Aula de Biofsica Qumica

Tema:

Espectropolarimetria de Dicrosmo Circular

Circular Dichroism - CD
Prof. Dr. Jlio Csar Borges
Depto. de Qumica e Fsica Molecular DQFM
Instituto de Qumica de So Carlos IQSC
Universidade de So Paulo USP
E-mail
mail:: borgesjc@iqsc.usp.br

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Luz Polarizada

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Diferena de Absoro entre a luz Circularmente polarizada
- Esquerda
- Direita

CDsignal = ( nm ) = AEsquerda ( nm ) ADireita ( nm )

 Luz Circularmente Polarizada
A combinao de duas ondas linearmente polarizadas, uma vertical e outra
horizontal, de mesma amplitude e eletricamente DEFASADAS em 90 graus, resulta
em uma onda CIRCULARMENTE POLARIZADA
Amplitudes diferentes - uma onda elipticamente polarizada

http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo1.htm

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Diferena de Absoro entre a luz Circularmente polarizada
- Esquerda
- Direita

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Luz Plano Polarizada
- Somatria da luz circularmente polaridade esquerda e direita

Elipcidade somatria vetorial da luz Plano polarizada

Luz Plano
Polarizada

Elipcidade somatria vetorial

da luz Plano polarizada absorvida
esquerda e direita

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Assimetria
- Molcula assimtrica exibe fenmeno de dicrosmo circular porque a absoro de
luz circularmente polarizada dependente da rotao.

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Assimetria em Biomolculas  PROTENAS
- Estrutura primria: carbono alfa dos aminocidos (exceo Gly
Gly).
).
- Estrutura secundria: transies eletrnicas na cadeia principal e alfa
alfa--hlice
- Estrutura terciria: molculas simtricas colocadas em um campo assimtrico
(Tyr)
Tyr)

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Conformao da estrutura secundria
 n
* = 215215-222 nm

* = 190190-200 nm (208 nm
nm))
 n
* = envolve eltrons nono-ligantes do O do grupo
Carbonila (dipolo magntico)

* = envolve eletrons (dipolo eltrico)
 A intensidade e energia destas transies depende
dos ngulos da ligao peptdica ( e ) e portanto da
estrutura secundria da protena.

n
* centered around
220 nm

* centered around
190 nm

DICROSMO CIRCULAR (CD)

O cromforo em protenas

Plot de Ramachandram

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estrutura secundria: Hlice alfa

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estrutura secundria: Folha Beta

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Plot de Ramachandram e preferncia de estruturao de Aminocidos

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Conformao da estrutura secundria

Momento dipolo  polarizao

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Conformao da estrutura secundria
Alfa-hlice
Folha-beta paralela
Folha-beta antiparalela
Desordenada

+10

-10

Comprim ento de onda (nm )

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Conformao da estrutura secundria

EXEMPLOS

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Conformao da estrutura secundria

Aplicaes
1. Enovelamento de Protenas
2. Comparao de estruturas
Protenas obtidas de diferentes fontes
Mutantes de uma mesma protena
Controle de qualidade de protenas
estrutura secundria
3. Estabilidade Trmica e Qumica
 pH
T
 Desnaturantes
3. Mudanas conformacionais e ensaios de interao
Interaes protenaprotena-protena
Interaes protenasprotenas-ligantes

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Elipcidade Molar [] e CD molar
= rateio entre o menor eixo pelo maior eixo da elipse

( AL AR )
= L R =
cd
( )

ln 10 (180 o )( AL AR )
=
4
100
=
[c]d

[ ] =

100
= 3298.
[c]d

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  O tamanho da Cadeia influncia o Sinal de CD

Elipcidade Molar Residual = Deg.cm
Deg.cm2/dmol
n = nmero de resduos de aminocidos
MRW = Mean residue Weight

[ ]MRW( ) =

( ) .M W
10.c g .d .n

cg = mg/mL
mg/mL

[ ]MRW( ) =

( )
10.[c].d .n

[c] = mol/L = M

DICROSMO CIRCULAR (CD)

CD de PROTENAS  transies, max e
Secondary
structure
-helix

-sheet
Random--coil
Random

max

Signal

Transition

Wavelength
(nm)
nm)

positive

*

190--195
190

60,000 to 80,000

negative

*

208

-36,000 3,000

negative

n
*

222

-36,000 3,000

positive

*

195 - 200

30,000 to 50,000

negative

n
*

215 - 220

-10,000 to -20,000

negative

*

200

-20,000

positive

n
*

220

small

-helix

-sheet

Intensity
(deg.cm2.dmol-1)

Random
Random--coil

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Elipcidade Molar Residual

Permite comparao direta entre protenas com diferentes nmeros de
aminocidos

DECONVOLUO

Estimativa da quantidade de
estrutura secundria de um protena a
partir de seu espectro de CD.

