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Seccin I
Estructura
y funcin
del material
gentico
CAPTULO 1
Introduccin y aspectos generales
1.1 TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA

1.2 EL DNA COMO MATERIAL GENTICO
1.3 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GENOMA
3
4
5
1.3.1 Genoma de procariotas y eucariotas

1.3.2 Magnitud del genoma nuclear de eucariotas
1.3.3 Magnitud y caractersticas del genoma mitocondrial
5
7
10
A modo de introduccin general al planteamiento de la biologa molecular y la ingeniera gentica en este texto,
se comenzar describiendo de modo sucinto los tres aspectos que mejor ponen de manifiesto el papel de los
cidos nucleicos en la clula y en especial del DNA como portador de la informacin gentica: por un lado, la
descripcin global de las rutas de transmisin de la informacin gentica; en segundo lugar, los antecedentes
experimentales que demostraron el importante papel de los cidos nucleicos; finalmente, las caractersticas
generales del genoma de eucariotas, como punto de partida para el estudio posterior en profundidad de
los conceptos tericos, las tecnologas y las aplicaciones de esta materia en las ciencias de la salud.
1.1 TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA
1:1
Francis Crick introdujo el trmino dogma central de la gentica molecular para describir, incluso antes de
conocerse por completo su relevancia en los seres vivos, el flujo de la informacin gentica y la utilizacin
2012. Elsevier Espaa, S.L. Reservados todos los derechos
I . E S T R U C T U R A Y F U N C I N D E L M AT E R I A L G E N T I C O
de dicha informacin en las clulas. En concreto, la transmisin de la informacin contenida en la secuencia del
DNA a las clulas y organismos descendientes mediante la replicacin, y su expresin en biomolculas
funcionales mediante los procesos de transcripcin y traduccin. Esta descripcin comprende, pues, el conjunto
de relaciones generales existentes entre el DNA, el RNA y las protenas.
Debe evitarse la posible interpretacin errnea de la representacin abreviada de este dogma,
DNA ! RNA ! protena, que no indica la transformacin de una molcula en otra, tal como se utiliza
normalmente en las rutas metablicas, sino que cada elemento en este esquema aporta la informacin necesaria
para la sntesis del siguiente. En este sentido, es importante el concepto de plantilla o molde molecular: aunque
cada paso est catalizado por una enzima, los sustratos (nucletidos, aminocidos) no son seleccionados por
dicha enzima, sino que vienen especificados por la intervencin del molde, en concreto por su secuencia de
nucletidos.
El progreso en el conocimiento de los procesos de transmisin de la informacin gentica oblig a la
ampliacin de este esquema bsico original para acomodar otros procesos que tambin ocurren, al menos
en algunos organismos particulares, como es el caso de algunos virus:
1:2
Debe resaltarse tambin el papel esencial de los productos finales (protenas y algunos RNA) como
componentes estructurales de todas las clulas y como responsables de la catlisis de las reacciones
bioqumicas que conducen a la formacin de las biomolculas.
1.2 EL DNA COMO MATERIAL GENTICO

El conocimiento de la estructura de los cidos nucleicos se inicia en el siglo XIX con el aislamiento a partir de
ncleos celulares de un compuesto denominado inicialmente nuclena, formado por una parte cida (hoy,
DNA) y una parte bsica (protena), as como con el estudio parcial de las propiedades de la nuclena y de su
relacin con la herencia celular. Sin embargo, la estructura slo se conoci a mediados del siglo XX, tras
demostrarse que el DNA era el componente cromosmico depositario de la informacin gentica. Cabe
destacar en este sentido, como antecedentes clave, los experimentos de Frederick Griffith, Oswald T. Avery,
Colin MacLeod y Maclyn McCarty, en 1928 y 1944, y de Alfred D. Hershey y Martha Chase, en 1952, que
constituyen sendos hitos en la identificacin del DNA como material gentico.
Web 1.1. Experimentos que demostraron la identidad molecular del material gentico.
Tras estas aportaciones iniciales identificando el DNA como portador de la informacin gentica, el
verdadero inicio de la biologa molecular moderna lo constituy la propuesta de estructura en doble hlice
para el DNA, formulada en 1953 por James D. Watson y Francis Crick. A partir de este momento, casi todo el
esfuerzo realizado se centra en el estudio del DNA genmico, desde el punto de vista estructural y funcional, en
procariotas y eucariotas, con una atencin especial a mamferos en general y humanos en particular. Los
avances logrados, tanto tericos como tcnicos y aplicados, han sido enormes. A ello ha contribuido la
aparicin de la ingeniera gentica, como principal rea derivada de la biologa molecular. Una vez concluido
en 2003 el Proyecto Genoma Humano (genmica estructural) se inici el anlisis de las funciones de cada gen
1. Introduccin y aspectos generales
(genmica funcional) y la diseccin de la estructura y funcin de las protenas (protemica). Como expresin de
estos nuevos conocimientos ha surgido una gran variedad de campos de actividad en las ciencias de la salud
(medicina, farmacia y veterinaria), tales como anticuerpos monoclonales, mtodos inmunoqumicos, biochips
para el diagnstico, clonacin molecular y clonacin animal, farmacogenes, ingeniera de protenas, protenas
recombinantes de inters diagnstico y teraputico, sondas de hibridacin, terapia celular y terapia gnica,
transferencia de genes, vectores, virus, etc. Nuestro objetivo no es describir los aspectos concretos de estos
campos, sino slo poner de manifiesto las bases moleculares que les sirven de soporte, como punto de partida
para un estudio detenido de cada campo en su correspondiente rea de conocimiento. Con este fin se presentan
en este primer captulo las caractersticas generales del genoma de eucariotas.
1.3 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GENOMA

1.3.1 Genoma de procariotas y eucariotas
Conceptualmente, el genoma (de la raz griega gen, origen) puede ser considerado como el patrimonio
gentico de un organismo, es decir, el conjunto total de material gentico hereditario presente en una
clula. Debe incluirse en este concepto tanto el material gentico existente en el ncleo como el que contienen
mitocondrias y cloroplastos. Por otra parte, es ms adecuada esta definicin que la que se emplea en ocasiones,
conjunto de genes de un organismo pues, como se estudiar ms adelante, existe gran cantidad de material
gentico que no se expresa. La mayora de organismos poseen un genoma constituido por DNA, pero algunos
virus tienen un genoma de RNA. La parte codificante del genoma especifica, en forma de genes, la informacin
necesaria para dar lugar a productos gnicos, molculas funcionales que son las protenas y los RNA. Estos
productos son responsables de toda la actividad celular, de sus caractersticas morfolgicas y de muchas de las
claves del comportamiento de un organismo, desde la embriognesis a su crecimiento, maduracin fsica e
intelectual, estado adulto, reproduccin, y todas sus funciones metablicas y actividades fisiolgicas.
Con respecto al estudio del genoma, comenzaremos por resaltar las caractersticas diferenciales de procariotas y eucariotas:
1:3
Recurdese que los procariotas (o procariontes) son organismos unicelulares (bacterias y arqueas) de
tamao pequeo (entre 0,2 y 5 mm de dimetro), con membrana plasmtica rodeada generalmente por una
pared celular rgida y con diversas estructuras superficiales (pili, flagelos, etc.), pero carecen de membrana
nuclear, de orgnulos y de cualquier otro tipo de compartimentacin interna. El genoma de procariotas es,
comparativamente, de pequeo tamao y relativamente sencillo. Se reduce a un nico cromosoma formado
por una molcula circular de DNA, localizada en suspensin en el citosol pero anclada a la membrana
constituyendo la zona nuclear o nucleoide, sin membrana que la delimite. Es frecuente encontrar, adems,
una pequea cantidad de material gentico extra, no esencial, en forma de pequeas molculas circulares de
DNA, llamadas plsmidos. Los plsmidos poseen la propiedad de replicacin autnoma, es decir, sin
coordinacin alguna con la divisin celular. Desempean un papel importante, al codificar protenas que
confieren resistencia a los antibiticos u otros materiales txicos, y ofrecen una importante aplicacin como
herramientas en la tecnologa del DNA recombinante, concretamente como vectores para la incorporacin
de DNA a clulas.
Las clulas de eucariotas (o eucariontes), tanto multicelulares (animales y plantas) como unicelulares y
multicelulares simples (protozoos, hongos y algas), son ms variadas y complejas. Son de mayor tamao
(entre 10 y 50 mm), poseen membrana plasmtica, pueden poseer pared celular (plantas), tienen citoesqueleto
interno, y muestran una gran compartimentacin citoplasmtica, con diferentes tipos de orgnulos subcelulares (mitocondrias en animales y plantas, cloroplastos en plantas, lisosomas en animales, etc.) y otras
estructuras (retculo endoplsmico, complejo de Golgi, etc.). El ncleo tiene como caracterstica esencial la
presencia de una membrana nuclear doble. En el genoma de eucariotas debe distinguirse entre el genoma
nuclear y el de orgnulos. El genoma nuclear aparece bajo dos formas estructuralmente diferentes a lo largo
del ciclo celular: la cromatina como material filamentoso disperso por la mayor parte del ncleo en la
interfase (entre divisiones), y los cromosomas, fcilmente observables como entidades morfolgicas o
corpsculos independientes en los momentos previos a la divisin celular. Ambas formas estn constituidas
por las mismas molculas lineales muy largas de DNA bicatenario, estrechamente asociado a protenas. El
genoma de orgnulos (cloroplastos y mitocondrias) est formado por cromosomas circulares, al igual que el
de procariotas.
Algunas caractersticas diferenciales del genoma humano (clula somtica, diploide, 2n)
NUCLEAR
Tamao
Tipo de DNA
Nmero de cromosomas
Presencia de nucleosomas
Protenas asociadas
DNA codificante
DNA repetitivo
MITOCONDRIAL
9
6,4 Gb = 6.400 Mb = 6.400.000 kb = 6,4 10 pb
16,5 kb m
Lineal, bicatenario
Circular, bicatenario
23 distintos, 2 copias: 46 en total
Uno, con varias copias en cada

mitocondria; entre 200 y 2.000
copias por clula
No
Alrededor del 50% de la masa, histonas y otras
Poco numerosas o ausentes
Entre 2 y 5%
93%
Abundante ( 40%)
Prcticamente nada
Nmero de genes
25.000
37
Densidad de genes
1 gen cada 128 kb
1 gen cada 0,45 kb
En la mayora
Ausentes
Presencia de intrones
en los genes
Las cifras relativas al nmero de genes han sufrido fuertes variaciones en los aos recientes y an son
dispares dependiendo de la fuente que se consulte. Ello se debe a que no es sencillo definir qu regin del DNA
genmico es o no un gen, e incluso identificar con certeza sus puntos de comienzo y de fin, los que definen un
marco de lectura abierto (pg. 314); las tcnicas de deteccin e identificacin de genes en la secuencia del
genoma continan evolucionando. Como ejemplos de situaciones que hacen difcil esta precisin pueden
mencionarse la existencia de copias de genes que no son funcionales (pseudogenes, pg. 113); el tamao
mucho menor de las regiones codificantes (exones) en la mayora de genes frente a las no codificantes; la
posibilidad de expresin en formas alternativas de algunos genes, dando lugar a diferentes productos (ayuste
alternativo, pg. 306); los genes que codifican RNA funcionales son cortos y carecen de marco de lectura, etc.
Todo ello complica la definicin e identificacin inequvocas de un segmento del genoma como un gen.
Igualmente varan las cantidades derivadas, como la fraccin del genoma constituida por regiones codificantes. Lo importante es, en todo caso, transmitir una idea de las cifras aproximadas, los diferentes tipos de
secuencia implicados y las diferencias entre el genoma nuclear de los eucariotas y los genomas de orgnulos y
de procariotas.
1.3.2 Magnitud del genoma nuclear de eucariotas

El material gentico contenido en el ncleo supone generalmente ms del 90% del total de DNA celular. El
primer aspecto a destacar es su magnitud con respecto al genoma mitocondrial y al de procariotas. Adems, a
diferencia de stos, el genoma nuclear est repartido en varios cromosomas, en nmero diferente segn la
especie, generalmente muy grandes y con el DNA muy condensado al estar estrechamente asociado con histonas y otras protenas.
La magnitud del genoma nuclear viene determinada por la cantidad total de DNA en el conjunto de
cromosomas de una clula. sta se puede expresar de varias formas:
En nmero de cromosomas, designado por n en organismos haploides y 2n en diploides, en los que hay
2 copias de cada cromosoma.
En masa de DNA (pg = picogramos).
Como valor C, notacin que expresa la cantidad de DNA total en el genoma de una clula con respecto a la
presente en una clula haploide de la misma especie. Como se ver, en clulas diploides el valor puede ser de
2C o 4C, dependiendo del estadio del ciclo celular.
Lo
ms habitual es expresarlo en longitud: pb = pares de bases en bicatenario, o nt = nucletidos en mono
catenario. Para molculas largas se emplean kilobases (kb o kpb = 103 pb) o megabases (Mb o
Mpb = 106 pb).
Comparaciones que resaltan la magnitud del DNA nuclear en eucariotas:

Por regla general, la cantidad total de DNA en una clula diploide eucaritica es entre 10 y 1.000 veces superior que la de
una clula procaritica, aunque la diferencia puede llegar hasta un factor de 200.000, por ejemplo, considerando los
casos extremos de algunas plantas y anfibios respecto a la bacteria de menor tamao, el micoplasma.
En forma lineal, la longitud total del DNA de una clula humana somtica (diploide, 46 cromosomas) sera de unos
2,2 metros.
Al referir esta cifra al nmero de clulas del cuerpo humano, la longitud total resultante, 110 billones de metros
(110 1012 m), equivale a casi 3 millones de vueltas a la Tierra, 143.000 viajes de ida y vuelta a la Luna o 370 viajes de ida
y vuelta al Sol.
Para
escribir la secuencia completa del genoma de una clula humana diploide se necesitaran 1.280 tomos, que
ocuparan 64 m de estantera.
Para leer en voz alta dicha secuencia se necesitaran 20 aos y 3 meses.
Para almacenar la secuencia completa del genoma de una clula humana diploide en formato electrnico se requieren
1,5 GB (gigabytes).
Las cifras se hacen casi incomprensibles si se quiere considerar la magnitud total del DNA de la humanidad (actualmente
7 109 individuos).
Datos empleados:
N. de clulas en el cuerpo: estimado al menos en unos 50 billones = 50 1012 clulas.
Circunferencia de la Tierra: 40.000 km.
Distancia promedio entre la Tierra y la Luna: 384.000 km.
Distancia promedio entre la Tierra y el Sol: 150 millones de km.
5.000 letras por pgina y 1.000 pginas por tomo, con un grosor de 5 cm.
Velocidad de lectura: 10 letras por segundo.
Procede, por otra parte, analizar la magnitud del genoma de forma comparativa tanto entre individuos de
una misma especie como entre especies diferentes:
a) Todas las clulas de los individuos de una misma especie poseen la misma cantidad total de DNA y nmero
de cromosomas. De esta generalizacin deben exceptuarse las clulas germinales, dedicadas a la
reproduccin del individuo, que poseen la mitad. En todos los casos, estas cifras se refieren a clulas en
un mismo estado de divisin celular (normalmente la interfase) pues, como se ver posteriormente
(captulo 8), la cantidad total de DNA, aunque no el nmero de cromosomas, vara en una clula a lo largo
del ciclo celular.
b) El contenido total de DNA, expresado en pg o en n. de pb, y el nmero de cromosomas varan ampliamente
entre especies diferentes. A menudo se ha asumido que el tamao del genoma pueda estar relacionado con el
grado de complejidad del organismo, o su posicin en la escala evolutiva, pero hoy en da est claro que esto
no es as. Solamente al comparar virus, procariotas y eucariotas se aprecia una diferencia significativa
en la magnitud del genoma. Dentro de los eucariotas, el tamao del genoma vara ampliamente pero de forma independiente de la posicin en la escala evolutiva o de lo que pudiera, bajo un punto de vista
antropocntrico, entenderse como complejidad de la especie. As, por ejemplo, la clula humana contiene
700 veces ms DNA que la de E. coli, pero 300 veces menos que las clulas de algunas salamandras y plantas
angiospermas, e incluso menos que algunos protozoos (eucariotas unicelulares).
1:4
Por otro lado, no existe correlacin alguna entre el tamao del genoma de una especie y el nmero de
cromosomas que lo componen. Por ejemplo, mientras que el genoma humano diploide (6,4 109 pb) est
repartido en 46 cromosomas (23 pares, n = 23), las clulas de ratn, con un genoma menor (3 109 pb), poseen
menor nmero de cromosomas (40), mientras que en las clulas de cebolla un genoma 2 veces mayor que el
humano (1,5 1010 pb) est contenido en slo 16 cromosomas. De forma similar, la mosca de la fruta, con un
genoma (1,7 108 pb) mucho mayor que el de la levadura (1,6 107 pb), posee un nmero muy inferior de
cromosomas (8 frente a 32).
1:5
Esta ausencia de correlacin entre cantidad de material gentico y complejidad del organismo es una de las pautas
para sugerir que el tamao de los genomas de organismos superiores es muy superior al necesario y, por tanto, que
una gran parte es no codificante, es decir, no est organizado en genes, nunca traduce su informacin a un producto
gnico (RNA o protena). De todos modos, se debe ser cauto al considerar una categorizacin de los organismos de
acuerdo a su complejidad, pues es muy discutible que un ser humano sea ms complejo que, digamos, un gusano. En
cualquier caso, la hiptesis de una importante fraccin no codificante en el genoma se ha confirmado. Por ejemplo, se
ha encontrado que los genes tienen una longitud media de alrededor de 1.000 pb. Asumiendo esta cifra, el genoma
humano haploide podra contener unos 3,2 millones de genes y, sin embargo, se estima hoy en da que slo contiene
unos 25.000, de modo que la fraccin codificante slo alcanza alrededor del 1% del DNA total.
Aunque la funcin de los genes est bien establecida para una pequea fraccin del total presente en el genoma
humano, la diversidad en la cantidad total de DNA en los genomas puso de manifiesto la necesidad de estudiar
con mayor precisin la organizacin estructural de genes y genomas a nivel molecular (captulos 9 y 17). Las
caractersticas ms relevantes del genoma nuclear son la presencia de grandes regiones que no codifican producto
gnico alguno (DNA no codificante) y la existencia de secuencias de DNA que se repiten un nmero ms o menos
elevado de veces (DNA repetitivo). Como se estudiar con detenimiento posteriormente, hay que unir a ello la
existencia de una enorme diversidad en la secuencia (polimorfismo, captulo 24) en distintas regiones del DNA,
tanto sencillas como repetitivas, codificantes o no.
1:6
10
1.3.3 Magnitud y caractersticas del genoma mitocondrial

