Professional Documents
Culture Documents
Rekayasa Genetika
Oleh:
Kelompok 3
Henrika Jempormase
(130341614778)
Melania Primasta
(130341614846)
(130341614839)
Yoananda Ramadhina
(130341614826)
enzim retriksi. Beberapa enzim retriksi seperti EciRI memotong DNA untuk membentuk
fragmen DNA dengan satu unting akhir yang menjalar disebut sticky atau kohesif ends.
Enzim yang lain mengatur fragmen dengan unting ganda akhir yag disebut blunt ends.
Pada awal 1970, beberapa ilmuwan menggunakan cloning gen untuk mengubah biologi
molecular selamanya. Berg menemukan teknologi DNA rekombinan ketika menciptakan
sebuah potongan dari DNA rekombinan dengan menyambung DNA dari kromosom E. coli
dan DNA dari virus primate yang disebut SV40, pertama dilakukan isolasi DNA kromosomal
dari E. coli dan DNA dari SV40. Kemudian memotong kedua sampel DNA dengan EcoRI,
memasukkan DNA E. coli dan fragmen DNA virus ke dalam pipa reaksi dengan DNA enzim
ligase dan berhasil pada pembuatan persilangan molekul SV40 dan DNA E. coli.
Cohen tertarik dengan potongan kecil berbentuk bundar dari DNA yang dikenal sebagai
plasmid. Plasmid DNA ditemukan pada bakteri. Plasmid termasuk DNA ekstrakromosomal
karena mereka ada pada sitoplasma bakteri. Plasmid berukuran kecil dengan rata-rata 10004000 pasangan utama. Cohen mempelajari replikasi plasmid untuk mentransfer plasmid
diantara bakteri dan mekanisme resistensi bakteri terhadap antibiotic.
Cohen menyebutkan bahwa plasmid dapat digunakan sebagai vector yang dapat
menerima, membawa, dan mengklon bagian lain dari DNA. Dengan menggunakan EcoRI
mereka memotong kedua plasmid dan menggabungkan fragmen dari masing-masing plasmid
menggunakan DNA ligase untuk menghasilkan persilangan (rekombinan) plasmid baru.
Sebagai hasil dari percobaan, Cohen dan Boyer memproduksi vector plasmid pertama untuk
kepentingan cloning, yang disebut pSC101. pSC101 mengandung gen resistensi tetrasilin dan
sisi retriksi untuk beberapa enzim termasuk EcoRI dan HindIII. Berikutnya mereka
menggunakan percobaan yang sama untuk mengklon DNA dari katak claw-toed Afrika
Selatan, Xenopus laevis menjadi sisi EcoRI dari pSC101.
Cohen dan Boyer membuat cloning DNA vector pertama yang merupakan jalan untuk
insersi dan replikasi DNA.percobaan ini sebagai awal lahirnya bioteknologi modern karena
banyak teknik yang sekarang ini menggunakan cloning gen dan manipulasi gen berdasarkan
metode teknologi DNA rekombinan.
Transformasi Sel Bakteri Dan Seleksi Antibiotik Rekombinan Bakteri
Cohen juga membuat kontribusi penting lainnya untuk gen kloning, yang membuat
kloning pSC101. Transformasi adalah sebuah proses memasukkan DNA asing ke dalam
bakteri, bisa digunakan untuk membuktikan pengenalan DNA didalam bakteri. Cohen
menemukan bahwa perlakuan sel bakteri dengan larutan kalsium klorida, ditambahkan
plasmid untuk sel didinginkan di dalam es, dan kemudian sel dihangatkan secara singkat dan
DNA bercampur, plasmid masuk ke dalam sel bakteri. Di dalam sel bakteri, DNA bereplikasi
dan secara cepat. Teknik transformasi menjelaskan lebih banyak penjelasan. Lebih modern
metode transformasi disebut elektroforesi, termasuk penggunaan secara singkat tekanan
listrik tinggi untuk membuat celah kecil di dinding sel bakteri dan membiarkan DNA masuk.
Elektroferesi juga dapat digunakan untuk mengenal DNA di dalam sel mamalia dan
tranformasi sel tumbuhan.
Penyambungan fragmen DNA dan transformasi oleh beberapa metode yang tidak
efisien. Selama penyambungan beberapa pengolaan penyambungan plasmid kembali secara
sendiri untuk menciptakan peredaran kembali plasmid yang kurang bagian DNA. Selama
transformasi, sel dewasa tidak bertindak DNA.
