Seminarski rad:

Aktuelno:

Fitopatogene gljive predstavljaju najznaajnije patogene biljaka.

Intenzivna poljoprivreda utie na patogene da evoluiraju pod jakim

selekcionim pritiskom to predstavlja globalni problem za kontrolu i
suzbijanje patogena (primer), I to ne samo ekoloki problem, ve i
zdravstveni, kada se uzme u obzir poveanje svesti o ouvanju
zdravlja i ivotne sredine.

Detekcija i precizna identifikacija patogena su najznaajniji za

efikasnu kontrolu i suzbijanje biljnih bolesti. Meutim pokazalo se da
detekcija i identifikacija fitopatogenih gljiva mogu biti dosta zahtevni
i oteani zbog specifinosti ivotnog ciklusa gljiva (simptomatologija
oboljenja, morfoloke i fizioloke osobine, razvojne faze ivotnog
ciklusa, genetika varijabinost).

Tradicionalne metode:
Simptomatologija bolesti
Morfoloke i fizioloke osobine
Razvojni ciklus gljiva

Kako?
Opisno
Izolacija na hranljive podloge
Karakterizacija morfolokih i
fiziolokih parametara
Testovi patogenosti

Posmatranje,
Kvantifikovanje,
Standardizacija i
Analiza
TEKO i
NEPOUZDANO

Molekularne metode:

U fitopatologiji gljiva, najee

koriene molekularne metode
zasnivaju se na analizi DNK
ispitivanog organizma

Kako?
Identifikacija
vrsta,
Velika brzina
1.
IZBOR ODGOVARAJUE
SEKVENCE NUKLEOTIDA
KOJA E BITI
KORIENAgenetike
ZA IDENTIFIKACIJU
Detektovanje
Osetljivost
varijabilnosti unutar vrsta,
Preciznost
2.
IZOLACIJA
DNK MATERIJALA
IZ UZORKA
Utvrivanje
srodnosti
dve jedinke
Olakano tumaenje rezultata
Pravac evolucije patogena
3. METODOLOKI PRISTUP ZA DETEKCIJU PRISUSTVA CILJNE SEKVENCE
Delovanje evolutivnih faktora
DNK U UZORKU

1. Izbor specifine sekvence nukleotida

VISOKOKONZERVATIVNI REGIONI DNK
ITS REGION
-TUBULIN
AKTIN
HITIN SINTAZA
TF1
GDPH
KALMODULIN
MAT GENI
COX I
COX II

SLUAJAN IZBOR JEDNE ILI VIE SEKVENCI

Izbor gena - veoma znaajan;
izbor neodogovarajueg gena moe dovesti do pogrene identifikacije

2. Izolacija DNK materijala

iste kulture, biljni materijal, zemljite ili neki drugi supstrat, ak i
pojedinana spora gljiva

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

1. DNK hibridizacija

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

2. Standardna PCR reakcija
Najznaajnije otkrie na polju molekularne biologije u poslednjih 30 godina.
Selektivna amplifikacija specifinog fragmenta DNK u in vitro uslovima
Mala poetna koliina DNK ogromna koliina umnoenog eljenog fragmenta
PCR oponaa prirodne procese replikacije/transkripcije uz korienje specifinih
oligonukleotida (prajmera) komplementarnih krajevima DNK fragmenta od interesa

Priprema PCR smee:

PCR reakcija:

Identifikacija PCR produkata

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

Prednosti:

Nedostaci:

Visoka senzitivnost
minimalna koliina
materijala DNK iz
samo jedne elije
Visoka specifinost
odreena selektivnom
hibridizacijom
prajmera
Jednostavnost, brzina,
niska cena

PCR inhibitori u
biljnom tkivu ili
zemljitu
Kontaminacija
Ne mogu se
diskriminisati stvarni
patogeni
Etidijum bromid
Kriterijum:
razlikovanje samo na
osnovu velicine
(molekulske mase)
Rezultati su
kvalitativni, ne
kvantitativni

Postoje razliite modifikovane varijante PCR reakcija

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

Metoda

Mehanizam

Prednosti

Mane

3. Nested PCR

dvostruka PCR
reakcija

Poveana
Poveana mogunost
specifinost i
kontaminacije i trajanje
osetljivost
procesa
detekcije
patogena
Mala koliina DNK

4. Co PCR

Uz upotrebu DNK
proba

Vea osetljivost
od Nested PCRa
Smanjena
mogunost
kontaminacije

Vrlo specifina
Visoka cena

5. Multiplex PCR

Nekoliko
prajmera u istoj
reakciji

Uteda vremena I
novca
Detekcija I
diferencijacija
vie patogena

Krae sekvence se
obimnije umnoavaju

6. RT PCR

Detekcija mRNK

Ekspresija
fungalnih gena
Razlikuje ive I
mrtve elije u
uzorku

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

7. RTi PCR
1. interkalirajue fluorescentne boje koje se nespecifino vezuju za
dvolanani DNK molekul.

2. Fluorescentne probe koje su sekvencno-specificne.

Analize se vre u zatvorenoj tubi, nema kontaminacije

Brza i jednostavna analiza
Kvantifikacija mogua na vie naina
Vea pouzdanost i osetljivost rezultata