El genoma de orgnulos (mitocondrias en animales, mitocondrias y cloroplastos en plantas) es, posiblemente,
un vestigio del cromosoma de bacterias arcaicas que accedieron al citoplasma de eucariotas primitivos, para
dar lugar tras la evolucin a dichos orgnulos (hiptesis endosimbionte). Se cree que la mitocondria (orgnulo
que aporta casi toda la energa que necesitan las clulas) surgi al acumularse el oxgeno en la atmsfera
terrestre. Posiblemente, la mitocondria y el ncleo de la clula eucaritica se formaron en paralelo, al incorporarse por endocitosis clulas procariotas aerbicas al interior de la clula eucaritica anaerbica y fusionarse
ambas. Con el tiempo, la mayora de los genes procariticos (genes protomitocondriales) se integraron en el
genoma nuclear, con lo que el eucariota primitivo anaerbico ya poda vivir en una atmsfera rica en oxgeno;
slo una pequea fraccin del genoma procaritico primigenio permaneci en la mitocondria.
Las clulas animales poseen un nmero muy variable de mitocondrias, dependiendo de la especie y del
tejido. Cada mitocondria posee varias copias de un nico cromosoma (habitualmente menos de una decena),
situadas en la matriz mitocondrial y ancladas a la membrana interna. En consecuencia, el nmero de copias de
DNA mitocondrial (mtDNA) en una clula oscila entre 200 y 2.000 (algunas referencias hablan de hasta
100.000 en casos puntuales). El cromosoma mitocondrial es bicatenario y circular, como el de procariotas,
aunque de tamao muy inferior: 16.569 pb en humanos, con una longitud de 5 mm y una masa molecular de
10 MDa; esto supone una longitud 3.000 veces inferior a la del cromosoma nuclear ms pequeo. Teniendo en
cuenta el nmero de copias totales (2 del genoma nuclear frente a mltiples, y muy variables, del mitocondrial),
se puede calcular que el DNA mitocondrial total supone, dependiendo del tejido, entre un 0,05 y un 0,5% del
DNA total de la clula (quizs hasta el 20% en los casos extremos mencionados). Finalmente, la situacin es
similar para el cromosoma de cloroplastos, que es igualmente bicatenario y circular, pero de mayor tamao que
el mitocondrial.
A diferencia del DNA nuclear, con abundantes repeticiones y regiones no codificantes, el mtDNA es en su
casi totalidad no repetitivo y codificante. En concreto, el cromosoma mitocondrial humano contiene un total de
37 genes que suponen el 93% del DNA. Entre ellos se cuentan 2 genes para RNA ribosmico, 22 para RNA
transferente y 13 para protenas; stas forman parte de los complejos enzimticos respiratorios I, III, IV y V,
pero suponen slo el 5% de las protenas mitocondriales, estando el resto codificadas por DNA nuclear.
CAPTULO 2
Componentes de los cidos nucleicos
2.1 COMPONENTE CIDO: FOSFATOS

2.1.1 Difosfatos
2.1.2 Trifosfatos
2.1.3 Tipos de enlaces fosfato
2.2 COMPONENTE NEUTRO: AZCARES
2.3 COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS
2.3.1 Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos
2.3.2 Otras bases de inters biolgico y clnico
2.3.3 Propiedades fisicoqumicas de las bases
purnicas y pirimidnicas
2.3.3.1 Existencia de dipolos
2.3.3.2 Hidrofobia
2.3.3.3 Disposicin coplanar de los anillos
2.3.3.4 Tautomera o isomera dinmica
2.3.3.5 Propiedades cido-base
2.3.3.6 Absorcin de la luz en el ultravioleta
2.4 ESTRUCTURA DE NUCLESIDOS
2.4.1 Caractersticas generales
11
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13
13
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14
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16
16
16
16
16
16
16
16
17
17
2.4.2 Tipos de nuclesidos

2.4.2.1 Nuclesidos que forman parte
de cidos nucleicos
2.4.2.2 Otros nuclesidos de inters biolgico y clnico
2.5 ESTRUCTURA DE NUCLETIDOS
2.5.2 Nucletidos sencillos
2.5.2.1 Nomenclatura
2.5.2.2 Estructura de los nuclesidos-monofosfato
que forman parte de los cidos nucleicos
2.5.3 Propiedades fisicoqumicas de nuclesidos y nucletidos
2.5.3.1 Propiedades inicas
2.5.3.2 Formacin de complejos
2.5.3.4 Nucletidos como molculas
de reserva energtica
2.5.3.5 Hidrlisis
2.5.4 Nucletidos cclicos y nucletidos complejos
18
18
19
19
19
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23
23
23
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24
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Los cidos nucleicos (DNA y RNA) estn constituidos por la unin de numerosos nucletidos, de 4 tipos.
Como introduccin a su estudio, se consideran algunos aspectos de inters para cada uno de los componentes
estructurales de dichas unidades, los nucletidos:
2:1
2.1 COMPONENTE CIDO: FOSFATOS

El fosfato inorgnico (Pi), mezcla de las especies qumicas resultantes de la disociacin de la molcula de cido
fosfrico, aparece como anin a pH cido, como dianin a pH fisiolgico y como trianin a pH alcalino. En la
clula, el fosfato se encuentra tanto en forma libre (Pi) como formando parte de numerosos compuestos
orgnicos (RP), resultado de un enlace ster entre el fosfrico y un grupo hidroxilo (alcohol); entre ellos se
encuentran los nucletidos.
11
12
2:2
Cuando un nucletido se encuentra formando parte de un cido nucleico, su grupo fosfato est esterificado
al mismo tiempo con dos grupos alcohol (formando un enlace fosfodister, pg. 28), por lo que slo existe un
equilibrio de ionizacin. El pK de tal ionizacin es similar al pK1 del cido fosfrico, razn por la que se
denominan cidos nucleicos:
2:3
2.1.1 Difosfatos
El difosfato o pirofosfato (PPi) se presenta a pH fisiolgico como trianin (una de las 4 formas inicas del cido
pirofosfrico). Es estable en disolucin a pH neutro o alcalino; sin embargo, dentro de la clula es inestable por
accin de las pirofosfatasas, que lo hidrolizan formando 2 Pi. Aparece combinado fundamentalmente en
nuclesidos-difosfato (por ejemplo, ADP).
2:4
2. Componentes de los cidos nucleicos
2.1.2 Trifosfatos
El trifosfato (PPPi) se presenta a pH fisiolgico como tetraanin. No aparece en forma libre en las clulas, sino
formando parte, esencialmente, de nuclesidos-trifosfato (por ejemplo, ATP).
2:5
La elevada densidad de carga negativa presente en estos compuestos es responsable de que los nuclesidostrifosfato, los nuclesidos-difosfato y el PPi, e incluso el Pi, se encuentren en la clula en su mayor parte
formando complejos con iones Mg2+ (pgs. 23-24).
2.1.3 Tipos de enlaces fosfato

Pueden distinguirse cinco tipos de enlaces fosfato que van a formar parte de los nucletidos. Obsrvese la
estructura y nombre de todos ellos, as como la diferencia entre enlaces ster y anhdrido en los nuclesidos
difosfatados y trifosfatados.
2:6
13
14
Ms adelante se irn encontrando ejemplos de biomolculas con estos enlaces, tales como el AMP
(fosfoster, pg. 20), los dinucletidos, oligonucletidos y cidos nucleicos (fosfodister), la vitamina B12
(fosfodister, pg. 19), el ADP (difosfato, pg. 20), el ATP (trifosfato, pg. 20), o las coenzimas NAD, FAD
y CoA (disteres pero tambin difosfatos, pg. 25).
2.2 COMPONENTE NEUTRO: AZCARES

El azcar (en su denominacin histrica, una osa) siempre es una pentosa (monosacrido con 5 tomos de
carbono), bien la D-ribosa o la D-desoxirribosa. La ribosa (nombre derivado de osa del Rockefeller
Institute of Biochemistry, 1908) interviene en nuclesidos y nucletidos bajo su forma ms estable,
b-D-ribofuranosa.
2:7
La frmula representada como ejemplo puede extenderse a otras muchas molculas de inters bioqumico,
como D-glucosa, D-galactosa, 3-desoxi-D-ribosa, etc., aunque stas no forman parte de los cidos nucleicos, por
lo que no se exponen aqu.
2.3 COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS

Son molculas heterocclicas, con varios tomos de nitrgeno, formadas bien por un anillo nico (pirimidina) o
bien por dos anillos condensados (purina). Obsrvense en los ejemplos de bases que intervienen en los cidos
nucleicos la numeracin de los tomos del heterociclo y la posicin de los sustituyentes externos.
2.3.1 Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos
2:8
2.3.2 Otras bases de inters biolgico y clnico

Existen otras bases purnicas y pirimidnicas, en general poco frecuentes, que bien se sintetizan a partir de o bien
pueden considerarse como derivados estructurales de las bases principales A, G, C, T y U o de la hipoxantina
(H), una base purnica emparentada metablicamente. Algunas existen de forma natural, mientras que otras se
han obtenido de modo sinttico. Algunas forman parte de la estructura de cidos ribonucleicos, o presentan
una funcin en el DNA (metilacin de las citosinas como seal de regulacin epigentica, pg. 278). Otras, en
particular sintticas, muestran utilidad como agentes antibiticos, antivricos o antitumorales.
Web 2.1. Bases nitrogenadas infrecuentes y derivados de bases.
Web 2.2. Agentes antivirales: anlogos de bases, nuclesidos y nucletidos.
15
16
2.3.3 Propiedades fisicoqumicas de las bases purnicas y pirimidnicas

2.3.3.1 Existencia de dipolos
Todas las bases poseen tomos electronegativos de oxgeno (excepto la adenina), en posicin exocclica o
extranuclear, y de nitrgeno, tanto exocclicos como en el anillo, nucleares. Como consecuencia, son
abundantes los enlaces polares, lo que les permite interaccionar entre s mediante puentes de hidrgeno,
que poseen una importancia capital en la estructura secundaria de los cidos nucleicos, en especial del
DNA (captulo 4).
2.3.3.2 Hidrofobia
La naturaleza aromtica de los anillos hace que las bases tengan un marcado carcter apolar, sean hidrfobas y
poco solubles en agua al pH celular, cercano a la neutralidad. A pH cido o alcalino adquieren carga y se hacen
ms solubles en agua. Como ya se estudiar, el efecto hidrfobo (es decir, el aislamiento de las bases evitando el
contacto con el agua) y las interacciones de apilamiento, que tienen lugar entre bases dispuestas paralelamente
(a modo de monedas apiladas), son esenciales para estabilizar la estructura tridimensional de los cidos
nucleicos.
2.3.3.3 Disposicin coplanar de los anillos

La observacin de modelos tridimensionales permite apreciar la coplanariedad de los anillos y de buena parte
de sus sustituyentes, asociada con el carcter aromtico.
Web 2.3. Estructura tridimensional de los anillos.
2.3.3.4 Tautomera o isomera dinmica

Los grupos funcionales ceto y amino de las bases estn sometidos a equilibrios tautomricos que afectan, entre
otras cosas, a su capacidad de ionizacin y de formacin de enlaces de hidrgeno. A pesar de ello, en las bases
libres las formas tautomricas lactama (ceto) y amina son las predominantes.
Web 2.4. Tautomera de las bases nitrogenadas.
2.3.3.5 Propiedades cido-base

Todas las bases nitrogenadas son bases dbiles, pues sus tomos de N, tanto nucleares como extranucleares, se
pueden protonar, con valores de pKb comprendidos entre 9 y 10. Sin embargo, este carcter bsico, propio de
los anillos purina y pirimidina, se ve disminuido por la presencia de algunos sustituyentes. En concreto, es
ligeramente cido el grupo -OH de las formas lactima tautomricas en las bases nitrogenadas con grupos
lactama (ceto).
Web 2.5. Propiedades cido-base de las bases nitrogenadas.

sta es una propiedad caracterstica de las bases purnicas y pirimidnicas, debida a su carcter aromtico. En
los espectros de absorcin, a pH = 7, se observa una fuerte absorcin de la luz en el ultravioleta (UV), con un
mximo cerca de 260 nm para todas ellas.
2:9
El mantenimiento de esta propiedad en nuclesidos, nucletidos (pg. 24) y cidos nucleicos, de los que las
bases forman parte, permite su utilizacin analtica en estos compuestos; por ejemplo, para la cuantificacin de
cidos nucleicos (pg. 32). Debe adelantarse, sin embargo, que la magnitud de la absorcin se ve reducida
cuando las bases forman parte de cidos nucleicos, en especial si son bicatenarios (pgs. 32 y 163).
Web 2.6. Absorcin de la luz por las bases nitrogenadas.
2.4 ESTRUCTURA DE NUCLESIDOS

Corresponde al esquema general: nuclesido = base nitrogenada + azcar.
Tambin pueden considerarse como el producto de la hidrlisis de los nucletidos, con liberacin de fosfato
inorgnico. Equivale, por tanto, a un nucletido carente de fosfatos.
2:10

La unin covalente (enlace N-glicosdico) entre la base y el azcar (ribosa o desoxirribosa) se establece entre el
C-1 (carbono anomrico) del azcar y el N-1 del anillo pirimidnico o el N-9 del anillo purnico, con prdida de
una molcula de agua.
17
18
2:11
2.4.2 Tipos de nuclesidos

Debe distinguirse entre nuclesidos constituyentes de cidos nucleicos y otros nuclesidos de inters biolgico y
clnico. Su descripcin siempre se hace en funcin de la naturaleza qumica de la base y del azcar, como se ver
a continuacin.
2.4.2.1 Nuclesidos que forman parte de cidos nucleicos
2:12
La distincin entre ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos estriba, obviamente, en la presencia de ribosa
o desoxirribosa en la molcula.
2.4.2.2 Otros nuclesidos de inters biolgico y clnico

Adems de los componentes de nucletidos y cidos nucleicos, existen en la naturaleza otros nuclesidos en
forma libre o combinada. Algunos de ellos son significativos por su localizacin o accin bioqumica, e incluso
por sus aplicaciones clnicas. Cabe citar los siguientes:
Nuclesidos componentes de los RNA, como inosina, pseudouridina, dihidrouridina, etc.