Sekarang kita belajar bahwa DNA bisa memasuki ke dalam vektor dan mengenali di
dalam sel bakteri, kita memikirkan bagaimana bakteri rekombinan ditransformasi dengan
rekombinan plasmid bisa dibedakan dari ukuran besar nontransformasi bakteri dan sel bakteri
yang berisi plasmid DNA tanpa DNA asing. Proses skrening ini disebut seleksi karena ini
dibuat untuk memfasilitasi identifikasi bakteri rekombinan yang mencegah perkembangan
tidak ada perubahan bakteri dan bakteri yang berisi plasmid tanpa DNA asing.
Cohen dan Boyer menggunakan seleksi antibiotik, teknik ini yang ditransfomasi sel
bakteri di dalam lapisan agar dengan antibiotik berbeda, sebagai cara untuk mengidentifikasi
bakteri rekombinan dan tidak ada perubahan sel. Selama bertahun seleksi antibiotik telah
banyak digunakan. Teknik modern kloning sering menjadi terkenal strategis seleksi, seperti
seleksi blue-white. Seleksi blue-white DNA adalah kloning pemotongan bagian di gen lac
Z.
Transformasi bakteri adalah penggambaran di dalam lapisan agar yang berisi antibiotik
ampicilin, contohnya tidak ada perubahan bakteri tidak tumbuh yang terdapat ampicilin
karena tidak ada plasmid berisi gen resiten ampicilin (ampR). Tetapi seleksi antibiotik sendiri
tidak bisa membedakan transformasi bakteri dengan plasmid tidak rekombinan yang memiliki
peredaran dari plasmid rekombinan. Untuk mengidentifikasi bakteri dengan plasmid
rekombinan, agar harus mengandung kormogenik (penghasil warna). Hasilnya, bakteri tidak
rekombinan berisi plasmid yang menyambung kembali tanpa memasukkan DNA yang
mengandung fungsi gen lac Z, penghasil -gal, dan perubahan biru.
Pengenalan Gen Kloning Manusia
Enzim retriksi, DNA ligase, dan plasmid merupakan alat secara molekul biologi untuk
memanipulasi dan kloning gen dari hakikat beberapa sumber. Dengan transformasi, ilmuwan
memiliki cara untuk mengenali DNA rekombinan didalam sel bakteri. Teknologi rekombinan
DNA membuat kemungkinan untuk memotong dan menggabungkan fragmen DNA bersamasama, memasukkan DNA kedalam plasmid, dan menghasilkan sejumlah besar pemasukan
DNA oleh bakteri untuk benar-benar bereplikasi DNA rekombinan
Fragmen DNA kloning adalah gen yang mengkode produksi protein, sel bakteri bisa
digunakan untuk sintesis protein dari gen kloning. Kita menyebutnya ekspresi protein.
Biologi molekul mengenali bahwa gen manusia bisa dikloning dan diekspresikan, teknologi
rekombinan DNA akan menjadi alat tidak terhingga dengan kekuatan dan aplikasi di
penelitian dan pengobatan.
Komersial yang pertama produksi gen manusia dari teknologi rekombinan DNA adalah
insulin manusia, hormon peptida diproduksi oleh sel di dalam pankreas yang disebut beta sel.
Ketika darah peningkatan glukosa, contohnya setelah makan makanan dengan kandungan
gula tinggi, dan insulin dalam darah rendah dengan stimulasi glukosa yang tinggi di dalam
hati dan sel otot sebagai suati rantai glukosa yang disebut glikogen. Individu dengan tipe I,
diabetus mellitus tidak bisa memproduksi insulin secara sendiri. Hasilnya kekurangan insulin,
diabetes tingginya gula darah, setelah itu bisa menyebabkan bahaya yang serius untuk organ
tubuh lainnya.
What Makes a Good Vector?
Fungsi vektor dan aplikasi telah ditingkatkan sejak Cohen membentuk pSC101.
Plasmid masih sering digunakan sebagai kloning vektor karena mereka kebiasaan digunakan
dalam kloning dan manipulasi bagian kecil DNA yang merupakan dasar untuk banyak teknik
yang digunakan sehari-hari di biologi molekular laboratorium. Salah satu yang digunakan
vektor plasmid disebut pBR322, yang dibuat termasuk resisten terhadap tetrasiklin dan
ampicilin dan berguna untuk pemotongan suatu bagian.
