Imunohistoquímica

IMUNOHISTOQUMICA
i
Amadeu Borges
Ferro
- Instituto Politcnico de Lisboa - Escola Superior de Tecnologia da Sade de Lisboa -
Licenciatura em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica
Imunohistoqumica
Autor:
Amadeu Borges Ferro
Outubro de 2013
AMADEU BORGES FERRO

Escola Superior de Tecnologia da Sade de Lisboa (ESTeSL)
Av. D. Joo II, Lote 4.69.01 1990-096 Lisboa - Portugal
Tel: +351-218980400
amadeu.ferro@estesl.ipl.pt
o Bacharel em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica pela Escola Superior de

Tecnologia da Sade de Lisboa.
o CESE em Metodologias do Ensino da Cincias pela Universidade Lusfona de Humanidades e Tecnologias.
o Mestre em Educao Mdica pela Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
o Ttulo de Especialista em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica pelo Instituto Politcnico de Lisboa.
o Professor Adjunto da rea Cientfica de Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica da Escola Superior de Tecnologia da Sade de Lisboa.
o Diretor de Curso da Licenciatura em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica
da Escola Superior de Tecnologia da Sade de Lisboa.
o Responsvel pela Unidade Curricular de Imunocitoqumica da Licenciatura em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica da Escola Superior de Tecnologia da Sade de Lisboa.
ii
NDICE GERAL
NDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................vii
1 IMUNOHISTOQUMICA ............................................................................................................... 1
1.1
Imunohistoqumica e Imunocitoqumica ............................................................................ 1
1.2
Definio geral ............................................................................................................................... 2
1.3
Enquadramento histrico ......................................................................................................... 3
1.4
Principais aplicaes ................................................................................................................... 6
1.5
Pr-requisitos para Imunohistoqumica ............................................................................. 7
2 ANTIGNIO E ANTICORPO ........................................................................................................ 9

2.1
Antignio.......................................................................................................................................... 9
2.2
Imunognio ..................................................................................................................................... 9
2.3
Anticorpo ...................................................................................................................................... 10
2.3.1 Especificidade e afinidade de um anticorpo .............................................................. 10

2.4
Imunoglobulinas ........................................................................................................................ 11
2.5
Cadeias leves ............................................................................................................................... 14
2.6
Cadeias pesadas ......................................................................................................................... 14
2.6.1 Cadeia pesada Alfa................................................................................................................ 14

2.6.2 Cadeia pesada Gama ............................................................................................................ 15
2.6.3 Cadeia pesada Delta ............................................................................................................. 15
2.6.4 Cadeia pesada Miu ................................................................................................................ 15
2.6.5 Cadeia pesada Epsilon ........................................................................................................ 16
2.7
Foras de ligao entre antignio e anticorpo ............................................................... 16
2.7.1 Ligao eletrosttica ou inica ........................................................................................ 16

2.7.2 Pontes de hidrognio .......................................................................................................... 17
2.7.3 Ligaes hidrofbicas.......................................................................................................... 18
2.7.4 Foras de van der Waals .................................................................................................... 19
3 SOROS POLICLONAIS E MONOCLONAIS ............................................................................. 21
3.1
Soros Policlonais ........................................................................................................................ 21
3.1.1 Etapas da produo de Soros Policlonais .................................................................... 21

3.1.2 Trs tipos de soros policlonais ........................................................................................ 23
3.2
Soros Monoclonais .................................................................................................................... 24
3.2.1 Produo de Soros Monoclonais ..................................................................................... 25

3.3
Soros Monoclonais versus Soros Policlonais .................................................................. 29

iii
3.4
Manuseamento de Soros......................................................................................................... 30
3.5
Receo .......................................................................................................................................... 30
3.6
Armazenamento e conservao ........................................................................................... 31
3.6.1 Frascos contentores............................................................................................................. 31

3.6.2 Temperatura ........................................................................................................................... 31
3.6.3 Manipulao diria............................................................................................................... 32
3.6.4 Azida de sdio ........................................................................................................................ 32
4 IMUNOFLUORESCNCIA ......................................................................................................... 33
4.1
Mtodos de Imunofluorescncia ......................................................................................... 33
4.1.1 Fluorocromos ......................................................................................................................... 34

4.1.2 Unio dos fluorocromos a anticorpos........................................................................... 35
4.1.3 Microscpio de fluorescncia .......................................................................................... 35
4.1.4 Microscopia de Imunofluorescncia no diagnstico ............................................... 36
5 IMUNOENZIMOLOGIA .............................................................................................................. 39
5.1
Enzimologia Bsica ................................................................................................................... 39
5.1.1 Papel Catalisador .................................................................................................................. 40

5.1.2 Caractersticas das Enzimas ............................................................................................. 41
5.1.3 Modelos de Interao Enzima/Substrato .................................................................... 41
5.1.4 Fatores que afetam a Atividade Enzimtica ............................................................... 42
5.1.5 Classificao das Enzimas ................................................................................................. 43
5.1.6 Tipos de Inibio ................................................................................................................... 44
5.2
Imunoenzimologia .................................................................................................................... 44
5.2.1 Horseradish Peroxidase HRP........................................................................................ 44

5.2.2 Fosfatase Alcalina (Calf intestine Alkaline Phosphatase); .................................... 48
5.2.3 Glucose Oxidase (Aspergillus niger) ............................................................................. 50
5.2.4 Contraste .................................................................................................................................. 51
6 MTODOS IMUNOHISTOQUMICOS .................................................................................... 53
6.1
Mtodo Direto ............................................................................................................................. 53
6.2
Mtodos indiretos ..................................................................................................................... 54
6.2.1 Simples...................................................................................................................................... 54
6.2.2 Mtodo Peroxidase Anti Peroxidase (PAP) ................................................................ 54
6.2.3 Mtodo APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) ................. 55
6.3
Mtodos de avidina-biotina ................................................................................................... 56
6.3.1 Enquadramento histrico ................................................................................................. 56

iv
6.3.2 Principais caractersticas da avidina............................................................................. 57

6.3.3 Principais caractersticas da streptavidina ................................................................ 57
6.3.4 Principais caractersticas da Biotina ............................................................................. 58
6.3.5 A ligao entre a avidina e a biotina .............................................................................. 58
6.3.6 Biotinilao ............................................................................................................................. 58
6.3.1 Bloqueio da biotina endgena ......................................................................................... 59
6.3.2 Marcao da avidina ............................................................................................................ 59
6.3.3 Tcnicas imunohistoqumicas de avidina-biotina ................................................... 59
6.3.4 Aplicaes prticas............................................................................................................... 61
6.4
Mtodos de polmero ............................................................................................................... 62
6.4.1 Polmero de esqueleto interno ........................................................................................ 63

6.4.2 Micropolmeros de enzimas ............................................................................................. 66
6.4.3 Sistemas de dois e trs passos ......................................................................................... 67
7 ASPETOS PRTICOS DOS MTODOS .................................................................................. 69
7.1
Cuidados com material e reagentes ................................................................................... 69
7.2
Diluio de soros de anticorpos ........................................................................................... 69
7.3
A diluio ideal ........................................................................................................................... 70
7.4
Teste de diluio de soros de anticorpos ......................................................................... 70
7.5
Pipetagem ..................................................................................................................................... 71
7.5.1 Cuidados gerais ..................................................................................................................... 71

7.5.2 Preparao da Micropipeta............................................................................................... 72
7.5.3 Como retirar uma amostra com uma micropipeta .................................................. 72
7.5.4 Como expelir a amostra da micropipeta ...................................................................... 74
7.6
Tempo de durao da incubao ......................................................................................... 75
7.7
Temperatura de incubao .................................................................................................... 75
7.8
pH .................................................................................................................................................... 75
7.9
Higiene e segurana no Laboratrio .................................................................................. 75
8 PREPARAO DE AMOSTRAS ............................................................................................... 77

8.1
Fixao em Imunohistoqumica ........................................................................................... 77
8.1.1 Fixao para cortes de cristato ..................................................................................... 77

8.1.2 Fixao em Imunohistoqumica de rotina................................................................... 78
8.2
Processamento histolgico .................................................................................................... 80
8.3
Preparao de lminas ............................................................................................................ 81
8.3.1 Cromo-almen gel ................................................................................................................ 81

v
8.3.2 Vectabond ................................................................................................................................ 82

8.3.3 Lminas com cargas electrostticas .............................................................................. 82
8.3.4 3-Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE) ....................................... 82
8.4
Microtomia ................................................................................................................................... 82
9 RECUPERAO ANTIGNICA ................................................................................................ 83

9.1
Consequncias da fixao ....................................................................................................... 83
9.2
Digesto enzimtica proteoltica ......................................................................................... 84
9.3
Recuperao antignica de origem trmica por alta temperatura ........................ 85
10
INIBIO DE PARTCULAS ENDGENAS ................................................................... 89
10.1
Peroxidase Endgena............................................................................................................... 89
10.2
Fosfatase Alcalina ...................................................................................................................... 89
10.3
Glucose Oxidase ......................................................................................................................... 89
10.4
Pontos susceptveis de atrair protenas ........................................................................... 89
10.5
Causas de marcao inespecfica......................................................................................... 89
11
CONTROLO DE QUALIDADE........................................................................................... 91
11.1
Avaliao da qualidade da imunohistoqumica ............................................................. 91
11.1.1
Preservao da morfologia do tecido ....................................................................... 93
11.1.2
Sensibilidade...................................................................................................................... 93
11.1.3
Especificidade.................................................................................................................... 93
11.1.4
Contraste ............................................................................................................................. 94
11.1.5
Operacionalizao do instrumento de recolha de dados ................................. 94
11.1.6
Score final ........................................................................................................................... 97
12
AUTOMATIZAO ........................................................................................................... 101
13
IMUNOHISTOQUMICA NO DIAGNSTICO .............................................................. 103
13.1
14
Principais antignios detectados por imunohistoqumica ......................................106

MARCAO MLTIPLA.................................................................................................. 111
14.1
Mtodo simultneo .................................................................................................................111
14.2
Mtodo sequencial com desnaturao intercalar .......................................................111
15
CONCLUSO ...................................................................................................................... 113
16
APNDICES ........................................................................................................................ 115
16.1
Apndice 1 - Adesivao de lminas - APES..................................................................115
16.2
Apndice 2 - Tampo EDTA 1 mM pH 8.0 ......................................................................115
16.3
Apndice 3 - Tampo citrato, pH 6.0................................................................................115
16.4
Apndice 4 - Tampo Tris/EDTA, pH9.0 ........................................................................116

vi
16.5
Apndice 5 - Soluo de pepsina 0,4% pH 1/2 ............................................................116
16.6
Apndice 6 - Soluo de bloqueio da Peroxidase Endgena ..................................116
16.7
Apndice 7 Protocolo de Tcnica Imunohistoqumica LSAB ..............................116
16.8
Apndice 8 Protocolo de Tcnica Imunohistoqumica de Polmero Indirecto

117
17
LISTA BIBLIOGRFICA .................................................................................................. 119
NDICE DE FIGURAS
Figura 1 Lmina de microscpio com amostra histolgica ...........................................................................1
Figura 2 Lmina de microscpio com amostra citolgica processada por thinprep .....................2
Figura 3 Albert Coons ...................................................................................................................................................4
Figura 4 Artigo pioneiro em imunohistoqumica publicado em 1942 .....................................................4
Figura 5 FITC conjugado com marcador anti-nuclear factor HEP 2 ..........................................................5
Figura 6 Imunomarcao por HRP associada a anticorpos anti-actina do msculo liso (A) e
fosfatase alcalina associada a anticorpos anti-insulina (B) ..............................................................................5
Figura 7 Autoradiogramas com vitamina D marcada com trtio na amgdala cerebral ....................5
Figura 8 Eptopo e paratopo ................................................................................................................................... 10
Figura 9 - Especificidade do anticorpo................................................................................................................... 11
Figura 10 Aspecto esquemtico de uma imunoglobulina ........................................................................... 11
Figura 11 Quebra da molcula de anticorpo .................................................................................................... 12
Figura 12 Hinge do anticorpo ................................................................................................................................. 13
Figura 13 - Localizao das diferentes zonas estruturais do anticorpo ................................................... 13
Figura 14 Interao entre zonas hipervariveis e ligaes dissulfdicas do anticorpo .................. 14
Figura 15 Estrutura esquemtica das diferentes imunoglobulinas........................................................ 16
Figura 16 ligao eletroesttica (inica) ........................................................................................................... 17
Figura 17 ligao por ponte de hidrognio ....................................................................................................... 18
Figura 18 Ligaes hidrofbicas............................................................................................................................ 18
Figura 19 Ligaes por foras de van der Waals ............................................................................................ 19
Figura 20 Soro policlonal. ........................................................................................................................................ 21
Figura 21 Produo de soros policlonais........................................................................................................... 22
Figura 22 Soro total. ................................................................................................................................................... 23
Figura 23 Soro de frao de imunoglobulinas. ................................................................................................ 23
Figura 24 Soro de afinidade isolada..................................................................................................................... 24
Figura 25 Soro Monoclonal ..................................................................................................................................... 24
Figura 26 Jerne, Kohler e Milstein. ....................................................................................................................... 25
Figura 27 - Produo de Soros monoclonais ....................................................................................................... 26
Figura 28 - Imunizao ................................................................................................................................................. 26
Figura 29 Frascos contentores............................................................................................................................... 31
Figura 30 Imunofluorescncia ............................................................................................................................... 33
Figura 31 Espectro de radiaes ........................................................................................................................... 33
Figura 32 Microscpio de Fluorescncia ........................................................................................................... 36
Figura 33 - IgG em padro linear. ............................................................................................................................. 37
Figura 34 - IMF positiva para IgA em padro granular .................................................................................. 37
Figura 35 Microscpio tico.................................................................................................................................... 39
Figura 36 Enzimas e Co-fatores ............................................................................................................................. 40
Figura 37 Papel catalisador das enzimas numa reaco ............................................................................. 41
vii
Figura 38 Reao de oxidao-reduo.............................................................................................................. 43

Figura 39 Reao de transferncia ....................................................................................................................... 43
Figura 40 Reao de hidrlise ................................................................................................................................ 43
Figura 41 Horseradish ................................................................................................................................................ 45
Figura 42 estrutura qumica da HRP. .................................................................................................................. 45
Figura 43 Estrutura tridimensional da HRP. O grupo heme est localizado no centro com o
tomo de ferro a vermelho e os ies de clcio so as esferas pretas ......................................................... 46
Figura 44 representao esquemtica da revelao por DAB .................................................................. 47
Figura 45 imunomarcao por DAB .................................................................................................................... 47
Figura 46 revelao por AEC .................................................................................................................................. 48
Figura 47 reao de revelao da fosfatase alcalina por NBT-BCIP ....................................................... 49
Figura 48 Revelao por NBT-BCIP ..................................................................................................................... 49
Figura 49 Revelao por New Fuchsin. .............................................................................................................. 50
Figura 50 Revelao por Fast Red TR. ................................................................................................................ 50
Figura 51 Hematoxilina de Harris ........................................................................................................................ 51
Figura 52 Hematoxilina de Mayer ........................................................................................................................ 51
Figura 53 Nuclear Fast Red. .................................................................................................................................... 52
Figura 54 Verde Metilo.............................................................................................................................................. 52
Figura 55 Mtodo direto ........................................................................................................................................... 53
Figura 56 Mtodo indirecto simples .................................................................................................................... 54
Figura 57 Mtodo PAP ............................................................................................................................................... 55
Figura 58 Mtodo APAAP ......................................................................................................................................... 56
Figura 59 representao esquemtica da avidina com 4 bolsas .............................................................. 57
Figura 60 representao esquemtica da avidina ligada a 4 biotinas ................................................... 57
Figura 61 estrutura qumica da Biotina. ............................................................................................................ 58
Figura 62 Bloqueio da biotina endgena. .......................................................................................................... 59
Figura 63 Mtodo streptABC .................................................................................................................................. 60
Figura 64 Mtodo LSAB/LAB.................................................................................................................................. 61
Figura 65 Polmero de esqueleto interno .......................................................................................................... 63
Figura 66 - Dextrano (esquerda - estrutura qumica; centro - aspeto fsico; direita - Leuconostoc
mesenteroides) .................................................................................................................................................................. 64
Figura 67 Polmero de esqueleto interno directo .......................................................................................... 65
Figura 68 Polmero de esqueleto interno indireto ........................................................................................ 65
Figura 69 Micropolmero de enzimas indirecto. ............................................................................................ 67
Figura 70 - A colocao do segundo anticorpo permite aumentar a quantidade de polmeros
ligados .................................................................................................................................................................................. 68
Figura 71 - A colocao do segundo anticorpo permite associar o polmero ao antignio .............. 68
Figura 72 Soros pr-diludos .................................................................................................................................. 70
Figura 73 Colocao de ponta na micropipeta ................................................................................................ 71
Figura 74 Colocao da micropipeta ................................................................................................................... 72
Figura 75 Utilizao do polegar para pipetar .................................................................................................. 72
Figura 76 Micropipeta e tubo ao nvel dos olhos ........................................................................................... 73
Figura 77 Presso no mbolo da micropipeta ................................................................................................. 73
Figura 78 Introduo da ponta no lquido ........................................................................................................ 73
Figura 79 Libertar o mbolo da micropipeta ................................................................................................... 74
Figura 80 Ponta a tocar parede do tubo............................................................................................................. 74
Figura 81 Presso no mbolo da micropipeta ................................................................................................. 74
Figura 82 Cristato para corte de material congelado ................................................................................ 78
Figura 83 Microtomo para cortes de parafina ................................................................................................. 78
Figura 84 Ponte de metileno entre aminocidos............................................................................................ 79
Figura 85 Alterao estrutural em protenas fixadas por formaldedo. ............................................... 79
Figura 86 Processador automtico de tecidos ................................................................................................ 81
Figura 88 Reao entre Ca2+ e EDTA.................................................................................................................. 86
viii
Figura 88 Conceptualizao da metodologia de recolha de dados ......................................................... 92

Figura 89 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados. ............................................................... 104
Figura 90 - Algoritmo utilizado para situaes linfoproliferativas. ........................................................ 105
Figura 91 - Receptores de Estrognio ................................................................................................................. 106
Figura 92 - Receptores de progesterona ............................................................................................................ 106
Figura 93 - Protena p53 ........................................................................................................................................... 106
Figura 94 - HER-2......................................................................................................................................................... 106
Figura 95 - Bcl-2 ........................................................................................................................................................... 107
Figura 96 - CD3 ............................................................................................................................................................. 107
Figura 97 - CD15........................................................................................................................................................... 107
Figura 98 - CD20........................................................................................................................................................... 107
Figura 99 - CD30........................................................................................................................................................... 108
Figura 100 - CD34 ........................................................................................................................................................ 108
Figura 101 - CD45 ........................................................................................................................................................ 108
Figura 102 - Ki67.......................................................................................................................................................... 108
Figura 103 - melanoma HMB45 ............................................................................................................................. 109
Figura 104 - CL Kappa ................................................................................................................................................ 109
Figura 105 - CL lambda.............................................................................................................................................. 109
Figura 106 - vimentina .............................................................................................................................................. 109
Figura 107 - CK 7 .......................................................................................................................................................... 110
Figura 108 - PAN CK clones -AE1\AE3 ............................................................................................................... 110
Figura 109 - protena S100 ...................................................................................................................................... 110
Figura 110 - actina do msculo liso...................................................................................................................... 110
Figura 111 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gnglio linftico.......................................................... 112
Figura 112 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em bao............................ 112
Figura 113 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pncreas. ........ 112
Figura 114 CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileo-cecal........ 112
NDICE DE TABELAS
Tabela 1 Marcadores em imunohistoqumica ....................................................................................................6
Tabela 2 Mtodos imunohistoqumicos ................................................................................................................6
Tabela 3 Aplicaes da imunohistoqumica ........................................................................................................7
Tabela 4 Pr-requisitos para imunohistoqumica ............................................................................................8
Tabela 5 Vantagens e desvantagens de soros policlonais e monoclonais ............................................ 30
Tabela 6 Caractersticas dos Fluorocromos ..................................................................................................... 35
Tabela 7 Grelha de avaliao de qualidade da imunohistoqumica........................................................ 97
Tabela 8 Factores de ponderao do Score Final da qualidade da imunohistoqumica. ............... 99
ix
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
1 IMUNOHISTOQUMICA
1.1 Imunohistoqumica e Imunocitoqumica
Desde o seu surgimento que as tcnicas que utilizam a reao anticorpo-antignio
para a deteo e caracterizao de molculas no seu local de origem tm sido denominadas de Imunohistoqumica e/ou Imunocitoqumica. Ao longo do tempo esta
terminologia tem sido utilizada de forma frequente para identificar as mesmas metodologias de forma, por vezes, indiscriminada. Numa tentativa de evitar as incorrees e diminuir as associaes errneas de palavras-chave em livros e artigos,
que podem provocar uma pulverizao ou a omisso da bibliografia relevante existente, alguns autores tm tentado clarificar a nomenclatura utilizada, principalmente com base na natureza da amostra biolgica que analisada1.
O termo Imunohistoqumica associado a metodologias que usam imuno-ensaios
para co-localizar um eptopo de interesse em cortes de tecido. Tambm se englobam os mtodos que recorrem a blocos de clulas ou de cogulos preparados a
partir de materiais citolgicos e hematolgicos. Na esmagadora maioria dos casos,
o tecido removido do ser vivo e conservado/fixado por congelao ou por mtodos qumicos (e.g. formaldedo) e embebido em parafina. Posteriormente so obtidas seces muito finas, de cerca de 4m, a partir do material congelado ou includo em parafina e colocadas em lminas de vidro. Desta forma, possvel colocalizar os antignios nos componentes histolgicos e celulares, mantendo a arquitectura original do tecido circundante. Dependendo do mtodo de fixao, as
amostras de tecidos e/ou clulas podem ser sujeitas a estratgias de recuperao
antignica (Figura 1).
Figura 1 Lmina de microscpio com amostra histolgica

