Bagian bawah plat
silica ditandai untuk tempat penotolan sampel dan batas tinggi eluen yang
digunakan, sedangkan penandaan pada bagian atas plat berfungsi sebagai
batas elusi dari eluen yang digunakan yang akan berpengaruh pada nilai Rf
yang dihasilkan. Sampel ditotolkan pada bagian yang telah diberi tanda pada
bagian kiri bawah plat, penotolan dilakukan dengan ukuran bercak sekecil
dan sesempit mungkin yang bertujuan mencegah terjadinya penurunan
resolusi sehingga spot yang dihasilkan tidak menyebar dan tidak
menghasilkan puncak ganda.
Setelah sampel ditotolkan, plat dimasukkan kedalam chamber yang
telah berisi eluen pertama kurng lebih sebnyak 5 mL dan telah terjenuhkan
oleh uap dari eluen. Eluen yang terdapat dalam chamber tidak boleh
mengenai sampel yang ditotolakn karena dapat menyebabkan pelebaran
ukuran spot dan larutnya sampel dalam eluen. Proses elusi dilakukan
dalam keadaan chamber tertutup untuk mencegah keluar nya uap eluen
yang menjenuhkan chamber. Setelah beberapa menit proses elusi
dihentikan karena eluen telah mencapai tanda batas atas. Kemudian Plat
silica diangkat dan eluen pertama diuapkan. Setelah eluen pertama habis
menguap, eluen kedua dimasukkan kedalam chamber kurang lebih
sebnyak 5 mL. Plat di putar 90 o kearah kiri sehingga spot yang dihasilkan
ketika elusi pertama berada dibagian bawah. Plat tersebut dimasukkan
kedalam chamber yang berisi eluen kedua untuk proses elusi. KLT dua
arah atau dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel
ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang
hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir. Selain itu, dua sistem fase
gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga
memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai
tingkat polaritas yang berbeda.