Keistimewaan Praktis Dari Vektor DNA Kloning
Vektor DNA kloning biasanya termasuk termasuk hal yang diinginkan
dan keistimewaan praktis
Ukuran, mereka cukup kecil untuk menjadi bagian yang mudah dari
kromosomal DNA di dalam sel inang bakteri
Sumber dari replikasi, bagian dari replikasi DNA membiarkan plasmid
untuk replikasi dari sel inang kromosom.
Bagian kelipatan kloning
Gen penanda seleksi
Vektor Bakteriofag
DNA dari lambda bakteriofag adalah salah satu vektor fag pertama
yang digunakan untuk kloning. kromosom lamda adalah struktur linear
sekitar 49 kb DNA kloning dimasukkan ke situs restriksi di pusat
kromosom lamda. kromosom rekombinan yang kemudian dikemas
menjadi partikel virus in vitro, dan fag ini digunakan untuk menginfeksi E.
Coli tumbuh sebagai rumput. Pada setiap akhir kromosom lamda adalah
12 urutan nukleotida disebut situs kohesif (COS) yang dapat mendasarkan
pasangan satu sama lain. Ketika lamda menginfeksi E.coli sebagai tuan
rumah, kromosom lamda menggunakan situs COS untuk menegdarkan
dan kemudian meniru. lamda bakteriofag ulangan melalui proses dikenal
sebagai siklus litik. Sebagai lamda ulangan untuk membuat partikel lebih
virus, E. Coli yang terinfeksi segaris (untuk melisiskan atau untuk
membagi atau pecah) dengan lamda, menciptakan zona bakteri mati yang
disebut plak, yang muncul sebagai bintik-bintik dibersihkan di halaman
bakteri. Setiap plak mengandung jutaan partikel fag rekombinan. Sebuah
keuntungan dari vektor ini adalah bahwa mereka memungkinkan untuk
kloning fragmen DNA yang lebih besar (sampai kira-kira 25kb) dari
plasmid. vektor fag tidak lagi sangat banyak digunakan.
Kosmid Vektor
Kosmid vektor mengandung COS ujung DNA lamda, asal plasmid
replikasi, dan gen untuk resistensi antibiotik, tetapi sebagian besar gen
virus untuk resistensi antibiotik. tetapi sebagian besar gen virus telah
dihapus. DNA adalah kloning ke situs restriksi dan kosmid ini dikemas
menjadi partikel virus, seperti yang dilakukan dengan vektor
bacteriophage, dan digunakan untuk menginfeksi E. Coli, di mana di
kosmid meniru sebagai nomor plasmid copy rendah. Salah satu
keuntungan dari kosmid adalah bahwa mereka memungkinkan untuk
kloning fragmen DNA dalam kisaran 20 sampai 45 kb. Tapi seperti vektor
fag, karena perkembangan jenis lain vektor, vektor kosmid tidak lagi
sangat banyak digunakan dan telah membatasi aplikasi.
Vektor Ekspresi
Vektor ekspresi protein memungkinkan untuk sintesis tingkat tinggi
(ekspresi) protein eukariotik dalam sel bakteri karena mengandung
promotor urutan prokariotik berdekatan dengan lokasi di mana DNA
dimasukkan ke plasmid. Bakteri RNA polimerase dapat mengikat plasmid.
Bakteri RNA polimerase dapat mengikat untuk promotor dan mensintesis
sejumlah besar RNA. Yang kemudian diterjemahkan ke dalam protein.
Protein kemudian dapat diisolasi menggunakan teknik biokimia. Namun,
itu tidak selalu mungkin untuk mengekspresikan protein fungsional dalam
bakteri. Misalnya, ribosom bakteri kadang-kadang tidak dapat
menerjemahkan urutan mRNA eukariotik. Jika protein yang dihasilkan
mungkin tidak melipat dan diproses dengan benar, seperti terjadi dalam
sel eukariotik yang menggunakan organel melipat dan memodifikasi
protein. Juga, membuat beberapa produk rekombinasi di di poduk bakteri
dapat menjadi masalah karena E. Coli sering tidak protein rahasia; yang
ada untuk vector ekspresi sering digunakan dalam Bacillus subtilis,.
Dalam kasus rumah, bakteri host dapat mengenali protein
rekombinan yang asing dan menurunkan protein, sedangkan di lain
menyatakan protein lethal ke sel bakteri inang. virus tertentu seperti
SV40, dapat digunakan untuk menyampaikan ekspresi plasmid ke dalam
sel mamalia. vektor biasanya SV40 diturunkan mengandung (virus) urut
promotor kuat untuk level tinggi transkripsi dan poli Sebuah sinyal Selain
untuk menambahkan poli Atail ke ujung 3 'mRNA disintesis. variasi vektor
tersebut telah digunakan untuk terapi gen manusia.