Fonte: http://science.taskermilward.org.uk/mod1/Year%207/Mod2/Mod2_img/onionslide%20002.jpg
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
O termo Imunocitoqumica associado a metodologias que usam imuno-ensaios

para co-localizar um eptopo de interesse testes em esfregaos citolgicos, preparaes citocentrifugadas (e.g. cytospin) ou preparaes monocamada (e.g.
thinprep).
Como o processamento destas amostras citolgicas , com frequncia, substancialmente diferente do processamento em imunohistoqumica, os testes imunocitoqumicos requerem diferentes medidas de controlo de qualidade, com nfase na
utilizao de controlos positivos e negativos apropriados. A maioria da matriz extracelular e outros componentes do estroma no esto presentes, deixando apenas
as clulas inteiras e isoladas ou em pequenos agregados, pelo que frequentemente aplicado um procedimento de permeabilizao, para que os anticorpos possam
atingir alvos intracelulares (Figura 2).
Figura 2 Lmina de microscpio com amostra citolgica processada por

thinprep
Fonte: http://www.hologic.de/uploads/images/imagerslide.large.jpg
Por uma questo de simplificao, ao longo deste documento ser utilizado o termo Imunohistoqumica pois as metodologias descritas, apesar de tambm serem
utilizadas em imunocitoqumica, esto mais frequentemente associadas a tecidos
fixados em formaldedo e includos em parafina.
1.2 Definio geral

A imunohistoqumica o conjunto de metodologias em que se utilizam anticorpos
como reagentes especficos capazes de identificar e estabelecer ligao com constituintes tecidulares que funcionam como antignios. Esta ligao permite situar e
identificar a presena de variadas substncias nas clulas e tecidos por intermdio
da cor que associada aos complexos antignio-anticorpo entretanto formados2.
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
O valor prtico desta rea tecnolgica, muito utilizada em Anatomia Patolgica,

resulta da possibilidade de combinar um marcador com um anticorpo, sem provocar qualquer tipo de dano ligao especfica estabelecida entre anticorpo e antignio. Este facto propicia a observao microscpica dos locais onde se encontra o
anticorpo e, consequentemente, o antignio.
Podemos dizer que a imunohistoqumica se apresenta como um poderoso meio de
identificao de vrias estruturas celulares e tecidulares que podem estar diretamente associadas a patologias, bem como das consequncias, a nvel funcional e
morfolgico, da ao desses mesmos elementos3.
Na ltima vintena de anos a crescente valorizao de diagnsticos diferenciais em
Anatomia Patolgica tem implicado um desenvolvimento progressivo da imunohistoqumica, levando a um progresso das metodologias para demonstrao de antignios em tecido fixado em formaldedo e includo em parafina, o que tem contribudo significativamente para o diagnstico de muitas patologias4.
De acordo com Werner5:
During the last two decades, immunohistochemistry has become the most
useful adjunctive method in diagnostic histopathology.
No obstante, persistem algumas dificuldades, eco das particularidades de determinadas patologias e limitaes tcnicas, pelo que a padronizao da imunohistoqumica tem sido uma tarefa dura de completar. A qualidade da marcao depende
de trs principais fatores alm da qualidade dos anticorpos6,7:
A. Fase pr-analtica (destacando-se fixao do tecido e processamento);
B. Recuperao antignica de eptopos;
C. Sensibilidade do sistema de deteo.
1.3 Enquadramento histrico

A primeira experiencia de relevncia no campo da imunohistoqumica foi introduzida por Coons, Creech e Jones8 em 1941 (Figura 3), e consistiu na conjugao de
um anticorpo com um corante fluorescente.
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 3 Albert Coons

Fonte: http://www.nap.edu/readingroom.php?book=biomems&page=acoons.html
Em 1942 foi publicada a descrio da utilizao do referido anticorpo para identificao de antignios em cortes histolgicos, o que significou a entrada numa nova
dimenso do diagnstico anatomopatolgico9.
Figura 4 Artigo pioneiro em imunohistoqumica publicado em 1942

Fonte: http://www.jimmunol.org/content/45/3/159.full.pdf+html
O 1 composto a ser conjugado com um anticorpo foi o isocianato de fluorescena8

e mais tarde surgiu o isotiocianato de fluorescena (FITC), mais fcil de conjugar. O
FITC tem excitao e emisso ao nvel dos comprimentos de onda de aproximadamente 495nm a 521nm e, como a maioria dos fluorocromos, propenso a fotodegradao3 (Figura 5).
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 5 FITC conjugado com marcador anti-nuclear factor HEP 2

Fonte: http://www.zeiss.de/c1256b5e0047ff3f/Contents-Frame/d8b6c4c29990d932c125706800507aaf
Gradualmente passaram a utilizar-se novos compostos marcadores como as enzimas horseradish peroxidase (HRP) em 196610 e fosfatase alcalina em 197811
(Figura 6).
Figura 6 Imunomarcao por HRP associada a anticorpos anti-actina do msculo

liso (A) e fosfatase alcalina associada a anticorpos anti-insulina (B)
Tambm se tornou possvel a marcao de anticorpos com substncias radioativas12, visualizando-se o resultado por autoradiografia - Figura 7.
Figura 7 Autoradiogramas com vitamina D marcada com trtio na amgdala cerebral

Fonte: http://www.leica-microsystems.com/products/total-histology/cryosectioning/details/product/leica-cm3600xp/application/
O produto final das reaes enzimticas pode adquirir eletrodensidade ou seja

densidade para os eletres, mas existem outros produtos que intrinsecamente j
possuem esta capacidade, podendo ser utilizados em imunohistoqumica para mi5
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
croscopia eletrnica: ferritina desde 196113 e ouro coloidal desde 197114 (Tabela
1).
Tabela 1 Marcadores em imunohistoqumica
Grupo
Compostos fluorescentes
Enzimas
Metais pesados
Compostos Radioativos
Nome
Isotiocianato de Fluorescena
Isotiocianato de Rodamina
Peroxidase (HRP)
Fosfatase alcalina
Ferritina
Ouro coloidal
14C
35S
O primeiro mtodo a ser utilizado foi o direto simples mas, ao longo do tempo, foram surgindo inovaes que permitiram um aumento paulatino da capacidade de
amplificao das metodologias imunohistoqumicas (Tabela 2).
Tabela 2 Mtodos imunohistoqumicos
Mtodo direto simples
Simples
Enzima antienzima
Mtodos indiretos
Avidina biotina
Polmero
PAP (peroxidase anti peroxidase)

APAAP (fosfatase alcalina anti fosfatase alcalina)
Streptavidin-Biotin Complex (ABC)
Labelled streptavidin-Biotin (LSAB)
Polmero direto (EPOS)
Polmero indireto
1.4 Principais aplicaes

A imunohistoqumica tem as suas principais aplicaes no estudo de neoplasias,
doenas infecciosas e doenas degenerativas, podendo, no entanto, ser aplicada no
estudo de muitas outras patologias (Tabela 3).
uma disciplina em permanente evoluo, devendo todos os investigadores que se
dedicam a esta atividade permanecer em constante procura, no sentido de estabelecer novos protocolos, adaptando s suas necessidades toda a gama de reagentes
disponvel no mercado3.
6
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
Tabela 3 Aplicaes da imunohistoqumica

Diagnstico de neoplasias de baixa diferenciao morfolgica
Diagnstico
Caracterizao da histognese e patognese

Distino do carcter maligno ou benigno de proliferaes celulares
Caracterizao da origem de metstases indiferenciadas
Identificao da presena de recetores hormonais
Neoplasias
Prognstico
Caracterizao da expresso de proto-oncogenes

Estudo de protenas supressoras de tumor
Caracterizao da presena de indicadores de proliferao celular
Indicao tera- Quantificao da expresso de Her2/neu em neoplasia mamria

putica
Doenas
Identificao da presena de CD117 em tumores do estroma gstrico
Caracterizao dos agentes etiolgicos (bactrias, vrus e protozorios)
infecciosas Fenotipagem da reao inflamatria envolvente

Outras
Caracterizao de subtipos de amiloidose
patologias Caracterizao de produtos de secreo de clulas
Hormonas
Enzimas
1.5 Pr-requisitos para Imunohistoqumica

Tal como qualquer outro tipo de tecnologia, a imunohistoqumica, necessita de
respeitar determinados requisitos de modo a que possa ser realizada de uma forma vlida, correta e eficaz3.
A primeira condio a respeitar que o antignio deve permanecer insolvel, mas
disponvel no tecido, no decorrer da tcnica. Essa insolubilidade implica a sua
permanncia no local original. A par disso, deve tambm apresentar as caractersticas que vo ser reconhecidas pelo anticorpo, da que, nalguns casos, seja necessrio aplicar mtodos de recuperao antignica.
A segunda condio a marcao especfica pelo anticorpo primrio, isto , o anticorpo dever apenas ligar-se ao antignio pretendido (marcao especfica) e no
a outros elementos estranhos (marcao inespecfica). O que se pretende obter
uma marcao especfica do antignio com ausncia de marcao inespecfica de
fundo3.
Depois temos a terceira condio: fundamental conhecer os atributos dos tipos
de soros a aplicar: clonalidade, classe/subclasse da imunoglobulina, especificidade,
reatividade e condies de manuseamento, revelam-se essenciais para a interpretao de resultados, bem como para a avaliao da qualidade da tcnica3.
7
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA
Finalmente surge a quarta e ltima condio: para uma escrupulosa realizao destas tcnicas imprescindvel o uso de uma marcao estvel com uma intensidade
suficiente, que no suscite qualquer tipo de dvidas relativamente presena ou
ausncia do antignio no tecido3 (Tabela 4).
Tabela 4 Pr-requisitos para imunohistoqumica
PR-REQUISITO
Antignio disponvel
Marcao especfica
CARACTERSTICAS
O antignio dever permanecer no seu local original, insolvel e disponvel
O antignio deve ser reconhecvel pelo anticorpo (com ou sem mtodos de recuperao)
O anticorpo dever ligar-se ao antignio pretendido
Devero ser conhecidos todos os elementos teciduais a que o anticorpo se pode ligar
Anticorpo caracterizado
Dever ser conhecida toda a sequncia de ligao anticorpo-antignio

As caractersticas do anticorpo devem ser conhecidas (e.g. classe, subclasse, produo)
Marcador visualizvel
Marcadores Enzimticos, Fluorescentes, metlicos ou radioativos
IMUNOHISTOQUMICA
ANTIGNIO E ANTICORPO
2 ANTIGNIO E ANTICORPO
2.1 Antignio
Um antignio geralmente uma molcula com razovel dimenso, como uma protena, um lpido, um hidrato de carbono ou um cido nucleico, que uma vez introduzido num organismo induz uma resposta por parte do sistema imunitrio, com
produo de anticorpos especficos. Tal deve-se ao facto de cada antignio ser
constitudo por diversos radicais qumicos, com capacidade de promover a produo de anticorpos ou imunoglobulinas15.
Os antignios so reconhecidos principalmente devido sua estrutura tridimensional, resultante da sua nuvem de eletres, sendo este facto consistente com a natureza das afinidades antignio-anticorpo3. Cada uma destas molculas apresenta na
sua superfcie, um ou mais locais especficos de ligao ao anticorpo determinante antignico ou eptopo. Estas regies de ligao altamente especficas so constitudas por sequncias (completas ou fragmentos) de protenas ou de polissacardeos15.
Tendo em conta que, segundo a sua estrutura, os antignios apresentam a capacidade de estabelecer ligaes com um dado anticorpo, todas as molculas podem
constituir potenciais antignios15. Quando essas molculas evidenciam um peso
molecular superior a 8 kDa, possuem a capacidade de atuar por si s como antignios. Por sua vez, substncias de baixo peso molecular podem ligar-se a molculas
com um peso molecular superior (os chamados haptenos), e desempenhar as funes de antignio15,16.
2.2 Imunognio
Um imunognio um antignio, sinttico ou natural, utilizado para produzir anticorpos em massa. A fonte e preparao de um imunognio so muito importantes
para se obter a melhor qualidade de reagentes para tcnicas imunohistoqumicas.
Existem dois grandes grupos de imunognios: pptidos sintticos e protenas purificadas. Os pptidos sintticos tm a vantagem de possuir uma sequncia de aminocidos conhecida, contudo, pode no ser possvel alcanar laboratorialmente a
conformao tridimensional da protena nativa, o que pode originar falsos negati9
IMUNOHISTOQUMICA
vos se a aplicao do anticorpo criado a partir deste imunognio no for devidamente caracterizada. Pode ainda ser impossvel recriar determinado antignio in
vitro visto que as modificaes ps-traducionais representam muitas vezes um
importante processo para a conformao final de um antignio in vivo. O uso de
antignios purificados evita muitos destes problemas, mas origina outros. O processo de purificao muitas vezes difcil de otimizar, podendo o produto final
conter demasiadas protenas contaminantes. Um outro problema ao utilizar antignios purificados, prende-se com a presena de outros eptopos que no so especficos para a obteno do anticorpo pretendido7.
2.3 Anticorpo
Os anticorpos so as molculas de natureza proteica que so produzidas maioritariamente pelos plasmcitos em resposta presena de material reconhecido como
estranho. A sua principal caracterstica combinar-se com o material indutor (antignio) em condies fisiolgicas favorveis sua ligao. O local de ligao ao
eptopo denominado paratopo. Esta ligao constitui a base da Imunohistoqumica2 (Figura 8).
Figura 8 Eptopo e paratopo
2.3.1 Especificidade e afinidade de um anticorpo

A especificidade a caracterstica de um anticorpo que lhe permite reconhecer e
estabelecer ligaes com antignios individualizados e especficos15 (Figura 9).
Depende da proximidade e da complementaridade entre antignio e anticorpo. A
alta complementaridade vai estar relacionada com a proximidade entre grupos
especficos que estabelecem ligaes muito fortes entre si, por perfeita correspondncia3.
A afinidade a caracterstica que define a fora de ligao entre um antignio e um
anticorpo. Se existirem muitas complementaridades entre estes elementos ao nvel
10
IMUNOHISTOQUMICA
estrutural e qumico surgir uma elevada fora de ligao e consequentemente

uma alta afinidade. Por outro lado se existirem poucas complementaridades iremos ter baixa fora de ligao e baixa afinidade17.
Figura 9 - Especificidade do anticorpo

Adaptado de: http://www.cisncancer.org/research/new_treatments/immunotherapy/promise.html
2.4 Imunoglobulinas
Classe de protenas que possuem atividade de anticorpo. As imunoglobulinas podem ser visualizadas ao microscpio eletrnico e demonstram uma conformao
em Y, que tomada como exemplo quando se quer representar um anticorpo3,18
(Figura 10).
Figura 10 Aspecto esquemtico de uma imunoglobulina

Fonte: http://imgt.cines.fr/textes/IMGTeducation/QuestionsAnswers/_UK/PosterIGH/imagesIgH.html
Cada imunoglobulina possui uma estrutura bsica constituda por quatro cadeias
proteicas: duas cadeias pesadas idnticas e duas cadeias leves idnticas, unidas por
ligaes dissulfdicas que mantm a estabilidade do anticorpo15.
A enzima papana divide a molcula em dois fragmentos com capacidade de ligao
ao antignio - Fab (fragment antigen binding) - e um fragmento sem capacidade de
11
IMUNOHISTOQUMICA
ligao ao antignio - Fc (fragment crystallisable). A molcula tambm pode ser

quebrada pela enzima pepsina dando origem a um fragmento especfico: F(ab)2,
com capacidade de ligao ao antignio e cristalizao. A maioria dos anticorpos
utilizados em imunohistoqumica so tratados desta forma para evitar reatividade
cruzada com a poro pFc que reconhecida por alguns recetores de clulas humanas, podendo originar falsos positivos3. Por reduo e acidificao pode-se dividir uma imunoglobulina nos seus constituintes bsicos: cadeias pesadas e leves
(Figura 11).
Figura 11 Quebra da molcula de anticorpo

Fonte: Delves, P, et al. Roitt's Essential Immunology. 12 Edio. New York: Wiley-Blackwell, 2011. ISBN: 978-1-4051-96833
As imunoglobulinas possuem uma zona mvel denominada hinge (dobradia), que

permite ao anticorpo uma mudana de ngulo de orientao de modo a existir uma
maior capacidade de ligao ao antignio18 (Figura 12).
12
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 12 Hinge do anticorpo

Fonte: http://www.odec.ca/projects/2003/lange3c/public_html/hinge.gif
Nas cadeias leves e pesadas existem 3 tipos de zonas (Figura 13):

A. Zonas constantes;
B. Zonas variveis;
C. Zonas hipervariveis.
A zona constante da cadeia pesada determina o tipo de cadeia pesada em questo e
consequentemente o tipo de imunoglobulina. A zona constante da cadeia leve determina o tipo de cadeia leve em questo. As zonas variveis so as zonas de ligao do anticorpo e as zonas hipervariveis esto localizadas dentro destas, sendo
responsveis pela ligao altamente especfica a um antignio15.
Figura 13 - Localizao das diferentes zonas estruturais do anticorpo
A distribuio das zonas hipervariveis ocorre tipicamente entre os aminocidos

31-37, 86-91 e 101-110 na cadeia pesada e entre os aminocidos 23-34, 50-56 e
13
IMUNOHISTOQUMICA
89-97 na cadeia leve. Enquanto as ligaes dissulfdicas se estabelecem entre os

aminocidos 22-98 na cadeia pesada e 23-98 na cadeia leve. Isto vai permitir a organizao espacial da molcula de anticorpo de modo a expor ativamente as reas
especficas de ligao ao contacto com o antignio3 (Figura 14).
Figura 14 Interao entre zonas hipervariveis e ligaes dissulfdicas do anticorpo

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK28374/bin/ch23f31.jpg
2.5 Cadeias leves

A distribuio de cadeias leves difere em todas as classes e subclasses de imunoglobulinas, bem como entre diferentes espcies animais. Existem cadeias leves
kappa e lambda, no entanto, cada anticorpo possui cadeias leves de um s destes
tipos15. No ser humano, as cadeias kappa constituem cerca de 65% do total de cadeias leves18.
2.6 Cadeias pesadas

As cadeias pesadas de cada imunoglobulina diferem nas propriedades antignicas
e estruturais e definem a classe e subclasse de cada molcula.
2.6.1 Cadeia pesada Alfa
Est presente na imunoglobulina de tipo A (IgA). Existe nas secrees seromucosas saliva, lgrimas, suor, corrimento nasal ou secrees gastrointestinais,
onde possui funes de defesa contra o ataque por microorganismos. Existe nestes
lquidos sob a forma de dmero estabilizado contra a protelise por combinao
14
IMUNOHISTOQUMICA
com outra protena (o componente secretor), sintetizado por clulas epiteliais e

que possui uma cadeia peptdica simples. A dimerizao efetuada por conjugao
com uma outra cadeia proteica (cadeia J)3 (Figura 15). Tem como funo principal
ligar-se aos microorganismos, diminuindo a sua capacidade de aderncia s clulas
epiteliais, impedindo assim a sua entrada. Possui duas subclasses com diferentes
ligaes dissulfdicas: IgA1, IgA216.
2.6.2 Cadeia pesada Gama
Est presente na imunoglobulina de tipo G (IgG) que a imunoglobulina que existe
em maior quantidade e possui capacidade de atravessar a barreira placentria:
passa da me para o feto e defende-o nas primeiras semanas de vida. a imunoglobulina com maior capacidade de difuso, sendo a primeira responsvel pela
neutralizao imediata das toxinas bacterianas e pela promoo da fagocitose.
Existem 4 subclasses IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 possuindo, cada uma delas, cadeias
pesadas ligeiramente diferentes, na constituio por aminocidos e nas ligaes
dissulfdicas (Figura 15). Caracterizam-se por possuir diferentes concentraes
serolgicas ao longo da vida do ser humano15.
2.6.3 Cadeia pesada Delta
Pode ser encontrada na imunoglobulina de tipo D (IgD) que foi a ltima a ser descoberta. Possui menor capacidade de resistncia digesto proteoltica, ao contrrio das outras imunoglobulinas, o que explica o seu curto tempo de vida no plasma
sanguneo. Possui uma elevada percentagem de glcidos e encontra-se na superfcie de linfcitos sanguneos com a funo de ativador/inibidor15 (Figura 15).
2.6.4 Cadeia pesada Miu
Encontra-se na imunoglobulina de tipo M (IgM). As molculas de IgM so polmeros de 5 unidades de anticorpos, unidos por uma cadeia J (Figura 15). Existe principalmente na corrente sangunea e possui principal apetncia para antignios com
vrios eptopos. Tem alta capacidade citoltica e resposta rpida, estando envolvida
nos casos de resposta a bactermia15.
15
IMUNOHISTOQUMICA
2.6.5 Cadeia pesada Epsilon

Est presente na imunoglobulina de tipo E (IgE), existindo em baixa proporo no
organismo humano. Forma uma segunda barreira de defesa contra o ataque de
micro-organismos nas superfcies externas do organismo. Est presente em afees por parasitas e responsvel por alguns dos sintomas de alergia atpica - reao inflamatria16 (Figura 15).
Figura 15 Estrutura esquemtica das diferentes imunoglobulinas

Fonte: http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n12/box/nrm972_BX1.html
2.7 Foras de ligao entre antignio e anticorpo

Todas as foras de atraco entre antignio e anticorpo possuem em comum a necessidade de proximidade entre molculas para se criarem, podendo ser de quatro
tipos: eletrostticas, pontes de hidrognio, hidrofbicas e foras de van der
Waals3,17. Nenhum destes tipos de fora muito robusto, mas, quando combinados,
conseguem estabelecer ligaes bastante fortes. A contribuio que cada um destes
tipos de fora confere depende do tipo e da localizao dos aminocidos que se
encontram no antignio e no anticorpo17.
2.7.1 Ligao eletrosttica ou inica
um tipo de ligao qumica baseada na atrao eletrosttica entre dois ies carregados com cargas opostas. Na formao da ligao inica, um tomo doa um
16
IMUNOHISTOQUMICA
eletro, devido sua baixa eletronegatividade, formando um io positivo ou catio.

