PEMBUATAN dan PEWARNAAN

HAPUSAN DARAH TEPI

OLEH :
PUTU RINA WIDHIASIH
(P07134014002)

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
TAHUN AKADEMIK 2015/2016

Tanggal Praktikum

: 14 & 21 Maret 2016

Materi Praktikum

: Pembuatan dan Pewarnaan Hapusan Darah Tepi

I. TUJUAN
Untuk dapat mengetahui cara pembuatan dan pewarnaan sediaan hapusan darah.
II.METODE
Metode yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah hapusan darah (blood smear)
III.

PRINSIP
Darah + antikoagulan di teteskan pada objek glass dan di buat hapusan menyerupai
lidah, kemudian sediaan di warnai dengan giemsha lalu dibaca dibaca pada mikroskop.

IV.

DASAR TEORI
1. Darah
Darah berasal dari kata haima, yang berasal dari akar kata hemo atau hemato. Darah
adalah sejenis jaringan ikat yang sel-selnya (elemen pembentuk) tertahan dan dibawa dalam
matriks cairan (plasma). Darah terdiri dari 45% korpuskula dan 55% plasma darah. Darah
lebih berat dibandingkan air dan lebih kental. Cairan ini memiliki rasa dan bau yang khas,
serta PH 7,4 (7,35 - 7,45). (Mansyur Arif.2012)
Warna darah bervariasi dari merah terang sampai merah tua kebiruan, bergantung
pada kadar oksigen yang dibawa sel darah merah. Volume darah total sekitar 5 liter pada lakilaki dewasa berukuran rata- rata, dan kurang sedikit pada perempuan dewasa. Volume ini
bervariasi sesuai dengan ukuran tubuh dan berbanding terbalik dengan jumlah jaringan
adiposa dalam tubuh. Volume ini juga bervariasi sesuai dengan perubahan cairan darah dan
konsentrasi elektrolitnya.
Darah memiliki komposisi yang terdiri atas sekitar 55% cairan darah (plasma) dan
45% sel-sel darah. Elemen pembentuk darah meliputi tiga macam sel darah, yaitu sel darah
merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit). Ketiga sel-sel
darah tersebut tergolong dalam unsur padat yang disebut korpuskuler. (Mansyur Arif.2012)

2. Sediaan hapusan darah

Hapusan darah tepi adalah tindakan diagnostik yang digunakan dalam evaluasi dan
diagnosis berbagai kondisi medis, atau dalam bahasa Inggris dikenal sebagai Blood Smear.

Ini adalah tindakan standar jika dokter menduga ada penyakit atau infeksi, Hapusan darah
tepi biasanya tes diagnostik pertama yang dilakukan.Dalam hapusan darah tepi yang
diperiksa adalah tiga komponen utama darah:

Trombosit

Sel darah putih

Sel darah merah

Trombosit adalah sel yang memungkinkan pembentukan gumpalan darah untuk

mencegah darah mengalir dengan bebas dalam luka. Hal ini memainkan peran penting dalam
proses penyembuhan. Sementara itu, sel-sel darah putih merupakan bagian penting dari
sistem kekebalan tubuh karena mereka melawan zat asing dan penyakit menular. Sel darah
merah, di sisi lain, memberikan oksigen ke berbagai organ untuk memungkinkan mereka
berfungsi secara normal. (Bashar, yazhid.2013)
Sediaan hapusan digunakan untuk melihat komponen-komponen ini di bawah
mikroskop untuk memeriksa setiap kelainan, seperti dalam bentuk sel-sel atau jumlahnya.
Kelainan sel-sel ini menghasilkan komplikasi dalam pengiriman oksigen, dalam sistem
kekebalan tubuh, atau pembekuan darah.Hapusan darah tepi merupakan bagian tak
terpisahkan dari proses diagnostik. Pewarnaan hapusan merupakan komponen penting dalam
pembuatan hapusan ini karena dengan adanya pewarnaan maka akan memberikan gradasi
warna dan memperjelas setiap inti dan bagian dari sel-sel darah, sehingga memudahkan
dalam pengamatannya. Pewarnaan yang biasa dilakukan adalah pewarnaan Romanowsky
yaitu :
o Pewarna Wright, yang dipakai sebagai pewarna tunggal
o Pewarna Giemsha, yang dipakai sebagai pewarna tunggal atau bersama-sama
dengan pewarna May-Grunwald