Nuclesidos como formas activadas de los precursores biosintticos: UDP-glucosa, CMP-silico, etc.
Componentes de coenzimas: S-adenosilmetionina, vitamina B12, etc.
Antibiticos, como la puromicina.
Anlogos de nuclesidos naturales con aplicacin antiviral o anticancerosa. Destaca una amplia variedad de
frmacos inhibidores de la transcriptasa inversa, que se emplean para combatir los retrovirus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2), causantes del sida.
Web 2.7. Estructuras de otros nuclesidos.
2.5 ESTRUCTURA DE NUCLETIDOS

Corresponde al esquema general:
nucle
otido nucle
osido fosfatos base nitrogenada az
ucar fosfatos
Tambin se puede considerar como:
nucle
otido az
ucar-fosfato base nitrogenada
2:13

La unin, de carcter covalente (fosfomonoster), se establece entre uno o varios grupos fosfato y sendos
grupos OH del azcar del nuclesido.
La importancia de los nucletidos es excepcional, principalmente porque son los monmeros constituyentes
de los cidos nucleicos y, por ello, tanto sus precursores biosintticos como los productos de su hidrlisis. Al
mismo tiempo, porque aparecen en forma libre en distintas localizaciones subcelulares, formando parte de
molculas de gran inters bioqumico (especialmente coenzimas).
Para estudiar los nucletidos se emplean distintos criterios de clasificacin, atendiendo a:
Caractersticas estructurales, criterio utilizado normalmente:
El nmero y posicin en el azcar de los grupos fosfato: nuclesidos-monofosfato, -bifosfato y -trifosfato.
El tipo de azcar: ribonucletidos y 2-desoxirribonucletidos.
El tipo de base nitrogenada: nucletidos purnicos y pirimidnicos.
Su carcter lineal o cclico (determinado por los enlaces del fosfato).
Otras caractersticas, a las que slo se alude ocasionalmente: procedencia o estado en la clula, funcin, etc.
19
20
2:14
2.5.2 Nucletidos sencillos

Se consideran nucletidos sencillos los que presentan fosfato(s) en una sola posicin del azcar; esto incluye
tanto los que tienen un nico fosfato (monofosfatos) como los que tienen dos o tres fosfatos que estn unidos
entre s (difosfatos y trifosfatos). Se muestran como ejemplos los correspondientes a la adenina:
2:15
Los nucletidos que forman parte de los cidos nucleicos son siempre NMP con un fosfato en posicin 5. Su
estructura y nomenclatura se estudian de forma detallada a continuacin. Los nucletidos con 2 o 3 fosfatos
21
consecutivos unidos en 5 (difosfatos o NDP y trifosfatos o NTP, respectivamente), dada su importante funcin
bioqumica, son objeto de estudio en cursos de bioqumica general. Finalmente, otros nucletidos, con fosfatos
en mltiples posiciones del azcar, se estudian posteriormente como nucletidos cclicos o complejos
(pg. 25).
2.5.2.1 Nomenclatura
Los nucletidos se nombran segn dos criterios:
a) Como steres fosfato del nuclesido. Por ejemplo: adenosina-monofosfato, guanosina-difosfato, uridinatrifosfato, etc. (abreviados, respectivamente, como AMP, GDP, UTP).
b) Como cidos, sustituyendo la terminacin del nombre de la base por el sufijo lico. Este criterio slo se
utiliza normalmente para los nuclesidos-monofosfato. Por ejemplo: cido adenlico, cido guanlico, cido
uridlico, etc. (respectivamente, para AMP, GMP y UMP). En el caso de nuclesidos-difosfato y trifosfato,
se emplearan los nombres diadenlico, triadenlico, diguanlico, etc. (para ADP, ATP y GDP). Si se quiere
tener en cuenta que los restos fosfato estn ionizados a pH fisiolgico, se utiliza el sufijo ilato: adenilato,
guanilato, uridilato, etc.
Correspondencia entre los nombres de bases, nuclesidos y nucletidos:

abreviatura
comn:
base:
nuclesido:
nucletido:
(nuclesidomonofosfato,
NMP)
adenina
guanina
uracilo
timina
citosina
adenosina
guanosina
uridina
timidina
citidina
adenilato,
c. adenlico
o AMP
guanilato,
c. guanlico
o GMP
uridilato,
c. uridlico
o UMP
timidilato,
c. timidlico
o TMP
citidilato,
c. citidlico
o CMP
Web 2.8. Desarrollo en profundidad de la nomenclatura y de las abreviaturas normalizadas.
Bajo ambos criterios, para indicar de forma ms detallada la estructura, se especifica el nmero y la posicin
de los fosfatos. Por ejemplo:
adenosina-5-monofosfato
cido 5-adenlico
5-AMP
adenosina-3-monofosfato
cido 3-adenlico
3-AMP
adenosina-5-difosfato
cido 5-diadenlico
5-ADP
adenosina-5-trifosfato
cido 5-triadenlico
5-ATP
Cuando no se especifica el nmero, implcitamente se asume que el fosfato ocupa la posicin 5. En este
sentido, los dos ltimos ejemplos se nombran simplemente como ADP y ATP.
Estos sistemas de nomenclatura se aplican tanto a desoxirribonucletidos como a ribonucletidos.
Lgicamente, para los primeros debe anteponerse el prefijo desoxi- o su forma abreviada, la letra d. Por
ejemplo: desoxicitidina monofosfato, dCMP, desoxicitidilato, 5-dCMP.
Una forma an ms abreviada de representar los nuclesidos-monofosfato es mediante la inicial de su base,
anteponiendo la letra p si el fosfato se une en 5 o posponiendo la p si la unin es en 3. Por ejemplo: pA,
pG, pU, Ap, Gp, Up. Este criterio es de inters para la descripcin de la hidrlisis qumica o enzimtica de los
cidos nucleicos (pgs. 31 y 210).
22
Las tablas siguientes resumen todos los nucletidos sencillos (NMP, NDP y NTP) existentes en la clula,
incluyendo sus distintas denominaciones.
Nomenclatura de nucletidos sencillos purnicos

Bases:
Adenina
Ribonucletidos
Guanina
Desoxirribonucletidos
Ribonucletidos
2-AMP
2-adenilato
adenosina-2-fosfato
2-adenosina-monofosfato
( )
2-GMP
2-guanilato
guanosina-2-fosfato
2-guanosina-monofosfato
(*)
3-AMP (Ap)
3-adenilato
adenosina-3-fosfato
3-dAMP
desoxi-etc.
3-GMP (Gp)
3-guanilato
guanosina-3-fosfato
3-dGMP
desoxi-etc.
5-AMP (pA)
5-adenilato
adenosina-5-fosfato
5-dAMP
desoxi-etc.
5-GMP (pG)
5-guanilato
guanosina-5-fosfato
5-dGMP
desoxi-etc.
difosfato
5-ADP (ppA)
adenosina-5-difosfato
5-adenosina-difosfato
5-dADP
desoxi-etc.
5-GDP (ppG)
guanosina-5-difosfato
5-guanosina-difosfato
5-dGDP
desoxi-etc.
trifosfato
5-ATP (pppA)
adenosina-5-trifosfato
5-adenosina-trifosfato
5-dATP
desoxi-etc.
5-GTP (pppG)
guanosina-5-trifosfato
5-guanosina-trifosfato
5-dGTP
desoxi-etc.
monofosfato
La desoxirribosa no tiene -OH en C2.
Nomenclatura de nucletidos sencillos pirimidnicos

Bases:
monofosfato
Uracilo
Timina
Ribonucletidos
2-UMP
2-uridilato
uridina-2-fosfato
2-uridina-monofosfato
( )
Citosina
Ribonucletidos
2-CMP
2-citidilato
citidina-2-fosfato
2-citidina-monofosfato
(*)
3-UMP (Up)
3-dTMP (Tp)
3-CMP (Cp)
3-uridilato
3-desoxitimidilato
3-citidilato
uridina-3-fosfato
desoxitimidina-3-fosfato
citidina-3-fosfato
3-uridina-monofosfato 3-desoxitimidina-monofosfato 3-citidina-monofosfato
3-dCMP
desoxi-etc.
5-UMP (pU)
5-dTMP (pT)
5-CMP (pC)
5-uridilato
5-desoxitimidilato
5-citidilato
uridina-5-fosfato
desoxitimidina-5-fosfato
citidina-5-fosfato
5-uridina-monofosfato 5-desoxitimidina-monofosfato 5-citidina-monofosfato
5-dCMP
desoxi-etc.
difosfato
5- UDP (ppU)
uridina-5-difosfato
5-uridina-difosfato
5- dTDP (ppT)
desoxitimidina-5-difosfato
5-desoxitimidina-difosfato
5- CDP (ppC)
citidina-5-difosfato
5-citidina-difosfato
5-dCDP
desoxi-etc.
trifosfato
5- UTP (pppU)
uridina-5-trifosfato
5-uridina-trifosfato
5- dTTP (pppT)
desoxitimidina-5-trifosfato
5-desoxitimidina-trifosfato
5- CTP (pppC)
citidina-5-trifosfato
5-citidina-trifosfato
5-dCTP
desoxi-etc.
Aunque la nomenclatura que se muestra es la sistematizada, es habitual y est reconocido por los organismos responsables de normalizar la
nomenclatura omitir el prefijo desoxi- y utilizar simplemente timidina y timidilato para los nuclesidos y nucletidos de timina con
desoxirribosa. Esto se debe a la presencia sistemtica de T en el DNA y su ausencia en los RNA (salvo excepciones puntuales).
*
La desoxirribosa no tiene -OH en C2.
2.5.2.2 Estructura de los nuclesidos-monofosfato que forman parte de los cidos nucleicos
2:16
2.5.3 Propiedades fisicoqumicas de nuclesidos y nucletidos

2.5.3.1 Propiedades inicas
Como consecuencia de la disociacin en disolucin acuosa de los grupos P, PP y PPP, todos los nucletidos
(NMP, NDP y NTP) muestran un marcado carcter cido, con 2, 3 y 4 valores de pKa, respectivamente. En
general, al ser sus valores de pKa inferiores a 7, se encuentran cargados negativamente (existen como aniones) a
pH fisiolgico. Gracias a este carcter aninico, los nucletidos forman sales con metales, son cristalizables y
son ms solubles en agua que los nuclesidos o sus bases nitrogenadas.
2.5.3.2 Formacin de complejos

Los grupos PP de los NDP y PPP de los NTP muestran gran afinidad (NTP 10 veces ms que NDP) por cationes
divalentes, como Mg2 , Mn2 y Ca2 . Al estar stos presentes en la clula en elevada concentracin, los NDP
23
24
y NTP no existen como aniones libres, sino formando complejos quelato 1:1, principalmente con Mg2+. Bajo
estas formas activas (MgADP1 y MgATP2) ambos nucletidos participan en las reacciones enzimticas de
transferencia de fosfato.
2:17
Web 2.9. Estructura del complejo ATP:Mg.

Los nuclesidos y los nucletidos muestran el caracterstico mximo de absorcin de la luz en el UV, prximo a
260 nm, debido a la base nitrogenada correspondiente (pgs. 16-17).
Web 2.10. Absorcin de la luz por nuclesidos y nucletidos.
2.5.3.4 Nucletidos como molculas de reserva energtica

Muchos nucletidos (fundamentalmente, los NDP y NTP) actan en todo tipo de clulas y en multitud de
procesos metablicos como compuestos ricos en energa. Entre ellos, los nuclesidos-trifosfato intervienen
como precursores de la sntesis de DNA y RNA, con liberacin de pirofosfato.
2.5.3.5 Hidrlisis
Los nuclesidos y nucletidos pueden ser hidrolizados en sus componentes, en medio cido o alcalino. Esta
hidrlisis qumica posee cierto inters en el estudio de los cidos nucleicos. Para ms detalles, vase pg. 31.
2:18
2.5.4 Nucletidos cclicos y nucletidos complejos

Con intencin de un desarrollo completo del captulo y debido a su relacin estructural, cabe mencionar por
ltimo la existencia de otros nucletidos que no forman parte de los cidos nucleicos, pero que desempean
funciones, a menudo esenciales, en los seres vivos.
En primer lugar, existen nucletidos cclicos, que son nuclesidos-monofosfato en los que un mismo fosfato
se une a dos posiciones del azcar (dos -OH diferentes), generalmente 3 y 5. Tienen un papel relevante en la
transmisin de seales desde el entorno (por ejemplo, hormonas o primeros mensajeros) hacia el interior de la
clula. Destacan en esta funcin de segundos mensajeros el AMP cclico (cAMP) y el GMP cclico (cGMP).
Bajo la expresin genrica nucletidos complejos recogemos los que difieren estructuralmente de los
nucletidos sencillos en uno o varios de los siguientes aspectos:
+
Varios grupos fosfato esterificados en posiciones mltiples del azcar (bis- y tris-fosfatos, CoA, NADP ).
+
Presencia de dos nuclesidos, unidos entre s por un puente de grupos fosfato (FAD, NAD , ApnA); stos
entran dentro de la categora de dinucletidos.
+
+
Presencia de otras bases nitrogenadas (FMN, FAD, NAD , NADP ).
Presencia de azcares distintos de la ribofuranosa (FMN, FAD).
Grupos funcionales adicionales (CoA).
Web 2.11. Estructura de nucletidos cclicos y nucletidos complejos.
25
CAPTULO 3
Estructura primaria de cidos nucleicos
3.1 ASPECTOS GENERALES

3.1.1 Niveles estructurales
3.2 ESTRUCTURA PRIMARIA
3.3 DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU
COMPOSICIN
3.4 FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL
3.4.1 Frmula completa
3.4.2 Representaciones esquemticas
3.4.3 Representaciones abreviadas
27
28
28
28
29
29
29
30
3.5 PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS

NUCLEICOS
3.5.1 Propiedades en disolucin
3.5.2 Reactividad
3.5.3 Hidrlisis qumica de cidos nucleicos
3.5.3.1 Hidrlisis cida
3.5.3.2 Hidrlisis alcalina
3.5.4 Absorcin en el ultravioleta
30
30
31
31
31
31
32
3.1 ASPECTOS GENERALES

Tradicionalmente se considera que los cidos nucleicos, como componentes del material gentico, forman parte
de los nucleoproteidos, el grupo ms importante de heteroproteidos o protenas conjugadas, entre los que
tambin se incluyen glicoproteidos y lipoproteidos y, en ocasiones, tambin fosfoproteidos y cromo o metaloproteidos. Efectivamente, los nucleoproteidos resultan de la interaccin, mediante enlaces electrostticos fuertes,
de los residuos bsicos (catinicos) de ciertas protenas (histonas, protaminas) y los grupos fosfato (aninicos) del
cido nucleico. El estudio detenido de estas asociaciones nucleoproteicas se har una vez conocida la estructura
de los cidos nucleicos a todos sus niveles.
Por su composicin qumica elemental (C, H, O, N y P), derivada de la presencia exclusiva de nucletidos en
su estructura, los cidos nucleicos se diferencian de las protenas, esencialmente, en su mayor contenido de
fsforo (10%) y en la ausencia total de azufre.
Existen dos tipos de cidos nucleicos, denominados ribonucleico o RNA y desoxirribonucleico o DNA, que
difieren en los nucletidos componentes. Antes de describir su estructura, recordemos brevemente que ambos
cidos nucleicos se encuentran en todo tipo de clulas, tanto procariotas como eucariotas; como excepcin, los
virus contienen slo DNA o slo RNA. En todos los casos, sus diversas funciones en la transmisin y expresin
de la informacin gentica vienen determinadas por su localizacin subcelular y su estructura de orden superior
(conformacin tridimensional).
Localizacin
Funcin
Eucariotas
Procariotas
Virus
DNA
en ncleo celular (varios

cromosomas), en matriz
mitocondrial y en
estroma de cloroplastos
(varias copias del
cromosoma)
en la zona nucleoide
del citosol (un
cromosoma y varios
plsmidos)
dentro de la
cpsida (slo en
algunos tipos de
virus)
Material gentico: depositario y

transmisor de la informacin gentica,
organizada en genes que codifican
productos gnicos (protenas o RNA)
RNA
en ncleo celular
(temporalmente), en
citosol, en matriz
mitocondrial y en
estroma de cloroplastos
en citosol
dentro de la
cpsida (en otros
tipos de virus)
Interviene en la transmisin de la
informacin desde el DNA hasta los
productos gnicos.
Interviene en el control de la expresin
gnica.
Constituye el genoma de algunos virus
27
28
3.1.1 Niveles estructurales

Desde un punto de vista estructural, para el estudio de los cidos nucleicos se pueden considerar varios niveles,
similares, en cierto modo, a los descritos tradicionalmente para protenas:
Estructura primaria, descrita por la unin covalente de numerosos nuclesidos mediante enlaces fosfodister, dando lugar a un polmero lineal. El orden de los nuclesidos (o sus bases) en la cadena define la secuencia del cido nucleico.
Estructura secundaria, con la que se inicia el anlisis espacial de la molcula, correspondiente a interacciones
no covalentes que definen la conformacin local, es decir, la disposicin relativa de nucletidos que estn
prximos en la secuencia. Para el DNA este nivel estructural viene definido por la asociacin, mediante
enlaces de hidrgeno, de dos cadenas polinucleotdicas a travs de las bases nitrogenadas que sobresalen del
esqueleto azcar-fosfato. En el RNA slo se presenta en determinadas regiones de la molcula.
Estructuras de orden superior: Se engloban bajo este trmino genrico todas aquellas estructuras tridimensionales que surgen a partir de los niveles primario y secundario. En el caso del DNA pueden incluirse aqu las
estructuras resultantes del superenrollamiento y de la asociacin con protenas bsicas para formar la
cromatina. Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre en protenas, en general la estructura adoptada a
este nivel no viene determinada por las de los niveles inferiores. En el caso de algunos RNA (especialmente los
tRNA y rRNA) s se observa un plegamiento tridimensional bien definido, equiparable a la estructura terciaria de las protenas. Aun en este caso, no se observa una estructura cuaternaria, ya que dicho plegamiento slo afecta a una molcula y no a varias asociadas entre s, como s ocurre en las protenas.
3.2 ESTRUCTURA PRIMARIA

La estructura primaria, comn para DNA y RNA, consiste en la existencia de cadenas, generalmente largas, de
carcter macromolecular, formadas por la unin de nuclesidos mediante enlaces covalentes 3-5-fosfodister.
Por tanto, la unidad monomrica es el nucletido, o nuclesido-monofosfato (generalmente contemplado
como 5-NMP).
Los cidos nucleicos son, por tanto, polmeros de nucletidos o polinucletidos, con un esqueleto lineal
formado por unidades alternas de fosfato y pentosa (parte constante de la secuencia), del cual sobresalen lateralmente las bases (parte variable, que define la secuencia), unidas al azcar respectivo por enlaces N-glicosdicos.
Por convenio, la secuencia siempre se indica en direccin 5 ! 3, es decir, con el extremo 5 terminal (5-P)
a la izquierda y el extremo 3 terminal (3-OH) a la derecha.
3:1
Dentro de este nivel estructural se estudiarn a continuacin las diferencias en composicin qumica de los
dos tipos de cidos nucleicos, las distintas formas de representacin y sus propiedades fisicoqumicas ms
representativas.
3.3 DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN
3. Estructura primaria de cidos nucleicos
Segn la notacin de frmula completa (exceptuando el detalle de las bases), la representacin de ambos
cidos nucleicos es la siguiente:
3:2
3.4 FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL

Pueden emplearse hasta 6 niveles, de simplificacin creciente. En general, se hace uso de la letra inicial de las
bases, en maysculas, para representar a stas, a sus nuclesidos o a sus nucletidos. El cido nucleico
propuesto como ejemplo es un RNA (azcar: ribosa y bases: A, G, U y C), pero las representaciones son
igualmente vlidas para un DNA (azcar: desoxirribosa y bases: A, G, T y C).
3.4.1 Frmula completa

Por razones de espacio y fundamentalmente didcticas, es aconsejable comenzar con una representacin
vertical del esqueleto del cido nucleico (notacin 1 en la figura), que permite apreciar con detalle los enlaces
fosfodister entre nuclesidos consecutivos (uniones azcar-fosfato) y la situacin transversal al esqueleto de
los enlaces N-glicosdicos (uniones azcar-base). Para mantener la orientacin 5 ! 3, se sita el extremo 5-P
en la parte superior y el extremo 3-OH en la inferior.
3.4.2 Representaciones esquemticas