O elemento recetor adquire ento carga negativa tornando-se um anio. Estes dois
elementos podem ento estabelecer entre si uma ligao eletrosttica ou inica 19
(Figura 16).
Figura 16 ligao eletroesttica (inica)

Fonte: http://www.britannica.com/EBchecked/media/92139/Ionic-bond-An-atom-of-sodium-donates-one-of-its
2.7.2 Pontes de hidrognio

So relativamente fracas e reversveis e formam-se entre grupos hidroflicos como
OH e NH2 e COOH, dependendo da proximidade das duas molculas que transportam estes grupos. So fortemente condicionadas pela elevada eletronegatividade
dos elementos envolvidos, que aglomeram junto a si a nuvem eletrnica da molcula a que pertencem e criam polos de cargas contrrias que podem atrair molculas adjacentes no mesmo estado19 (Figura 17).
17
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 17 ligao por ponte de hidrognio

Fonte: http://www.britannica.com/EBchecked/media/92139/Ionic-bond-An-atom-of-sodium-donates-one-of-its
2.7.3 Ligaes hidrofbicas

Da mesma forma que as gotas de leo na gua podem juntar-se todas numa s,
grupos hidrofbicos no polares tendem a fazer o mesmo. Se dois grupos hidrofbicos de 2 protenas se aproximarem o suficiente, de forma a exclurem todas as
molculas de gua entre elas, a superfcie em contacto com a gua reduzida e as
protenas adquirem um estado de energia mais baixo (menor entropia) do que
aquele que existia enquanto estavam separadas, ou seja, surge uma atrao entre
elas. Estima-se que as foras hidrofbicas contribuem em mais de 50% da fora
total da ligao antignio-anticorpo3 (Figura 18).
Figura 18 Ligaes hidrofbicas

Fonte: http://ak47boyz90.wordpress.com/page/59/
18
IMUNOHISTOQUMICA
2.7.4 Foras de van der Waals

Esto ligadas a perturbaes temporrias da nuvem de eletres de uma molcula,
que podem formar um dipolo eltrico que induz uma perturbao dipolar em outra
molcula adjacente, podendo assim os dois dipolos estabelecer uma fora de atraco entre eles19 (Figura 19).
Figura 19 Ligaes por foras de van der Waals

Fonte: http://www.planet-schule.de/wissenspool/total-phaenomenal/inhalt/hintergrund/klebekuenstler.html
19
IMUNOHISTOQUMICA
20
IMUNOHISTOQUMICA
SOROS POLICLONAIS E MONOCLONAIS
3 SOROS POLICLONAIS E MONOCLONAIS

Para realizao das tcnicas imunohistoqumicas fundamental possuir reagentes
adequados, dos quais se destaca o soro de anticorpos. Este produto obtido aps
imunizao de animais-alvo, dos quais so posteriormente obtidos, por via direta
ou indireta, os anticorpos produzidos20. Existem assim dois tipos de soros de anticorpos, que se distinguem pela forma de produo: soros policlonais e soros monoclonais.
3.1 Soros Policlonais

Os soros policlonais possuem anticorpos produzidos por vrios plasmcitos, reagindo assim com diversos eptopos de um antignio (Figura 20). O animal mais
utilizado para a produo de soros policlonais o coelho, mas podem ser utilizados
cabra, porco ou ovelha, entre outros, tratando-se sempre de animais cujo sistema
imunitrio est bem documentado21.
Figura 20 Soro policlonal.
3.1.1 Etapas da produo de Soros Policlonais

A sequncia habitual de produo inicia-se na escolha do antignio e sua injeo no
animal-alvo de forma a obter-se uma resposta imunitria, e termina na obteno
de um soro purificado com vrios anticorpos diferentes dirigidos para os vrios
eptopos do antignio3 (Figura 21).
A qualidade do soro policlonal fortemente condicionada pela eficincia das tcnicas de purificao, logo este passo crucial na obteno de reagentes de qualidade
21
IMUNOHISTOQUMICA
superior. O uso de animais de laboratrio pouco expostos a ambientes abertos e

altamente contaminados por antignio facilita a obteno de soros com poucos
anticorpos previamente desenvolvidos contra outros antignios16.
Figura 21 Produo de soros policlonais
22
IMUNOHISTOQUMICA
3.1.2 Trs tipos de soros policlonais

Existem trs tipos de soros policlonais diferenciados pela etapa de seleo e purificao em que se encontram: soro total ou whole serum, soro de frao de imunoglobulinas ou Ig fraction e soro de afinidade isolada ou affinity isolated antibodies16.
3.1.2.1 Soro total
Obtido aps extrao dos elementos celulares por centrifugao. Possui diversos
anticorpos e protenas circulantes (albumina, Alfa, beta globulinas). Se no se conseguir um soro mais purificado este utilizado, apesar de no ser o ideal.
Figura 22 Soro total.
3.1.2.2 Soro de frao de imunoglobulinas

Obtido aps extrao das protenas (exceto imunoglobulinas). Possui diversos anticorpos especficos e no especficos.
Figura 23 Soro de frao de imunoglobulinas.
23
IMUNOHISTOQUMICA
3.1.2.3 Soro de afinidade isolada

Obtido aps extrao das imunoglobulinas no especficas para o antignio pretendido. Possui anticorpos especficos e vestgios de contaminantes (protenas e
outras imunoglobulinas). Nem sempre se consegue este tipo de soros mas, como
muito mais puro que os outros, tem a possibilidade de oferecer uma melhor marcao.
Figura 24 Soro de afinidade isolada.
3.2 Soros Monoclonais

Um soro monoclonal um reagente que o produto de um nico clone de plasmcitos imortalizados e que, como tal, uniforme em estrutura, especificidade e afinidade, podendo ser produzido por tempo indeterminado.
Os anticorpos de um determinado clone so imunoquimicamente idnticos e reagem com um determinado eptopo de um antignio, contra o qual foram produzidos (Figura 25). O animal mais utilizado para obter clones de anticorpos o ratinho3,16.
Figura 25 Soro Monoclonal
Estes reagentes, introduzidos em 197522, revolucionaram muitas reas de trabalho

experimental, industrial e clnico, tendo, em 1984, proporcionado o prmio Nobel
24
IMUNOHISTOQUMICA
da medicina e fisiologia aos seus maiores impulsionadores: Jerne, Kohler e

Milstein23 (Figura 26).
Figura 26 Jerne, Kohler e Milstein.

Fonte: http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/jerne.jpg
A tcnica original de produo sofreu ao longo do tempo algumas melhorias22,24,

das quais se destaca a introduo de clulas modificadas por Epstein-Barr vrus
(EBV)por Steinitz et al em 197725 e as tcnicas de repertoire cloning' e
'Fab/phage display'26,27.
3.2.1 Produo de Soros Monoclonais
A tcnica mais utilizada para a produo de soros monoclonais consiste, resumidamente, nos seguintes passos3,28 (Figura 27):
A. Imunizao de um animal de modo a serem produzidos anticorpos para um
determinado Antignio que introduzido por injees repetidas.
B. Colheita de plasmcitos no bao desse animal.
C. Fuso desses plasmcitos (curto tempo de vida) com clulas de mieloma
(longo tempo de vida).
D. Colocao individual das clulas resultantes da fuso em cultura de modo a
poder recolher-se os anticorpos por elas produzidos.
E. Testes para os anticorpos em causa, no sentido de se saber quais as suas caractersticas.
F. Manuteno das culturas (clones) que demonstrem caractersticas teis e
destruio das restantes.
G. Recolha sistemtica dos anticorpos produzidos pelo clone que passam a
constituir o soro monoclonal e que podem ser utilizados em IHQ.
25
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 27 - Produo de Soros monoclonais
3.2.1.1 Imunizao
Imunizao o nome dado ao processo pelo qual se obtm uma resposta imunolgica, por parte de um ser vivo, para um determinado antignio28. Essa resposta
pode implicar a produo pelos plasmcitos de anticorpos para esse antignio
(Figura 28).
Figura 28 - Imunizao
26
IMUNOHISTOQUMICA
A escolha do animal a ser imunizado definida pelo tipo de clulas de mieloma a

utilizar posteriormente, pois sabe-se que fuso de DNA entre espcies iguais permite melhores resultados3.
A escolha da porta de entrada para a imunizao definida pelas caractersticas de
solubilidade do antignio. Caso o antignio seja solvel pode ser utilizada a injeo
endovenosa, caso seja insolvel deve ser utilizada a injeo intraperitoneal, intradrmica ou intramuscular.
A capacidade do antignio para produzir uma resposta imunolgica pode ser manipulada nalguns casos de modo a obter o mximo de resposta com um mnimo de
antignio. Pode-se, por exemplo, adicionar ao antignio determinados reagentes,
como o hidrxido de alumnio, que permitem a formao de um "depsito" de antignio no animal que lenta, mas consistentemente, vai provocar a resposta imunolgica sem que seja necessrio o uso de injees repetidas.
Na determinao da classe e a afinidade dos anticorpos produzidos existem alguns
fatores que no podem ser controlados como, a natureza do antignio, pois se este
possuir elevado teor em glcidos tende a despoletar uma resposta sob a forma de
IgM, ou as caractersticas individuais de cada animal, que vo estar envolvidas no
tipo de imunoglobulina produzido aps a imunizao. No entanto, podem ser utilizadas algumas estratgias de modo a ser produzido o tipo de imunoglobulina pretendido3:
A. Se for utilizada uma nica injeo para produzir a resposta imunitria esta
vai ser sob a forma de IgM;
B. Se forem utilizadas vrias injees separadas por um espao de tempo relativamente prolongado a resposta tende a ser sob a forma de IgG.
Os soros de IgG so mais procurados devido s menores dimenses desta molcula, o que possibilita uma maior capacidade de difuso tecidual e tambm devido
facilidade com que digerida pela pepsina de modo a ser eliminada a poro Fc
que pode originar falsas marcaes. Mas, por vezes, til possuir um soro de IgM
para um antignio, que pode ser utilizado em tcnicas de dupla marcao simultaneamente com um soro de IgG para outro antignio.
importante ter em conta que os anticorpos com maior afinidade para o antignio
so produzidos tardiamente e portanto deve-se esperar algum tempo entre a primeira injeo e a colheita de plasmcitos.
27
IMUNOHISTOQUMICA
3.2.1.2 Escolha das clulas de mieloma a utilizar

Esto disponveis comercialmente diversos tipos de linhas celulares de mieloma.
Os mais utilizados so o X63-Ag8.653 para ratinho29 e o YB213.0Ag3 (Y0) para ratazana30, pois no produzem qualquer tipo de cadeia, permitindo assim que todos
os anticorpos produzidos aps a fuso sejam do tipo anteriormente produzido pelo
plasmcito imunizado31.
3.2.1.3 Mtodos de fuso entre um grupo de clulas de mieloma e um grupo de
plasmcitos
O mtodo mais utilizado o que utiliza o polietileno glicol (PEG) como diminuidor
da tenso superficial entre as membranas celulares das clulas do mieloma e as
clulas do bao do animal utilizado, que, entretanto foi sacrificado para permitir a
sua retirada. Uma vez diminuda a tenso superficial as clulas fundem as suas
membranas celulares e numa posterior mitose fundem o seu DNA o que resulta
numa clula hbrida que mantm a imortalidade de uma clula-me e a capacidade
de produzir anticorpos especficos da outra clula-me. Esta clula hbrida prolifera e d origem a um clone31.
3.2.1.4 Seleco HAT
Aps a juno, em meio de cultura, dos grupos de clulas de mieloma e dos plasmcitos so aplicadas as tcnicas de fuso anteriormente referidas e da resultam
trs tipos de clulas31: plasmcitos no hibridados, clulas de mieloma no hibridadas e clulas hbridas. Estas clulas sero triadas pela adio ao meio de cultura
de Hipoxantina, Aminopterina e Timidina (HAT)32.
Os plasmcitos apenas vo sobreviver em cultura de tecidos durante cerca de 1
semana, pois possuem um nmero limitado de ciclos de replicao.
As clulas de mieloma sero eliminadas, pois a aminopterina bloqueia a sntese de
nucletidos pela via de novo. A clula tenta a via salvage mas sendo deficiente em
enzima (HPGRT) no consegue ativar esta via e morre.
As clulas hbridas que so o objetivo desta tcnica, conseguem sintetizar nucletidos pela via salvage, pois possuem enzima (HPGRT) e tm disponveis os precursores para esta via (hipoxantina e timidina). Assim estas clulas sobrevivem por-
28
IMUNOHISTOQUMICA
que, porque a clula-me normal fornece-lhes capacidade de produzir a enzima

(HPGRT) e o mieloma imortaliza a sua linha celular.
3.2.1.5 Seleo de clones
As clulas hbridas so testadas por etapas at se individualizarem clones produtores de anticorpos para o antignio pretendido. Os testes podem ser feitos por imunohistoqumica, aplicando os sobrenadantes da culturas onde repousam as clulas
hbridas como soros primrios de uma tcnica de imunofluorescncia indirecta,
pois as clulas libertam para o lquido sobrenadante da cultura os anticorpos que
produzem.
3.2.1.6 Produo alargada de soro monoclonal.
A partir do momento em que um sobrenadante de um clone intensivamente testado e comprovada a sua viabilidade, este pode ser utilizado. A cultura pode ento produzir soro durante muito tempo, desde que mantida em boas condies. O
sobrenadante assim regularmente recolhido e comercializado pelo seu produtor.
Existe ainda a hiptese de inocular o clone de clulas na cavidade abdominal de um
ratinho e recolher regularmente o lquido asctico que se desenvolve e que muito
rico em anticorpos especficos33.
3.2.1.7 Purificao, digesto e conjugao de anticorpos.
Podem ser realizados estes tipos de intervenes utilizando tcnicas especficas
para esse fim.
3.2.1.8 Armazenamento de anticorpos.
Os soros podem ser conservados durante vrios anos em cmaras frigorficas a 70C, mas uma vez descongelados podero permanecer a 4C durante alguns meses ou, no caso de possuir conservantes especficos (e.g. sodium azide ou azida de
sdio), alguns anos.
3.3 Soros Monoclonais versus Soros Policlonais

Cada um dos tipos de soros referidos anteriormente possui vantagens e desvantagens quando comparado com o outro tipo. Os soros monoclonais destacam-se por
29
IMUNOHISTOQUMICA
possurem alta especificidade e homogeneidade enquanto os policlonais so geralmente menos dispendiosos e mais fceis de obter (Tabela 5).
Tabela 5 Vantagens e desvantagens de soros policlonais e monoclonais
Alta especificidade e afinidade
Vantagens
Alta homogeneidade
Ausncia de anticorpos no especficos
Maior facilidade de caracterizao
Baixa variabilidade de lote para lote
Alto custo relativo
Desvantagens
Soros Monoclonais
Determinao de um s eptopo de um antignio
Se eptopo detetvel estiver destrudo, mesmo que exista antignio, este no ser identificado
Se existirem outros antignios com o eptopo selecionado, a grande vantagem da alta
especificidade ser intil
Vantagens
Baixo custo relativo

Capacidade para detetar um antignio mesmo na ausncia de vrios dos seus eptopos
Relativa facilidade de obteno em grandes quantidades
Relativa baixa especificidade
Desvantagens
Soros Policlonais
Relativa dificuldade de obteno em grandes quantidades
Determinao de vrios eptopos que podem pertencer a vrios antignios

Relativa baixa homogeneidade
Possibilidade de presena de anticorpos no especficos
Maior dificuldade de caracterizao
Relativa alta variabilidade de lote para lote
3.4 Manuseamento de Soros

Para se conseguir o mximo de qualidade nas marcaes de imunohistoqumica
importante que na utilizao de todos os soros se sigam as regras de manuseamento e armazenamento que so indicadas pelo fabricante na "bula" que os acompanha.
3.5 Receo
Assim que se recebe um soro no laboratrio muito importante que se proceda ao
seu armazenamento, de acordo com as indicaes do fabricante (normalmente
indicado o seu armazenamento no frigorfico a 4C.). Cada soro dever ser regista30
IMUNOHISTOQUMICA
do numa folha do laboratrio onde se indicam: o lote, data de validade, data de receo e nmero da nota de encomenda. Estes dados sero teis em caso de posterior reclamao.
3.6 Armazenamento e conservao

Os principais fatores a ter em conta quando se fala em armazenamento de soros
so: os frascos contentores, a temperatura e a manipulao diria.
3.6.1 Frascos contentores

Devero ser utilizados frascos de polipropileno, policarbonato ou de vidro borossilicado, pois possuem uma baixa capacidade de absoro de protenas. tambm
til utilizar frascos transparentes pois permitem uma rpida inspeo (Figura 29).
Figura 29 Frascos contentores

Fonte: http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/ps/products/affinity_media/sku_view/global/1563004_view.jpg
3.6.2 Temperatura
Este fator talvez o mais determinante quando se fala em conservao de anticorpos.
Todas as indicaes dos fabricantes devero ser seguidas criteriosamente em relao a esta condicionante. Os frigorficos e arcas congeladoras utilizados para armazenar anticorpos devem ter indicao digital da temperatura que desenvolvem e
ser monitorizados regularmente para prevenir eventuais flutuaes. Dever existir
um sistema de "Back-up" para compensar eventuais falhas de energia. tambm
de evitar o "descongelar/congelar" dirio dos soros que requerem congelao,
mantendo-se uma pequena quantidade de soro a 4C para uso de curta durao.
31
IMUNOHISTOQUMICA
3.6.3 Manipulao diria

O tratamento adequado dos soros durante a sua utilizao previne a sua deteriorao ou contaminao.
Deve-se manter o reagente afastado do calor e da luz solar direta, para alm de se
proceder sua devoluo atempada ao local de armazenamento aps utilizao.
tambm importante utilizarem-se pontas descartveis para recolha de soros.
3.6.4 Azida de sdio

Os reagentes biolgicos utilizados em imunohistoqumica recorrem azida de sdio (NaN3) como conservante. Este produto qumico altamente txico na forma
pura, no entanto, as concentraes utilizadas nos referidos reagentes (15 mmol/L)
so extremamente baixas e, consequentemente, apresentam pouco risco. Em situaes de elevada concentrao do produto, embora no sendo classificada como
perigosa, a azida de sdio pode reagir com as canalizaes de chumbo e de cobre,
formando acumulaes de azidas metlicas altamente explosivas. Ao eliminar o
soros de imunohistoqumica, adicionar gua abundante para evitar a acumulao
de azidas metlicas na canalizao34.
32
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
4 IMUNOFLUORESCNCIA
4.1 Mtodos de Imunofluorescncia
D-se a designao de imunofluorescncia aos mtodos de imunohistoqumica que
utilizam molculas fluorescentes como substncias propiciadoras da visualizao
do antignio (Figura 30).
Figura 30 Imunofluorescncia
Fonte: http://www.microscopyu.com
Estes mtodos exigem a utilizao de um microscpio especial para a visualizao

das marcaes, com uma lmpada que emite radiao com comprimento de onda
no campo dos ultravioletas de 480-590 nm (Figura 31).
Figura 31 Espectro de radiaes
33
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
As tcnicas de imunofluorescncia foram introduzidas por Albert Coons e pelos

seus colaboradores em 1941 e, desde ento, so aplicveis tanto para diagnstico
como para investigao. So de uso limitado no diagnstico de rotina, sendo por
isso pouco utilizados, uma vez que as molculas fluorescentes perdem atividade
com o passar do tempo, no permitindo a conservao das lminas em arquivo.
A imunofluorescncia uma forma de luminescncia, entendo-se esta ltima como
a emisso de luz que se produz a partir de uma fonte de energia no trmica. A fluorescncia primria ou autofluorescncia aquela que certos tecidos ou rgos
apresentam sem haver necessidade de serem modificados. Por exemplo, a lmina
elstica das artrias mostra autofluorescncia em determinadas substncias. Podemos induzir fluorescncia em determinadas substncias que no tenham esta
capacidade (fluorescncia secundria) marcando, com fluorocromos, anticorpos
dirigidos contra antignios tecidulares.
As tcnicas de imunofluorescncia realizam-se quase sempre com tecido congelado pois existe a perceo de que o processo de fixao com formaldedo e a incluso em parafina alteram a estrutura dos tecidos, provocando um aumento dos fenmenos de autofluorescncia e o bloqueio de alguns determinantes antignicos,
no entanto, alguns estudos tm permitido perceber que isso ultrapassvel e existe a possibilidade de aplicar tcnicas de imunofluorescncia em tecidos fixados em
formaldedo35,36.
4.1.1 Fluorocromos
Fluorocromos so substncias que tm a propriedade de absorver altas fontes de
energia precedentes da radiao UV e do espectro de luz visvel. Assim, quando
estas substncias so iluminadas, h uma libertao gradual de energia que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa. Este fenmeno denomina-se fosforescncia.
Os fluorocromos mais utilizados nas tcnicas de imunofluorescncia so a fluorescena e a rodamina. A fluorescena usa-se quase sempre sob a forma de isotiocianato (FITC), que absorve a luz azul e emite fluorescncia verde. A rodamina usa-se na
forma de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC); absorve luz verde e emite
fluorescncia vermelha (Tabela 6).
34
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
Tabela 6 Caractersticas dos Fluorocromos
Para ser utilizado em imunofluorescncia, um fluorocromo dever ter determinadas caractersticas:

A. No deve interferir com a relao antignio-anticorpo;
B. O seu armazenamento dever ser estvel;
C. Dever encontrar-se disponvel na sua forma purificada;
D. A sua emisso dever ser mxima no espectro do visvel;
E. O comprimento de onda da luz absorvida e da luz emitida devem ser muito
diferentes para que possam diferenciar-se facilmente.
Os fluorocromos podem ligar-se de forma covalente aos anticorpos sem alterar as
suas propriedades e estes ltimos ligam-se depois aos antignios. Assim, os fluorocromos ligados a anticorpos especficos constituem um meio til para visualizar
zonas onde ocorra a reao antignio-anticorpo. Tambm podem marcar-se os anticorpos especficos com fluorocromos distintos (marcao mltipla).
4.1.2 Unio dos fluorocromos a anticorpos

O tipo de ligao depende do tipo de fluorocromo. O FITC e o TRITC ligam-se ao
anticorpo atravs de ligaes covalentes com os grupos amina e carboxilo dos anticorpos. Esta ligao deve ser feita em pH alcalino e devem usar-se molculas purificadas para que os fluorocromos no se liguem a outras protenas e originem falsa
marcaes.
4.1.3 Microscpio de fluorescncia

Para a visualizao das tcnicas de imunofluorescncia deve usar-se um microscpio de fluorescncia (Figura 32). Este tipo de microscpio tem incorporado:
1. Fonte de luz UV e visvel;
2. Filtros primrios (ou de excitao) que selecionam o comprimento de onda
que vai incidir sobre a amostra;
35
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
3. Filtro secundrio (ou de emisso) que seleciona os comprimentos de onda

emitidos dentro do espectro de luz visvel, deixando passar apenas a luz
emitida por uma substncia fluorescente.
A fonte de luz pode ser uma lmpada de vapor de mercrio a alta presso ou uma
lmpada halognea de quartzo. A primeira produz mais energia e prefervel
quando se pretende uma imunofluorescncia de baixa intensidade. No entanto,
dispendiosa, h risco de exploso e perde a intensidade com o tempo. Existem dois
tipos de microscpios de imunofluorescncia: o microscpio de transmisso e o de
luz de incidncia.
Figura 32 Microscpio de Fluorescncia

Fonte: http://www.jic.ac.uk/microscopy/more/t5_6.htm
4.1.4 Microscopia de Imunofluorescncia no diagnstico

A utilizao da imunofluorescncia para o diagnstico das doenas glomerulares
do rim to importante que algumas delas devem seu nome a particularidades da
tcnica. As glomerulopatias podem apresentar-se com imunofluorescncia negativa (doenas glomerulares no imuno mediadas). Porm a maioria apresenta imunofluorescncia positiva para anticorpos anti-IgA, IgG, IgM ou complementos C1,
C3 ou C4, que pode ter padro linear ou padro granular (cerca de 95%). Quando o
padro da imunofluorescncia fortemente linear feito o diagnstico de Doena
Glomerular por anticorpos anti membrana basal glomerular. Essa doena quando
36
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
associada ao componente pulmonar chamada de Doena de Goodpasture (Figura

33).
Figura 33 - IgG em padro linear.

Fonte: http://classconnection.s3.amazonaws.com/33/flashcards/602033/jpg/gps_vs_sle1317950166424.jpg
Quando o padro granular evidencia-se outra patologia glomerular cujo diagnstico exige a tcnica de imunofluorescncia que a Glomerulopatia de IgA, quando a
imunoglobulina detectada pela imunofluorescncia a IgA (Figura 34).
Figura 34 - IMF positiva para IgA em padro granular

Fonte: http://classconnection.s3.amazonaws.com/33/flashcards/602033/jpg/gps_vs_sle1317950166424.jpg
37
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOFLUORESCNCIA
38
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
5 IMUNOENZIMOLOGIA
D-se o nome de imunoenzimologia aos mtodos de imunohistoqumica que utilizam enzimas como substncias propiciadoras da visualizao do antignio. So os
mtodos mais utilizados atualmente, pois permitem a visualizao em microscpio
tico comum e a obteno de preparaes permanentes3 (Figura 35). Possuem
como principal vantagem a visualizao da estrutura geral do tecido em simultneo com a marcao imunohistoqumica.
Figura 35 Microscpio tico.

Fonte: http://biogv.webnode.com.br/a1%C2%BA%20a/
5.1 Enzimologia Bsica

As enzimas so catalisadores biolgicos muito potentes e eficazes, responsveis
pela maior parte das reaes qumicas que mantm a homeostasia. Como possuem
um papel muito importante ao nvel dos processos dos seres vivos, tornam-se chaves importantes no diagnstico clnico e teraputica.
As enzimas podem ser classificadas com base na sua composio em enzimas simples que so constitudas apenas por protenas e enzimas complexas, quando so
compostas por protenas e uma pequena quantidade de molculas orgnicas.
39
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
As enzimas complexas tambm so denominadas holoenzimas, cujo componente

proteico denominado apoenzima e o componente no-protico coenzima ou
grupo prosttico (ex.protoporfirina de ferro da peroxidase). Quando a coenzima
um io ou molcula inorgnica, denomina-se co-fator (Figura 36).
EXEMPLO DE COFATOR
ENZIMAS COMPLEXAS
Figura 36 Enzimas e Co-fatores

http://www.bio12.com/ch6/RemedialEnzymes.htm
As enzimas podem ser encontradas em todos os tecidos e fluidos do corpo, como:
Enzimas intracelulares catalisam as reaes da cascata metablica;
Enzimas da membrana plasmtica - regulam a catlise dentro das clulas

em resposta a sinais extracelulares;
Enzimas do Sistema Circulatrio - so responsveis pela regulao da coagulao sangunea.
5.1.1 Papel Catalisador

Um catalisador uma substncia que acelera uma reao qumica, diminuindo a
energia de ativao. Como catalisadores as enzimas atuam em pequena quantidade, no levando a cabo reaes que sejam energicamente desfavorveis, no modificam o sentido dos equilbrios qumicos, mas sim acelerando o seu processo
(Figura 37).
40
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
Figura 37 Papel catalisador das enzimas numa reaco

Fonte: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fe/Carbonic_anhydrase_reaction_in_tissue.svg
5.1.2 Caractersticas das Enzimas

As enzimas possuem a capacidade de distinguir de forma especfica o substrato
sobre o qual agem (Especificidade do Substrato) e cada reao catalisada por uma
enzima especfica (Especificidade de Ao).
A reao entre enzima e substrato descreve-se da seguinte forma:
ENZIMA (E)+ SUBSTRATO (S) COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO (CES)
CES E + PRODUTO FINAL (P)
A ao enzimtica caracteriza-se pela formao de um complexo que representa o
estado de transio, logo necessrio a formao do complexo enzima - substrato
antes da obteno do produto final.
O substrato une-se ao centro ativo da enzima atravs de numerosas interaes
como, por exemplo: pontes de hidrognio, ligaes eletrostticas e ligaes hidrofbicas.
O centro ativo uma pequena poro da enzima, constituda por uma srie de
aminocidos que interatuam com o substrato.
5.1.3 Modelos de Interao Enzima/Substrato

5.1.3.1 Modelo de Fisher Chave/Fechadura
Elaborado por Fisher no incio do sculo passado, baseado no princpio de que as
enzimas so muito especficas e s atuam sobre determinados substratos, catalisando reaes. Fisher sugeriu que esta especificidade devida ao facto dos subs41
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
tratos encaixarem perfeitamente no centro ativo das enzimas, provocando a abertura ou fecho desta. De acordo com este modelo o centro ativo uma estrutura
rgida, havendo assim um ajuste perfeito entre enzima e o substrato37.
5.1.3.2 Modelo de Koschland - Encaixe Induzido
De acordo com este modelo, a enzima e o centro ativo no so estruturas rgidas. O
substrato que tem afinidade para determinada enzima liga-se ao centro ativo, modificando-o, de modo que haja um encaixe perfeito do substrato enzima. Exercese assim uma fora sobre o substrato, quebrando ligaes da molcula ou estabelecendo outras (reaes de catlise ou de sntese). Assim se explica a especificidade relativa das enzimas, isto , uma enzima pode catalisar alguns substratos com
diferenas estruturais pequenas38.
5.1.4 Fatores que afetam a Atividade Enzimtica

Existem diversos fatores que afetam a atividade enzimtica. Um deles a concentrao enzimtica, sabendo-se que a velocidade de transformao do substrato
proporcional concentrao da enzima. Outro dos fatores a concentrao do
substrato, pois a atividade enzimtica aumenta com o aumento da concentrao do
substrato at saturao da enzima. Temos ainda o pH, que pode afetar de diferentes maneiras: o centro ativo pode conter aminocidos com grupos ionizados que
podem variar com o pH do meio, a ionizao dos aminocidos que no esto no
centro ativo pode provocar modificaes na conformao das enzimas ou o substrato pode ser afetado por variaes do pH. Um pH extremo modifica irreversivelmente a estrutura da enzima, desnaturando a protena e em certos casos modifica
a ligao entre a apoenzima e a coenzima. Algumas enzimas apresentam variaes
peculiares, como por exemplo: a pepsina do estmago apresenta um pH ideal de
2.0, enquanto que a fosfatase alcalina do intestino apresenta um pH ideal de 12.0. A
temperatura tambm influencia fortemente a atividade enzimtica. Uma determinada temperatura representa o mximo da atividade enzimtica, mas quando se
supera um valor considervel (normalmente acima dos 50C) a atividade enzimtica cai bruscamente, pois a enzima sofre uma desnaturao. E, finalmente, temos a
concentrao de sais e ies da soluo envolvente, pois algumas enzimas necessi-
42
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
tam que estejam presentes ies metlicos (e.g. Mg++, Mn++, Zn++) que funcionam
como agentes eletroflicos.
5.1.5 Classificao das Enzimas

As enzimas podem ser divididas em 6 tipos39:
Classe 1: Oxirredutases - Catalisam reaces de oxirreduo, transferindo eletres,
hidretos (H-) ou protes (H+) (Figura 38).
Classe 2: Transferases - Transferem grupos qumicos entre molculas. So denominadas Quinases (Figura 39).
Classe 3: Hidrolases - Utilizam a gua como recetor de grupos funcionais de outras
molculas (Figura 40).
Classe 4 - Liases - Formam ou destroem ligaes duplas, respetivamente retirando
ou adicionando grupos funcionais.
Classe 5 - Isomerases - Transformam uma molcula num ismero.
Classe 6 - Ligases - Formam ligaes qumicas por reaces de condensao, consumindo energia sob a forma de ATP
Existem as oxiredutases que atuam em reaes de Oxidao Reduo. Nestas reaes h uma molcula que se reduz e outra que se oxida
Figura 38 Reao de oxidao-reduo

Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/enzimas.htm
Figura 39 Reao de transferncia

Figura 40 Reao de hidrlise
43
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
5.1.6 Tipos de Inibio

Podem existir dois tipos de inibio. Por um lado temos a inibio competitiva, que
ocorre em enzimas que tem a capacidade de se ligar a mais do que um substrato,
sabendo-se que se o inibidor se liga enzima ao nvel do centro ativo, diminui a
sua afinidade para o substrato. Temos ainda a inibio no-competitiva, na qual o
inibidor se liga enzima no centro alostrico (zona especfica extra-centro ativo),
levando a uma alterao da configurao do centro ativo, o que faz com que a enzima tenha dificuldade a ligar-se ao substrato.
5.2 Imunoenzimologia
Os mtodos de marcao imunoenzimticos utilizam reaes do tipo enzimasubstrato para obterem produtos finais coloridos a partir de cromognios incolores.
As enzimas mais utilizadas so:
A. Horseradish Peroxidase - HRP;
B. Fosfatase Alcalina (Calf intestine Alkaline Phosphatase);
C. Glucose Oxidase (Aspergillus niger).
So critrios teis para seleo de enzimas para utilizao em imunohistoqumica3:
A. A enzima deve existir em grandes quantidades na natureza numa forma altamente pura e ser pouco dispendiosa;
B. A conjugao no deve anular a atividade enzimtica;
C. A enzima conjugada deve ser estvel em soluo;
D. A atividade da enzima endgena no deve interferir em grande escala com a
tcnica;
E. Os produtos da reao enzimtica devem ser facilmente detetados e permanecerem estveis durante longos perodos.
5.2.1 Horseradish Peroxidase HRP

A enzima mais utilizada a Horseradish Peroxidase ou HRP obtida da raiz do rbano Armoracia rusticana (Figura 41)40. Esta molcula possui um peso molecular de
44
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
40 kDa e bastante estvel. Como p liofilozado, pode ser guardado durante muitos anos a 4C. Em soluo aquosa (1mg/ml) pode ser mantida mais do que um
ano a C, sem diminuio da atividade.
Possui ainda outras particularidades muito vantajosas3:
A. Existe em grandes quantidades na natureza numa forma altamente pura e
pouco dispendiosa;
B. A sua conjugao no anula a atividade enzimtica;
C. Os produtos da reao enzimtica so facilmente detetados e permanecem
estveis durante longos perodos.
Figura 41 Horseradish
http://content.answcdn.com/main/content/img/wiley/visualfood/27_HerbesEpicesCondiments/40758-RacineRaifort.jpg
A peroxidase pode ser dividida em mais de 30 isoenzimas, sendo que a forma predominante a isoenzima C (HRP C), uma glicoprotena monomrica com peso molecular de aproximadamente 44 kDa (Figura 42).
Figura 42 estrutura qumica da HRP.

Fonte: http://www.york.ac.uk/depts/chem/staff/jrls.html
caracterizada como uma nica cadeia de polipeptdeo com 308 resduos, com
um resduo N-terminal bloqueado por piroglutamato. fortemente glicosilada
45
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
(18% em massa) e contm um nico grupo de protoporfirina IX como grupo prosttico, dois ies de clcio, quatro pontes dissulfeto, e oito cadeias de carbohidratos
N-linked. Contm um grupo de base frrica (hematina) no seu centro ativo (Figura
42), possuindo, em soluo, cor castanha41.
Figura 43 Estrutura tridimensional da HRP. O grupo heme est localizado no centro com o tomo de ferro a vermelho e os ies de clcio so as esferas pretas
Fonte: http://www.pdb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1HCH
A hematina da peroxidase forma um complexo com o perxido de hidrognio

(substrato) provocando a sua decomposio em gua (H2O) e oxignio atmico3. A
peroxidase tambm pode oxidar outras substncias como os nitratos e os polifenois42.
Pode ser conjugada com outras protenas de duas maneiras:
A. Ligao covalente:
a. Pode ser realizada utilizando o glutaraldedo;
b. Esto envolvidos os grupos E-amino da lisina e os grupos N-terminal
de ambas as protenas.
B. Ligao no-covalente:
a. ligao anticorpo / peroxidase atravs da poro Fab (Complexo
PAP).
Em imunohistoqumica, a HRP oxida indiretamente os cromognios ao reagir com
o perxido de hidrognio. Os cromognios utilizados so substncias que na sua
forma oxidada so coloridas e estveis, conferindo cor ao local da reao. Existe
sob a forma de peroxidase endgena em vrias estruturas humanas como os glbulos vermelhos.
46
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
5.2.1.1 Substratos e Cromogneos

A HRP, em presena de perxido de hidrognio, forma, numa primeira fase, um
complexo enzima-substrato, e, posteriormente, oxida um dador de eletres que
permite que a reao prossiga na degradao do perxido em gua e oxignio livre.
Alguns dadores de eletres uma vez oxidados tornam-se coloridos e portanto so
designados cromogneos. Este facto associado capacidade de precipitarem no
local da reao aps a oxidao, torna-os muito teis em imunohistoqumica, pois
permite identificar a presena e localizao do antignio3 (Figura 44).
Figura 44 representao esquemtica da revelao por DAB
O cromognio mais utilizado a 3,3-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB)

que gera um precipitado castanho/bronze insolvel em lcool e noutros solventes
orgnicos (Figura 45).
Figura 45 imunomarcao por DAB
A sua oxidao causa a polimerizao, permitindo a reao com o tetrxido de smio, aumentando a intensidade da cor e permitindo o surgimento da densidade
para os eletres, que pode ser til em microscopia eletrnica43.
O composto final pode mudar a sua cor para negro caso seja utilizado, em simultneo com a oxidao, o cloreto de nquel. Pode tambm intensificar-se a cor castanha caso seja utilizado, em simultneo com a oxidao, o sulfato de cobre43.
47
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
Por sua vez, o cromognio 3-Amino-9-Etilcarbazol (AEC) aps oxidao forma um

produto final vermelho-rosado, solvel no lcool (Figura 46). Devem ser utilizados
um meio de montagem e um contraste aquosos. No entanto, existem atualmente
alguns meios de montagem permanentes que podem tambm ser utilizados44 (e.g.
Ultramount - Dako).
Figura 46 revelao por AEC
O cromognio 4Cloro-1-Naftol (CN) forma um produto final azul. solvel em

lcool e noutros solventes orgnicos. Tende a difundir-se do local onde precipita.
5.2.2 Fosfatase Alcalina (Calf intestine Alkaline Phosphatase);

A Fosfatase Alcalina possui um peso molecular de 100 kDa e tem com funo principal remover por hidrlise e transferir grupos fosfatos de steres orgnicos, quebrando as ligaes P-O. formada uma ligao temporria entre a enzima e o substrato PO4. Estas reaes so ativadas por diversos ies metlicos como: Mg++,
Mn++ e Ca++.
No era muito utilizada em Imunohistoqumica at surgir o mtodo APAAP, que
tem como principal vantagem o facto de evitar a atividade endgena da peroxidase.
recomendada a sua utilizao em esfregaos e tecidos com muito sangue. Para a
inibio da fosfatase alcalina endgena do osso, rim, fgado e glbulos brancos, recomenda-se a utilizao de Levamisole, que adicionado soluo de revelao.
A enzima hidrolisa os steres de fosfato-naftol (substratos) em compostos fenlicos e fosfatos. Os fenois reagem com os sais incolores de Diazonium (cromognio)
para produzir corantes azo.
Podem ser utilizadas diferentes combinaes de substrato/cromognio como o 5Bromo-4-Cloro-Indolil Fosfato (BCIP)/Nitro Blue Tetrazolium (NBT).
48
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
O BCIP hidrolisado pela fosfatase alcalina levando formao de um composto

temporrio que posteriormente dimerizado para produzir um corante de ndigo.
O NBT reduzido a formazan pela dimerizao do composto anterior (Figura 47).
Figura 47 reao de revelao da fosfatase alcalina por NBT-BCIP

Fonte: http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/References/the-handbook/UltrasensitiveDetection-Technology/Enzyme-Labeled-Fluorescence.Par.35337.Image.-1.0.1.gif
Esta combinao de reagentes forma um precipitado azul a negro insolvel em solventes orgnicos44 (Figura 48).
Figura 48 Revelao por NBT-BCIP

Fonte: http://www.maxim.com.cn/show/product/showlist.asp?id=128&tid=&tid1=4
A New Fucsin um cromognio que produz um tom avermelhado, sendo insolvel

nos solventes orgnicos44. Possui uma intensidade bastante forte (Figura 49).
49
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
Figura 49 Revelao por New Fuchsin.

Fonte: http://www.maxim.com.cn/show/product/showlist.asp?id=128&tid=&tid1=4
O substrato Naftol As-Mx Fosfato pode ser utilizado na sua forma cida ou de sal
slido (substrato) e, quando combinado com os cromognios Fast-Red TR ou Fast
Blue BB, produz uma cor vermelha (Figura 50) ou azul brilhante respetivamente,
sendo estes solveis em lcool e nos solventes orgnicos.
Figura 50 Revelao por Fast Red TR.

Fonte: http://home.primus.com.au/royellis/hmb45.html
Existem ainda outros Cromognios como o Fast Red LB ou o Fast Garnet GBC.
5.2.3 Glucose Oxidase (Aspergillus niger)

Sendo uma holoenzima, a glucose oxidase possui 185 kDa e constituda por duas
subunidades idnticas, que esto ligadas entre si por ligaes no covalentes. Existem cerca de 120 pontos de contacto entre os dmeros centrados volta de 11 resduos, formando cada um ligaes de hidrognio. No existe nos mamferos, o que
significa que no existe atividade enzimtica endgena. Possui pouca sensibilidade
quando comparada com a fosfatase alcalina e com a peroxidase. As suas preparaes so estveis durante anos se guardadas no frio. No seu estado puro contm
50
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
polissacridos como amilase, maltase e sucrase, que podem contribuir para falsos
resultados.
Existem muitos sais cujos produtos de reao so apropriados para as tcnicas de
imunoenzimologia que utilizam a glucose oxidase, como o INT (2 (p-iodophenyl)
3-(p-nitrophenyl)5-phenyl tetrazolium chloride) de cor violeta e solvel no lcool. As lminas devem ser montadas em meio de montagem aquoso.
5.2.4 Contraste
As coloraes de contraste so escolhidas tendo em conta a cor do produto final
obtido na tcnica de imunohistoqumica.
Pode ser utilizada a Hematoxilina de Harris de cor azul (Figura 51), a Hematoxilina
de Mayer de cor azul (Figura 52), o Nuclear Fast Red ou Kernechtrot de cor vermelha ou ainda o Methyl Green ou verde de metilo de cor verde.
Figura 51 Hematoxilina de Harris
Figura 52 Hematoxilina de Mayer
51
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOENZIMOLOGIA
Figura 53 Nuclear Fast Red.