o Pewarna May-Grunwald, yang dipakai bersama-sama dengan pewarna

Giemsha sebagai pewarna May-Grunwald Giemsa (MGG)
o Pewarna Leishman, yang dipakai sebagai pewarna tunggal
(Riswanto. 2013)
Bahkan, hampir setiap pasien akan memerlukan hapusan darah tepi. Namun, beberapa
alasan

paling umum mengapa dokter akan meminta tindakan ini adalah untuk

mengidentifikasi alasan mengapa pasien mengalami anemia, penyakit kuning, memar

abnormal, nyeri tulang, ruam, infeksi, penurunan berat badan, atau gejala flu berulang.
Sangat penting untuk memahami bahwa hasil hapusan darah tepi dapat dipengaruhi oleh
beberapa faktor. Sangat penting bagi Anda untuk menginformasikan dokter, apa saja obat,
vitamin, atau suplemen yang Anda konsumsi jika diminta untuk menjalani tindakan tersebut.
(Vanila.2011)
Beberapa jenis pengobatan paling umum yang akan mempengaruhi hasil tes hapusan
darah tepi adalah antikoagulan dan obat untuk penyakit lain. Jika Anda telah didiagnosa
dengan penyakit tertentu sebelum menjalani hapusan darah tepi, pastikan bahwa dokter telah
diinformasikan soal ini untuk menghindari hasil yang salah. Jika ada kelainan pada sel darah
putih, ini bisa menunjukkan kondisi, seperti malaria, hepatitis C, infeksi jamur, infeksi
parasit, HIV, limfoma, leukemia akut, dan gangguan limfoproliferatif. Untuk memastikan
hasil temuan, dokter pendiagnosa akan menggabungkan hasil hapusan darah tepi dengan
hasil tes lain untuk mengkonfirmasi gangguan tertentu. Kelainan trombosit bisa
menunjukkan gangguan mieloproliferatif, trombositopenia, penyakit hati, hypothyroidism,
atau penyakit ginjal. Hasil sel darah merah yang abnormal dapat mengindikasikan anemia,
penyakit sel sabit, polisitemia, defisiensi vitamin B12, atau sindrom hemolitik uremik. (Joy
LeFever Kee.2007)

V. ALAT DAN BAHAN

a. Alat

Objek glass

Pipet tetes

Rak pewarna

Beaker glass

Pipet ukur

Ball pipet

Botol semprot

Stopwatch

Mikroskop binokuler

b. Bahan

Darah vena dengan antikoagulan EDTA

Tissue

Tissue lensa

Buffer phosfat pH 6.8

Giemsha pekat

Methanol p.a

Alkohol 70 %

VI.

Aquadest

Oil imersi

CARA KERJA
a. Pembuatan sediaan hapusan darah
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan di gunakan
2. Diteteskan sampel darah pada objek glass
3. Diratakan sampel darah dengan bantuan objek glass yang lain
4. Didorong objek glass dengan membentuk sudut 30-40 derajat
5. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat
b. Pewarnaan sediaan hapusan darah

Giemsha
1. Diteteskan sediaan darah pada rak pewarnaan
2. Diteteskan methanol pada sediaan selama 5 menit
3. Diteteskan sediaan hapusan dengan giemsha + buffer phosfat (1:4)
4. Diamkan larutan pewarna pada sediaan selama 30 menit
5. Dibilas sediaan yang diwarnai dengan aquadest
6. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat

Wright
1. Diteteskan sediaan darah pada rak pewarnaan
2. Diteteskan methanol pada sediaan selama 5 menit
3. Diteteskan cat Wright sebanyak 20 tetes pada hapusan dan tunggu 2 menit
4. Diteteskan buffer phosfat pH 6,4 pada hapusan dan tunggu 20 menit
5. Dibilas sediaan yang diwarnai dengan aquadest atau air mengalir
6. Dikeringkan dengan menganginkan sediaan hapusan yang telah dibuat

VII. HASIL PENGAMATAN

Hapusan darah
tepi sebelum
dilakukan
pengecatan

Hapusan
dalam
jembatan
pengecatan

Hapusan
dengan
pengecatan
Giemsha

Hapusan
dengan
pengecatan
Wright

Gambar dibawah
mikroskop dengan
pengecatan Giemsha

Gambar dibawah
mikroskop dengan
pengecatan Wright

VIII.