Como peculiaridad de esta representacin, el anillo furansico del azcar se simplifica mediante un solo trazo
vertical, cuyo extremo superior corresponde al C-1 y el inferior al C-5 (notacin 2 en la figura).
En una forma an ms simple se omiten los fosfatos intermedios y la numeracin de los azcares
(notacin 3).
29
30
3:3
3.4.3 Representaciones abreviadas

La simplificacin se puede aumentar indicando cada nuclesido mediante la letra inicial de su base nitrogenada
(lo nico variable en la secuencia). El polinucletido queda as reducido a una sucesin de letras maysculas
intercaladas con letras p minsculas (notacin 4). El extremo 5-P (a la izquierda) viene representado por una
letra p seguida por la letra del primer nuclesido. El extremo 3-OH, a la derecha, viene dado por la letra del
ltimo nuclesido. Los nuclesidos intermedios llevan la p a izquierda y derecha, correspondientes a las
posiciones 5 y 3, respectivamente.
En la descripcin cotidiana de secuencias de cidos nucleicos se suprimen las letras p intermedias, con
lo que la representacin se reduce a una secuencia de letras precedida por una letra p para el fosfato en
el extremo 5 (notacin 5), o se asume la presencia del fosfato en 5 y se omite incluso esa primera p
(notacin 6).
3.5 PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Los cidos nucleicos presentan propiedades importantes relacionadas con sus funciones de almacenamiento
(estructura), transmisin (replicacin) y expresin (transcripcin y traduccin) de la informacin gentica. Se
comentan aqu brevemente algunas de ellas, relacionadas con la estructura, y el resto se irn estudiando a
medida que surja su aplicacin al propio estudio de estas molculas (por ejemplo, la renaturalizacin de un
DNA desnaturalizado se analizar como fundamento de la hibridacin, captulo 12).
3.5.1 Propiedades en disolucin

Las cadenas polinucleotdicas de DNA y RNA son hidrfilas, debido a la posibilidad de formacin de enlaces
de hidrgeno con el agua por parte de los numerosos grupos fosfato y -OH del azcar a lo largo del esqueleto.
31
Aunque las bases son esencialmente hidrfobas, como se discutir pronto su contribucin a la polaridad de la
molcula se reduce debido a su ubicacin aislada del medio acuoso.
Por otro lado, a pH fisiolgico los grupos fosfato (con un pKa prximo a 2) se ionizan casi por completo,
haciendo que las molculas de DNA y RNA se comporten como cidos y tengan numerosas cargas
negativas. Debido a este carcter polianinico, los cidos nucleicos se encuentran casi siempre neutralizados
por interaccin inica con las cargas positivas de otras molculas. Concretamente, el DNA del genoma
nuclear eucaritico se encuentra unido a histonas, protenas ricas en arginina y lisina, cargadas positivamente a pH fisiolgico, dando lugar a nucleoproteidos; la importancia de esta asociacin se considerar
posteriormente (pg. 84). En los espermatozoides, el papel de las histonas lo desempean pequeas
protenas ricas en arginina, denominadas protaminas y tambin con fuerte carga positiva. En otras ocasiones, el DNA se une a poliaminas (principalmente espermina y espermidina, as llamadas por haber sido
detectadas originalmente en el semen), distribuidas de forma amplia, pero especialmente en algunos virus y
bacterias en estado de rpida proliferacin. As, por ejemplo, en el fago T4 las poliaminas neutralizan un
40% de la carga negativa total del DNA, estabilizando su conformacin. Por ltimo, como resultado
experimental de esta propiedad, la cristalizacin de cidos nucleicos se facilita si su carga negativa se
compensa por la unin de iones metlicos.
Debido a la relativa rigidez de la molcula (en doble hlice) y a su inmensa longitud en relacin al dimetro,
las disoluciones de DNA son muy viscosas. Esta propiedad tiene inters en relacin con el estudio del proceso de
desnaturalizacin (pg. 165).
3.5.2 Reactividad
En general, los cidos nucleicos son qumicamente muy estables, especialmente el DNA. Ello se debe a que la
desoxirribosa carece de grupos reactivos: el 4-OH est comprometido en el cierre del anillo, y los 3-OH y
5-OH estn formando enlaces fosfodister. El RNA es algo ms reactivo, gracias a los grupos 2-OH, lo que se
refleja en sus propiedades, por ejemplo, su hidrlisis en medio alcalino, como se ver a continuacin.
3.5.3 Hidrlisis qumica de cidos nucleicos

3.5.3.1 Hidrlisis cida
Los cidos fuertes escinden tanto los enlaces fosfodister entre nuclesidos como los enlaces N-glicosdicos de
cada nucletido. Por tanto, sirven para analizar la composicin de bases de un cido nucleico, pero no para
determinar su secuencia.
Los cidos dbiles respetan los enlaces fosfodister, pero tienden a romper la unin N-glicosdica. Este
enlace es ms lbil con purinas que con pirimidinas, por lo que se puede conseguir (por ejemplo, a pH = 3)
escindir de manera selectiva las bases purnicas, dando lugar a los denominados cidos apurnicos. Esta
hidrlisis tuvo cierto inters histricamente para el anlisis parcial de la secuencia del DNA.
DNA
RNA
Enlaces fosfodister
(entre nuclesidos)
Enlaces N-glicosdicos
(en cada nuclesido)
Enlaces fosfodister
(entre nuclesidos)
Enlaces N-glicosdicos
(en cada nuclesido)
Medio cido fuerte

(p. ej., HCl 1M)
Medio cido dbil
No
S (todos o purinas)
No
S (todos o purinas)
Medio alcalino
No
No
No
Se hidrolizan?
3.5.3.2 Hidrlisis alcalina

El medio bsico afecta de distinta manera a los enlaces fosfodister, hidrolizando los del RNA, pero no los del
DNA; los enlaces N-glicosdicos son resistentes.
32
El RNA se hidroliza rpidamente, liberando sus nucletidos, en disoluciones diluidas de NaOH (pH = 11),
sin afectar a los enlaces N-glicosdicos. La hidrlisis de los enlaces entre azcar y fosfato se debe a la implicacin
directa de los grupos 2-OH de la ribosa en la catlisis qumica. Se forman as NMP 2:3-cclicos como
productos intermedios, que se hidrolizan rpidamente en el medio alcalino, al azar a uno u otro lado del enlace
2:3-fosfodister, para dar una mezcla de los 2-NMP y 3-NMP.
3:4
El DNA, al contrario que el RNA, es resistente a la hidrlisis en medio alcalino. Ello se debe a la ausencia de
grupos 2-OH en las unidades de desoxirribosa, lo que impide el mecanismo expuesto anteriormente. sta es
una de las pocas diferencias en las propiedades de ambos tipos de cido nucleico y, por ello, es esencial en el
diseo de los mtodos de purificacin o de anlisis de DNA.
3.5.4 Absorcin en el ultravioleta

La similitud en el valor mximo de absorbancia de las distintas bases (pg. 16) puede utilizarse no slo para
detectar y cuantificar las bases, los nuclesidos y los nucletidos, sino tambin y especialmente para determinar
la concentracin de los cidos nucleicos. De hecho, es el procedimiento que se utiliza comnmente, a pesar de
no ser el ms exacto. Basta con medir el valor de A260 en una disolucin diluida de DNA o RNA para poder
calcular su concentracin. Sin embargo, es conveniente la realizacin de algunos controles, teniendo en cuenta
sobre todo la posible contaminacin con protenas, cuya presencia contribuye a la absorcin y, por tanto,
interfiere en esta determinacin.
Efectivamente, aunque los mximos de absorcin son caractersticos de cada uno de estos compuestos
(260 nm para cidos nucleicos y 280 nm para protenas), ambos absorben en cierta medida a las dos
longitudes de onda. Por ejemplo, la absorbancia de protenas a 260 nm es, para igual concentracin,
unas 20 o 30 veces inferior a la de los cidos nucleicos. En la prctica, teniendo en cuenta esta situacin, se deben emplear ambos valores de absorbancia (A260 y A280) para poder corregir la interferencia
mutua y as determinar de forma correcta las concentraciones de cido nucleico y de protena.
Web 3.1. Absorcin de la luz por los cidos nucleicos.
33
CAPTULO 4
Estructura secundaria del B-DNA
4.1 ANTECEDENTES EXPERIMENTALES:

ESTEREOQUMICA Y DIFRACCIN DE RAYOS X
4.2 PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS:
REGLAS DE CHARGAFF
4.2.1 Algunas relaciones entre bases son iguales en
todas las especies
4.2.1.1 Relacin entre bases
4.2.1.2 Relacin entre purinas y pirimidinas
4.2.1.3 Relacin entre aminobases y oxobases
4.2.2 Otras relaciones son diferentes segn la especie
4.3 MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA
4.3.1 Complementariedad de las bases nitrogenadas
4.3.1.1 Consecuencias de la complementariedad
35
36
37
37
37
37
37
38
38
40
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.3.7
4.3.8
4.3.9
4.3.1.2 Efecto del pH sobre el emparejamiento

de bases
Geometra de los pares de bases
Antiparalelismo de las dos hebras
Diferencias en la secuencia de ambas hebras
Helicidad y carcter dextrorso
Parmetros cuantitativos de la doble hlice
Carcter anfiptico y estabilidad de la doble hlice
4.3.7.1 Situacin de los fosfatos y carcter hidrfilo
4.3.7.2 Coplanariedad, apilamiento de las bases
y carcter hidrfobo
Superficie de la molcula: surcos en el DNA
Significado biolgico: idoneidad para la replicacin
41
42
42
42
43
43
44
44
44
45
45
4.1 ANTECEDENTES EXPERIMENTALES: ESTEREOQUMICA Y DIFRACCIN DE RAYOS X
4:1
El anlisis por difraccin de rayos X ha influido notablemente sobre el conocimiento de la estructura secundaria del DNA. Desde sus inicios se observaron, incluso en muestras de DNA sin purificar por completo, seales
que correspondan a un espaciado regular de 0,34 nm a lo largo de las fibras de DNA. En la dcada de 1950 se
obtuvieron datos ms precisos (principalmente en los laboratorios de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin),
35
36
con muestras de DNA mejor purificado y haciendo uso de los mtodos de difraccin de rayos X, que ya se
haban desarrollado para el estudio estructural de protenas. A partir de los correspondientes patrones de
difraccin, donde la distribucin de las manchas en forma de aspa indica una estructura en hlice y las bandas
intensas en las partes superior e inferior indican la repeticin peridica de estructuras, se concluy que las
molculas de DNA adoptaban una disposicin helicoidal con una doble periodicidad a lo largo del eje de la
hlice, cada 0,34 nm y cada 3,4 nm.
Por otra parte, la qumica de nucletidos permita conocer la existencia de interacciones por apilamiento, as como la asociacin mediante puentes de hidrgeno (emparejamiento o apareamiento). Todos
estos datos experimentales, junto con el anlisis de la proporcin de las bases constituyentes de la molcula,
cuyas conclusiones se exponen a continuacin, y la construccin de modelos moleculares, sirvieron de base
para la propuesta por Watson y Crick de la estructura de doble hlice, cuya descripcin es el objeto principal de
este captulo.
4.2 PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

A pesar de que la composicin de bases puede parecer un aspecto ligado a la estructura primaria, se estudia en
este captulo por estar directamente relacionada con la estructura secundaria del DNA. En un principio se crey
que el DNA estaba formado por cantidades iguales de los cuatro nucletidos A, G, C y T, e incluso que la
unidad fundamental era el tetranucletido, hasta que Erwin Chargaff, entre otros, observ distintas proporciones de los 4 nucletidos en diversos organismos. Concretamente, los DNA aislados a partir de clulas o
tejidos diferentes de distintos individuos, dentro de una misma especie, presentan idntica composicin de
bases, que adems no cambia con la edad, estado nutricional o variaciones del entorno. La composicin
del DNA es, por tanto, caracterstica de cada especie. A partir de esos datos se formularon unas reglas o
generalizaciones cuantitativas sobre la composicin de bases del DNA, que fueron la clave para deducir su
estructura bicatenaria.
Composicin de bases (% moles)
Relacin entre bases
Adenina
Timina
Guanina
Citosina
A
T
G
C
Purinas/
Pirimidinas
AG
TC
Animales:
Hombre
Oveja
Rata
Gallina
Tortuga
Salmn
Erizo de mar
30,9
29,3
28,6
28,8
29,7
29,7
32,8
29,4
28,3
28,4
29,2
27,9
29,1
32,1
19,9
21,4
21,4
20,5
22,0
20,8
17,7
19,8
21,0
20,4
21,5
21,3
20,4
17,3
1,05
1,04
1,01
0,99
1,06
1,02
1,02
1,01
1,02
1,05
0,95
1,03
1,02
1,02
1,03
1,03
1,02
0,97
1,05
1,02
1,02
1,52
1,36
1,36
1,38
1,33
1,43
1,85
Bacterias:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Chlostridium perfringens
Brucella abortus
Sarcina lutea
24,7
30,8
36,9
21,0
13,4
23,6
29,2
36,3
21,1
12,4
26,0
21,0
14,0
29,0
37,1
25,6
19,0
12,8
28,9
37,1
1,05
1,05
1,02
1,00
1,08
1,02
1,11
1,09
1,00
1,00
1,03
1,07
1,04
1,00
1,02
0,94
1,50
2,73
0,73
0,35
24,3
26,3
32,7
26,4
24,1
22,3
18,5
22,3
0,74
1,00
1,30
1,00
0,95
1,00
1,34
1,18
Virus:
Fago f174 (monofilar)
Fago f174, forma
replicativa (bifilar)
Relacin de
asimetra
AT
GC
9
>
>
>
>
=
>
>
>
>
;
9
>
=
>1
>
<1
>
;
37
4. Estructura secundaria del B-DNA
4.2.1 Algunas relaciones entre bases son iguales en todas las especies
A pesar de que la composicin vara entre especies, en todas ellas se cumplen ciertas relaciones entre las bases,
formuladas como las tres primeras reglas de Chargaff, que se exponen a continuacin.
4.2.1.1 Relacin entre bases

En prcticamente todas las especies, el contenido de A se aproxima al de T, y el contenido de G al de C:
4:2
Esta observacin pudo explicarse una vez que Watson y Crick postularon la naturaleza bicatenaria del
DNA, definida mediante la complementariedad de bases en los pares AT y GC. Hay que destacar que esta regla
no se cumple para las pocas especies cuyo material gentico est formado por RNA o DNA monocatenarios
(comprense en la tabla los ejemplos del virus f174, en sus formas monocatenaria y bicatenaria).
4.2.1.2 Relacin entre purinas y pirimidinas

Como consecuencia de lo anterior, el contenido de bases purnicas (A + G) se aproxima al de bases
pirimidnicas (T + C), es decir, siempre hay un 50% de purinas y un 50% de pirimidinas:
4:3
4.2.1.3 Relacin entre aminobases y oxobases

Al observarse que A/T = C/G = 1, tambin se ha de cumplir (por razones estrictamente matemticas) que
(A + C) / (T + G) = 1. Por tanto, puede concluirse, como relacin adicional (sin un significado especial), que:
6-aminopurinas A 4-aminopirimidinas C 6-oxopurinas G 4-oxopirimidinas T
4.2.2 Otras relaciones son diferentes segn la especie

Otras relaciones entre bases no se mantienen constantes entre especies; de entre ellas, resulta til la denominada
razn de asimetra:
AT
GC
que, adems de tener un valor diferente para cada especie, no se aproxima a la unidad como las razones
anteriores (v. tabla). Por ejemplo, en animales la razn de asimetra es siempre superior a uno; lo mismo ocurre
en plantas superiores y hongos. Por contraste, en bacterias y virus los valores son mucho ms variados y
superiores o inferiores a la unidad.
38
La razn de asimetra puede tambin calcularse directamente a partir del contenido en G+C, parmetro
habitual en otros tipos de estudio, como la desnaturalizacin del DNA (pg. 167 y web 12.1):
raz
on de asimetra
A T %A T 100 %G C
G C %G C
%G C
De acuerdo con ello, los animales, plantas superiores y hongos muestran un exceso de A+T (de 50 a 65%)
sobre G + C (de 50 a 35%), mientras que en bacterias y virus se aprecia la gran variabilidad en G+C (de 25 a
75% dependiendo de la especie).
4:4
En resumen, con estos estudios se ha observado que los DNA de especies evolutivamente relacionadas
poseen una razn de asimetra similar, mientras que las especies muy alejadas tienden a tener una razn
diferente. A pesar de ser sta la menos conocida de las reglas de Chargaff, el hecho de que permita distinguir
entre especies hace que pueda utilizarse como uno de los criterios en las relaciones evolutivas y en las
clasificaciones taxonmicas de los organismos.
4.3 MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA

El modelo tridimensional, como estructura de referencia para las propiedades del DNA, fue postulado por
James Watson y Francis Crick en 1953. Corresponde a la actualmente denominada forma B del DNA, la ms
comn en las clulas y la ms estable de todas las que puede adoptar un DNA bajo condiciones fisiolgicas. Este
modelo se bas tanto en las observaciones por rayos X como en las reglas de Chargaff, as como en otros
estudios realizados mediante tcnicas diversas, y permite justificar todos esos resultados experimentales.
Simultneamente se propuso la adecuacin del modelo a la funcionalidad de la molcula de DNA para la
conservacin y transmisin de la informacin gentica (pgs. 45-46). A continuacin se relacionan las
caractersticas que conforman el modelo estructural de Watson y Crick.
4.3.1 Complementariedad de las bases nitrogenadas