Fonte: http://www.vetmed.fu-berlin.de/einrichtungen/institute/we01/studium/histologie/uebungen_ss/index.html
Figura 54 Verde Metilo

Fonte: http://www.pathology-skin-rjreed.com/html/amf__dendritic_cells_.htm
52
IMUNOHISTOQUMICA
MTODOS IMUNOHISTOQUMICOS
6 MTODOS IMUNOHISTOQUMICOS
Uma vez que os anticorpos, como protenas que so, no possuem cor prpria nem outra
forma de serem visualizados nas preparaes histolgicas e citolgicas, foi necessrio
encontrar forma de lhes conferir uma maneira de serem observveis quando se encontram ligados aos antignios que se querem detetar em Anatomia Patolgica.
Existem atualmente diversos mtodos aplicveis a imunohistoqumica. A sua inveno
teve praticamente sempre o mesmo denominador comum: a procura de uma ampliao
de sinal mais potente. Todos ambicionaram continuamente associar o mximo de molculas visualizveis ao complexo anticorpo-antignio.
Se no incio, com Coons, a ampliao de sinal era medocre, o que limitava a exequibilidade da imunohistoqumica a situaes excecionais e espordicas, isso no toldou as
potencialidades destas tcnicas, tendo desde sempre os investigadores procurado identificar quantidades cada vez mais nfimas de antignio45.
Ao longo dos anos tm sido desenvolvidas abundantes formas de aumentar o sinal (cor,
fluorescncia, etc.) que est associado ao antignio tecidual. Algumas dessas metodologias no singraram e nunca obtiveram uma expanso relevante, outras tiveram muita
aplicabilidade no seu tempo mas foram ultrapassadas e no so praticamente utilizadas
nos dias de hoje. No entanto, todas possuem as suas vantagens e desvantagens que devem ser conhecidas para uma compreenso mais profunda da Imunohistoqumica.
6.1 Mtodo Direto

Neste mtodo utilizado somente um anticorpo primrio, que possui o marcador. Isto
significa que o anticorpo que possui o marcador se liga diretamente ao antignio (Figura
55).
Figura 55 Mtodo direto
53
IMUNOHISTOQUMICA
Possui como principais vantagens a simplicidade e a rapidez, e, como desvantagens, a

pouca ampliao de sinal, pois somente existe uma molcula de marcador por molcula
de antignio e o facto de ser dispendioso, pois obriga existncia de anticorpos primrios com marcador.
6.2 Mtodos indiretos

6.2.1 Simples
Neste mtodo so utilizados dois tipos de reagentes (Figura 56):
A. Primrio - anticorpo dirigido contra o antignio que se quer detetar;
B. Secundrio - anticorpo dirigido contra as imunoglobulinas da espcie animal em
que foi produzido o anticorpo primrio. Est marcado com a substncia que permite a visualizao do complexo.
Podem ser utilizados como anticorpos secundrios, entre outros, os Rabbit anti-mouse
Igs (RAM) no caso do anticorpo primrio ser produzido em ratinho ou os Swine anti rabbit Igs (SAR) no caso do anticorpo primrio ser produzido em coelho.
Figura 56 Mtodo indirecto simples
Possui como principais vantagens ser mais sensvel do que o mtodo direto, pois h
maior nmero de molculas de marcador por cada molcula de Antignio, possuir maior
versatilidade do que o mtodo direto, pois basta possuir um anticorpo secundrio marcado e no necessrio que os primrios estejam marcados, e mais econmico.
Como desvantagens assinala-se que mais demorado e complexo do que o mtodo direto.
6.2.2 Mtodo Peroxidase Anti Peroxidase (PAP)

Neste mtodo so utilizados trs tipos de reagentes46 (Figura 57):
54
IMUNOHISTOQUMICA
A. Primrio - anticorpo dirigido contra o antignio que se quer detetar;

B. Secundrio (ou de ponte) - anticorpo dirigido contra as imunoglobulinas da espcie animal em que foi produzido o anticorpo anterior;
C. Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP).
Figura 57 Mtodo PAP
Para que o anticorpo secundrio possa fazer a ponte entre ambos, o complexo PAP dever ser produzido na mesma espcie animal do anticorpo primrio.
O anticorpo secundrio deve ser aplicado em excesso de modo a manter uma poro Fab
ligada ao anticorpo primrio e a outra poro Fab livre para se poder ligar ao complexo
PAP.
Possui, como principais vantagens, maior sensibilidade relativamente aos mtodos anteriormente descritos, a no utilizao de anticorpos marcados e permite o aumento das
diluies do anticorpo primrio e consequentemente a diminuio da marcao de inespecfica.
Como desvantagens de assinalar que mais demorado e complexo do que os mtodos
anteriores.
6.2.3 Mtodo APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase)

Mtodo semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a fosfatase alcalina em vez
da peroxidase (Figura 58).
55
IMUNOHISTOQUMICA
bastante utilizado em situaes que pela sua natureza impeam ou dificultem a utilizao dos mtodos de imunoperoxidase, como, por exemplo, lminas de imunocitoqumica
(amostra citolgica)com muitos eritrcitos.
Figura 58 Mtodo APAAP
6.3 Mtodos de avidina-biotina

6.3.1 Enquadramento histrico
Os mtodos de avidina-biotina so utilizados desde a dcada de 40 em cromatografias
bioqumicas que se baseavam na grande afinidade entre a avidina e a biotina. S em
1977 se d a aplicao do sistema avidina-biotina em Imunohistoqumica, por Heggeness e Ash em mtodos de imunofluorescncia47. Em 1981, Hsu et al introduziram o
Complexo Avidina-biotina (ABC), que permitiu a grande popularizao destas tcnicas e
que ainda hoje tem alguma utilizao48,49. Posteriormente surgiram inovaes como a
utilizao da streptavidina, a tcnica da Labelled Avidin-biotin (LAB) e a tcnica da Labelled Streptavidin-biotin (LSAB).
Todos os mtodos de avidina-biotina se baseiam em 4 princpios gerais:
A. A extraordinria afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um complexo praticamente indissocivel;
B. A possibilidade existente de ligao entre a biotina e outras molculas, como enzimas e anticorpos (anticorpos biotinilados);
C. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substncias como
enzimas, metais pesados ou fluorocromos;
D. Possibilidade de utilizao da avidina como ponte entre duas molculas biotiniladas (e.g. um anticorpo e uma enzima).
56
IMUNOHISTOQUMICA
6.3.2 Principais caractersticas da avidina

Trata-se de uma glicoprotena bsica (p.m 67 kDa), presente na clara do ovo em grandes
quantidades e que, apesar de existir em alguns ovparos, no tem expresso nos mamferos. constituda por quatro subunidades, que por sua vez so constitudas cada uma,
por uma cadeia polipeptdica simples de 128 aminocidos.
A principal caracterstica da estrutura terciria desta molcula a formao de quatro
bolsas, cada uma correspondente a uma das referidas subunidades (Figura 59), e que
tm a capacidade de se ligar a uma molcula de biotina50 (Figura 60).
Figura 59 representao esquemtica da avidina com 4 bolsas
Figura 60 representao esquemtica da avidina ligada a 4 biotinas
Apesar das suas teis caractersticas, a avidina possui uma desvantagem que a presena de resduos oligossacridos na sua estrutura51. Estes elementos induzem a ligao da
avidina a estruturas tecidulares de carga elctrica negativa, o que provoca o aparecimento de marcao inespecfica de fundo. Para suplantar este problema implantou-se a
utilizao de streptavidina52.
6.3.3 Principais caractersticas da streptavidina

A streptavidina uma protena de p.m 60 Kd, extrada da cultura de Streptomyces avidinii, no possuindo resduos oligossacridos. Embora a avidina possua uma estrutura
secundria, terciria e quaternria quase idntica da streptavidina, as duas protenas
mostram apenas 30% de semelhana quando sequenciadas e pensa-se que no possuem
57
IMUNOHISTOQUMICA
relao evolutiva53. Se a avidina tem uma maior afinidade para a biotina no conjugada,
a streptavidina possui maior afinidade para a biotina conjugada54.
6.3.4 Principais caractersticas da Biotina

Tambm conhecida por vitamina H, uma protena muito simples de apenas 244 d, existente em grande quantidade na gema do ovo (Figura 61). A sua simplicidade permite a
sua ligao em cada uma das bolsas, que existem na molcula de avidina para a qual
especfica.
Figura 61 estrutura qumica da Biotina.

Fonte: http://www.csapt.it/b/bi/biotina.html
6.3.5 A ligao entre a avidina e a biotina

A ligao entre a avidina e a biotina devida a ligaes qumicas no covalentes e extremamente rpida e forte, sendo uma das ligaes mais duradouras das existentes na
Natureza55. S pode ser quebrada em situaes extremas como a utilizao de um meio
de pH extremamente baixo (1.5)56.
6.3.6 Biotinilao
Processo pelo qual a biotina conjugada com uma variedade de molculas por exemplo:
enzimas, cidos nucleicos ou anticorpos. O pequeno tamanho da molcula da biotina,
permite a ligao s referidas estruturas sem que ocorram alteraes ao nvel das suas
caractersticas imunolgicas ou fsicas57. Pode at ser efectuada a mltipla biotinilao
do mesmo anticorpo sem que surjam alteraes imunolgicas. Surge-nos assim a possibilidade de revestir um anticorpo ou uma enzima com um grande nmero de molculas de biotina, que se comportam como locais de ligao para a avidina. O nmero mximo de molculas de biotina que se podem ligar a um anticorpo foi estimado em 150.
O processo de biotinilao implica a passagem da biotina para a sua forma activada
permitindo assim a sua ligao atravs do grupo carboxlico as zonas NH2 da molcula a
ser biotinilada. A biotinilao no somente aplicada a anticorpos, mas tambm a cidos nucleicos para utilizao em ISH (in situ hibridization).
58
IMUNOHISTOQUMICA
6.3.1 Bloqueio da biotina endgena

A biotina que existe normalmente em alguns rgos humanos, sendo neste caso denominada endgena. Para evitar que esta molcula se ligue avidina utilizada na imunohistoqumica, criando falsos-positivos ou fundo inespecfico, pode ser feita um bloqueio da biotina endgena, que consiste na aplicao, no incio da imunohistoqumica,
de avidina livre que se ir ligar biotina endgena, bloqueando-a. Seguidamente aplicada biotina livre para bloqueio dos pontos activos livres da avidina previamente aplicada. Logo, no local onde havia uma molcula de biotina passa a existir um complexo de
avidina-biotina completamente desactivado (
Figura 62).
Figura 62 Bloqueio da biotina endgena.
6.3.2 Marcao da avidina

A avidina pode ser marcada com diversas molculas, como por exemplo:
A. Fluorocromos: FITC ou TRITC;
B. Enzimas: HRP, fosfatase alcalina, beta- galactosidase;
C. Ferritina ou ouro coloidal.
No caso dos fluorocromos, pode existir ligao via um derivado do isotiocianato. Para as
enzimas e a ferritina utilizado um reagente de brao duplo como o gluteraldedo; finalmente o ouro coloidal liga-se atravs de foras electrostticas no covalentes.
6.3.3 Tcnicas imunohistoqumicas de avidina-biotina
As tcnicas que utilizam a avidina e a biotina no diferem, no seu essencial, das outras.
Logo no necessria a utilizao de processamento ou fixao especial, o que permite a
sua aplicao na rotina hospitalar. As tcnicas mais conhecidas so a streptavidin-biotin
complex (streptABC) e a labelled streptavidin-biotin (LSAB).
59
IMUNOHISTOQUMICA
As suas principais vantagens so:

A. Alta sensibilidade: A possibilidade de biotinilao de um anticorpo com cerca de
150 molculas de biotina permite uma ampliao de sinal, que as tcnicas usadas
anteriormente no atingiam;
A. Alta versatilidade: a alta polivalncia do processo de biotinilao permite a utilizao das tcnicas de avidina-biotina em diversas situaes como a imunohistoqumica, Hibridao in situ ou a citoqumica de afinidade, quer em microscopia
electrnica quer em microscopia tica.
As suas desvantagens so:
A. Ligao da avidina a estruturas tecidulares carregadas negativamente. Esta desvantagem foi suplantada com a introduo da streptavidina;
B. Ligao da avidina e streptavidina biotina endgena que existe normalmente
em alguns rgos humanos como o rim, o fgado ou a mama.
6.3.3.1 Tcnica streptABC
Nesta metodologia so utilizados 3 passos (Figura 63):
A. Aplicao do anticorpo primrio dirigido contra o antignio pretendido;
B. Aplicao do anticorpo secundrio biotinilado dirigido contra o anticorpo primrio;
C. Aplicao do complexo streptavidina-biotina (marcado com substncia propiciadora da visualizao - normalmente HRP).
Figura 63 Mtodo streptABC
A preparao do complexo streptABC feita cerca de 1 a 4h antes da aplicao. Misturase streptavidina e biotina marcada com HRP de modo a que haja ligao entre elas. As
60
IMUNOHISTOQUMICA
propores adicionadas devem facultar a existncia de uma zona livre na streptavidina e

trs ocupadas com biotina marcada.
6.3.3.2 Tcnica LSAB
Nesta metodologia so utilizados 3 passos (Figura 64):
A. Aplicao do anticorpo primrio contra o antignio pretendido;
B. Aplicao do anticorpo secundrio biotinilado dirigido contra o anticorpo primrio;
C. Aplicao da streptavidina marcada com substncia propiciadora da visualizao
(normalmente HRP).
Figura 64 Mtodo LSAB/LAB
6.3.4 Aplicaes prticas

Os mtodos que utilizam a avidina-biotina, sendo bastante sensveis, so teis para a
deteo de pequenas quantidades de antignio. Estas pequenas quantidades podem
existir normalmente ou como consequncia da fixao e processamento. Tambm devido alta sensibilidade, estes mtodos permitem a diminuio do fundo por aumento
da diluio dos anticorpos primrios, o que tambm diminui os custos. No entanto, a alta
sensibilidade pode ter consequncias negativas como a ampliao do sinal de pequenas
quantidades de biotina endgena ou a ampliao de sinal de pequena quantidade de anticorpo primrio ligado inespecificamente. Para alm disso, estes mtodos facultam uma
diminuio dos tempos de incubao, tornando a tcnica mais rpida.
As tcnicas que utilizam a avidina marcada foram muito populares durante vrios anos,
mas esto actualmente em forte decrscimo devido introduo dos mtodos de polmero.
61
IMUNOHISTOQUMICA
6.4 Mtodos de polmero

Fruto de uma evoluo constante que gerou vrias patentes registadas58,59, esto, atualmente, em uso os sistemas de amplificao de polmero que permitem novas abordagens
dos conceitos anteriormente utilizados. Os mtodos que maior sucesso obtiveram foram
os mtodos de polmero, que podem ser de esqueleto interno ou de micropolimeros de
enzimas.
Tendo em conta que, atravs da utilizao dos polmeros, existe a possibilidade de conjugar grandes quantidades de marcador a anticorpos, emerge uma capacidade superior
de amplificao, pois conseguem concentrar bastantes molculas propiciadoras de visualizao, normalmente enzimas, por molcula de antignio. Como est presente um
grande nmero de enzimas no polmero, maior quantidade de cromogneo ser precipitada, o que resulta numa marcao mais intensa e brilhante, aumentando assim a sensibilidade do mtodo, permitindo detetar at as quantidades mais nfimas de antignio60.
Alm disso, estes mtodos permitem diminuir os custos com anticorpos primrios pois
facultam um aumento das suas diluies de trabalho sem comprometer a intensidade
das marcaes. Com maiores diluies de trabalho dos anticorpos primrios surgem
tambm outras vantagens, como a forte diminuio das marcaes inespecficas provocadas pelas marcaes cruzadas. O facto destes sistemas no possurem (strept)avidina
nem biotina torna desnecessria a utilizao de reagentes bloqueadores61. Paralelamente permitem ainda a utilizao de recuperao antignica mais vigorosa sem o receio de
evidenciar biotina endgena62. Os sistemas de polmero possibilitam todas estas vantagens enquanto se beneficia da simplicidade e rapidez de um ensaio de poucas etapas60.
Na generalidade, os mtodos so simples e de rpida execuo, tornando menos provvel a variabilidade intra-laboratorial, aumentando a reprodutibilidade e a facilidade de
padronizao, e diminuindo fatores de erro, equvocos e repeties. Para reforar esta
tendncia os reagentes so normalmente fornecidos pelo fabricante em formato lquido,
pronto a aplicar, com protena estabilizadora e conservante. Estas caractersticas aumentam a qualidade e garantem a diminuio dos custos do trabalho e do tempo tcnico
e, quando associadas possibilidade de aumentar diluies dos anticorpos primrios,
permitem compensar largamente os custos destes reagentes60.
De um ponto de vista muito prtico, estes mtodos so extremamente teis, particularmente quando so necessrios resultados muito rpidos. Podem, por exemplo, ser apli62
IMUNOHISTOQUMICA
cados rotineiramente para avaliar, em exame intra-operatrio, as margens cirrgicas de

um melanoma atravs de cirurgia microgrfica de Mohs, detetando melancitos por via
do antignio MART-1/Melan A. Com este mtodo rpido e sensvel surgem benefcios
para o doente e para as equipas de cirurgia e patologia, garantindo margens cirrgicas
mais seguras, com todas as consequncias que da advm em mortalidade, morbilidade e
qualidade de vida63.
6.4.1 Polmero de esqueleto interno

Como o prprio nome indica estas metodologias recorrem a uma macromolcula constituda por um esqueleto central de grandes dimenses, ao qual esto acopladas grandes
quantidades de anticorpos e molculas propiciadoras da visualizao que podem ser
enzimas (Figura 65).
Figura 65 Polmero de esqueleto interno
As principais molculas utilizadas como esqueleto interno so os dextranos. Estes polissacardeos hidroflicos so caracterizados pelo seu elevado peso molecular de aproximadamente 500 kDa, alta hidrosolubilidade e baixa toxicidade/imunogenicidade. So
bioquimicamente inertes, devido sua rara ligao poli-(-D-1,6-glucose) que os torna
resistentes clivagem pela glicosidases endgenas celulares64.
O dextrano comercializado sob a forma de aglomerados polimricos extremamente
flexveis, que em soluo se transformam em espirais muito expansveis. Este composto
facilmente solvel em gua e eletrlitos, constituindo solues incolores, transparentes e altamente estveis. O pH no afeta significativamente a sua solubilidade e possvel dissolve-lo em sulfeto de metilo, formamida, etilenoglicol e glicerol. No entanto,
insolvel em metanol, etanol, isopropanol, acetona e 2-propanona. As solues de dextrano podem ser esterilizadas em autoclave e so estveis por muitos anos, devendo ser
conservadas a temperatura constante. O pH ideal para o armazenamento entre 6.0 e
7.0, no entanto, o dextrano estvel temperatura ambiente por longos perodos na
63
IMUNOHISTOQUMICA
faixa de pH 4-10. Em aplicao farmacutica este composto utilizado em vrias preparaes parentricas, um ingrediente de solues para uso oftlmico e tambm usado
em cremes e pomadas64.
Os dextranos so formados a partir da sacarose durante o crescimento de bactrias pertencentes aos gneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus, todas pertencentes
famlia Lactobacillacea. No entanto, a maioria dos dextranos sintetizada pela bactria
Leuconostoc mesenteroides64.
A biodegradao do dextrano realizada por enzimas (dextranases) produzidas por alguns fungos como Penicillium e Verticillium. Os produtos de degradao so essencialmente acares de baixo peso molecular, por exemplo glicose ou isomaltose. Da mesma
forma, muitas bactrias produzem dextranases extracelulares que degradam o dextrano
em acares de baixo peso molecular: Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga e Bacillus
spp65,66 (Figura 66).
Figura 66 - Dextrano (esquerda - estrutura qumica; centro - aspeto fsico; direita - Leuconostoc mesenteroides)
Fontes: http://www.enterprise-europe-network.ec.europa.eu/src/request/pictures/Structure%20dextrane.gif;
http://www.dextran.net/dextrans-image-gallery.html; http://genome.jgi.doe.gov/leume/leume.home.html
Este tipo de polmero atinge grandes dimenses e engloba cerca de 100 molculas de
HRP e at 20 anticorpos secundrios do tipo cabra anti-ratinho ou cabra anti-coelho.
Todas estas molculas esto ligadas diretamente ao esqueleto de dextrano ativado60.
6.4.1.1 Polmero de esqueleto interno directo
Neste mtodo utiliza-se somente um polmero que constitudo pelo esqueleto de dextrano ao qual esto acoplados anticorpos primrios e substncias propiciadoras da
visualizao normalmente HRP (Figura 67).
64
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 67 Polmero de esqueleto interno directo
Por possuir s um passo, trata-se de um mtodo extremamente rpido e fcil, evidenciando uma diminuio de fatores de erro. No entanto, possui pouco poder de amplificao. Para alm disso, relativamente dispendioso e existem poucos anticorpos primrios comercializados desta forma.
O principal polmero deste tipo a ser comercializado foi o Enhanced Polymer One-Step
Staining (EPOS), da Dako, apresentado por Bisgaard et al e introduzido no mercado em
199367.
6.4.1.2 Polmero de esqueleto interno indireto
Neste mtodo aplica-se um anticorpo primrio dirigido contra o antignio pretendido e
posteriormente aplica-se um polmero ao qual esto acoplados anticorpos secundrios
e substncias propiciadoras da visualizao normalmente HRP (Figura 68).
Figura 68 Polmero de esqueleto interno indireto
Por possuir s dois passos, trata-se de um mtodo rpido e fcil, evidenciando uma diminuio de fatores de erro. Para alm disso um mtodo muito ampliativo, deslocando
bastantes molculas propiciadoras de visualizao por molcula de antignio. , no entanto, relativamente dispendioso.
65
IMUNOHISTOQUMICA
6.4.2 Micropolmeros de enzimas