Bacterial Artificial Chromosomes
Kromosom buatan bakteri besar plasmid copy - angka yang rendah
hadir sebagai salah satu untuk dua salinan dalam sel bakteri dan mereka
mengandung gen yang mengkodekan f - faktor ( unit gen mengendalikan
replikasi bakteri ) . BACs dapat menerima sisipan DNA di kisaran 100
sampai 300 kb . BACs secara luas digunakan di dalam manusia Genom
Project untuk mengkloning dan sekuens potongan besar kromosom
manusia
Koleksi gen aktif dinyatakan dalam sel atau jaringan dari mana
mRNA diisolasi
Intron tidakdikloning
Dapat dibuat dan disaring untuk mengisolasi gen yang terutama
dinyatakan hanya dalam kondisi tertentu di jaringan
Kerugian cDNA Perpustakaan
Bisa sulit untuk membuat perpustakaan cDNA jika jaringan sumber
dengan jumlah yang berlimpah mRNA untuk gen tidak tersedia
Library Screening
Perpustakaan "disaring" untuk mengidentifikasi gen yang
diinginkan. salah satu teknik penyaringan perpustakaan yang paling
umum disebut Colony hibridisasi. Pada Colony hibridisasi, koloni bakteri
yang mengandung DNA rekombinan ditumbuhkan pada plate agar.
Sebuah Nylon atau filter nitroselulosa ditempatkan di atas piring dan
beberapa koloni bakteri menempel filter di lokasi yang tepat mereka di
piring. Perlakukan filter dengan larutan alkali untuk melisiskan sel dan
denaturasi DNA, DNA terdenaturasi mengikat untuk menyaring sebagai
DNA untai tunggal
Filter diinkubasi dengan probe, fragmen DNA yang merupakan
pelengkap dari gen yang diinginkan. Probe mengikat dengan ikatan
hidrogen ke urutan komplementer pada filter.Filter dicuci untuk
menghilangkan kelebihan penyelidikan terikat.
Filter terkena film autoradiografi
Di mana saja penyelidikan telah terikat, cahaya akan dipancarkan
dan mengekspos butir perak dalam film
Film dikembangkan untuk membuat catatan permanen dari
hibridisasi koloni
Film ini kemudian dibandingkan dengan plate agar asli untuk
mengidentifikasi koloni terdapat plasmid rekombinan dengan gen
dari bunga
Polymerase Chain Reaction (PCR) / Reaksi Polimerasi Berantai
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase
adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara
eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini
ditemukan oleh Kary B. Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari
perusahaan CETUS Corporation. Metode PCR ini pada awalnya hanya
digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, akan tetapi dalam
perkembangannya dapat digunakan untuk melipatgandakan molekul
mRNA.
TEKNIK
LABORATORIUM
DAN
APLIKASI
TEKNOLOGI
DNA
REKOMBINAN
Elektroforesis Gel Agarosa
Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan
molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah
pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa
atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk
memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan
dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat
memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis
poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA
(sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA,
RNA, dan protein. Molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak
menuju elektroda negatif, sedangkan molekul bermuatan negatif akan
bergerak ke elektroda positif melalui gel elektroforesis. Lokasi fragmen
DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati
secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang digunakan
adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada
DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan
memperlihatkan lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium
bromida merupakan senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan
percobaan yang menggunakan etidium bromida harus menggunakan
sarung tangan.
Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Gel agarosa dapat
melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus
hingga
20.000
pasang
basa
(pb). Molekul
DNA
bermuatan
negatif sehingga nanti di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya,
makin rendah laju migrasinya.
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran
fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti
yang berbeda ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian
atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai
macam kegiatan, yaitu membandingkan gen homolog dari sspesies yang
berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA
fingerprinting, mendeteksi kelainan genetic, mendeteksi lokasi dan jumlah
mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama
perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan
gen, mempelajari evolusi tingkat molecular, mengetahui variasi genetik
data
gambar.
Perusahaan
Diterapkan
Biosystems
(ABI)
telah
mengembangkan pendekatan yang
disebut solid
yang
dapat
menghasilkan 6 gigabase urutan DTA per run! Metode padat
menggabungkan berbagai pendekatan untuk urutan fragmen DNA yang
terkait dengan manik-manik dan aplified, mirip dengan 454 pendekatan,
tetapi berbeda teknologi sequencing digunakan yang ... memberikan
output yang lebih besar dari data yang sequencing per instrumen jangka.