La estructura qumica de las bases permite la formacin de enlaces por puente de hidrgeno (dos tomos
electronegativos, como N y O, comparten un tomo de hidrgeno cuando los 3 estn en lnea y la distancia es
cercana a 3 ). En concreto, dos nucletidos pueden interaccionar de forma especfica mediante dichos enlaces
y se habla de bases complementarias, pares de bases o emparejamiento de bases.
Para una mejor comprensin de la complementariedad, es conveniente establecer unos criterios previos en
cuanto a la escritura de los nucletidos en cada pareja de bases. Se trata con ello, simplemente, de facilitar la
descripcin de unas estructuras relativamente complejas:
4:5a
39
40
4:5b
Las interacciones ptimas se forman entre G y C (tres enlaces de hidrgeno) y entre A y T, o bien A y U (dos
enlaces de hidrgeno). El par GC establece as una interaccin ms fuerte que el par A=T (en el DNA) o el par
A=U (en el RNA). Obsrvese que siempre se forma un enlace de hidrgeno entre los dos tomos de N nucleares,
mientras que los restantes se forman entre un grupo amino exocclico y un grupo carbonilo.
Las interacciones ptimas mostradas corresponden a los tautmeros ms abundantes (pg. 16); en los
casos en que por alguna razn se estabilice otra forma tautomrica, los emparejamientos de bases sern
diferentes.
Web 4.1. Diferencias en el emparejamiento de bases.
Tambin son posibles otros emparejamientos entre bases, entre ellos los denominados de tipo Hoogsteen,
que aparecen menos frecuentemente y no forman parte del B-DNA. Pueden encontrarse, por ejemplo, en el
RNA (pg. 66), en los puentes entre 3 bases en DNA o RNA (pgs. 55-56) y en la interaccin codnanticodn (pg. 315).
4.3.1.1 Consecuencias de la complementariedad

Gracias a la complementariedad descrita, dos cadenas polinucleotdicas se pueden asociar a todo lo largo
siempre y cuando todas sus bases sean complementarias. Este emparejamiento completo de las dos cadenas da
lugar a un cido nucleico bicatenario, que es la estructura habitual del DNA. Esto quiere decir que siempre que
en un DNA exista A, G, C o T en una cadena, se encontrarn respectivamente T, C, G y A en la otra.
Es importante destacar que la complementariedad entre las dos hebras del DNA es fundamental para su
papel como portador de la informacin gentica. Por un lado, porque se reduce la posibilidad de que las bases
sufran modificaciones qumicas accidentalmente. Por otro, porque la informacin est en cierto modo duplicada, aunque las secuencias de ambas hebras son diferentes entre s (pgs. 42-43); esa duplicidad facilita la
correccin de mutaciones y de errores producidos durante la replicacin del DNA.
Adems, la existencia de la complementariedad explica las reglas de Chargaff (pg. 36), y justifica dos
caractersticas estructurales importantes, la helicidad y el antiparalelismo, que se estudian ms adelante.
4:6
4.3.1.2 Efecto del pH sobre el emparejamiento de bases

Los cambios de pH, al afectar a la ionizacin de los grupos funcionales de las bases nitrogenadas y al equilibrio
de tautmeros (pg. 16), modifican las posibilidades de formacin de enlaces de hidrgeno y, por tanto, el
emparejamiento de las bases.
4:7
41
42
Como consecuencia, a valores de pH inferiores o superiores al fisiolgico la reduccin en el nmero de

enlaces de hidrgeno provoca la separacin de las hebras componentes del DNA, fenmeno denominado
desnaturalizacin (pg. 162). No debe confundirse este efecto con la hidrlisis cida o alcalina, bajo condiciones ms extremas, de las cadenas de cido nucleico (pg. 31).
4.3.2 Geometra de los pares de bases

A pesar de la dificultad de visualizar la geometra de un par de bases en ausencia de un modelo cercano a la
realidad (modelo tridimensional, sea material o informtico), se describe a continuacin de la forma ms fiel posible.
La formacin de un enlace de hidrgeno requiere que los tres tomos implicados (dos electronegativos y un
H) se siten sobre una lnea recta. Esta condicin slo se puede cumplir cuando los dos enlaces N-glicosdicos
de los nuclesidos complementarios forman un ngulo, inferior a 90o, con la lnea imaginaria que une los C-1
de ambas pentosas. Esta geometra del par de bases determina la disposicin espacial relativa de las dos hebras
en el DNA (helicidad) y es la causa molecular de la presencia de surcos menor y mayor en su estructura
tridimensional; ambos aspectos se analizan en detalle ms adelante (pgs. 43 y 48).
Una vez establecidos los enlaces de hidrgeno mltiples, las distancias entre los tomos que los forman son
prcticamente iguales para todos los casos. Asimismo, al emparejarse siempre una purina con una pirimidina,
la separacin entre las pentosas de ambas hebras tambin se mantiene constante (por ejemplo, la distancia entre
los C1 o entre los P). Slo de esta manera (distancia constante entre las hebras, independientemente de su
secuencia) es posible la asociacin continua de las dos cadenas para formar una molcula de DNA bicatenario.
4:8
Web 4.2. Geometra de los pares de bases.
4.3.3 Antiparalelismo de las dos hebras

Ya se ha indicado que el emparejamiento completo entre las dos hebras exige que sus secuencias sean
complementarias. Debe aadirse ahora que, estructuralmente, esto slo se puede conseguir si ambas hebras
se disponen en sentidos opuestos: si una avanza de 5 a 3, la otra debe hacerlo de 3 a 5. Se dice que las hebras
tienen polaridad opuesta, o que son antiparalelas. El concepto de antiparalelismo va, pues, estrechamente
ligado al de complementariedad.
Web 4.3. Antiparalelismo de las hebras del DNA.
4.3.4 Diferencias en la secuencia de ambas hebras

Debe destacarse que las dos hebras de un DNA, complementarias y antiparalelas, poseen secuencias totalmente
diferentes, como se puede ver en el ltimo ejemplo mostrado. Es decir, son hebras no idnticas. Este hecho,
aparentemente simple pero que a menudo pasa inadvertido, es de gran trascendencia; en concreto, en el proceso
de transcripcin, la molcula de RNA que se sintetiza es completamente diferente segn cul de las dos hebras
del DNA se transcriba.
En ocasiones se utiliza el trmino hebras equilibradas refirindose a aquellas regiones del DNA en las que
una de las hebras contiene igual proporcin de purinas y pirimidinas. Como consecuencia, la hebra complementaria es tambin equilibrada:
Web 4.4. Relaciones de secuencia y composicin entre ambas hebras.
4.3.5 Helicidad y carcter dextrorso

Las restricciones estricas impuestas por la geometra de los pares de bases (que incluye los enlaces entre base,
pentosa y fosfato, pg. 42) hacen que el emparejamiento completo de las dos hebras slo se pueda establecer
si los pares de bases sucesivos van girando unos con respecto a otros (concretamente, 34,6o en el B-DNA).
Como consecuencia de la acumulacin de estos giros, las hebras de DNA adoptan una disposicin helicoidal (es
decir, cada hebra describe una hlice) y la molcula bicatenaria es una doble hlice.
Geomtricamente, una hlice (genrica, no de DNA), sea sencilla o doble, puede ser de dos tipos: dextrorsa o
sinistrorsa, dependiendo de que gire hacia la derecha o hacia la izquierda.
En el caso de la forma B del DNA, ambas hebras se enrollan alrededor de un eje comn, longitudinal,
formando una doble hlice dextrorsa. La observacin de modelos moleculares tridimensionales permite una
mejor comprensin de este carcter helicoidal.
Web 4.5. Helicidad y carcter dextrorso.
4.3.6 Parmetros cuantitativos de la doble hlice
4:9
43
44
Conocida la separacin entre cada dos pares de bases sucesivos, es posible calcular el nmero total de pares
de bases de una molcula de B-DNA de cualquier longitud, y viceversa.
Web 4.6. Dimensiones de la molcula en doble hlice.
4:10
4.3.7 Carcter anfiptico y estabilidad de la doble hlice

4.3.7.1 Situacin de los fosfatos y carcter hidrfilo
Debido a la interaccin entre las bases de las dos hebras, los esqueletos azcar-fosfato de ambas deben
disponerse hacia el exterior de la doble hlice, estableciendo as interacciones favorables con el medio acuoso
circundante; por ello, el DNA bicatenario muestra un marcado carcter hidrfilo y es muy soluble en agua.
Al mismo tiempo, la distribucin relativa de los fosfatos es la que permite una menor repulsin electrosttica
entre ellos.
Web 4.7. Superficie de la molcula de DNA.
4.3.7.2 Coplanariedad, apilamiento de las bases y carcter hidrfobo

Web 4.8. Interior de la molcula de DNA.
Las bases purnicas y pirimidnicas de ambas cadenas se encuentran dirigidas hacia el interior de la doble
hlice, superpuestas, formando un apilamiento similar a un montn de monedas. Como consecuencia de la
proximidad y paralelismo de los anillos aromticos, se originan entre ellos fuerzas de atraccin, de tipo van der
Waals, llamadas interacciones de apilamiento. Asimismo, esa disposicin evita la interaccin entrpicamente
desfavorable de las bases con el medio acuoso; este efecto hidrfobo contribuye, junto con el apilamiento, a
la estabilizacin de la molcula y a la proteccin de la informacin gentica (constituida por la secuencia
de bases).
Todas estas interacciones son mayoritariamente inespecficas (es decir, son independientes del tipo de base
implicada), a diferencia de los enlaces de hidrgeno entre bases complementarias, que son muy especficos.
Aunque la atraccin entre dos bases en un par no es muy fuerte de forma individual, la acumulacin para todos
los pares de bases de la molcula supone un aporte total muy elevado para la estabilidad de sta.
4:11
4.3.8 Superficie de la molcula: surcos en el DNA

Como se ha observado, la geometra de los pares de bases (pg. 42) y el antiparalelismo de las hebras (pg. 42),
necesarios para la formacin de los puentes de hidrgeno, hacen que los C-1 de los azcares de los dos
nucletidos complementarios no se dispongan simtricamente con respecto a las bases y, por ello, que los
esqueletos desoxirribosa-fosfato de las dos cadenas no se siten en puntos diametralmente opuestos de la doble
hlice. Como consecuencia, a todo lo largo de la estructura en doble hlice se forman dos surcos de diferentes
dimensiones, uno mayor (o hendidura profunda) y otro menor (o hendidura pequea), que van girando de
forma helicoidal, al igual que los dos esqueletos. Los surcos, especialmente el mayor, dejan espacio suficiente
para que molculas externas puedan contactar con las bases; ste es el fundamento de la interaccin del DNA
con numerosas protenas capaces de reconocer secuencias de bases (pgs. 56-59), con funciones tan importantes como la regulacin de la expresin gnica (por ejemplo, factores de transcripcin). En cierto modo, es
como si las protenas leyeran la secuencia a travs de los grupos funcionales de las bases que asoman
dentro del surco mayor del DNA. Las dimensiones del surco mayor son adecuadas para que entre en ellas una
hlice a de una protena (pg. 57) o una tercera hebra de DNA (pgs. 55-56).
Web 4.9. Los surcos en la molcula de DNA.
4.3.9 Significado biolgico: idoneidad para la replicacin
4:12
45
46
El modelo de doble hlice de Watson y Crick permite explicar que se mantenga una estructura regular
a pesar de la variacin de secuencia y que se produzca, mediante un mecanismo muy simple, la duplicacin
del material gentico. En resumen, la replicacin procede de una manera lgica, con dos procesos: a) la
separacin de las dos hebras, y b) la sntesis, a partir de ellas como molde, de otras dos cadenas complementarias (los detalles de este proceso se estudiarn posteriormente, en el captulo 11). Tambin permite
la reparacin de mutaciones y daos en una hebra, al disponerse de la otra como referencia de la secuencia
correcta.
CAPTULO 5
Variaciones en la estructura del DNA
5.1 VARIANTES BICATENARIAS: FORMAS A Y Z

5.1.1 Forma A del DNA, en comparacin
con la forma B
5.1.2 Forma Z del DNA, en comparacin con las
formas B y A
5.2 VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA
SECUNDARIA DEL B-DNA
5.2.1 Curvatura de la doble hlice
5.2.2 Palndromos
5.2.2.1 Concepto y caractersticas
5.2.2.2 Palndromos en molculas
monocatenarias
5.2.2.3 Repeticiones de secuencia
5.2.2.4 Consecuencias estructurales de los
palndromos
a) En cidos nucleicos monocatenarios
b) En DNA bicatenario
5.2.2.5 Funcionalidad de los palndromos
5.2.3 H-DNA: triple hlice
47
48
49
51
51
51
51
5.3 MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES

DE LA UNIN DEL DNA
CON PROTENAS
5.3.1 Descripcin de los motivos estructurales ms
frecuentes
5.3.1.1 Motivo hlice-giro-hlice o
hlice-vuelta-hlice
5.3.1.2 Motivo hlice-bucle-hlice
5.3.1.3 Motivo homeodominio
5.3.1.4 Motivo dedo de zinc
5.3.1.5 Motivo cremallera de leucina
56
57
57
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58
58
59
52
53
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54
54
55
55
La molcula de DNA no es una estructura esttica, sino flexible y dinmica. Gracias a la capacidad de rotacin
alrededor de los enlaces de los nucletidos, el DNA puede adoptar in vivo diversas formas, distintas de la forma
B de Watson y Crick. Se estudian en este captulo:
Aquellas que, manteniendo la estructura helicoidal bicatenaria, presentan una conformacin diferente:
formas A y Z.
Las variaciones conformacionales de carcter local en torno a la estructura B.
La interaccin de regiones especficas del DNA con estructuras caractersticas de algunas protenas.
En general, estos tres tipos de variaciones estructurales se relacionan con funciones importantes en el
metabolismo del DNA, e intervienen, por ejemplo, en el inicio y en la regulacin de los procesos de
replicacin, recombinacin, transcripcin, etc. De ah el inters de su descripcin conjunta, como captulo
independiente, para ampliar la estructura secundaria y sentar las bases de dichas funciones, que sern objeto de
estudio en captulos posteriores.
5.1 VARIANTES BICATENARIAS: FORMAS A Y Z

El anlisis por difraccin de rayos X a resolucin atmica revel la existencia de otras dos formas
estructurales o conformaciones, diferentes a la B-DNA de referencia, en las que se mantienen las
caractersticas bsicas de sta (complementariedad, antiparalelismo, helicidad, etc.), pero con algunas
diferencias:
47
48
Comparacin entre las tres principales conformaciones del DNA bicatenario

Tipo de hlice
A (deshidratada)
B (Watson-Crick)
Z (Rich-Dickerson)
Dextrorso
Dextrorso
Sinistrorso
La ms ancha y corta
Intermedia
La ms estrecha y larga
Dimetro de la hlice
2,55 nm (25,5 )
2,37 nm (23,7 )
1,84 nm (18,4 )
Distancia entre bases1 (d)
0,23 nm (2,3 )
0,34 nm (3,4 )
0,38 nm (3,8 )
11
10,4
12
Sentido de giro de la hlice

Forma y tamao
Pares de bases por vuelta (n)

Rotacin por cada base (360 /n)

3
Longitud vuelta de hlice (n d)

Inclinacin del plano de los
pares de bases4
Surco mayor o grande
Surco menor o pequeo
+ 32,7
30
+34,6
2,53 nm (25,3 )
3,54 nm (35,4 )
4,56 nm (45,6 )
19 (gran inclinacin)
1,2 (casi perpendicular

al eje de la hlice)
9 (ligera inclinacin)
Estrecho, profundo
Ancho, profundidad media
Plano, sin profundidad
Amplio, no profundo
Estrecho, profundidad media
Estrecho, profundo
anti
anti
sin (G,A) y anti (C,T)
Enlace N-glicosdico
1
Distancia entre pares de bases, medida a lo largo del eje de la hlice.