A utilizao dos polmeros aumenta drasticamente o nmero de enzimas que podem ser
conjugadas com anticorpos. No entanto, no incio da sua comercializao, com os polmeros de esqueleto interno, esses produtos conjugados possuam um tamanho muito
elevado e a densidade de enzima por unidade de superfcie no assumia uma proporo
eficiente para esse tamanho. Tendo em conta esta caracterstica, conceptualizou-se que
seria desejvel obter um complexo anticorpo-enzima mais compacto, com um elevado
nmero de molculas de enzima ligado a cada anticorpo, mas garantindo um aumento
mnimo de tamanho molecular68.
De forma a alcanar este objetivo, fizeram-se algumas experiencias que procuravam
combinar pequenas molculas de estrutura linear ou minimamente ramificada, de forma
a polimerizar anticorpos e enzimas, constituindo um complexo muito compacto. Observou-se ento que a polimerizao de pequenas molculas orgnicas monomricas pode
ser realizada com recurso ao cido acrlico e ao cido bisacrlico. Assim, utilizaram-se
estes reagentes de forma a criar um complexo de elevado nvel de polimerizao que
no perde o seu poder de reao e penetrabilidade pois o rcio de polimerizao, apesar
de elevado, no se torna incomportvel, pois condicionado pelo facto da HRP apenas
possuir um grupo amino que facilmente acessvel68.
Ao contrrio dos sistemas de polmero de esqueleto interno, que utilizam molculas de
dextrano com configurao molecular extensa, os micropolmeros de enzimas apostam
no pequeno porte e na elevada concentrao funcional. Embora o produto final desta
conjugao por via do cido acrlico e dos seus derivados, seja um complexo heterogneo, com diferentes tamanhos moleculares, formas e rcios enzima/anticorpo, a experincia prtica sugere que o conhecimento da relao exata entre anticorpo e enzima, da
forma molecular ou do tamanho no fundamental para avaliar o seu desempenho. Os
resultados dos estudos indicam que a imunomarcao proporcionada por estes reagentes de elevada qualidade, independentemente dos antignios serem de membrana,
citoplasma ou ncleo68,69.
Segundo os seus fabricantes esta abordagem evita os problemas decorrentes do uso de
dextrano ou de outras macromolculas como esqueleto. O micropolmero com uma alta
densidade de enzima muito ativa acoplada a um anticorpo secundrio gera um reagente,
que supera a interferncia estrica, que advm do enorme volume ocupado pelo polme66
IMUNOHISTOQUMICA
ro de esqueleto interno. Este mtodo proporciona maior acessibilidade ao antignio pois

a pequena dimenso dos seus reagentes permite uma melhor difuso aos pontos-alvo e
uma reduo da ligao no especfica70,71 (Figura 69).
Figura 69 Micropolmero de enzimas indirecto.
6.4.3 Sistemas de dois e trs passos

Os sistemas de polmero atualmente os mais difundidos, podem possuir s dois passos,
ou seja implicar apenas a incubao do anticorpo primrio e, posteriormente, do polmero propriamente dito. No entanto, para a deteo de alguns antignios verificou-se
que a intensidade de imunomarcao ficava diminuda e assumiu-se que isso era devido
a problemas de penetrao do polmero nos tecidos, provavelmente em resultado de
impedimento espacial provocado pelo elevado peso molecular dos grandes conjugados
polimricos69. Para tentar ultrapassar este problema foram criados os sistemas de trs
passos, nos quais includa a aplicao de um anticorpo extra (comummente designado
pelos fabricantes como ativador), entre o primrio e o polmero, que aumenta a capacidade de deteo do sistema e a sua sensibilidade61. Este segundo anticorpo permitir o
aumento da superfcie de ligao disponvel para a polmero que colocado a posteriori
(Figura 70).
67
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 70 - A colocao do segundo anticorpo permite aumentar a quantidade de polmeros ligados
Alm disso, este anticorpo permitir aumentar, em dimenso tridimensional, todo o

complexo que est ligado ao tecido, facilitando assim a ligao do polmero nas situaes
em que o antignio se encontra na profundidade tridimensional do tecido (Figura 71).
Figura 71 - A colocao do segundo anticorpo permite associar o polmero ao antignio
68
IMUNOHISTOQUMICA
ASPETOS PRTICOS DOS MTODOS
7 ASPETOS PRTICOS DOS MTODOS

Uma das principais estratgias para o sucesso dos mtodos imunohistoqumicos
passa pela aplicao rigorosa de todos os procedimentos, incluindo uma planificao cuidada e devidamente registada. Outra das estratgias implica a utilizao de
reagentes de elevada qualidade devidamente validados, incluindo a efectiva verificao dos limites de validade.
Nunca se deve realizar a tcnica sem o devido controlo de qualidade, positivo e
negativo, de modo a garantir a fidelidade dos resultados.
Todas as tcnicas devem ser aplicadas e/ou controladas por profissionais com
formao e experiencia em imunohistoqumica de modo a garantir a sua eficincia
e adequado troubleshooting.
7.1 Cuidados com material e reagentes

Existem diversos procedimentos a assegurar na execuo de tcnicas imunohistoqumicas, sendo que um dos principais se prende com a correcta utilizao do material e reagentes. Todo o material a utilizar deve encontrar-se devidamente limpo,
de forma a evitar contaminaes ou danos na tcnica, e aquele que descartvel
deve ser cuidadosamente separado aps utilizao.
Os reagentes habitualmente utilizados nas baterias de hidratao/desidratao,
como etanol, xilol ou gua destilada devem ser mudados dos recipientes com relativa frequncia, de forma a manter a maior grau de pureza possvel.
Ao utilizar pipetas de Pasteur, estas devem ser descartadas num recipiente apropriado aps cada utilizao, bem como as pontas das micropipetas.
7.2 Diluio de soros de anticorpos

Existem no mercado diversos soros sob a forma pr-diluida que permitem aplicao imediata, mas a margem de manobra que facultam limitada (Figura 72). A
maior parte dos anticorpos so comercializados sob a forma concentrada e necessrio proceder sua diluio para posterior aplicao. A apresentao concentrada dos anticorpos a ideal para a adaptao personalizada de cada laboratrio
com as suas caractersticas pr-analticas especficas, sendo assim possvel contor69
IMUNOHISTOQUMICA
nar condies de fixao e de processamento que, por vezes, se encontram longe

das ideais.
Figura 72 Soros pr-diludos

Fonte: http://www.biorad.com/webroot/web/images/cdg/products/autoimmune/product_detail/global/aibu_29403_pdp.jpg
7.3 A diluio ideal

considerada diluio ideal de um soro a diluio que permite a maior intensidade
de marcao com o menor fundo possvel. A diluio representa-se por: X/Y; sendo
que X= [partes de soro concentrado] e Y= [partes de soluo final]. Exemplos de
diluies usuais so: 1/20; 1/1000; 1/5000.
necessrio efectuar alguns clculos quando se pretende calcular as quantidades
de soro a pipetar. Existe ainda a possibilidade de conjugar a diluio do anticorpo
com outros factores que podem ser manipulados de modo a melhorar e adaptar
tcnica as condies de cada laboratrio:
A. Mtodo utilizado;
B. Tempo de incubao;
C. Temperatura de incubao.
7.4 Teste de diluio de soros de anticorpos

Caso o fabricante fornea uma indicao de partida para a diluio ideal do anticorpo, esta dever ser utilizada como ponto de partida para o teste. Se isso no
acontecer, dever ser utilizado o teste padro do laboratrio para os anticorpos,
cuja diluio desconhecida. Exemplo: 1/20; 1/50; 1/100; 1/200; 1/500.
A diluio correcta de um anticorpo o factor que mais contribui para a qualidade
de uma lmina de imunohistoqumica.
70
IMUNOHISTOQUMICA
A maneira mais utilizada para o teste de anticorpos a utilizao de um mtodo

sensvel, um tempo e uma temperatura de incubao constantes, e fazer variar as
diluies de forma programada at se identificar a diluio ideal.
7.5 Pipetagem
Os soros utilizados em imunohistoqumica so utilizados normalmente em quantidades muito reduzidas da ordem dos microlitros. O microlitro a unidade de volume equivalente milionsima parte de um litro, representada pelo smbolo L e
equivalente ao milmetro cbico (mm3).
Para manusear pequenas quantidades de reagente de forma precisa, utilizam-se
micropipetas, que medem um volume exacto e facilmente aspiram e expelem lquidos. Ao utilizar a micropipeta, deve escolher-se a ponta adequada, normalmente
reconhecida pela cor presente no topo da micropipeta. Por regra, utiliza-se o polegar para controlar cuidadosamente o mbolo da micropipeta, pois este , para a
maioria dos indivduos, o dedo com melhor motricidade fina.
7.5.1 Cuidados gerais

Selecione o volume a pipetar dentro da amplitude da micropipeta. No tente seleccionar um volume que ultrapasse o mnimo ou o mximo permitido.
Quando utilizar a micropipeta colocar sempre primeiro a ponta. Se no proceder
desta forma poder aspirar lquido para dentro da cmara e provocar danos graves72 (Figura 73).
Figura 73 Colocao de ponta na micropipeta

Fonte: http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/geneconn/smallvol/part1.php
Mantenha sempre a micropipeta numa posio vertical quando tem lquido na

ponta. No permita que o lquido possa escorrer para o seu interior72 (Figura 74).
71
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 74 Colocao da micropipeta

Mude sempre de ponta a cada pipetagem. Utilize o seu polegar para controlar a
velocidade a que aspira ou dispensa o lquido. Se for demasiado brusco pode aspirar lquido para dentro da cmara da micropipeta72 (Figura 74).
Figura 75 Utilizao do polegar para pipetar

7.5.2 Preparao da Micropipeta

Verifique se possui a micropipeta correcta para pipetar a quantidade desejada. No
caso de micropipetas de volume varivel existem trs amplitudes mais comuns: 110L, 10-100L, 100-1000L. Ao regular o volume desejado tenha sempre presentes a caracterstica mecnicas da micropipeta. Pressione a extremidade da micropipeta na ponta adequada. As pontas amarelas so para 1-200 L. As pontas azuis
so para 100-1000 L72.
7.5.3 Como retirar uma amostra com uma micropipeta

Antes de pegar na micropipeta destape o tubo ou frasco de onde vai retirar a amostra. Segure a micropipeta na posio vertical numa mo e o tubo na outra mo.
Ambos devero estar ao nvel dos olhos72 (Figura 76).
72
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 76 Micropipeta e tubo ao nvel dos olhos

Antes de colocar a ponta dentro do lquido pressione o mbolo da micropipeta at

sentir a primeira presso e mantenha essa posio. No ultrapasse a primeira
presso ou ir pipetar um volume incorrecto72 (Figura 77).
Figura 77 Presso no mbolo da micropipeta

Introduza a ponta no lquido a pipetar72 (Figura 78).
Figura 78 Introduo da ponta no lquido

Aspire o lquido libertando lentamente o mbolo da micropipeta. Em seguida tape

o tubo ou frasco que contem o lquido a pipetar72 (Figura 79).
73
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 79 Libertar o mbolo da micropipeta

7.5.4 Como expelir a amostra da micropipeta

Com a mo livre destape o tubo ou frasco para onde pretender colocar o liquido
pipetado. Segure a micropipeta numa posio vertical com uma mo e segure o
tubo ou frasco de destino com a outra. Ambos devero estar ao nvel dos olhos.
Toque a parede interior do tubo ou frasco de destino com a ponta. Isto cria uma
pequena tenso superficial que auxilia expulso do lquido da ponta da micropipeta72 (Figura 80).
Figura 80 Ponta a tocar parede do tubo

Lentamente pressione o mbolo da micropipeta at primeira presso. Depois

continue at segunda presso e mantenha o mbolo nessa posio72 (Figura 81).
Figura 81 Presso no mbolo da micropipeta

74
IMUNOHISTOQUMICA
Lentamente retire a micropipeta do tubo ou frasco, mantendo o mbolo pressionado e evitando aspirar lquido para dentro da ponta72.
7.6 Tempo de durao da incubao

Normalmente estabelece-se um tempo de incubao uniforme para todos os soros. Esse
o ponto de partida e s alterado caso prove ser inaplicvel.
Tempos mais utilizados:
30 minutos (a mais utilizada).
60 minutos.
16 horas (incubao overnight).
De um modo geral, quanto maior o tempo de incubao, maior a intensidade de marcao

e consequentemente de fundo.
7.7 Temperatura de incubao

Estabelecida no incio dos testes, e s alterada caso se prove inaplicvel (por maus resultados).
Temperaturas mais utilizadas:
A. 4C;
B. 37C;
C. temperatura ambiente (a mais utilizada).
De um modo geral, quanto maior a temperatura, maior a marcao e consequentemente
maior a marcao de fundo.
7.8 pH
Estabelecido no incio dos testes e assim permanece at final com o auxlio da soluo
tampo. Os valores de pH mais utilizados vo de 7.4 a 7.6.
7.9 Higiene e segurana no Laboratrio

Ao trabalhar dentro de qualquer laboratrio, importante ter presente regras de
segurana indispensveis a uma boa prtica. Cada indivduo tem o dever de tomar
os procedimentos adequados salvaguarda da sua sade e segurana e daqueles
que o rodeiam.
O uso de substncias txicas, corrosivas, inflamveis ou explosivas, de alta temperatura ou electricidade potenciam os riscos. Por isso, devem cumprir-se as regras
bsicas de segurana:
75
IMUNOHISTOQUMICA
A. Conservar as bancadas arrumadas e limpas,

B. No correr ou fazer movimentos bruscos,
C. Lavar as mos com frequncia,
D. No pipetar com a boca,
E. Fazer a correcta manipulao de reagentes,
F. Adicionar solues concentradas sobre outras mais diludas e no o inverso.
tambm indispensvel o uso de equipamentos de proteco individual, como
bata, luvas, culos, mscara e outros, sempre que a situao o justifique. A proteco colectiva representa um importante factor de segurana e conseguida com
adequados sistemas de ventilao e extraco de ar, entre outros.
Em caso de acidente importante saber como agir. Para tal, so necessrias noes
bsicas de primeiros socorros, destacando-se os procedimentos PAS a cumprir em
caso de acidente:
1. Prevenir actuar no sentido de evitar a ocorrncia de mais acidentes ou o
agravamento dos j ocorridos;
2. Alertar informar as entidades competentes da ocorrncia;
3. Socorrer abordar os feridos e proceder de acordo com as situaes encontradas.
Em caso de ingesto de produto txico ou nocivo no se deve provocar o vmito ou
dar de beber vtima sem indicao expressa de Profissional de Sade competente.
Quando um reagente perigoso contacta com os olhos, pele ou mucosas deve lavarse de imediato e abundantemente a zona afectada com gua fria.
Ao assumir uma atitude cautelosa/ponderada e respeitando as regras de segurana laboratorial estamos a contribuir drasticamente para a diminuio do nmero
de acidentes.
76
IMUNOHISTOQUMICA
PREPARAO DE AMOSTRAS
8 PREPARAO DE AMOSTRAS
Quando se pretende proceder a estudos imunohistoqumicos essencial garantir a
preservao adequada da amostra e dos seus antignios alvo, para alm de se preparar as clulas/tecidos para visualizao em microscpio tico. Nesse sentido, o
mais usual proceder-se fixao qumica da amostra e ao seu subsequente processamento laboratorial e microtomia, com vista obteno de um corte histolgico ntegro e facilmente visualizvel em microscopia.
8.1 Fixao em Imunohistoqumica

A fixao uma das mais importantes fases da preparao da amostra, sabendo-se
que a sua principal finalidade manter as clulas e os tecidos o mais prximo possvel das caractersticas in vivo42, assegurando12,73:
Preservao - as enzimas endgenas e a flora microbiana ficam impedidas

de destruir o tecido;
Estabilizao - a estrutura molecular do tecido estabilizada;
Proteo o fixador protege ainda os tecidos e as clulas das agresses do

procedimento histolgico e colorao.
O formaldedo tem sido o fixador mais utilizado nos laboratrios de Anatomia Patolgica, pois bastante econmico e possui grande poder de penetrao nos tecidos, preservando os detalhes morfolgicos com artefactos de retrao reduzidos12.
No entanto, este qumico provoca algumas alteraes estruturais nas biomolculas,
principalmente nas protenas, que, por sua vez, constituem o principal alvo das
identificaes imunohistoqumicas.
8.1.1 Fixao para cortes de cristato

Os cortes de cristato (Figura 82), pelo menos teoricamente, permitem uma maior
preservao dos antignios do que os de parafina, mas perdem no pormenor estrutural. As tcnicas de Imunohistoqumica podem ser realizadas sem qualquer fixao qumica ou, posteriormente, podem ser utilizados diversos fixadores para os
cortes de cristato, como lcool, acetona ou at formol. Cada laboratrio deve determinar o processo de fixao que considera melhor para si.
77
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 82 Cristato para corte de material congelado

Fonte: http://education.vetmed.vt.edu/Curriculum/VM8054/Labs/Lab2/IMAGES/cryostat.jpg
8.1.2 Fixao em Imunohistoqumica de rotina

A maior parte dos cortes de imunohistoqumica so cortes de tecidos includos em parafina (Figura 83), tendo surgido vrias tcnicas para a fixao inicial.
Figura 83 Microtomo para cortes de parafina

Fonte: http://www.leica-microsystems.com/uploads/pics/KNIFE_Angle_Microtomy.png
8.1.2.1 Formaldedo
Quimicamente, o formaldedo o mais simples dos aldedos e tem a denominao
da International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) de metanal. Possui a
frmula qumica H2CO e apresenta-se, em condies normais de presso e temperatura, como um gs incolor de cheiro caracterstico e penetrante, sendo txico e
carcinognico humano documentado74. normalmente comercializado sob a forma de gs a 37%-39% em soluo aquosa, a que se d o nome de formol ou formalina. Na utilizao em Anatomia Patolgica o fixador mais utilizado o formol a
10% que deve ser tamponado para manter o pH estvel12.
78
IMUNOHISTOQUMICA
Ao nvel celular o formaldedo parece possuir a capacidade de fomentar o estabelecimento de pontes de metileno entre os aminocidos de vrias protenas, alterando
a sua forma e contribuindo para a sua inativao funcional - Figura 84.
Figura 84 Ponte de metileno entre aminocidos.

Fonte: http://stainsfile.info/StainsFile/prepare/fix/agents/formalin.htm
O formaldedo fomenta assim alteraes na conformao das protenas que resultam na inativao das enzimas, sabendo-se que os compostos resultantes dos processos de fixao diferem dos compostos iniciais nos aspetos qumicos e estruturais, e consequentemente nas caractersticas dos antignios teciduais. Por conseguinte, pode dizer-se que, apesar de ser um passo indispensvel na tcnica histolgica, a fixao afeta diretamente a imunohistoqumica, podendo mascarar alguns
antignios e impedir o seu reconhecimento pelo anticorpo3.
O formaldedo pode reagir com um eptopo antignico mascarando-o diretamente
ou pode tambm reagir com os aminocidos envolventes do eptopo alterando a
sua forma e mascarando-o indiretamente42- Figura 85.
Figura 85 Alterao estrutural em protenas fixadas por formaldedo.