Roche 454 Next-Generation Sequencing Teknologi
Roche 454 teknologi sequencing mengikat fragmen DNA ke manikmanik. fragmen DNA diperkuat dengan PCR dan kemudian addedto sumur
(langkah 1) dan dikenakan pyrosequencing, di dijelaskan dalam teks.
(Langkah 2) Selama pyrosequencing, sebuah nukleotida neon individu,
biru G ditunjukkan dalam hal ini, adalah flowedover sumur. Sebagai
nukleotida ditambahkan ke primer dengan DNA polimerase, di pirofosfat
organik (PPi) dilepaskan yang bereaksi dengan adenosine 5'phosphosulfate (APS) dan enzim sulfurylase untuk menghasilkan ATP
(panah biru). Enzim luciferase kunang-kunang menggunakan ATP untuk
menghasilkan cahaya, yang dapat dideteksi dan diukur. (Langkah 3)
Cahaya ditangkap oleh sistem deteksi dianalisis untuk melacak pola
nukleotida ditambahkan ke masing-masing dengan baik. Siklus aliran
selanjutnya diulang dengan masing-masing tiga nukleotida lainnya. Terusmenerus ... dari proses ini menghasilkan sequencing membaca sekitar
400 basis.
Fluoresensi in situ Hibridisasi
Teknik yang disebut Fluorescence In Situ Hibridisasi (FISH) dapat
digunakan untuk mengidentifikasi kromosom mengandung gen yang
diinginkan. Misalnya, jika Anda hanya kloning gen manusia diyakini
sebagai gen yang diinginkan. Misalnya, jika Anda hanya kloning gen
manusia diyakini terlibat dalam kecerdasan, Anda bisa menggunakan
IKAN untuk menentukan di mana kromosom berada gen ini. Dalam IKAN,
kromosom terisolasi sel bentuk seperti cellls darah putih dan tersebar di
kaca mikroskop slide. Sebuah DNA atau RNA Probe untuk gen yang
diinginkan dilabeli dengan nukleotida fluoresensi dan kemudian diinkubasi
dalam larutan dengan slide. probe hybridizes dengan urutan
komplementer pada kromosom pada slide. slide dicuci dan kemudian
terkena cahaya fluoresensi. Dimanapun probe telah terikat chrmosome,
maka flourescentl berlabel probe diterangi untuk menunjukkan adanya
probe yang mengikat.
Menentukan mana dari 23 kromosom manusia menunjukkan
fluoresensi, mereka selaras sesuai dengan panjang dan pewarnaan pola
kromatid mereka untuk membuat kariotipe. Fluoresensi pada lebih dari
satu kromosom menunjukkan baik beberapa salinan dari gen atau urutan
terkait yang mungkin menjadi bagian dari keluarga gen. IKAN juga
digunakan untuk menganalisis kelainan genetik.
Ketika gen diekspresikan dalam organ dengan banyak sel yang
berbeda jenis-misalnya, ginjal atau otak jaringan-FISH juga dapat
digunakan untuk menentukan jenis sel yang mengekspresikan mRNA
tertentu. Dalam pendekatan ini, jaringan bunga yang diawetkan dalam
larutan fiksatif dan kemudian tertanam dalam bahan seperti lilin atau
resin.
Blotting selatan teknik lain, yang disebut analisis Southern blot, sering
digunakan untuk menentukan jumlah salinan gen antara aplikasi lainnya.
Southern blotting dimulai dengan mencerna DNA kromosom menjadi
fragmen kecil dengan enzim restriksi fragmen DNA dipisahkan oleh
elechtrophoresis gel agarosa. Namun, jumlah fragmen restriksi yang
dihasilkan oleh mencerna DNA kromosom sering begitu besar sehingga
hanya berjalan gel dan pewarnaan DNA tidak menyelesaikan fragmen
diskrit. Sebaliknya, DNA dicerna muncul sebagai smear terus menerus
fragmen pada gel. Southern blotting digunakan untuk memvisualisasikan
hanya fragmen tertentu yang menarik. Berikut elektroforesis, gel
diperlakukan dengan soluton alkali untuk denaturasi DNA; maka fragmen
yang ditransfer ke membran nilon atau nitroselulosa menggunakan teknik
yang disebut blotting.