Rotacin por cada par de bases, o giro respecto al par anterior (+ dextrorso, sinistrorso).
3
Longitud de la vuelta de hlice, medida a lo largo del eje; habitualmente se denomina paso de hlice.
4
Inclinacin respecto al plano perpendicular al eje de la hlice.
2
5.1.1 Forma A del DNA, en comparacin con la forma B

Una de las formas de estudiar la estructura del DNA es su preparacin en forma de fibras para
analizarlo mediante difraccin de rayos X (pg. 35). Cuando las fibras se preparan en un ambiente
de elevada humedad relativa se observa la estructura B, pero si la humedad es inferior al 75% el
DNA adopta otra conformacin, denominada A-DNA. Aunque esta forma no se ha encontrado para
el DNA bajo condiciones fisiolgicas, es un ejemplo de la flexibilidad de la molcula y su estudio es de
inters por ser la que adopta el RNA cuando posee regiones bicatenarias, as como en los hbridos
DNA:RNA.
Estructuralmente, el A-DNA es similar a la forma B: es igualmente una doble hlice dextrorsa, con dos
hebras complementarias y antiparalelas unidas por enlaces de hidrgeno. Sin embargo, difiere en sus
dimensiones: la hlice A es ms ancha (mayor dimetro), ms corta para un mismo nmero de
nucletidos (menor distancia entre pares de bases) y tiene mayor nmero de bases por vuelta. Como
consecuencia, son menores la rotacin por cada base y el paso de hlice. Adems, las bases no se disponen
casi perpendicularmente al eje de la hlice, sino claramente inclinadas, y se sitan ms alejadas del eje de la
hlice. La superficie de la molcula es tambin diferente: el surco mayor es ms estrecho que en la forma B
y muy profundo, mientras que el surco menor es relativamente ancho y poco profundo. Mientras que la
forma B puede acomodar en su surco menor una columna de molculas de agua, el surco superficial de
la forma A no ofrece espacio suficiente; esta diferencia explica, al menos en parte, por qu la deshidratacin favorece la forma A.
Web 5.1. Las hlices A y B en el DNA.
5. Variaciones en la estructura del DNA
5:1
Las diferencias, recin comentadas, en la estructura de las dobles hlices A y B vienen originadas en ltima
instancia por la diferente disposicin relativa de los pares de bases, debida concretamente a una distinta
conformacin de la desoxirribosa en todos los nucletidos: en el A-DNA, el C3 sobresale del plano formado
por los otros cuatro carbonos de la ribofuranosa (conformacin C3-endo), mientras que en el B-DNA es el C2
el que no es coplanar (conformacin C2-endo).
Web 5.2. Conformaciones 2-y 3-endo en los nucletidos.
Esta distinta conformacin del anillo de ribosa hace que en el A-DNA los dos grupos fosfato consecutivos
estn ms prximos entre s, lo que explica que los pares de bases sucesivos se acerquen, acortando la cadena.
De manera similar, el cambio en la geometra conduce a los diferentes parmetros geomtricos ya comentados.
5.1.2 Forma Z del DNA, en comparacin con las formas B y A

La existencia de la forma Z surge por primera vez de la observacin, mediante difraccin de rayos X, de una
doble hlice del hexanucletido CGCGCG, con caractersticas distintas a las formas B y A; entre ellas, como
muy significativa, su giro a izquierdas o sinistrorso. Posteriormente, se ha encontrado esta estructura en otros
oligonucletidos sintticos con secuencias de purinas y pirimidinas alternas. Aunque in vivo predomina el
B-DNA, se ha podido observar la presencia de algunas regiones Z en el genoma de clulas eucariticas,
empleando anticuerpos contra esta ltima conformacin. Su funcin, an por confirmar, parece estar relacionada con el control de la expresin gnica y con la recombinacin, a travs de sus efectos sobre el
superenrollamiento.
En cuanto a sus dimensiones, observadas ahora comparativamente con las otras conformaciones, se observa
que la hlice Z es la ms estrecha (1,84 nm de dimetro), la ms larga (mayor distancia entre bases: 0,38 nm) y
49
50
la que tiene mayor nmero de pares de bases por vuelta (12), lo cual supone una menor rotacin por base (30 )
y un mayor paso o longitud de una vuelta de hlice (4,56 nm). Es, en resumen, una hlice muy estirada. En su
superficie forma un solo surco, profundo (correspondiente a la posicin del surco menor en A- y B-DNA).
5:2
La consideracin de esta estructura a nivel molecular muestra que sus diferencias respecto a las formas A y B
se deben tambin a una distinta conformacin, en este caso alrededor del enlace N-glicosdico. En las formas A
y B todas las bases nitrogenadas se orientan alejadas del anillo de pentosa, en la llamada conformacin anti,
mientras que en el Z-DNA slo lo hacen las pirimidinas; las purinas tienden a situarse sobre la pentosa
(conformacin sin). Por ello, en las secuencias de purinas y pirimidinas alternantes (por ejemplo,
CGCGCG), habituales del Z-DNA, se favorece la sucesin de ambas conformaciones, sin (G) y anti (C), lo
que obliga al esqueleto azcar-fosfato a plegarse en zig-zag para poder establecer los enlaces de hidrgeno.
5:3
Web 5.3. Conformaciones anti- y sin- en los nucletidos.

Web 5.4. Disposicin en zig-zag en el Z-DNA.
5.2 VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA

Los estudios de difraccin de rayos X tambin revelaron la existencia de variaciones en la conformacin en
determinadas secuencias del B-DNA. Aunque dentro de este apartado tambin podra incluirse el superenrollamiento del DNA, se ha preferido describir este aspecto como una estructura de orden superior de los
cidos nucleicos, dada su implicacin en la organizacin del cromosoma.
5.2.1 Curvatura de la doble hlice

A pesar de la regularidad del modelo de Watson y Crick, existen pequeas diferencias locales en la estructura de
los DNA dependiendo de los nucletidos integrantes. Por ejemplo, en determinadas secuencias los pares de
bases no son exactamente coplanares; por otro lado, los pares AT son un poco ms abiertos que los pares GC;
todo ello puede ocasionar una desviacin del eje de la doble hlice. As, se ha comprobado que la repeticin de 3
a 5 residuos de adenosina cada 10 pb (es decir, cada vuelta de hlice) provoca flexiones en la molcula de DNA
bicatenaria. En otros casos, frecuentes, la curvatura no se origina por una secuencia particular de nucletidos,
sino que es forzada por la unin de una protena a la cadena de DNA (como, por ejemplo, la mostrada en la
web 5.9).
5.2.2 Palndromos
5.2.2.1 Concepto y caractersticas
Se denominan secuencias palindrmicas, o simplemente palndromos, aquellas regiones de un DNA cuya
secuencia es la misma en ambas hebras. Son bastante comunes, y tienen un significado especial por varias
razones, principalmente: a) ser dianas de las enzimas de restriccin (herramientas experimentales para escindir
cidos nucleicos en la tecnologa del DNA recombinante); b) intervenir en la regulacin de la expresin gnica,
pues son puntos de unin de los factores de transcripcin, y c) generar estructuras secundarias peculiares en
DNA y RNA (horquillas y cruciformes, pg. 54).
Gramaticalmente, un palndromo (del griego palin = de nuevo, dromos = carrera) es toda palabra o
frase que se deletrea igual de izquierda a derecha y de derecha a izquierda. Por ejemplo: RADAR,
ANILINA, DBALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. En los palndromos hay un centro de simetra
(a la vez eje y plano de simetra), que es la letra central o la posicin entre las dos letras centrales.
Sin embargo, la extensin de este trmino al mbito de la biologa molecular no es directa: se dice que
una regin de DNA es palindrmica cuando la secuencia de una hebra, leda de izquierda a derecha, es
igual que la de la otra hebra, leda de derecha a izquierda. Por tanto, los palndromos se observan en las dos
cadenas conjuntamente, y no en una sola. Por ejemplo, la secuencia TTAGCACCACGATT sera un
palndromo gramatical, pero no es una secuencia palindrmica. Teniendo en cuenta que, segn el convenio
de escritura de los DNA, la secuencia de ambas hebras debe leerse de 5 a 3, se concluye que las dos hebras
de un palndromo tienen la misma secuencia; sta es una de las definiciones de palndromo.
51
52
5:4
Como una extensin del concepto de palndromo, se llaman palndromos interrumpidos aquellos en los
cuales una pequea regin del cido nucleico separa las dos mitades del palndromo y acta, por tanto, como
centro de simetra no puntual (en lugar del espacio entre dos nucletidos de un palndromo estricto). En
cualquier caso, todo palndromo est formado por dos mitades de secuencia idntica, separadas por un
centro de simetra, puntual o no puntual.
5:5
Al cumplirse tanto la simetra propia del palndromo como la complementariedad de las dos hebras resulta
que las secuencias de una misma hebra que quedan a ambos lados del centro de simetra son complementarias
entre s; se afirma, por ello, que las secuencias palindrmicas son autocomplementarias (otra forma de definir
un palndromo, aplicable no slo a molculas bicatenarias sino tambin a las monocatenarias, como se ver a
continuacin).
5:6
Web 5.5. Simetra y autocomplementariedad en los palndromos.
5.2.2.2 Palndromos en molculas monocatenarias

Para el caso de cidos nucleicos monocatenarios, las dos primeras definiciones de palndromo no se pueden
aplicar de forma estricta. Sin embargo, dada la relacin de complementariedad entre la secuencia de un RNA y
la de una de las hebras del DNA que lo codifica, las molculas de RNA monocatenario codificado por un DNA
palindrmico son tambin autocomplementarias y se consideran como palndromos. Bajo este criterio, cada
una de las dos hebras de un DNA palindrmico tambin es una secuencia palindrmica monocatenaria.
5.2.2.3 Repeticiones de secuencia
5:7
En ocasiones se utiliza como sinnimo de palndromo el trmino repeticiones invertidas, puesto que si se
leen en sentidos opuestos, las dos mitades de la molcula bicatenaria tienen la misma secuencia (a ambos lados
del centro de simetra, puntual o no).
Otra expresin relacionada es la de repeticiones directas, que se emplea cuando en un DNA hay repeticin de una secuencia (unidad de repeticin), leda siempre en el mismo sentido. No son palndromos
53
54
porque no se cumple el criterio de igualdad de secuencias ledas en sentido opuesto, ni hay centro de simetra, por lo que no se habla de mitades. Estas repeticiones resultan de inters porque aparecen con
una gran frecuencia en el genoma (pg. 111), tanto en posiciones contiguas o adyacentes (repeticiones
en tndem) como separadas por un nmero elevado de pares de bases (repeticiones dispersas).
Finalmente, se habla de repeticiones especulares cuando la secuencia se repite, de forma invertida, dentro
de la misma hebra. De nuevo, no son palndromos, pues no hay centro de simetra rotacional, sino plano de
simetra especular.
Estas dos ltimas posibilidades, aunque aparecen con frecuencia en los DNA, ocupando una parte
importante de su secuencia (pg. 108), no tienen consecuencias en cuanto a la estructura secundaria de
los cidos nucleicos, por lo que a partir de este momento slo se tratarn los palndromos.
5.2.2.4 Consecuencias estructurales de los palndromos

a) En cidos nucleicos monocatenarios
La existencia de palndromos, por ser secuencias autocomplementarias, puede afectar de forma importante a la
estructura secundaria. As, los DNA o RNA monocatenarios a menudo se pliegan sobre s mismos para formar
una estructura en horquilla, siempre que posean regiones complementarias (las dos mitades del palndromo). Si
el centro de simetra no es puntual (palndromos interrumpidos), esa porcin forma un bucle en el extremo de la
horquilla.
5:8
La formacin de horquillas posee gran relevancia en la estructura tridimensional de algunos RNA. El

ejemplo ms significativo lo constituyen quiz los brazos de los tRNA, regiones con estructura de tallo y bucle
(pg. 66), formados por secuencias palindrmicas. Por otro lado, este tipo de plegamiento en el mRNA
contribuye, en algunos casos, a la terminacin de la transcripcin; concretamente, en el mecanismo de
terminacin independiente de r en procariotas (v. web 17.8).
En el caso de DNA monocatenarios tambin pueden encontrarse horquillas, por ejemplo en el DNA
desnaturalizado, que carece de una estructura secundaria regular y definida. Tambin se propone su
formacin en situaciones particulares, por ejemplo, durante la sntesis en el laboratorio del cDNA (DNA
complementario) a partir de un mRNA, donde el extremo 3 del DNA monocatenario se repliega sobre s
mismo y sirve as de cebador para la polimerasa (pg. 223).
Web 5.6. Horquillas en los cidos nucleicos.
b) En DNA bicatenario
En el caso de un DNA de doble hebra, las hebras del palndromo pueden separarse y reasociarse de otra
forma, generando estructuras de doble horquilla o cruciformes (en forma de cruz). De forma similar a lo
que ocurre en el caso anterior, los palndromos interrumpidos forman cruciformes con dos bucles.
5:9
5.2.2.5 Funcionalidad de los palndromos

Adems de las alteraciones de estructura recin descritas, los palndromos en DNA bicatenario actan como
seales de reconocimiento a las que se unen numerosas protenas. stas poseen habitualmente estructuras
dimricas, por lo que se unen de forma simtrica a ambas mitades del palndromo (pg. 57). Destacan entre
ellas los factores de transcripcin, que regulan la expresin gnica (pg. 288) y las enzimas de restriccin, que
fragmentan la molcula de DNA (pg. 212).
5.2.3 H-DNA: triple hlice

Se trata de una estructura poco habitual, formada por 3 hebras: una triple hlice, tambin llamada
trplex o trplice. Se descubri por primera vez en un RNA, aunque es en el DNA donde se encuentra
con ms frecuencia. Se forma en regiones ricas en pirimidinas en una hebra (secuencia (CT)n) y ricas en
purinas (secuencia (AG)n) en la hebra complementaria. En condiciones normales, dichas secuencias se
encuentran totalmente emparejadas sin alteracin alguna en la doble hlice. Sin embargo, puede ocurrir
que parte de la doble hlice se abra y la hebra rica en C y T se repliegue y se empareje con la otra
hebra (AG), mediante una nueva clase de enlaces de hidrgeno (conocidos como enlaces de Hoogsteen),
en una zona donde sta an forma doble hlice. Aparece as una triple hlice (CT)n/(AG)n/(CT)n
en dicho segmento del DNA. La otra hebra sencilla (rica en A y G), desemparejada, forma una especie
de bucle.
55
56
5:10
Este tipo de estructura ha despertado gran inters por su aplicacin en terapias de inhibicin de la expresin
gnica, mediante la unin de un oligonucletido sinttico a la doble hlice del DNA en la regin promotora de
un gen, formando una triple hlice que impide la expresin del gen.
5.3 MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DE PROTENAS AL DNA

Son numerosos los procesos biolgicos en los que la funcin del DNA depende de su interaccin especfica con
protenas; destaca entre ellos el control de la expresin gnica, ejercido por protenas denominadas
genricamente factores de transcripcin (cuyo papel se estudia ms adelante, pg. 288). El estudio de estas
protenas tiene inters dentro del contexto de las variantes estructurales del DNA, precisamente por su
capacidad de reconocer e interaccionar con secuencias concretas del DNA. Este reconocimiento tiene lugar
gracias a la posibilidad de variaciones locales en la estructura tridimensional del DNA, as como a la interaccin
directa de la protena con las bases, sin necesidad de que se separen las hebras de la doble hlice. En la mayor
parte de los casos, los numerosos contactos establecidos (de tipo inico, hidrfobo y enlaces de hidrgeno),
aunque individualmente dbiles, se combinan para dar una interaccin especfica y muy fuerte entre DNA y
protena.
El reconocimiento se ejerce a travs de regiones o elementos estructurales, que son slo una parte de la
estructura terciaria completa de la protena, y que se pueden encontrar, con una estructura espacial muy
similar, en protenas distintas, interviniendo en una misma funcin en todas ellas. Si se cumplen estos requisitos,
reciben la denominacin genrica de motivos estructurales proteicos (en ingls, motifs), en este caso motivos de unin a DNA o motivos ligantes de DNA.
La interaccin tiene lugar con la superficie de la doble hlice, en especial sobre el surco mayor. Como
caracterstica importante, una misma protena puede contactar simultneamente con varios puntos diferentes
del DNA, forzando as en ste una modificacin conformacional que hace que secuencias lejanas puedan
aproximarse. Dicho cambio conformacional puede inducir incluso la separacin parcial de las hebras
(desnaturalizacin local), con lo que se vera favorecido el acceso de otras protenas. Tal es el caso, por ejemplo,
de la RNA-polimerasa en el proceso de transcripcin.
5.3.1 Descripcin de los motivos estructurales ms frecuentes
5:11
5.3.1.1 Motivo hlice-giro-hlice o hlice-vuelta-hlice

Se abrevia como HTH, del ingls helix-turn-helix. Fue el primer motivo proteico de unin al DNA bien
estudiado. Se ha encontrado en protenas reguladoras de la expresin gnica, tanto en virus como en procariotas y eucariotas. Est formado por dos segmentos peptdicos en hlice a, de estructura rgida, separados por
un corto tramo peptdico que permite que las dos hlices se aproximen entre s. Una de las hlices a (llamada
hlice de reconocimiento) se encaja en el surco mayor del DNA, de forma que los residuos aminocidos de un
lado de la hlice interaccionan mediante puentes de hidrgeno o enlaces de van der Waals con las bases
nitrogenadas expuestas en ese surco. El dimetro de la hlice a posee la dimensin adecuada (1,2 nm) para
entrar en el surco. Algunos aminocidos, situados en la cara opuesta de la misma hlice, establecen interacciones con otros de la segunda hlice, fijando la posicin relativa de ambas en un ngulo casi perpendicular (v. el
esquema inicial). La segunda hlice a queda as cruzada sobre la de reconocimiento y situada en el exterior del
DNA.
Web 5.7. Estructura de los motivos hlice-giro-hlice.
Es frecuente que una protena presente dos motivos HTH o bien que se asocien dos molculas de protena
iguales (es decir, un homodmero), cada una con un motivo HTH. En ambos casos, las dos hlices de
reconocimiento (una de cada motivo) se sitan a una distancia mutua de unos 3,5 nm, lo que coincide con
el paso de hlice del B-DNA (3,54 nm) y, por tanto, con dos posiciones consecutivas de su surco mayor. Es
decir, ambos motivos interaccionan de manera simultnea con el DNA, contribuyendo a estabilizar la unin de
la protena.
Los ejemplos mejor conocidos de protenas con motivos HTH actan regulando la transcripcin en
bacterias y virus, respectivamente. El primero, la protena receptora de AMP cclico (CRP, tambin llamada
CAP) es un dmero por tanto, con 2 motivos HTH que cuando une cAMP aumenta su afinidad por
secuencias especficas del DNA, desencadenando la expresin de los genes del opern lactosa (ste fue el
primer ejemplo conocido de control de la transcripcin). El segundo ejemplo (en la web 5.7) es la protena Cro
57
58
del fago lambda, codificada por un gen del virus y expresada en la bacteria anfitriona, que interacciona a travs
de su motivo HTH con el gen de la protena vrica denominada represor del fago l, bloqueando como
consecuencia su expresin (transcripcin del gen y posterior sntesis de la protena).
5.3.1.2 Motivo hlice-bucle-hlice