3. Detekcija prisustva ciljne sekvence DNK

1. Metode DNK otisaka
Kada ne postoji neophodna varijabilnost na nivou konzervativnih sekvenci,
razlike se mogu traiti u nasuminim sekvencama DNK.
Filogenetske studije populacija patogena
Diferencijacija razliitih sojeva unutar iste vrste, u zavisnosti od domaina,
geografske regije, nekog morfolokog karaktera

1. Metode DNK otisaka

Metoda
DNK
otisaka

Mehanizam

Prednosti

Nedostaci

RFLP

Sekvencno specifini
restrikcioni enzimi, ispituje
polimorfizam homolognih
sekvenci;
PCR-RFLP
Elektroforeza

Prva tehnika DNK

profiliranja

Visoka cena
Velika strunost
Mnogo vremena
Komplikovana

Kratki prajmeri (8-12 n);

vezivanje prajmera
nasumino;
Elektroforeza;
Softverska analizadendrogrami

Ne zahteva
prethodno
identifikaciju vrste
Brza metoda
pogodna za analizu
Analiza genetikog
diverziteta izmeu
populacija

Veliko variranje rezultata

Teka ponovljivost
Ispituje uglavnom
dominantne alele

Restrikcioni enzimi
primenjeni na celokupnu
DNK. Iseenim fragmentima
se prikljuuje adapter
molekul, kasnije prajmeri
poseduju sekvencu
komplementarnu adapteru;
vizuelizacija na

irok spektar
diverziteta koji
moe da detektuje

Mala osetljivost metode

Potrebna velika koliina
DNK
Velika tehnika strunost
za sprovoenje metode

Restriction
Fragment
Length
Polymorphism

RAPD
Random
Amplified
Polymorphic
DNK

AFLP
Amplified
Fragment
Length
Polymorphism

1. Metode DNK otisaka

Metoda
DNK
otisaka

Mehanizam

Prednosti

Nedostaci

Mikrosateliti
Minisateliti

Segmenti DNK sainjeni od

nekoliko nasumino
rasporeenih uzastopno
ponovljivih motiva.

Mapiranje genoma
Populaciona
genetika

Zahteva ispitivanje
velikog broja
mikrosatelitiskih lokusa
Neophodna identifikacija
organizma
Nije pouzdana za
filogenetske
rekontrukcije I
taksonomiju

Simple
sequence
repeats
Short tandem
repeats

Sekvenciranje
Sekvenciranje podrazumeva utvrivanje redosleda nukleotida u
DNK molekulu.
Postoji nekoliko metoda sekvenciranja; veina je zasnovana na
Sangerovoj (Frederik Sanger) metodi.
Sangerova metoda je poznata kao metoda Terminacije sinteze
lanaca, ili kao dideoksi metoda.
Dideoksi metoda - jednolanani DNK molekuli koji se razlikuju u
duini za samo jedan nukleotid, mogu razdvojiti elektroforezom u
denaturiuem poliakrilnom gelu.

Glavni element Sangerove metode je hemijska modifikacija

3-deoksi nukleotid trifosfata
(dNTP) u
2,3-dideoksi
nukleotid trifosfata (ddNTP) tj, odsustvo 3-OH grupe na
dNTP (pored odsustva 2-OH grupe).

Sekvenciranje
U
reakcionoj
smei
ugradnjom
ddNTPova dolazi do terminacije sinteze
novog lanca. Zbog toga to se u reakcionoj
smei nalazi milijarde kopija, terminacija
sinteze moe biti prekinuta na bilo kojoj
poziciji.
Kao posledica,
dobijaju se fragmeni
razliite duine
(obeleeni
fluorescentnim
bojama
karakteristinim za
svaki nukleotid) koji
se razdvajaju na
osnovu duine.
Najbre putuju
najkrai fragmenti,
pa se njihova

Sekvenciranje
DNK je negativno naelektrisan molekul,
kree se ka pozitivnoj elektrodi. Kretanje
DNK kroz gel je zavisno od veliine.
Milione kopija iste veliine kretae se
istom brzinom i zauzee odreenu poziciju
na gelu (traka na odreenoj poziciji).
Nakon zavrene elektroforeze, gel se
vizuelizuje pomou X zraka.

Zakljuak:
Poznavanje evolutivne istorije patogena, sagledavanje diverziteta, naina irenja
infekcije i razmnoavanja su kljuni za prevenciju I kontrolu biljnih bolesti.
Dalja unapreenja molekularne biologije, automatizacije i kompjuterske
tehnologije i dalje e imati pozitivan efekat na razvoj brih, osetljivijih i pouzdanijih
metoda za detekciju fitopatogenih gljiva
Tano ime vrste i pravovremena detekcija rezistentnosti na fungicide u
populacijama fitopatogenih gljiva omoguavaju efikasniji menadment zatite
prirodnih I agrikulturalnih resursa.
Primena molekularnih tehnika u prouavanju ini se da je esencijalna
potpora za fitopatologiju; da jedino zajedno sa tradicionalnim, fenotipskim
pristupom mogu omoguiti otkrivanje, opisivanje i klasifikaciju gljiva.