Comparao do Espectro de CD em
EMR com bancos de dados de Espectros
de CD de protenas com a sua estrutura
3D determinada.

Ex: CDNN

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Estudo de PROTENAS  Dependncia das condies experimentais
- Temperatura

- pH

- Agentes desnaturantes - Ligantes

pH 2

pH 7

DICROSMO CIRCULAR (CD)

-Aromatic side chains, such as Phe
Phe,, Trp,
Trp, and Tyr, absorb CD light in a lesser extent
than secondary structure.
- Absorption bands of protein chromophores
chromophores::
Wavelength Range
250--270nm
250

Chromophore Contributions
side chain Phe

270--290nm
270

side chain Tyr

280--300nm
280

side chain Trp

250--350nm
250

disulphide bond

Resduos aromticos:

*: 250250-300 nm
-W contribui com
banda + em 230 nm

Pontes dissulfeto
dissulfeto::
n-* : 260 nm

DICROSMO CIRCULAR (CD)

Ponto isodicrico
- (nm) de cruzamento de espectros de CD em diferentes concentraes = 0

Variaes no Ponto isodicrico pode indicar mudana de conformao

Ramos, 1998

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 Ensaios de interao
- A espectropolarimetria de CD sensvel mudanas conoformacionais envolvidas
em interaes diversas

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 Ensaios de interao
- A espectropolarimetria de CD sensvel mudanas conformacionais envolvidas
em interaes diversas
25
Hsp70 20 mol/L
Nativa
MgAMP 100 mol/L
MgADP 100 mol/L
MgATP 100 mol/L

[] (103 mDeg x cm x dmol-1)

20
15
10
5
0
-5
-10
-15
190

200

210
220
230
240
Comprimento de onda (nm)

250

260

Borges & Ramos, ABB (2006)

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 Ensaios de interao em funo da Temperatura
- A espectropolarimetria de CD sensvel mudanas conformacionais envolvidas
em interaes diversas

[]222nm (103 mDeg x cm x dmol-1)

0
Hsp70 6 mol/L
Nativa
ADP 200 mol/L
MgADP 200 mol/L
ATP 200 mol/L
MgATP 200 mol/L

-2

-4

-6

-8

-10

-12
20

30

40

50

60

70

80

90

Temperatura (oC)
Borges & Ramos, ABB (2006)

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 CD uma importante sonda de estrutura secundria para estudos de
Enovelamento de protenas

G10 m1 [D ]

G10 + G20 (m1 + m2 )[D]

YN + Yi exp
+ YU exp

RT
RT

Y=
G10 m1 [D]

G10 + G20 (m1 + m2 )[D]

1 + exp
+ exp

RT
RT

Hughson et al. (1990). Science

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 possvel estimar a GH2O de um sistema em desenovelamento dois estados
diretamente a partir do sinal de CD na presena de agentes desnaturantes

Importante ferramenta para comparar protenas diferentes em termos de
estabilidade
Protein Folding

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 CD uma importante sonda de estrutura secundria para estudos de
Enovelamento de protenas

G10 m1 [D]

G10 + G20 (m1 + m2 )[D]

YN + Yi exp
+ YU exp

RT
RT

Y=
G10 m1 [D]

G10 + G20 (m1 + m2 )[D]

1 + exp
exp

RT
RT

Thermodynamic
property

Sis1_
Sis1_
GM130

GwN-I (kcal/mol)

4.9 0.5

GwI-U (kcal/mol)

6.1 0.3

mN-I (kcal/mol.mol/L)

2.4 0.2

mI-U (kcal/mol.mol/L)

1.4 0.1

CmN-I (mol/L
(mol/L))

2.0 0.1

CmI-U (mol/L
(mol/L))

4.3 0.1

G w
Cm =
mvalue

Medidas de DICROSMO CIRCULAR (CD)

 Fluxo de N2 constante
evitar formao de O3 em Far UV (< 230 nm
nm))
 Filtrar/centrifugar
eliminar material particulado (espalhamento)
 Concentrao de protena: < 1.0 Abs.
Depende do passo ptico
1 cm: 1 M (10(10-100 g/mL ); 2 mL
1 mm: 10 M (0,1(0,1-1 mg/mL ); 200 L
 Ar, cubeta,
cubeta, branco
 Voltagem < 600 V

JASCO JJ-815
163--1100 nm
163

DICROSMO CIRCULAR (CD)

 Cubetas de Quartzo temperadas
 Cdigo azul
transparncia > 80% entre 200200-800 nm
 Passo tico e volume
Lei de BeerBeer-Lambert
 Uso de Luvas
evitar gordura dos dedos
 Limpeza com Hellmanex
Hellmanex,, gua, acetona, etanol, gua
 cido Ntrico a quente (se necessrio)
- Retangulares (1(1-10 mm)

-Circulares (0,1/0,2/0,5/1,0 mm)