Fonte: http://www.nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/94
79
IMUNOHISTOQUMICA
Estudando uma outra via, Shi e seus colaboradores sustentam a hiptese de que a
sensibilidade de alguns eptopos no devida somente ao efeito direto do aldedo
mas sim ligao de outros elementos ao eptopo, como, por exemplo, ies metlicos de que exemplo habitual o clcio - Ca2+ 75.
Apesar de tudo, estas alteraes podem, em boa medida, ser revertidas atravs do
aquecimento dos cortes histolgicos a alta temperatura em solues especficas.
Este procedimento denomina-se recuperao antignica (antigen retrieval)76. Segundo Werner, Von Wasielewski e Komminoth4.
The pretreatment of parafin sections from formalin-fixed tissues by heat
in the presence of appropriate buffers resulted in retrieval of antigens
that were previously either undetectable or only weakly visualizable.
Apesar de causar efeitos adversos, o formaldedo continua a ser o fixador mais utilizado em histopatologia por fornecer uma boa preservao morfolgica e ser menos dispendioso que outros fixadores alternativos60. Acresce ainda que, devido ao
longo historial do uso deste qumico, foi com recurso aos tecidos por si fixados que
foi estabelecida a maior parte dos critrios em uso para diagnstico, prognstico e
indicao teraputica60.
Em ltima anlise importa ainda referir que, apesar dos eptopos ocultados pelo
formaldedo poderem ser recuperados atravs de mtodos diversos, o sistema de
amplificao de imunohistoqumica dever sempre ser sensvel e especfico o suficiente para dar um sinal forte e inequvoco5.
Os efeitos negativos causados pelo formol podem ser minimizados com a aplicao
das condies ideais de fixao, pois a capacidade de afectar os antignios no depende somente do fixador utilizado mas tambm das condies da fixao, como o
tempo de espera entre colheita de material e fixao, pH, temperatura, tamanho
dos fragmentos a fixar (o ideal seria 10*10*3 mm), durao da fixao, entre outros42.
8.2
Processamento histolgico
Se o fragmento estiver corretamente fixado, um processamento histolgico consistindo em desidratao, diafanizao e impregnao de parmetros normais no
ter grande impacto na qualidade antignica dos tecidos. No entanto, podem surgir
80
IMUNOHISTOQUMICA
alteraes ao nvel dos antignios, principalmente devido ao aquecimento do tecido na impregnao e incluso3.
Normalmente, os referidos passos do processamento histolgico so realizados
com recurso a um equipamento prprio, denominado processador de tecidos
(Figura 86).
Figura 86 Processador automtico de tecidos

Fonte: http://www.leicamicrosystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20PELORIS/Brochures/Leica_Peloris_Brochure_EN.pdf
8.3
Preparao de lminas
Quando sujeitas s lavagens da tcnica de imunohistoqumica e recuperao antignica,

os cortes podem descolar da lmina, perdendo-se assim trabalho e tempo, por vezes essencial ao doente77. Isto implica que, por regra, as lminas de vidro utilizadas em
imunohistoqumica so sujeitas a um tratamento prvio que permite um aumento

da fora de ligao com os cortes.
Tendo em conta que a carga eltrica dos tecidos maioritariamente negativa (ADN,
grupos fosfato, ies monovalentes, entre outros), ao fornecer s lminas uma carga
oposta (positiva) torna-se mais fcil o estabelecimento de ligaes entre o tecido e
a slica do vidro da lmina3. Este procedimento baseia diversas metodologias de
adesivao das lminas: histobond, superfrost plus, silanizao, entre outros.
8.3.1 Cromo-almen gel

Este mtodo fcil de aplicar e permite bons resultados. Tem a desvantagem de
fazer ponte entre o vidro e os corantes, levando a que as lminas no final da tc81
IMUNOHISTOQUMICA
nica fiquem, em toda a sua extenso, coradas da cor do corante de contraste. Uma
vez que utiliza substncias de origem orgnica, h tendncia para a formao de
contaminantes (fungos e bactrias) nas lminas preparadas e armazenadas.
8.3.2 Vectabond
Este mtodo permite bons resultados. Tem a desvantagem de utilizar reagentes txicos e
corrosivos.
8.3.3 Lminas com cargas electrostticas

Estas lminas so adquiridas j preparadas (ex. superfrost plus) e permitem excelentes
resultados. Apesar de serem relativamente dispendiosas so muito fceis de utilizar pois
so prontas a utilizar. Trata-se de um mtodo muito utilizado em laboratrios com um
grande volume de trabalho e poucos recursos humanos.
8.3.4 3-Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE)

Trata-se de um dos mtodos mais utilizados, e, apesar de utilizar reagentes txicos e corrosivos, permite obter lminas adesivadas de forma rpida, simples e pouco dispendiosa.
A tcnica para utilizao deste composto est em Apndice 2.
8.4 Microtomia
Os cortes para imunomarcao (Figura 83) devero ser o mais finos possvel (24m) e no devero possuir pregas ou estrias que facilitam o descolar nas lavagens
e recuperao antignica3. importante que estejam colocados numa posio central da lmina, que por sua vez deve ter esmerilados de boa qualidade para que no
se apaguem os nmeros de registo.
O corte no deve ser demasiado espesso, principalmente quando se utilizam aparelhos automticos com funes baseadas em capilaridade. Na altura do corte, se o
bloco histolgico a estudar j se encontrar desbastado no se deve proceder a um
novo desbaste, de forma a manter a mesma superfcie de corte obtida na HE (Hematoxilina-Eosina), de forma a estabelecer comparao entre os casos.
Aps o corte, as lminas permanecem o tempo necessrio na estufa para que o tecido adira lmina (por exemplo: de 20min a 80C).
82
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
9 RECUPERAO ANTIGNICA
No ano de 1974, Taylor, Hambridge e Burns defenderam a importncia da aplicao da imunohistoqumica a cortes de parafina, procedimento que no era feito at
ento, indicando que esse passo traria uma verdadeira revoluo na anatomia patolgica78. No entanto, o desejo destes autores esbarrou num obstculo: a maioria
dos antignios investigados so significativamente influenciados pela fixao em
formaldedo que provoca alteraes conformacionais dos eptopos45.
Para ultrapassar esse problema, aps alguns anos de investigao, estabeleceu-se
que alguns mtodos de tratamento dos tecidos podem levar reorganizao proteica e devolver quase toda a estrutura tridimensional da protena sua configurao nativa45. Surgiu assim o conceito de recuperao antignica76 ao demonstrarse que as alteraes conformacionais dos eptopos no eram irreversveis, como
era teoria at ento4, desde que as protenas mantenham a sua estrutura primria
fornecida pelo conjunto de aminocidos43.
A introduo de mtodos de recuperao antignica, que comeou com a aplicao
da digesto proteoltica dos cortes histolgicos, foi um dos principais avanos que
permitiram o desenvolvimento da imunohistoqumica, pois at ao seu aparecimento somente uma pequena percentagem de antignios podia efetivamente ser detetada. A posterior utilizao da recuperao antignica por alta temperatura facultou um avano determinante pois permitiu um aumento drstico de substncias
detetveis nos tecidos ou clulas e possibilitou a consolidao das metodologias
imunohistoqumicas tanto ao nvel do diagnstico, como do prognstico, como da
indicao teraputica.
9.1 Consequncias da fixao

As alteraes decorrentes da fixao podem ser de tal maneira extensas que levam
ao no reconhecimento do antignio fixado por parte do seu anticorpo especfico.
As consequncias da fixao dependem de:
A. Concentrao de formaldedo;
B. pH;
C. Temperatura C;
83
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
D. Durao da fixao.
No final da fixao e processamento histolgico podem existir trs tipos de situaes:
A. Pode ser possvel detetar diversos antignios teciduais mesmo aps fixao
e consequente alterao proteica, no sendo necessrio recorrer a processos de recuperao antignica;
B. Alguns antignios tm o seu nmero diminudo nos tecidos aps fixao,
sendo de todo o interesse recorrer a processos de recuperao antignica,
de forma a aumentar a sensibilidade da tcnica (evitando eventuais falsos
negativos);
C. Outros antignios ficam completamente obstrudos pela fixao sendo imperioso recorrer a processos de recuperao antignica (evitando de certeza falsos negativos).
9.2 Digesto enzimtica proteoltica

Em 1975, Huang (1) refere que a utilizao da digesto enzimtica, com enzimas
proteolticas, nos cortes de parafina, permite evidenciar antignios mascarados
pela fixao. Estas enzimas digerem as protenas envolventes do eptopo, expondo
assim antignios que estavam obstrudos ou mascarados pelas alteraes estruturais decorrentes da fixao e tornando possvel o seu reconhecimento pelo anticorpo79. No entanto, este tratamento enzimtico nem sempre eficaz: muitas vezes
no consegue recuperar os eptopos em estudo ou os eptopos so, eles prprios,
digeridos pelas proteases, conduzindo deste modo a resultados falsos negativos 12,
devendo o processo de digesto enzimtica ser controlado de forma extremamente
rigorosa.
Podem ser utilizadas vrias enzimas proteolticas como: pronase, tripsina, proteinase K ou pepsina. Para a digesto enzimtica em banho-maria a temperatura ideal
ronda os 37C, que a temperatura ptima de actuao da maior parte das enzimas utilizadas.
84
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
9.3 Recuperao antignica de origem trmica por alta temperatura

A recuperao antignica por alta temperatura consiste no aquecimento a alta
temperatura de cortes histolgicos de modo a recuperar a antigenicidade obstruda pela fixao em formaldedo80.
Na dcada de 40, Fraenkel-Conrat e seus colaboradores81 realizaram diversos estudos bioqumicos sobre as interaes entre o formaldedo e as protenas, demonstrando que as ligaes induzidas podiam ser destrudas por aquecimento a altas
temperaturas ou por tratamento em solues alcalinas fortes. Muito posteriormente, em 1991, estudos efetuados por Shi e colaboradores permitiram um grande
avano nas investigaes sobre a recuperao antignica ao descobrirem que o
processamento das lminas de imunohistoqumica a alta temperatura quando
mergulhadas em solues especficas um fator muito importante e eficaz nesta
tcnica. Estes investigadores demonstraram76:
A dramatic enhancing effect of this treatment on the recovery of many
antigens, which is particularly intriguing in view of the presumed deleterious effects of high temperatures on protein antigens.
Apesar de se saber que as protenas desnaturam entre os 70C e os 90C, verificase que nos tecidos fixados, elas resistem desnaturao a estas temperaturas 82.
Muitos outros investigadores puderam comprovar esta descoberta, nomeadamente, Kawai e colaboradores83 que concluram que a recuperao antignica a 90C
durante 10 minutos mais eficaz do que a 60C durante 120 minutos. Em 1993,
Cattoretti e colaboradores84, confirmam a eficcia desta tcnica e propem alternativas soluo de recuperao antignica de metais pesados, utilizada at ento. A
partir dessa altura, a soluo de tampo citrato 0,01M a pH 6.0 passou a ser a soluo de recuperao antignica mais utilizada. No entanto, posteriormente, verificou-se que no existe uma nica que se adeqe de forma universal a todos os tipos
de antignios3. Assim, devem-se testar os vrios anticorpos, at serem encontradas
as condies ideais de recuperao antignica.
Outro fator muito importante o pH das solues utilizadas. De acordo com Shi e
colaboradores85:
85
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
in addition to high-temperature heating, the pH of the Antigen Retrieval solution influences the degree of unmasking of epitopes.
Alguns investigadores chegam mesmo a afirmar que o valor do pH de uma soluo
de recuperao antignica mais importante do que a composio qumica da
mesma, principalmente para antignios nucleares e de membrana celular85.
A existncia de agentes quelantes (promovem a extrao dos ies clcio do tecido)
tambm afeta de algum modo a recuperao antignica86,87, surgindo antignios
com preferncia por determinados agentes quelantes, normalmente o cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA) entre outros - Figura 87.
Figura 87 Reao entre Ca2+ e EDTA

Fonte: http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/catalysis/olmethodscat.html
De um modo geral, as solues de recuperao antignica mais difundidas atualmente so:

A. Tampo EDTA 1mM pH 8.0;
B. Tampo citrato pH 6.0;
C. Tampo Tris-EDTA pH 9.0.
Como forma de obteno de alta temperatura foram testados vrios mtodos, tais
como: forno de micro-ondas76, autoclave8891, panela de presso92,93, banho de gua
quente83 e vapor quente94,95. Destes, os mais utilizados atualmente, so o microondas e a panela de presso, sendo ambos bastante semelhantes e eficazes. Se por
um lado a panela de presso exige um maior consumo de soluo tampo relativamente ao micro-ondas, por outro lado, o micro-ondas obriga a uma maior dura86
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
o do processamento. Para a recuperao trmica em forno micro-ondas utilizada frequentemente uma potncia de 750W durante 15/20 minutos e para a panela de presso o processamento normalmente dura 3/4 minutos presso mxima. Em qualquer destes procedimentos a morfologia geral do tecido no , regra
geral, particularmente afetada.
O sucesso da recuperao antignica demonstrou que a modificao da estrutura
proteica induzida pelo formol um processo reversvel sobre certas condies e
desde que as protenas mantenham a sua estrutura primria fornecida pelo conjunto de aminocidos43.
A introduo de mtodos de recuperao antignica foi, sem dvida, um dos principais avanos que permitiram o desenvolvimento da Imunohistoqumica at ao
modo que hoje conhecemos, pois at ao seu aparecimento somente uma pequena
percentagem de antignios podia efectivamente ser detectada. Com o aumento de
substncias detectveis nos tecidos ou clulas aumentou a procura da Imunohistoqumica tanto ao nvel do diagnstico, como do prognstico, como da indicao
teraputica.
87
IMUNOHISTOQUMICA
RECUPERAO ANTIGNICA
88
IMUNOHISTOQUMICA
INIBIO DE PARTCULAS ENDGENAS
10 INIBIO DE PARTCULAS ENDGENAS

10.1 Peroxidase Endgena
Existe principalmente em tecidos com glbulos vermelhos, mas tambm ao nvel
do Bao, Rins, Fgado, Medula ssea e em reas de necrose. bloqueada por um
excesso de substrato ( H2O2) que leva saturao da actividade enzimtica. Para a
inibio efectiva da peroxidase endgena pode ser utilizada uma soluo de H2O2 a
1.5% - 3% em gua destilada imediatamente aps a desparafinao/hidratao ou
noutro momento considerado adequado.
10.2 Fosfatase Alcalina

Existe em pequena quantidade no rim, fgado e osso. O bloqueio feito por adio
de levamisole a 5mM soluo de revelao. As fosfatases alcalinas do intestino
no podem ser inibidas desta forma.
10.3 Glucose Oxidase

No existe nos mamferos.
10.4 Pontos susceptveis de atrair protenas

Podem ser pontos hidrofbicos, electrostticos ou outros. Estas estruturas teciduais podem existir em qualquer rgo ou tecido e podero provocar o aparecimento
de colorao de fundo ou de marcao inespecfica. Devero ser anulados ou inibidos utilizando vrias tcnicas como:
A. Utilizao de soro normal no imune de uma espcie animal diferente da
utilizada para produzir o anticorpo primrio, aplicado imediatamente antes
do soro primrio;
B. Utilizao de PBS ou TBS de lavagem e de diluio de soros com um detergente (ex. triton X100; tween 20);
C. Utilizao de PBS ou TBS de diluio de soros com albumina srica bovina
(BSA) a 0.05%.
10.5 Causas de marcao inespecfica

A. Interaces hidrofbicas.
89
IMUNOHISTOQUMICA
INIBIO DE PARTCULAS ENDGENAS
B. Interaces inicas.
C. Actividade enzimtica endgena.
D. Anticorpos naturais.
E. Anticorpos contaminantes.
F. Difuso antignica.
G. Reaces cruzadas.
H. Receptores Fc.
I. Outros:
a. Tecidos necrosado
b. Fixao deficiente
c. M desparafinao
90
IMUNOHISTOQUMICA
CONTROLO DE QUALIDADE
11 CONTROLO DE QUALIDADE
O controlo de qualidade da tcnica da responsabilidade do Profissional Tcnico
de Anatomia Patolgica que a executou e surge como um dos passos mais importantes do seu desempenho, pois implica conhecimentos profundos e capacidade
crtica rigorosa.
Todas as lminas que saem de um laboratrio de imunohistoqumica tm que ser
avaliadas pelo Tcnico responsvel e ponderada a sua qualidade, tirando da as
consequentes ilaes, tendo como objectivo mximo a melhoria permanente da
qualidade do produto final do seu trabalho.
Tipos de controlo de qualidade:
A. Controlo de procedimentos
a. Substituio de reagentes
B. Controle tecidual
a. externo
i. Positivo
ii. Negativo
b. Interno
i. Positivo
ii. Negativo
11.1 Avaliao da qualidade da imunohistoqumica

De forma a permitir a interpretao e avaliao de lminas de Imunohistoqumica,
importante possuir uma escala de avaliao que quantifica os parmetros preservao da morfologia do tecido, sensibilidade e especificidade.
Se num estudo cientfico for usado um procedimento de recolha de dados no reprodutvel, ao repetir o mesmo estudo, nas mesmas circunstncias podem-se obter
diferentes resultados e concluses. fundamental ter garantias de reprodutibilidade, por um lado, optando pelo envolvimento de observadores experientes, que
podem aumentar a consistncia dos dados, especialmente na concordncia interobservador, e, por outro lado, utilizando um instrumento que normalize a recolha
91
IMUNOHISTOQUMICA
de dados, pois a falta de normas simples e objetivas podem tambm ser uma causa
da falta de reprodutibilidade de um procedimento.
Apesar de j existirem alguns programas informticos que permitem avaliar a qualidade da imunomarcao por anlise de imagem, o seu preo elevado e a sua irregular sensibilidade e reprodutibilidade implicam uma baixa implantao, pelo que
a quantificao automatizada da marcao imunohistoqumica ainda constitui um
problema de estandardizao por resolver96.
Segundo Barnes e seus colaboradores, na avaliao da qualidade dos resultados da
tcnica imunohistoqumicas importante que, entre os mtodos rigorosamente
construdos, se selecione um que seja easy, quick and reproducible97, enquanto
para o International Concensus Group on Standardization and Quality Control in
Immunohistochemistry importa que exista uma garantia de validao relativamente
a interpretao uniforme do mtodo imunohistoqumico98,99.
Estas diretrizes fundamentaram a escolha do mtodo de avaliao da imunomarcao utilizado neste trabalho, tendo-se optado por uma metodologia simples,
objetiva e operacionalizada baseada em Leake100 e defendida por vrios grupos de
trabalho, nomeadamente o UK Receptor Group, o UK National External Quality Assessment Scheme for Immunocytochemistry, o Scottish Breast Cancer Pathology
Group e o Receptor and Biomarker Study Group of the European Organization for
Research and Treatment of Cancer. Trata-se de um mtodo de avaliao que surge
na continuidade dos estudos de Allred e colaboradores98 e Harvey e colaboradores101, procurando por oferecer elevada consistncia na reprodutibilidade intra e
inter-observadores (Figura 88).
Figura 88 Conceptualizao da metodologia de recolha de dados
92
IMUNOHISTOQUMICA
Com base nesta conceptualizao e de forma a permitir a interpretao e avaliao

da imunomarcao, torna-se importante possuir uma escala de avaliao que
quantifique os parmetros sensibilidade e especificidade.
11.1.1 Preservao da morfologia do tecido

fundamental que uma metodologia imunohistoqumica garanta a estabilidade do
substrato onde aplicada, independentemente de este ser fresco ou de se apresentar fixado, ou ento de se constituir em base citolgica ou base histolgica. A operacionalizao ser directa criando-se uma escala ordinal que corresponde a uma
hierarquia iniciada na opo ausncia total de preservao morfolgica do tecido
que corresponde pior situao possvel, e terminando na opo preservao
perfeita da morfologia do tecido que corresponde melhor situao possvel (ver
Tabela 12).
11.1.2 Sensibilidade
A sensibilidade definida como a capacidade de reconhecer os verdadeiros positivos102. Partindo deste princpio poderemos operacionalizar este parmetro analisando e classificando a intensidade da marcao especfica e a quantidade relativa
de estruturas marcadas.
Assim, quanto mais forte for a intensidade e quanto maior for a quantidade de estruturas marcadas relativamente s estruturas elegveis (verdadeiros positivos)
tanto melhor a qualidade da imunomarcao.
11.1.3 Especificidade
Genericamente pode-se afirmar que a especificidade a capacidade de reconhecer
os verdadeiros negativos102. Em imunohistoqumica, a especificidade de um anticorpo permite-lhe reconhecer e estabelecer ligaes com antignios individualizados e especficos. Partindo deste princpio pode-se inferir, em oposio, que a
inespecificidade a capacidade de um anticorpo estabelecer ligaes com estruturas que no estiveram na sua gnese. Aplicando estes conceitos marcao imunohistoqumica podemos caracterizar como inespecfica a presena de marcao
em clulas ou em estruturas extra-celulares que no deveriam estar marcadas,
uma vez que o anticorpo no dirigido contra elas. Assim, quanto maior for a
93
IMUNOHISTOQUMICA
quantidade de estruturas marcadas relativamente s estruturas no elegveis

(verdadeiros negativos) tanto pior a qualidade da imunomarcao.
A marcao inespecfica pode surgir por diversos motivos, como por exemplo reaes cruzadas entre anticorpos ou baixa afinidade entre anticorpo e antignio. Comummente feita a distino entre marcao inespecfica propriamente dita e
marcao de fundo. A principal diferena entre estas duas dada pela forma de
apresentao: enquanto a marcao inespecfica propriamente dita eletiva para
as estruturas intra ou extra-celulares marcando-as de forma semelhante marcao especfica, a marcao de fundo no eletiva dispersando-se de forma irregular pelas estruturas celulares. No entanto, para efeitos desta escala de avaliao
no foi considerada relevante esta distino pois uma marcao imunohistoqumica de baixa qualidade quando apresenta marcao inespecfica, independentemente do seu subtipo.
11.1.4 Contraste
Finalmente, foi tambm avaliado o contraste utilizado, tendo em conta que a sua
qualidade pode incrementar ou diminuir a intensidade e eletividade da imunomarcao, tendo algum impacto na sua qualidade final.
11.1.5 Operacionalizao do instrumento de recolha de dados

Quantificou-se a qualidade da marcao imunohistoqumica constituindo como
metodologia de recolha de dados a observao microscpica com recurso a uma
grelha de avaliao que permite atribuir uma pontuao aos parmetros: intensidade de imunomarcao, imunomarcao especfica, Imunomarcao no especfica e intensidade da colorao de contraste - Figura 89.
94
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 89 Operacionalizao da metodologia de recolha de dados
11.1.5.1 Preservao da morfologia do tecido