Blotting dapat dicapai dengan mendirikan gel sandwichin yang gel
ditempatkan di bawah membran nilon, kertas saring, kertas handuk, dan
berat untuk memungkinkan wicking dari larutan garam melalui gell, yang
akan mentransfer DNA ke nylon dengan aksi kapiler . Single-untai DNA
yang menempel pada blot, diposisikan di band persis seperti pada gel.
Atau, tekanan atau vakum blotters dapat usedto DNA mentransfer ke
nilon. Nilon blot kemudian dipanggang atau sebentar terkena sinar UV
untuk melampirkan DNA premanently. Berikutnya blot tersebut diinkubasi
dengan probe berlabel dalam banyak cara yang sama bahwa hibridisasi
koloni dilakukan. Semakin, probe nonradioactive yang digunakan untuk
Southern blotting dan banyak teknik hibridisasi lainnya.
Pengembangan analisis Southern blot adalah teknik penting, yang
membentuk prinsip-prinsip dasar untuk Nothern blotting (blotting
pemisahan ans molekul RNA, seperti yang dibahas pada bagian
berikutnya) dan Western blotting (pemisahan dan blotting protein.
Mempelajari Ekspresi Gen
Para ahli biologi molekuler di seluruh dunia yang terlibat dalam
penelitian mempelajari ekspresi gen dan regulasi ekspresi gen. Banyak
teknik molekuler yang berbeda avalabe untuk mempelajari ekspresi gen.
Kebanyakan methodes melibatkan menganalisis mRNA yang dihasilkan
oleh tisu. Hal ini sering ukuran yang baik dari ekspresi gen karena yhe
jumlah mRNA menghasilkan oleh tisu sering setara dengan jumlah protein
jaringan membuat.
Northern Blot
Metodologi dasar noda Northern mirip dengan analisis selatan blot .
Dalam blotthing utara. RNA diisolasi dari dipermasalahkan bunga dan
dipisahkan dengan elektroforesis gel ( RNA tidak dicerna dengan enzim ).
RNA dihapuskan ke sebuah membrase nilon dan kemudian hibridisasi
untuk probe, seperti yang dijelaskan untuk bercak selatan . terkena band
pada autoradiogram menunjukkan adanya mRNA untuk gen dari bunga
dan ukuran mRNA yang
Reverse transkripsi PCR
Kadang-kadang jumlah RNA yang diproduksi oleh jaringan adalah di
bawah tingkat deteksi dengan analisis utara blot PCR memungkinkan
untuk mendeteksi jumlah menit mRNA bahkan dari jumlah yang sangat
kecil dari jaringan strating . misalnya , PCR telah alat untuk ahli biologi
molekuler belajar ekspresi gen pada embrio dan mengembangkan
jaringan di mana jumlah jaringan untuk analisis sangat kecil. Karena RNA
tidak dapat langsung diperkuat oleh PCR , teknik yang disebut reverse
transkripsi PCR ( RT PCR ) dilakukan . di RT PCR mRNA diubah menjadi
cDNA beruntai ganda oleh enzim reverse transcriptase dalam proses mirip
dengan cara di mana cDNA untuk perpustakaan dibuat . cDNA kemudian
diperkuat dengan satu set primer spesifik untuk gen yang diinginkan .
diperkuat fragmen DNA yang pola ekspresi electromine di tisu . jumlah
cDNA yang dihasilkan dalam reaksi RT PCR untuk kepentingan gen
tertentu mencerminkan jumlah.
real time PCR
realtime atau kuantitatif PCR ( qPCR ) memungkinkan penelitian untuk
mengukur reaksi amplifikasi yang terjadi dalam " real time " . prosedur
bacis melibatkan penggunaan cyclers termal khusus yang menggunakan
laser untuk memindai seberkas cahaya pikir atas atau bawah dari masingmasing tabung PCR. masing-masing tabung reaksi berisi baik probe
pewarna yang mengandung atau DNA mengikat PEWARNA yang
memancarkan cahaya fluorescente ketika diterangi oleh laser . cahaya
yang dipancarkan oleh zat pewarna corelates dengan jumlah PCR roduce
diperkuat .diperkuat cahaya dari masing-masing tabung ditangkap oleh
detektor yang menyampaikan informasi ke komputer untuk memberikan
pembacaan ion jumlah flourescene setelah setiap siklus pembacaan ini
dapat diplot dan dianalisa untuk menentukan kuantitas jumlah produk
PCR yang dihasilkan setelah setiap siklus.