PEMBAHASAN
Sediaan hapusan dapat dibedakan menjadi sediaan hapusan darah tipis dan
hapusan darah tebal. Kedua jenis hapusan ini biasanya digunakan untuk identifikasi
parasit Plasmodium sp. yang menyebabkan penyakit malaria. Pada hematologi
pembuatan hapusan darah juga sangat diperlukan untuk membantu diagnosis namun
pembuatan hapusan yang digunakan hanya hapusan darah tipis. Sediaan hapusan tipis
digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi morfologi sel darah (eritrosit, leukosit
dan trombosit), menentukan fraksi jumlah leukosit dan mengestimasi jumlah trombosit.
Sediaan ini dibuat dengan meletakkan setetes (kecil saja) darah pada kaca objek,
kemudian ditempatkan ujung kaca objek didepan tetesan darah tersebut dan biarkan darah
menepati seluruh ujung kaca objek lalu dorong kebelakang sedikit kemudian dorong
kedepan sehingga terbentuk hapusan yang tipis yang berbentuk peluru atau lidah. Dimana
hapusan ini harus memiliki daerah counting area sebagai tempat untuk penghitungan
yang penyebaran eritrositnya merata tidak menumpuk dan tidak jarang.

Hal-hal yang perlu diperhatikan yaitu, Kaca objek yang digunakan harus kering,
bersih dari debu dan lemak. Kaca objek yang berminyak/berlemak menyebabkan apusan
berlubang-lubang. Hindari menyentuh permukaan kaca objek dengan tangan. Kotoran
yang menempel pada kaca objek menyebabkan kesulitan dalam pembacaan. Pada waktu
pembuatan sediaan harus memperhatikan sudut kemiringan kaca penggeser dengan kaca
objek dan kecepatan penggerakan kaca penghapus sebab dapat berpengaruh pada
ketebalaan sediaan yang dibuat, semakin kecil sudut penggeseran dan semakin lambat
menggeser, maka semakin tipis apusan. Namun Penyebaran leukosit pada sediaan yang
dibuat tidak merata, leukosit kecil-kecil selalu lebih banyak terdapat di tengah-tengah,
sedangkan yang besar-besar lebih banyak dipinggir. Maka dari itu sebaiknya digunakan
sudut 30-40 derajat saja. (Riswanto. 2013)
Ciri-ciri sediaan apusan yang baik yaitu :
1. Memiliki bagian tebal dan bagian tipis untuk pembacan
2. Tidak melebar sampai pinggir kaca objek, panjangnya kira-kira setengah
sampai 2/3 kaca objek
3. Penyebaran eritrosit dan leukosit bagus, dimana sel-sel eritrosit terletak
berdekatan dan tidak bertumpuk-tumpuk atau menyusun gumpalan dan
sel-sel luekosit tersebar merata, tidak terhimpun/menggerombol dipinggirpinggir atau diujung-ujung sediaan.
4. Sediaan tidak boleh berlubang-lubang atau bergaris-garis, ditepi hapusan
rata tidak membentuk gerigi.
5. Bentuk seperti peluru

Selanjutnya hapusan yang sudah dibuat sebaiknya difiksasi terlebih dahulu

dengan menggunakan larutan methanol selama 5 menit, fiksasi ini bertujuan untuk
merekatkan sel-sel darah pada kaca objek. Namun sebelum difiksasi sebaiknya hapusan
dipastikan sudah benar-benar kering sempurna. Karena jika tidak kering sempurna maka
saat membilasnya dengan aquadest hapusan pada bagian yang belum kering akan ikut
larut dengan aquades menyebabkan lubang pada hapusan. Setelah dibilas dengan aquades

ditunggu sampai hapusan kering sempurna kemudian bisa dilanjutkan pewarnaan ataupun
disimpan.
Pada praktikum kali ini hapusan yang telah difiksasi disimpan terlebih dahulu
kemudian baru lakuakan pewarnaan. Pewarna yang digunakan adalah pewarna
Romanowsky yang terdiri dari zat warna methylene blue, azure B (produk oksidatif dari
methylene blue) dan eosin. Prinsip pewarnaan Romanowsky adalah :

Elemen seluler yang bersifat asam, seperti nucleoprotein, asam nukleat dan
protein plasma bereaksi dengan zat warna basa methylene blue dan azure B

sehingga terwarnai biru. Elemen seluler tersebut dinamakan basofilik

Elemen seluler yang bersifat basa, seperti hemoglobin dan beberapa
konstituen sitoplamik leukosit bereaksi dengan zat warna asam eosin dan

terwarnai orange-merah. Mereka dinamakan asidofilik

Elemen seluler yang bersifat netral, seperti beberapa organela seluler dapat
bereaksi dengan zat warna asam maupun basa serta menunjukan warna
ungu, yaitu campuran antara warna biru dan merah. Yang dinamakan
neutrofil
(Riswanto. 2013)