A preservao da morfologia do tecido permite avaliar a capacidade de agresso
tecidular dos mtodos utilizados. Este item obter expresso prtica submetendoo a hierarquizao numa escala ordinal que se inicia em ausncia de preservao
morfolgica que invalida a avaliao, que corresponde pior situao possvel,
passa por ausncia de preservao morfolgica que no invalida a avaliao, e termina em preservao perfeita da morfologia que corresponde melhor situao
possvel.
Aps a visualizao ao microscpio da totalidade do tecido em estudo classificada a intensidade de marcao de acordo com uma escala de cinco nveis associados
aos valores 0 a 4 - Tabela 8.
Tabela 7 - Classificao da preservao da morfologia
Valor
0
2
4
Caractersticas
Ausncia de preservao morfolgica que invalida a avaliao
--Ausncia de preservao morfolgica que no invalida a avaliao
--Preservao da morfologia
95
Operacionalizao
Alteraes visveis em baixa ampliao 40x
--Alteraes visveis somente em grande ampliao 100x
--Sem alteraes visveis
IMUNOHISTOQUMICA
11.1.5.2 Intensidade de imunomarcao

A intensidade de marcao permite apreciar a capacidade amplificativa dos mtodos de amplificao utilizados. Este item obter expresso prtica submetendo-o a
hierarquizao numa escala ordinal que se inicia em marcao nula que corresponde pior situao possvel e terminando em marcao muito forte intensidade
que corresponde melhor situao possvel.
Aps a visualizao ao microscpio da totalidade do tecido em estudo classificada a intensidade de marcao de acordo com uma escala de cinco nveis associados
Tabela 8 - Classificao da intensidade de imunomarcao
Valor
0
1
2
3
4
Caractersticas
Marcao nula
Marcao de fraca intensidade
Marcao de moderada intensidade
Marcao de forte intensidade
Marcao de muito forte intensidade
Operacionalizao
--Visvel somente em muito grande ampliao 400x
Visvel somente em grande ampliao 100x
Visvel em baixa ampliao - 40x
Nitidamente visvel em baixa ampliao 40x
11.1.5.3 Proporo de imunomarcao especfica

A proporo de imunomarcao especfica permite examinar o rcio entre estruturas marcveis e estruturas marcadas. Este item obter expresso prtica submetendo-o a hierarquizao numa escala ordinal que se inicia em 0% de marcao do
alvo que corresponde pior situao possvel e terminando em marcao em 90 a
100% do alvo que corresponde melhor situao possvel. Aps a visualizao ao
microscpio da totalidade do tecido em estudo classificada a proporo de estruturas verdadeiras-positivas de acordo com uma escala de quatro nveis associados
Tabela 9 - Classificao da imunomarcao especfica
Valor
0
1
2
3
4
Caractersticas
0% de marcao do alvo
Marcao de 1 a 10% do alvo
Marcao em 11 a 49% do alvo
Operacionalizao
--Estimativa de marcao de 1 em 10 estruturas alvo
Estimativa de marcao de at 4 em 10 estruturas alvo
11.1.5.4 Proporo de imunomarcao inespecfica

A proporo de imunomarcao inespecfica permite examinar o rcio entre estruturas "no marcveis" e estruturas marcadas. Este item obter expresso prtica
submetendo-o a hierarquizao numa escala ordinal que se inicia em marcao de
estruturas no-alvo que invalida a avaliao que corresponde pior situao poss96
IMUNOHISTOQUMICA
vel, passa por marcao de estruturas no-alvo que no invalida a avaliao e termina em Ausncia de marcao de estruturas no-alvo que corresponde melhor
situao possvel.
Aps visualizao microscpica da totalidade do tecido em estudo, classificada a
proporo de estruturas falsas-positivas de acordo com uma escala de cinco nveis
associados aos valores 0 a 4 - Tabela 10.
Tabela 10 - Classificao da imunomarcao inespecfica
Valor
0
2
4
Caractersticas
Marcao de estruturas no-alvo que invalida a avaliao
--Marcao de estruturas no-alvo que no invalida a avaliao
--Ausncia de marcao de estruturas no-alvo
Operacionalizao
Estimativa de marcao de 3 em 3 estruturas no-alvo
--Estimativa de marcao de at 1 em 3 estruturas no-alvo
--Estimativa de marcao de 0 em 3 estruturas no-alvo
11.1.5.5 Intensidade de colorao de contraste

A intensidade de colorao de contraste possibilita a apreciao da qualidade do
contraste utilizado. Este item obter expresso prtica submetendo-o a hierarquizao numa escala ordinal que se inicia em ausncia de colorao que corresponde
pior situao possvel e terminando em colorao de muito forte intensidade que
corresponde melhor situao possvel.
Aps a visualizao ao microscpio da totalidade do tecido em estudo classificada a intensidade da colorao de contraste de acordo com uma escala de cinco nveis associados aos valores 0 a 4 - Tabela 11.
Tabela 11 - Classificao da intensidade de colorao de contraste
Valor
0
1
2
3
4
Caractersticas
Ausncia de colorao
Colorao de fraca intensidade
Colorao de moderada intensidade
Colorao de forte intensidade
Colorao de muito forte intensidade
Operacionalizao
--Visvel somente em muito grande ampliao 400x
Visvel somente em grande ampliao 100x
Visvel em baixa ampliao - 40x
Nitidamente visvel em baixa ampliao 40x
11.1.6 Score final

Foi possvel assim construir uma grelha final coligindo todos os itens anteriormente referidos (Tabela 12).
Tabela 12 Grelha de avaliao de qualidade da imunohistoqumica
97
IMUNOHISTOQUMICA
Sensibilidade
Pontos
Especificidade
Preservao da
Intensidade da
Quantidade relativa
Marcao
morfologia tecidu-
marcao espec-
de estruturas mar-
inespecfi-
al
fica
cadas
ca/fundo
vao morfolgica
Intensidade de
0% de estruturas
estruturas no-
Ausncia de
que invalida a avali-
marcao nula
marcadas
alvo que invalida a
colorao
Ausncia de preser0
Marcao de
ao
1
Ausncia de preser2
vao morfolgica
que no invalida a
avaliao
Preservao perfeita
da morfologia
Contraste
avaliao
Intensidade de
1 a 10% de estruturas
marcao fraca
marcadas
Colorao de
fraca intensidade
Marcao de
Intensidade de
marcao moderada
11 a 49% de estruturas marcadas
estruturas no-
Colorao de
alvo que no
moderada inten-
invalida a avalia-
sidade
o
Intensidade de
50 a 89% de estrutu-
marcao forte
ras marcadas
Intensidade de
marcao muito
forte
90 a 100% de estruturas marcadas
Colorao de forte
intensidade
Ausncia de mar-
Colorao de
cao de estrutu-
muito forte inten-
ras no-alvo
sidade
Para permitir uma constatao mais imediata e percetvel da qualidade da imunohistoqumica, uma comparabilidade entre estudos e um tratamento estatstico
mais aprofundado, foi criado o Score Global de qualidade da imunohistoqumica.
Este dado quantitativo resulta da aplicao de um algoritmo sobre os itens referidos anteriormente.
11.1.6.1 Factores de ponderao
Numa tentativa de valorizar os itens que mais contribuem para a qualidade final da
marcao imunohistoqumica foram introduzidos fatores de ponderao. O item
considerado mais relevante foi intensidade de imunomarcao pelo que lhe foi
atribudo o fator de ponderao 3. Em seguida foi considerado o item imunomarcao especfica com o fator de ponderao 2. Finalmente surgem os parmetros
preservao da morfologia do tecido, imunomarcao no especfica e intensidade da colorao de contraste com o fator de ponderao 1 (Tabela 13).
98
IMUNOHISTOQUMICA
Sensibilidade
Especificidade
Preservao da
Intensidade da
Quantidade rela-
morfologia do
marcao espe-
tiva de estruturas
tecido
cfica
marcadas
Factor de
ponderao
Marcao inespecfica/fundo
Contraste
Tabela 13 Fatores de ponderao do score final da qualidade da imunohistoqumica.
Desta forma procura-se garantir que ao maior score equivale a melhor qualidade
de marcao imunohistoqumica. O score final pode tomar valores entre 0 (pior
resultado possvel, em que no h intensidade de marcao imunohistoqumica,
no h marcao especfica, no h contraste nem preservao tecidular, havendo
somente forte marcao inespecfica) e 36 (melhor resultado possvel, implicando
uma lmina com todas as clulas marcadas especificamente com muita intensidade, um contraste tambm muito intenso e sem marcao inespecfica, nem destruio tecidular). Para facilitar a interpretao, o score final poder ser multiplicado
pelo fator 2,77 para se obter valores finais na escala 0-100 ponto, normalmente
mais intuitiva.
99
IMUNOHISTOQUMICA
100
IMUNOHISTOQUMICA
AUTOMATIZAO
12 AUTOMATIZAO
BREVEMENTE
101
IMUNOHISTOQUMICA
AUTOMATIZAO
102
IMUNOHISTOQUMICA
IMUNOHISTOQUMICA NO DIAGNSTICO
13 IMUNOHISTOQUMICA NO DIAGNSTICO
As tcnicas de Imunohistoqumica so uma ferramenta poderosa ao dispor do diagnstico anatomo-patolgico e da investigao. No obstante, a imunohistoqumica um meio de pensar o diagnstico e frequentemente serve de complemento a
um raciocnio diagnstico, no o substituindo. O prognstico e a indicao teraputica so muito condicionados pelo recurso a estas tcnicas, demonstrando aqui o
Tcnico de Anatomia Patolgica toda a sua responsabilidade e relevncia para a
melhoria da quantidade e qualidade de vida do doente.
De um modo geral, j so conhecidos e estudados os diferentes antignios que podem ser expressados pelos diferentes tipos de patologias, sendo necessrio, muitas
vezes, detectar a sua existncia para confirmar a patologia correspondente. Noutras situaes recorre-se a tcnicas imunohistoqumicas no para confirmar uma
suspeita proveniente do aspecto morfolgico da patologia, mas sim como ferramenta de primeira linha pois o aspecto morfologico no indica caminhos definitivos. Aqui recorrem-se a algoritmos diagnsticos (Figura 90 e Figura 91), surgindo
a imunohistoqumica como a principal determinante da resposta final.
103
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 90 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados.
104
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 91 - Algoritmo utilizado para situaes linfoproliferativas.
105
IMUNOHISTOQUMICA
13.1 Principais antignios detectados por imunohistoqumica
Figura 92 - Receptores de Estrognio
Figura 93 - Receptores de progesterona
Figura 94 - Protena p53
Figura 95 - HER-2
106
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 96 - Bcl-2
Figura 97 - CD3
Figura 98 - CD15
Figura 99 - CD20
107
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 100 - CD30
Figura 101 - CD34
Figura 102 - CD45
Figura 103 - Ki67
108
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 104 - melanoma HMB45
Figura 105 - CL Kappa
Figura 106 - CL lambda
Figura 107 - vimentina
109
IMUNOHISTOQUMICA
Figura 108 - CK 7
Figura 109 - PAN CK clones -AE1\AE3
Figura 110 - protena S100
Figura 111 - actina do msculo liso
110
IMUNOHISTOQUMICA
MARCAO MLTIPLA
14 MARCAO MLTIPLA
A mltipla marcao consiste na aplicao de mais de um anticorpo primrio num corte
durante a tcnica imunohistoqumica e consequente identificao dos correspondentes
antignios. Cada ligao anticorpo-antigAg ir apresentar uma diferente cor que pode ser
separadamente identificada. Existem duas formas distintas de aplicar marcao mltipla:
mtodo simultneo ou mtodo sequencial (Kropf, 2006).
14.1 Mtodo simultneo

Nesta metodologia de mltipla marcao os anticorpos primrios so todos colocados em
simultneo na lmina, assim como os anticorpos secundrios e assim sucessivamente.
necessrio que seja feita uma planificao adequada para que no surjam interaces indesejadas entre os reagentes utilizados que podem comprometer a especificidade e sensibilidade da marcao imunohistoqumica.
Vantagens:
Rpida.
Desvantagens:
Planificao complicada.
Exigncia de reagentes altamente especficos.
14.2 Mtodo sequencial com desnaturao intercalar

Este mtodo implica a realizao de uma tcnica Imunohistoqumica completa, incluindo
revelao, seguida de uma desnaturao e posteriormente de nova tcnica imunohistoqumica, e assim sucessivamente (Figura 112, Figura 113, Figura 114, Figura 115).
A desnaturao tem a funo de eliminar todos os reagentes colocados no tecido pela tcnica anterior, de forma deixar o tecido limpo para os novos anticorpos. Pode ser realizada
com solues de baixo pH ou por alta temperatura.
Vantagens:
Planificao mais simples.
No exige reagentes altamente especficos.
Desvantagens:
Mais demorada e trabalhosa.
111
IMUNOHISTOQUMICA
MARCAO MLTIPLA
Figura 112 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gnglio linftico.
Figura 113 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em bao.
Figura 114 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pncreas.
Figura 115 CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileocecal.
112
IMUNOHISTOQUMICA
CONCLUSO
15 CONCLUSO
Este Manual procura facultar aos Estudante e interessados em Imunohistoqumica
uma informao actual e aplicada em lngua portuguesa. Na sua gnese esteve
principalmente a experincia profissional do autor e uma reviso bibliogrfica que
se procurou que fosse adequada. No entanto, muito ficou ainda por dizer e fundamentar, pelo que novas revises surgiro, dando lugar a novos Manuais, que procuraro ser mais ajustados ao estado-da-arte em vigor.
113
IMUNOHISTOQUMICA
CONCLUSO
114
IMUNOHISTOQUMICA
APNDICES
16 APNDICES
16.1 Apndice 1 - Adesivao de lminas - APES
1. Colocar as lminas em acetona - 5 minutos.
2. Secar as lminas ao ar.
3. Preparar soluo APES 2% em acetona.
4. Colocar as lminas em soluo de APES 2% - 30 minutos.
5. Colocar as lminas em gua corrente 10 minutos.
6. Passagem por gua destilada.
7. Deixar secar overnight, temperatura ambiente ou a 37C.
Notas:
a. APES - 3-AMINOPROPIL-TRIETOXISILANO (Sigma - 440140-500).
b. A soluo de APES pode ser guardada no frigorfico para nova utilizao.
c. Estas lminas no possuem prazo de validade.
16.2 Apndice 2 - Tampo EDTA 1 mM pH 8.0

Preparao da Soluo Stock 100x concentrada.
1. Juntar 29,2 g de EDTA a 1000 cm3 de gua Destilada.
2. Ajustar o pH com NaOH 0.1M para ajudar a dissoluo.
Notas:
a. A soluo stock deve se diluda a 1/100 antes da utilizao e ajustar o pH
com NaOH 0.1M.
b. Mergulhar as lminas em 400 ml de soluo tampo e colocar no forno microondas durante 15 minutos potncia de 900 w (nunca deixar secar as
lminas).
c. Aps recuperao, arrefecer gradualmente as lminas em gua corrente.
16.3 Apndice 3 - Tampo citrato, pH 6.0

Para 5000 cm3 de soluo:
1. Juntar 10.5g de cido Ctrico a 5000 cm3 de gua destilada.
2. Acertar o pH a 6.0 com NaOH 2M (aproximadamente 60 cm3).
3. Adicionar 2,5 cm3 de tween 20 e homogeneizar.
115
IMUNOHISTOQUMICA
APNDICES
16.4 Apndice 4 - Tampo Tris/EDTA, pH9.0

Para 1000 cm3 de soluo:
1. Juntar 1000 cm3 de gua destilada a 1,21 g de Tris Base e a 0,37 g de EDTA.
2. Verificar o pH e se necessrio corrigir para pH 9, com NaOH 2M.
3. Adicionar 0,5 cm3 de tween 20 e homogeneizar.
16.5 Apndice 5 - Soluo de pepsina 0,4% pH 1/2

1. Dissolver 0,4 g de pepsina em 100 cm3 de gua destilada.
2. Adicionar 1 cm3 de cido Clordrico
3. Acertar o pH entre 1 e 2 a 37C.
Notas:
a. a soluo de pepsina conservada no congelador e pode ser reutilizada at
quatro vezes.
b. Cada reutilizao exige o acerto de pH.
c. Evitar diluir a soluo em cada reutilizao.
16.6 Apndice 6 - Soluo de bloqueio da Peroxidase Endgena

1. Medir 100 cm3 de gua destilada.
2. Adicionar 3 cm3 de Perxido de Hidrognio 30% e homogeneizar.
16.7 Apndice 7 Protocolo de Tcnica Imunohistoqumica LSAB

1. Desparafinar em xilol - 15 min.
2. Passagem em lcool 100%.
3. Inibio da Peroxidase endgena em soluo de bloqueio - 10 min.
4. Passagem por gua corrente.
5. Recuperao antignica.
6. Lavagem em PBS e colocao de meio hidrfobo em volta do corte.
7. Colocao em soro primrio - 30 min.
8. Lavagem em PBS - 2 x 5 min.
9. Colocao em soro secundrio biotinilado - 30 min.
11. Colocao em soro tercirio- streptavidina conjugada com peroxidase - 30
min.
116
IMUNOHISTOQUMICA
APNDICES

13. Revelao com soluo de DAB - 5 min.
14. Lavagem em gua corrente.
15. Contrastar com hematoxilina de Mayer.
16. Desidratar, clarificar e montar.
16.8 Apndice 8 Protocolo de Tcnica Imunohistoqumica de Polmero Indirecto

1. Desparafinar em xilol - 15 min.
2. Passagem em lcool 100%.
3. Inibio da Peroxidase endgena em soluo de bloqueio - 10 min.
4. Passagem por gua corrente.
5. Recuperao antignica.
6. Lavagem em PBS e colocao de meio hidrfobo em volta do corte.
7. Colocao em soro primrio - 30 min.
9. Colocao do Soro polmero indirecto - 30 min.
11. Revelao com soluo de DAB - 5 min.
12. Lavagem em gua corrente.
13. Contrastar com hematoxilina de Mayer.
14. Desidratar, clarificar e montar.
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Licenciatura em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica

AMADEU BORGES FERRO

o Bacharel em Anatomia Patolgica, Citolgica e Tanatolgica pela Escola Superior de

Imunohistoqumica e Imunocitoqumica ............................................................................ 1

Definio geral ............................................................................................................................... 2

Enquadramento histrico ......................................................................................................... 3

Principais aplicaes ................................................................................................................... 6

Pr-requisitos para Imunohistoqumica ............................................................................. 7

2 ANTIGNIO E ANTICORPO ........................................................................................................ 9

2.3.1 Especificidade e afinidade de um anticorpo .............................................................. 10

Cadeias leves ............................................................................................................................... 14

Cadeias pesadas ......................................................................................................................... 14

2.6.1 Cadeia pesada Alfa................................................................................................................ 14

Foras de ligao entre antignio e anticorpo ............................................................... 16

2.7.1 Ligao eletrosttica ou inica ........................................................................................ 16

Soros Policlonais ........................................................................................................................ 21

3.1.1 Etapas da produo de Soros Policlonais .................................................................... 21

Soros Monoclonais .................................................................................................................... 24

3.2.1 Produo de Soros Monoclonais ..................................................................................... 25

Soros Monoclonais versus Soros Policlonais .................................................................. 29

Armazenamento e conservao ........................................................................................... 31

3.6.1 Frascos contentores............................................................................................................. 31

Mtodos de Imunofluorescncia ......................................................................................... 33

4.1.1 Fluorocromos ......................................................................................................................... 34

Enzimologia Bsica ................................................................................................................... 39

5.1.1 Papel Catalisador .................................................................................................................. 40

5.2.1 Horseradish Peroxidase HRP........................................................................................ 44

Mtodo Direto ............................................................................................................................. 53

Mtodos indiretos ..................................................................................................................... 54

Mtodos de avidina-biotina ................................................................................................... 56

6.3.1 Enquadramento histrico ................................................................................................. 56

6.3.2 Principais caractersticas da avidina............................................................................. 57

Mtodos de polmero ............................................................................................................... 62

6.4.1 Polmero de esqueleto interno ........................................................................................ 63

Cuidados com material e reagentes ................................................................................... 69

Diluio de soros de anticorpos ........................................................................................... 69

A diluio ideal ........................................................................................................................... 70

Teste de diluio de soros de anticorpos ......................................................................... 70

7.5.1 Cuidados gerais ..................................................................................................................... 71

Tempo de durao da incubao ......................................................................................... 75

Temperatura de incubao .................................................................................................... 75

Higiene e segurana no Laboratrio .................................................................................. 75

8 PREPARAO DE AMOSTRAS ............................................................................................... 77

Fixao em Imunohistoqumica ........................................................................................... 77

8.1.1 Fixao para cortes de cristato ..................................................................................... 77

Processamento histolgico .................................................................................................... 80

Preparao de lminas ............................................................................................................ 81

8.3.1 Cromo-almen gel ................................................................................................................ 81

8.3.2 Vectabond ................................................................................................................................ 82

9 RECUPERAO ANTIGNICA ................................................................................................ 83

Consequncias da fixao ....................................................................................................... 83

Digesto enzimtica proteoltica ......................................................................................... 84

Recuperao antignica de origem trmica por alta temperatura ........................ 85

INIBIO DE PARTCULAS ENDGENAS ................................................................... 89

Fosfatase Alcalina ...................................................................................................................... 89

Glucose Oxidase ......................................................................................................................... 89

Pontos susceptveis de atrair protenas ........................................................................... 89

Causas de marcao inespecfica......................................................................................... 89

Avaliao da qualidade da imunohistoqumica ............................................................. 91

Preservao da morfologia do tecido ....................................................................... 93

Operacionalizao do instrumento de recolha de dados ................................. 94

Score final ........................................................................................................................... 97