Se abrevia como HLH, del ingls helix-loop-helix. No debe confundirse con el anterior. Consta tambin de dos
segmentos en hlice a, pero en este caso el pptido que los une es ms largo, lo que lo dota de mayor flexibilidad
y, en consecuencia, hay ms posibilidades de orientacin mutua de las dos hlices. Generalmente, al igual que
en HTH, dos motivos HLH se asocian, formndose protenas dimricas, aunque no siempre interaccionan en
posiciones consecutivas del surco mayor. Un ejemplo de motivo HLH bien conocido es el de la protena Max de
ratn.
Web 5.8. Estructura de los motivos hlice-bucle-hlice.
5.3.1.3 Motivo homeodominio

Se puede considerar como una ampliacin del motivo hlice-giro-hlice (HTH), pero adquiere entidad propia
por aparecer repetidamente, con idntica estructura, en distintas protenas. Adems de la disposicin de dos
hlices cruzadas tpica del HTH, existe un tercer tramo en hlice a, del que sale una regin sin estructura
secundaria definida cuyos aminocidos interaccionan de manera directa con el DNA. Este motivo (en ingls,
homeodomain) es importante por aparecer en las protenas que regulan el desarrollo embrionario, estudiadas
especialmente en Drosophila.
Web 5.9. Estructura de los motivos homeodominio.
5.3.1.4 Motivo dedo de zinc

Se ha encontrado este tipo de motivo estructural (en ingls, zinc finger) en multitud de protenas eucariticas
que se unen al DNA, entre ellas el factor de transcripcin TFIIIA y el receptor de estrgenos. Al igual que en las
estructuras anteriores, es frecuente que una misma protena posea ms de un motivo; en este caso, se observan
normalmente mltiples dedos de zinc consecutivos. ste es un elemento estructural formado por unos 30
aminocidos, de los cuales 2 cistenas y 2 histidinas aparecen en posiciones constantes, coordinando
tetradricamente un ion Zn+2. Esta unin obliga a un plegamiento de la cadena peptdica, de forma que el
motivo se caracteriza por una conformacin tridimensional alargada, en forma de dedo, que le da nombre.
La variante ms frecuente muestra dos hebras b antiparalelas, cada una con un residuo Cys, seguidas de un giro
y de una estructura helicoidal a con los dos residuos His. Este motivo se denomina C2H2 (abreviaturas de una
letra para los aminocidos que unen el Zn+2) y su secuencia consenso es:
5:12
donde los subndices representan el nmero de residuos (aminocidos variables, X) que separa los aminocidos
consenso (constantes). Estas secuencias adquieren espontneamente gracias al Zn2+ la conformacin apropiada para que el segmento a-helicoidal interaccione con tres bases expuestas en el surco mayor del DNA. Los
residuos variables permiten que se reconozcan distintas secuencias del DNA.
En otras protenas se observa una variante de dedo de zinc llamada C4, donde el ion metlico se coordina
con cuatro residuos Cys en la secuencia consenso
-Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys-
que no forma hebras b, sino dos segmentos en hlice a. Esta estructura aparece, por ejemplo, en los receptores
de hormonas esteroides.
Web 5.10. Estructura de los motivos dedo de zinc.
5.3.1.5 Motivo cremallera de leucina

Se trata de una regin de la protena cuya secuencia tiene un residuo de leucina cada 7 aminocidos. Al adoptar
la conformacin a-helicoidal se concentran en un lado los aminocidos hidrfobos, pues Leu se repite en la
misma cara cada dos vueltas de hlice (2 vueltas de 3,6 residuos 7 aminocidos). Dos cadenas peptdicas de
este tipo pueden asociarse debido al efecto hidrfobo, intercalando sus restos de Leu como si se tratara de los
dientes de una cremallera (en ingls, leucine zipper). En el otro extremo del motivo las dos hlices a encajan en el
surco mayor del DNA y presentan en la cara exterior abundantes aminocidos bsicos que interaccionan
favorablemente con los fosfatos. De alguna manera, este modelo se asemeja a una Y, en la que el tallo
correspondera a la cremallera de leucina y los brazos a los tramos de las hlices que contactan con el DNA.
Estructuras de este tipo aparecen, por ejemplo, en las protenas reguladoras de la transcripcin llamadas bZIP.
Web 5.11. Estructura de los motivos cremallera de leucina.
59
CAPTULO 6
Estructura y funcin de los RNA
6.1 ESTRUCTURA DE LOS RNA

6.1.1 Composicin de bases y estructuras primaria y
secundaria del RNA
6.1.2 Estructura tridimensional de los RNA en general
6.1.3 Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares
6.1.3.1 RNA mensajero (mRNA)
6.1.3.2 RNA transferente (tRNA)
a) Especificidad de los tRNA por los aminocidos
b) Presencia de nuclesidos infrecuentes
c) Emparejamiento de bases intracatenario
d) Estructura secundaria en trbol
e) Estructura terciaria en "L''
6.1.3.3 RNA ribosmico (rRNA)
6.1.3.4 RNA interferente y otros RNA pequeos
6.2 FUNCIONES DE LOS RNA
6.2.1 RNA como material gentico
6.2.1.1 Depositario de la informacin gentica:
genoma de RNA
6.2.1.2 Portador transitorio de la informacin gentica
61
61
62
63
64
64
64
65
66
66
67
68
69
70
70
6.2.2 Sntesis de protenas

6.2.3 Maduracin del RNA
6.2.4 Regulacin de la expresin de los genes
6.3 RNA CATALTICO: RIBOZIMAS
6.3.1 Accin cataltica en la maduracin de RNA
6.3.2 Accin autocataltica en la eliminacin de intrones
6.3.3 Accin cataltica y autocataltica en viroides:
ribozimas de posible aplicacin teraputica
6.3.4 Accin cataltica transpeptidasa en la sntesis de
protenas
6.4 LOS RIBOSOMAS
6.4.1 Ubicacin subcelular
6.4.2 Origen
6.4.3 Composicin
6.4.4 Estructura
6.4.5 Separacin de los ribosomas, subunidades
y componentes
70
71
71
71
71
72
73
74
74
75
75
75
77
78
70
70
Los cidos nucleicos no se encuentran en las clulas en las formas extendidas correspondientes a su estructura
primaria y secundaria, sino molecularmente ms compactados, lo que hemos denominado (pg. 28) nivel
estructural de orden superior. En el caso del cido ribonucleico, RNA, esto se plasma en estructuras
tridimensionales variadas que, en algunos casos, se complementan con su asociacin estrecha con protenas
formando ribonucleoprotenas (por ejemplo, el RNA ribosmico, que al unirse a protenas forma los ribosomas). Todo ello se relaciona con una serie de funciones ejercidas especficamente por cada tipo de RNA,
siempre relacionadas con la expresin de la informacin contenida en el DNA genmico.
6.1 ESTRUCTURA DE LOS RNA

Como ya se ha indicado (pg. 28), los RNA son polirribonucletidos (polinucletidos con ribosa, y U en lugar
de T) monocatenarios, formados por cadenas lineales de varias decenas o millares de unidades, pero de
longitud muy inferior a la del DNA. No se presentan como molculas bicatenarias con dos hebras complementarias (salvo en algunos virus que tienen como genoma un RNA bicatenario (pg. 70).
6.1.1 Composicin de bases y estructuras primaria y secundaria del RNA

La estructura primaria de los RNA se ha estudiado anteriormente (v. Captulo 3). En cuanto a la secundaria, es
caracterstica la ausencia de una estructura repetitiva y regular, lo que los diferencia del DNA; en realidad slo
existe estructura secundaria en una parte de la molcula de algunos tipos de RNA.
Al no existir un emparejamiento sistemtico de dos hebras, la composicin de bases en los RNA es mucho ms
variada que en el DNA y no se cumplen las reglas de Chargaff (pg. 36). Por otro lado, en algunos RNA hay cierta
abundancia de nucletidos distintos de los cuatro principales (A, G, C y U), aunque en proporcin minoritaria con
respecto a la de stos.
61
62
Composicin de bases de varios RNA (%)

Organismo
Tipo de RNA
Rata (hgado)
nuclear
mitocondrial
ribosmico
transferente
mensajero
20,2
17,8
20,0
20,9
23,8
25,7
31,8
30,5
30,9
28,3
29,5
28,4
31,6
28,5
27,4
24,6
20,9
20,2
20,4
20,5
Levaduras
ribosmico
transferente
mensajero
24,9
18,5
27,5
27,7
29,2
25,1
19,4
28,4
20,3
26,7
20,0
27,1
E. coli
ribosmico
transferente
mensajero
25
19,3
24,1
31
32,0
27,7
22
28,3
24,7
21
16,0
23,5
Obsrvese cmo, a diferencia de lo que ocurre con el DNA,

la composicin de bases vara dentro de una misma especie (segn el RNA considerado)
no existe una equivalencia entre bases (A U, G C, purinas pirimidinas)
Algunos RNA adoptan una estructura secundaria en regiones limitadas de su molcula, gracias al plegamiento de su nica hebra sobre s misma, cuando esto permite el emparejamiento intracatenario de dos zonas
cuyas secuencias sean complementarias, a pesar de estar separadas en la estructura primaria; se forma as una
doble hlice local, de carcter antiparalelo. De manera similar se forman tambin dobles hlices entre una
molcula de RNA y una hebra sencilla de DNA (hbridos RNA-DNA).
En estos casos, si el grupo 2-OH de la ribosa adopta la conformacin C2-endo presenta impedimentos
estricos con otros tomos de la cadena de RNA, lo que impide que se forme la doble hlice (que sera de tipo B).
En concreto, el 2-OH estara muy cerca de los tomos del grupo fosfato contiguo y del C8 de la base adyacente.
En cambio, en la conformacin C3-endo el grupo 2-OH se proyecta hacia fuera, lejos de otros tomos del
esqueleto y no genera impedimento estrico alguno, por lo que es posible la formacin de la doble hlice, en este
caso de tipo A. En resumen, la nica doble hlice en la que puede participar un RNA es la de tipo A (el DNA, al
carecer del OH en 2, puede adoptar tanto la A como la B, como ya se ha estudiado en el Captulo 5).
Web 6.1. Conformaciones de la ribosa en el RNA.
6.1.2 Estructura tridimensional de los RNA en general

Existe una gran diversidad en la estructura tridimensional de las molculas de RNA. sta es compleja, nica
para cada tipo de RNA, y resulta de la combinacin de estructuras secundarias locales, estabilizadas por
enlaces de hidrgeno, por el efecto hidrfobo y por interacciones de apilamiento de bases. Su estudio concreto
se har ms adelante, para cada tipo de RNA.
6:1
A pesar de la inexistencia de una estructura secundaria propiamente dicha para toda la molcula, la cadena
sencilla de cualquier RNA adopta localmente variadas estructuras: horquillas, bucles, lazos, etc. Algunas de
ellas se deben al emparejamiento de bases intracatenario formando cortos tramos de doble hlice de tipo A,
como se acaba de indicar. La proporcin de zonas helicoidales vara ampliamente entre distintos RNA, pero en
algunos casos supera la mitad de la estructura total.
63
6. Estructura y funcin de los RNA
6.1.3 Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares

Tanto en procariotas como en eucariotas existen tres tipos principales de RNA, denominados mensajero
(mRNA), transferente (tRNA) y ribosmico (rRNA). Adems de ellos, en eucariotas existen RNA nuclear
heterogneo (hnRNA), nuclear pequeo (snRNA) y citoplsmico pequeo (scRNA), y RNA de orgnulos
(mitocondrias y cloroplastos), as como otros RNA pequeos con actividad reguladora (miRNA y siRNA,
principalmente). Todos ellos tienen en comn que sus funciones estn relacionadas, directa o indirectamente,
con la expresin gnica (maduracin postranscripcional y traduccin). Adicionalmente, en algunos virus el
genoma est constituido por RNA, que desempea as el papel de portador de la informacin gentica,
el mismo que en el resto de organismos corresponde al DNA.
Las diferencias fundamentales entre los distintos tipos de RNA se resumen en la tabla.
Clase
Ubicacin subcelular
Cantidad
Tamao
Caractersticas particulares
n nucletidos
s
mRNA
citoplasma (P y E)
5%
600 a 3.000
Estructura sencilla lineal, sin

plegamiento
tRNA
citoplasma (P y E)
20%
75 a 95
Hay de 50 a 60 diferentes,
especficos para cada aminocido
rRNA
citoplasma (P y E)
75%
16S
1.500
Forma parte de la subunidad

pequea del ribosoma
23S
2.900
5S
120
Forman parte de la subunidad

grande del ribosoma
18S
1.900
Forma parte de la subunidad

pequea del ribosoma
28S
4.700
5,8S
160
Forman parte de la subunidad

grande del ribosoma
5S
120
3 tipos, en ribosomas
de procariotas:
4 tipos, en ribosomas
de eucariotas:
hnRNA
ncleo (E)
minoritario
200 a 30.000
Transcrito primario, precursor

del mRNA
snRNA
ncleo (E)
minoritario
100 a 300
Forman parte de
ribonucleoprotenas nucleares,
snRNP1
scRNA
citoplasma (E)
minoritario
Forman parte de
ribonucleoprotenas citoplsmicas,
scRNP2
mtRNA
mitocondrias (E)
minoritario
De los 3 tipos: mensajero,

transferente y ribosmico
cpRNA
cloroplastos (E)
minoritario
Slo en vegetales, los 3 tipos:

mensajero, transferente y
ribosmico
miRNA
citoplasma (E)
minoritario
21 a 25
siRNA
citoplasma (E)
minoritario
21 a 25
ncleo/citoplasma
minoritario
otros
RNA pequeos que regulan

la expresin gnica
P = procariotas
E = eucariotas
s = coeficiente de sedimentacin (medido en svedbergs, web 10.2)
1
Son ejemplos de ribonucleoprotenas nucleares las protenas U1, U2, U4, U5 y U6 que forman el ayustosoma (pg. 304), que
interviene en la maduracin del mRNA eucaritico.
2
Un ejemplo de scRNA es el RNA 7SL, componente clave de la partcula de reconocimiento de seal (pg. 353).
64
6.1.3.1 RNA mensajero (mRNA)

La propuesta de la existencia de una molcula que transfiera el mensaje gentico desde el ncleo al citoplasma se
debe a Franois Jacob y Jacques Monod (premios Nobel en 1965). Dicha molcula es el RNA mensajero que, al
ser una copia de la informacin contenida en la secuencia del DNA, acta posteriormente en el ribosoma como
molde o plantilla para la sntesis proteica.
Las caractersticas principales del mRNA son las siguientes:
Se encuentra en el citoplasma de todas las clulas, en baja proporcin (5%) respecto al RNA total y con una
vida media corta dada su rpida degradacin. Aparece asociado transitoriamente a los ribosomas.
Sus molculas son de tamao muy diverso (relacionado con el tamao de las protenas que codifican).
Es el tipo de RNA de estructura ms sencilla, con una cadena lineal formada exclusivamente por los
ribonuclesidos A, U, C y G. La composicin de bases refleja directamente la del DNA molde del que
procede. La molcula carece de una conformacin definida: la cadena se mantiene extendida, sin adoptar
estructuras secundarias ni terciarias significativas, en parte gracias a la participacin de protenas que se
asocian a ella.
6.1.3.2 RNA transferente (tRNA)

Fue Francis Crick quien sugiri que los aminocidos se uniran a una molcula intermedia, que llam adaptador, para poder interaccionar con el mRNA. Efectivamente, los tRNA actan as en la sntesis de protenas.
Esta funcin depende de una doble interaccin:
Por un extremo de la molcula unen el aminocido para dar aminoacil-tRNA (pg. 326), la forma activa
necesaria para la reaccin de formacin del enlace peptdico.
Por el otro extremo se emparejan con el mRNA, en presencia del ribosoma.
La combinacin de ambas interacciones permite la transferencia del aminocido al pptido creciente,
generando el orden correcto de los aminocidos en la protena, de acuerdo con la secuencia leda por los
sucesivos tRNA sobre el mRNA (pg. 337).
6:2
A pesar de ser los RNA ms pequeos, los tRNA presentan una gran complejidad estructural. Se han aislado
y estudiado muchos, de distintos organismos, mostrando una estructura comn a pesar de sus distintas
secuencias; estas ltimas reflejan la necesidad de adaptarse a su especificidad por un nico aminocido.
a) Especificidad de los tRNA por los aminocidos

Los tRNA constituyen una fraccin importante del RNA total presente en la clula (20%) y se encuentran
disueltos en el citosol. Una clula puede contener hasta 60 tRNA diferentes, es decir, en nmero superior al de
aminocidos (20), puesto que cada tRNA interacciona especficamente con un solo aminocido, pero algunos
aminocidos son reconocidos por ms de un tRNA (se habla en este caso de tRNA sinnimos, pg. 319).
La especificidad se indica con el nombre del aminocido en superndice (por ejemplo, tRNAAla); los tRNA
sinnimos llevan subndices numricos (por ejemplo, tRNATrp1 y tRNATrp2). Cuando un tRNA est unido con
el aminocido se dice que est activado o cargado, se denomina aminoacil-tRNA y se indica con el
aminocido como prefijo (por ejemplo, Ala-tRNAAla, Trp-tRNATrp1, Trp-tRNATrp2, etc.).
b) Presencia de nuclesidos infrecuentes

Una de las caractersticas de los tRNA es que su composicin incluye, adems de los cuatro principales, otros
nuclesidos no corrientes o infrecuentes, que pueden suponer hasta un 10% del total. Generalmente se trata de
derivados de los cuatro principales, A, G, C, U, o bien de la inosina (nuclesido de la base hipoxantina), a menudo
con grupos metilo en la base o en la desoxirribosa (las bases infrecuentes y los nuclesidos infrecuentes se han
presentado en las pgs. 15 y 19). Adems, es caracterstica la presencia de ribotimidina. La participacin de todos
estos nuclesidos est relacionada con la estructura terciaria y tiene por ello una clara influencia sobre la funcin.
6:3
65
66
c) Emparejamiento de bases intracatenario