Pada praktikum kali ini digunakan 2 macam cat yaitu cat giemsha dan Wright.
Pewarna Wright dapat dibeli dalam bentuk serbuk atau larutan siap pakai. Untuk
membuat larutan sendiri, serbuk Wright harus diencerkan dengan methyl alcohol
(methanol). Setiap 0,1 gram serbuk itu digerus dalam mortar dan dilarutkan dengan
methanol sedikit demi sedikit sampai 60 ml. Karena sudah mengandung methanol dengan
konsentrasi tinggi pewarnaan Wright tidak perlu difiksasi terlebih dahulu. Namun karena
adanya penundaan pewarnaan saat praktikum sehingga hapusan sebelumnya sudah
difiksasi dengan methanol. Pewarnaan Wright baik digunakan untuk tujuan penilaian
morfologi sel-sel darah karena struktur plasma dan inti (nucleus) lebih jelas terlihat.
Sediaan yang banyak berisi sel-sel muda dan sediaan sumsum tulang lebih baik diwarnai
dengan pewarna ini. Untuk mendapatkan hasil pewarnaan yang bagus, pewarnaan
dilakukan dengan menambahkan larutan penyangga (buffer) fosfat pH 6,4. Larutan buffer

ini dibuat dari kalium dihidrogen fosfat (KH 2PO4) 6,63 gr, natrium hydrogen fosfat
(Na2HPO4) 2,56 gr dan 1 liter aquadest.
Cara pewarnaan dengan pewarna Wright adalah teteskan 20 tetes cat Wright pada
hapusan usahakan memenuhi semua bagian hapusan kemudian tunggu selama 2 menit,
lalu tambahkan buffer fosfat dan tunggu 20 menit. Buffer fosfat yang sebaiknya
digunakan adalah dengan pH 6,4 namun pada praktikum kali ini digunakan buffer fosfat
dengan pH 7 namun penggunaan larutan buffer 7 ini tidak mempengaruhi pewarnaan
tetapi sebaiknya menggunakan buffer fosfat dengan pH 6,4. Langkah terakhir dibilas
menggunakan aquadest atau air mengalir tunggu hingga kering kemudian dapat dibaca
pada mikroskop.
Pewarna giemsa biasanya dapat dibeli dalam bentuk larutan. Sebelum digunakan,
larutan ini harus diencerkan dengan larutan penyangga (buffer) fosfat pH 6,4. Pewarna
Giemsa diencerkan dengan buffer fosfat pH 6,4 dengan perbandingan 1 bagian Giemsa
dan 4 bagian atau 3 bagian buffer kemudian saring. Larutan ini harus dibuat dan segera
digunakan. Pewarnaan Giemsa tidak mengandung methanol sehingga sediaan perlu
difiksasi terlebih dahulu sebelum diwarnai. Zat warna Giemsa sama baiknya dengan zat
warna Wright untuk darah yang tidak banyak kelainan morfologinya. Perbedaannya
adalah pewarnaan dengan giemsa menyebabkan granula basophil tidak Nampak karena
granula itu akan larut. Selain itu eritrosit berwarna abu-abu. Namun jika untuk
mengamati parasite-parasit darah lebih baik menggunakan zat warna giemsa.
Cara pewarnaan dengan pewarna Giemsha adalah teteskan zat warna Giemsa
yang sebelumnya telah diencerkan dengan buffer fosfat dan telah disaring pada hapusan
sampai semua bagian hapusan tertutupi oleh zat warna. Kemudian tunggu selama 30
menit. Buffer fosfat yang sebaiknya digunakan adalah dengan pH 6,4 namun pada
praktikum kali ini digunakan buffer fosfat dengan pH 7. Langkah terakhir dibilas
menggunakan aquadest atau air mengalir tunggu hingga kering kemudian dapat dibaca
pada mikroskop.
Cara pembacaan hapusan yang benar adalah
1. Pilih bagian yang akan dipakai (zona dimana eritrosit tersebar rata)

2. Mulailah menghitung sel pada pinggir atas kebawah

3. Mulailah menghitung dari bagian ekor
Morfologi Sediaan apusan tipis
Dibedakan atas : kepala dan ekor
Bagian badan dibagi beberapa zona:

Zona I
Zona II
Zona III
Zona IV
Zona V
Zona VI

: irregular, tidak teratur,berdesakan, 3%

: tipis,tidak rata,berdesakan, 14%
: tebal, bergerombol,rouleux, 45%
: tipis , penyebaran rata, 18%
: tidak bertumpukan,penyebaran rata,bentuk utuh,11%
: sangat tipis, lebih longgar dan jarang, 9%
(Rahma Yuli.2011)

Sumber Kesalahan
1. Kesalahan dalam persiapan penderita, pengambilan dan penyimpanan bahan
pemeriksaan
2. Sediaan apus terlalu biru memungkinkan disebabkan oleh apusan yang terlampau
tebal , pewarnaan terlalu lama , kurang pencucian , zat warna atau larutan dapar
yang alkalis.
3. Sediaan apus terlalu merah mungkin disebabkan oleh sat warna sediaan atau larutan
dapar yang asam. Larutan yang terlalu asam dapat menyebabkan lekosit hancur.
4. Bercak-bercak zat warna pada sediaan apus dapat disebabkan oleh zat warna tidak
disaring sebelum dipakai atau pewarnaan terlalu lama sehingga zat warna
mengering pada sedian.
5. Morfologi sel yang terbaik adalah bila menggunakan darah tepi langsung tanpa anti
koagulan. Bila menggunakan anti koagulan sediaan apus harus dibuat segera, tidak
lebih dari satu jam setelah pengambilan darah. Penggunaan antikogulan heparin
akan menyebabkan latar belakang berwarna biru dan lekosit menggumpal

6. Sediaan hapus yang tidak rata dapat disebabkan oleh kaca pengapus yang tidak
bersih atau pinggirannya tidak rata atau oleh kaca objek yang berdebu, berlemak
atau bersidik jari.
7. Fiksasi yang tidak baik menyebabkan perubahan morfologi dan warna sediaan. Ini
mungkin terjadi apa bila fiksasi dilakukan menggunakan methanol yang tidak
absolut karena telah menyerap uap air akibat penyimpanan yang tidak baik.
8. Fiksasi yang tidak dilakukan segera setelah sediaan apus kering dapat
mengakibatkan perubahan morfologi lekosit.
(Bashar, yazhid.2013)
IX. KESIMPULAN
Pada praktikum kali ini dibuat hapusan dengan metode blood smear, dan dibuat hapusan
setipis mungkin serta digunakan pewarna giemsha dan wright untuk pengecatan sediaan
hapusan tersebut.

DAFTAR PUSTAKA
Anonim.2011.Sediaan

Apus

Darah.

(online).tersedia:https://nae010693.wordpress.com/tag/sediaan-apus-darah-tepi/.[Diakses:
25 Maret 2016. 10:15]
Bashar,

yazhid.2013.Pembuatan

dan

Pewarnaan

Sediaan

Apusan.[online].tersedia

http://yazhid28bashar.blogspot.co.id/2013/04/pembuatan-dan-pewarnaan-sediaanapus.html.[diakses 24 Maret 2016 14.45]

Joy LeFever Kee.2007.Pedoman Pemeriksaan Laboratorium & Diagnostik.Jakarta : EGC
Mansyur Arif.2012. Morfologi sel darah merah artikel, Bagian Patologi Klinik , Fakultas
Kedokteran Unhas /UPL. Perjan RS. Dr. Wahidin Sudirohusodo, Makassar

Rahma Yuli.2011.Membuat Sediaan Apusan Darah.[Online].Tersedia : http://AnaliskesehatanIndonesia.Blogspot.Co.Id/2011/03/Membuat-Sediaan-Apus-Darah-Dengan.Html.[diakses

24 Maret 2016 13.02]
Riswanto. 2013. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi. Yogyakarta: Alfamedia Kanal Medika
Vanila.2011.Sediaan

apus

darah

tepi.[online].tersedia

http://primavanilla.blogspot.co.id/2011/05/sediaan-apus-darah-tepi.html.[diakses 24 Maret
2016 14.12]

Denpasar, 25 Maret 2016

Praktikan

Putu Rina Widhiasih

P07134014002

Lembar Pengesahan

Mengetahui,

Pembimbing I

Pembimbing II

dr. Sianny Herawati, Sp.PK

Rini Riowati, B.Sc

Pembimbing III

Pembimbing IV

I Ketut Adi Santika, A.Md.AK

Luh Putu Rinawati, S.Si

Pembimbing V

I Kadek Aryadi Hartawiguna, A.Md.AK