A pesar de la abundancia de nucletidos no usuales, los tRNA muestran un grado notable de complementariedad, es decir, de regiones con estructura secundaria en doble hlice basada en emparejamientos de bases
intracatenarios. Con frecuencia se observan emparejamientos distintos de los de Watson y Crick, llamados
genricamente de Hoogsteen: por ejemplo, G puede emparejarse con U mediante un enlace menos fuerte que la
unin GC. Incluso, en algunos casos, en el enlace de hidrgeno participa el 2-OH de la ribosa. Tambin
pueden existir bases enfrentadas pero no complementarias, as como uno o ms nucletidos formando un bucle
en la cadena para facilitar el emparejamiento de sus vecinos.
Web 6.2. Emparejamientos de bases atpicos en los RNA.
d) Estructura secundaria en trbol

Al comparar la estructura de distintos tRNA se observa una notable semejanza. El plegamiento ms probable es
la estructura secundaria denominada en trbol (por su analoga con tres hojas y un tallo, o para otros con
cuatro hojas), donde el emparejamiento entre bases es mximo. En ella se distinguen:
Tres brazos o asas principales; una central, II, y dos perifricas, I y III (cada una con tallo y bucle).
Un brazo o asa menor (IV), de dimensin variable en diferentes tRNA.
Un brazo abierto: brazo aceptor o brazo del aminocido.
6:4
6:5
e) Estructura terciaria en "L''

Mediante anlisis por difraccin de rayos X de cristales de tRNA se ha podido deducir una estructura terciaria
compacta, en forma de codo o L. sta se origina por un retorcimiento en el espacio de la estructura secundaria
en trbol, impuesto por las dobles hlices locales y por puentes de hidrgeno que acercan los brazos D y T. Estos
puentes son de tipos infrecuentes, incluyendo en algunos casos tros de bases (web 6.2). La estructura en trbol es,
por tanto, slo una representacin bidimensional simplificada de la verdadera estructura tridimensional.
6:6
Web 6.3. Estructura tridimensional del RNA transferente.
67
68
El conocimiento detallado de esta estructura permite comprender una peculiaridad de los tRNA: todos son
distintos (por tener distinta secuencia e interaccionar con un codn de mRNA y un aminocido especficos),
pero al tiempo son de algn modo similares (por adoptar una estructura terciaria comn, unirse a ribosomas y
ser reconocidos por los factores que intervienen en la traduccin).
6.1.3.3 RNA ribosmico (rRNA)

Es el soporte estructural y componente principal de los ribosomas. En todas las clulas, sean procariticas o
eucariticas, existen varios tipos de rRNA, constituyendo la mayor parte del RNA total (75%). Al igual que los
tRNA, presentan un contenido relativamente elevado de nuclesidos infrecuentes (fundamentalmente Y, T y
los que tienen bases metiladas).
Los RNA ribosmicos adoptan una conformacin compleja. Estn formados por una sola hebra con numerosas regiones helicoidales cortas resultantes del emparejamiento intracatenario de bases. Son molculas con
muchos repliegues sobre s mismas, formando una estructura tridimensional bastante compacta. Su estructura
constituye un armazn sobre el que se ensamblan varias protenas para dar lugar al ribosoma (pg. 75-76).
6:7
Web 6.4. Estructura tridimensional de los RNA ribsomicos.
Conviene hacer en este punto una breve mencin a la relacin entre estas molculas de rRNA funcionales y
sus molculas precursoras, pues stas se encuentran tambin presentes tanto en las clulas procariticas como
en el ncleo de las eucariticas. Obviamente, la comprensin completa de estas interrelaciones slo se alcanzar
cuando se describa el proceso de maduracin postranscripcional (v. Captulo 19). Por otra parte, debe
indicarse que la S en los nombres de los rRNA aqu presentados corresponde a la unidad de coeficiente
de sedimentacin, el svedberg (v. web 10.2).
En eucariotas, la mayor parte del RNA presente en el ncleo corresponde a los transcritos primarios,
molculas obtenidas directamente de la transcripcin del DNA y que se convertirn en RNA funcional o
maduro tras sufrir el citado proceso de maduracin. Hay dos transcritos primarios precursores de los rRNA; el
mayor tiene un tamao que vara entre 6 y 14 kb, segn la especie (con un coeficiente de sedimentacin
comprendido entre 35 y 47S). Poco despus de ser sintetizado, ese pre-rRNA grande es escindido para dar
tres rRNA maduros, de 28S, 18S y 5,8S (v. tabla en pg. 63). Estos tres, junto al rRNA 5S (producto del otro
pre-RNA, y por ello de un gen diferente), son los RNA que constituyen el ncleo estructural de los ribosomas
eucariticos (pg. 76).
En procariotas, un nico pre-rRNA da lugar, tambin por procesamiento postranscripcional, a rRNA
maduros de 23S, 16S y 5S (pg. 63), que forman el ribosoma procaritico (pg. 76). Adems, a partir del
mismo precursor se generan algunos RNA transferentes.
6.1.3.4 RNA interferente y otros RNA pequeos

Entre los RNA minoritarios en cuanto a su abundancia en la clula se encuentran los RNA nucleares pequeos
y citoplsmicos pequeos. Se trata de RNA monocatenarios con menos de 300 nucletidos cuya estructura no
ofrece caractersticas de relevancia que merezcan su discusin en detalle y cuyas funciones, particulares para
cada uno, se estudiarn ms adelante (v. las citas en la tabla de pg. 63).
Recientemente se han ido descubriendo mltiples molculas pequeas de RNA, mono- o bicatenario, que ejercen
un papel regulador en la expresin de ciertos genes. Han alcanzado rpidamente relevancia debido a la gran utilidad
de su aplicacin en investigacin y potencialmente en terapia (bsicamente, la posibilidad de bloquear a voluntad la
expresin de un gen concreto). A menudo se habla genricamente de RNA pequeos o RNA reguladores, pero se
han identificado dos grupos de molculas con estructura, biosntesis y mecanismo de actuacin definidos: los
microRNA (o miRNA) y los RNA interferentes pequeos (siRNA, de small interfering RNA).
Los microRNA son molculas con entre 21 y 25 residuos nucletidos, monocatenarias en su forma madura,
bicatenarias en la forma precursora, cuya secuencia es complementaria al extremo 3 de un mRNA, de modo
que se emparejan con l y bloquean su traduccin. Desempean as un papel regulador en la traduccin de
algunos genes de protenas (que se estudiar con ms detalle en el Captulo 21). Bajo la categora microRNA se
incluyen los RNA temporales pequeos (stRNA).
Los RNA interferentes pequeos son molculas bicatenarias, igualmente de 21 a 25 pb. Ambos extremos 3
presentan dos nucletidos sin emparejar (extremos protuberantes, equivalente a los extremos cohesivos,
pg. 215). Las dos hebras se separan dando la forma monocatenaria, que se asocia con un complejo proteico
(RISC) y lo dirige hacia un mRNA especfico que tenga secuencia complementaria a la del siRNA. Como
consecuencia, RISC degrada el mRNA diana. Se trata, de nuevo, de un mecanismo de control postranscripcional
y pretraduccional, en este caso no por bloqueo del mRNA, sino mediante su eliminacin (v. Captulo 21).
La ribointerferencia (RNA interference, RNAi, interferencia por RNA) es el fenmeno desencadenado por
los RNA interferentes (interfering RNA, iRNA), incluidos los microRNA y los siRNA. El nombre se utiliza para
designar tanto al fenmeno biolgico de regulacin como a la tcnica de laboratorio en la que se usan RNA
interferentes sintetizados ex profeso con el fin de silenciar un gen determinado, con propsitos de investigacin
o aplicados.
Los ribointerruptores o riborreguladores (en ingls, riboswitches) son un tipo ms de RNA con actividad
reguladora. En este caso, se trata de una parte de la molcula de un mRNA que regula la expresin del propio
mRNA (el final de su transcripcin, su maduracin postranscripcional o su traduccin). Estas regiones del mRNA
poseen cierto grado de estructura secundaria que genera una estructura terciaria capaz de reconocer y unir de
forma especfica un metabolito. Por ejemplo, se han descubierto ribointerruptores que unen adenina, guanina,
xantina, hipoxantina, glutamina, glicina, lisina, pirofosfato de tiamina, riboflavina, cobalamina, Mg2+, FMN,
S-adenosilmetionina, o glucosamina-6P. Todas estas biomolculas pequeas actan como seal para la regulacin
de la expresin de algn gen, habitualmente relacionado con su metabolismo. El cambio conformacional inducido
en el RNA al unrsele el ligando conduce a la actuacin sobre la expresin gnica. La mayora de ribointerruptores
se han detectado en bacterias, pero al menos el de tiamina est tambin presente en algunos hongos y plantas.
Web 6.5. Estructura de RNA pequeos con funcin reguladora.
69
70
El descubrimiento de estas nuevas funciones para molculas de RNA aade una pincelada a la percepcin
anterior de que gran parte del genoma humano y, en general, de organismos superiores en la escala evolutiva
sea no codificante y pudiera ser intil (el denominado DNA basura). La bsqueda tradicional de genes se centr
en la codificacin de protenas; cada vez est ms claro que el panorama es ms complejo y al menos una parte
de ese DNA presumiblemente intil tiene realmente una funcin codificante. Parece hoy probable que existan
miles de genes en el genoma humano codificando RNA pequeos con funcin reguladora.
6.2 FUNCIONES DE LOS RNA

En directa relacin con la clasificacin anterior, basada en su estructura, se puede abordar el estudio de las
funciones ejercidas por los RNA, un catlogo que est sufriendo una ampliacin continua en los ltimos aos,
segn se van descubriendo nuevas estructuras y acciones de molculas pequeas de RNA. Se desarrolla aqu tan
solo una clasificacin y breve descripcin, pues la funcin de cada uno debe entenderse en el contexto de cada
proceso que forma parte de la expresin gnica (control de la transcripcin del DNA en un RNA, procesamiento de los RNA transcritos primarios para dar los RNA maduros, sntesis de protenas, control de la
traduccin del mRNA para sintetizar protenas), procesos abordados en captulos posteriores.
6.2.1 RNA como material gentico

6.2.1.1 Depositario de la informacin gentica: genoma de RNA
Algunas especies de virus poseen un genoma DNA (al igual que todos los procariotas y eucariotas), mientras
que otras tienen un genoma constituido por RNA. De stas, algunas emplean un RNA monocatenario y otras
uno bicatenario. Esto incluye dos categoras de virus: los retrovirus (cuyo genoma es RNA pero necesita
retrotranscribirse en un DNA para que el virus pueda propagarse) y los ribovirus o virus RNA, que no utilizan
DNA intermediario en su propagacin.
En todos estos casos, el papel del RNA ya no es el de una molcula auxiliar, sino que es el propio material
gentico de la especie, su genoma, la molcula depositaria de la informacin gentica que proporciona al virus
su identidad como especie y le permite reproducirse, multiplicarse.
Dado el enfoque de este texto, no se desarrollar en ms detalle la biologa molecular de este tipo de virus; el
lector interesado debe acudir a textos de virologa. Aun as, hay que destacar que el conocimiento de estos virus
es relevante para las ciencias de la salud debido a su implicacin en infecciones y enfermedades y la necesidad de
combatirlas, habitualmente interfiriendo en el mecanismo de propagacin del virus. Como ejemplos, este tipo
de virus causan la gripe, la hepatitis C, el sndrome respiratorio agudo grave (SARS, neumona coronavrica
o neumona atpica asitica), el sida, la hepatitis B, la leucemia de clulas T y el linfoma de clulas T.
6.2.1.2 Portador transitorio de la informacin gentica

En la gran mayora de organismos hay molculas de RNA (el mensajero, mRNA) que actan como una copia
temporal de la informacin contenida en el DNA genmico y se utilizan como fuente de informacin, como
plantilla, para la sntesis de protenas.
6.2.2 Sntesis de protenas

El RNA tambin participa en la sntesis de protenas de otras formas, sin aportar un mensaje gentico. (Esta
funcin es conceptualmente independiente del papel citado del RNA mensajero.) ste es el caso de los RNA
transferentes y ribosmicos, que intervienen en dicho proceso como molculas accesorias (aunque imprescindibles). Como se ha indicado y se estudiar con ms detalle en captulos posteriores (20 y 21), los tRNA
ejercen de portadores que llevan los aminocidos hasta el ribosoma para que reaccionen de manera ordenada
formando el polipptido y de activadores qumicos para que esa reaccin sea termodinmicamente favorable.
Por su parte, los rRNA son constituyentes estructurales del ribosoma, responsable de todo el proceso de sntesis
de las protenas.
En segundo lugar, una molcula concreta, el ms grande de los RNA ribosmicos (23S en procariotas, 28S
en eucariotas) es la transpeptidasa, la enzima que cataliza la unin de los aminocidos en enlace peptdico para
formar las protenas (v. a continuacin la descripcin de ribozimas).
6.2.3 Maduracin del RNA

Se denomina maduracin o modificacin postranscripcional (v. captulo 19) al conjunto de transformaciones
que experimenta un RNA recin sintetizado (transcrito primario) hasta convertirse en un RNA funcional (RNA
maduro). En este proceso intervienen tambin no exclusivamente algunas molculas de RNA. Por ejemplo, la
RNasa P es una ribozima que cataliza una de las reacciones de hidrlisis en la maduracin de los tRNA
procariticos. Por otro lado, el ayuste (pg. 303), parte de la maduracin de los mRNA eucariticos, depende
de ribonucleoprotenas que incluyen algunos RNA nucleares pequeos (snRNA).
6.2.4 Regulacin de la expresin de los genes

Como se ha indicado (pg. 9), los microRNA, los siRNA y los ribointerruptores, entre otros, ejercen una
funcin reguladora sobre diversas etapas de la expresin de algunos genes, bien bloqueando el fin de la
transcripcin o, ms comnmente, provocando la degradacin del mRNA o bloqueando su uso en la traduccin. La mayor parte de estos mecanismos forman parte del proceso conocido como ribointerferencia, o tambin silenciamiento gnico postranscripcional. Todo ello tiene lugar de forma selectiva sobre un gen determinado
en cada caso.
6.3 RNA CATALTICO: RIBOZIMAS

Algunas molculas de RNA son capaces de actuar como catalizadores de reacciones bioqumicas; de ah que el
concepto clsico de enzima haya sido ampliado ms all de las protenas. A estos RNA con actividad cataltica,
es decir, con capacidad de disminuir la energa de activacin de determinadas reacciones, se les llama ribozimas,
para distinguirlos de las enzimas proteicas. Su capacidad cataltica estriba tambin en la gran complejidad y
diversidad de estructura tridimensional que pueden adoptar los RNA, lo que les permite adaptarse al sustrato,
as como en su reactividad gracias a los grupos funcionales de bases y esqueleto. De hecho, se han podido
realizar estudios cinticos con algunas ribozimas, verificando que cumplen la cintica de Michaelis y Menten,
tpica de enzimas proteicas. Se cree que las ribozimas fueron los primeros biocatalizadores que aparecieron en
la evolucin, siendo desplazados posteriormente por las enzimas proteicas, ms verstiles. Los RNA seran, as,
las molculas primordiales de la vida, antes de que evolucionasen los DNA como portadores de informacin
gentica y las protenas como catalizadores.
A continuacin se describen algunos ejemplos de ribozimas, que actan en diversos tipos de reacciones de
inters en biologa molecular o en las tcnicas de ingeniera gentica.
Web 6.6. Estructura tridimensional de algunas ribozimas y reconocimiento de su sustrato.
6.3.1 Accin cataltica en la maduracin de RNA

El primer ejemplo conocido (1981) de molcula de RNA con actividad cataltica fue la RNasa P (se ha
estudiado principalmente en procariotas, pero existe una actividad similar en eucariotas). Esta enzima est
formada por molculas de RNA y de protena (una en la RNasa P bacteriana, 9 o 10 en la del ncleo
eucaritico), pero se ha comprobado que la actividad cataltica reside en el componente RNA. Reconoce como
sustrato al precursor mixto de rRNA y tRNA en procariotas (un transcrito primario) y cataliza una de las
reacciones de su maduracin postranscripcional (que genera los rRNA y tRNA funcionales), en concreto la
generacin de los extremos 5 de los tRNA (pg. 307).
71
72
6:8
6.3.2 Accin autocataltica en la eliminacin de intrones

La siguiente actividad ribozimtica encontrada fue la del precursor de rRNA en el protozoo Tetrahymena
(un eucariota unicelular). A diferencia del caso anterior, esta ribozima acta de forma autocataltica, es decir, el
sustrato es su propia molcula. Mediante un mecanismo similar actan como ribozimas otros pre-RNA
procariticos y eucariticos, aquellos que poseen intrones de los tipos I y II. Los intrones (pg. 264) son partes
existentes en el RNA precursor, pero no en el RNA maduro, pues se eliminan durante la maduracin; el preRNA comprende, pues, las regiones del RNA maduro y las de los intrones. Los tipos de intrn y los procesos de
maduracin del RNA precursor por corte y empalme se estudian como parte del procesamiento postranscripcional del RNA (pg. 303).
En este caso es cuestionable hablar de catlisis, pues uno de los requisitos de la definicin de catalizador es
que ste no se consuma en el proceso. Sin embargo, el producto final de una cadena de reacciones de
autohidrlisis del intrn de Tetrahymena es una molcula (derivada del propio intrn y denominada L-19
IVS) que es capaz de catalizar reacciones de hidrlisis y de esterificacin de oligonucletidos externos a ella. Por
tanto, si bien no lo son el pre-RNA o el intrn originales, L-19 IVS s es un verdadero biocatalizador.
6:9
6.3.3 Accin cataltica y autocataltica en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica

Los viroides son agentes infecciosos formados por una molcula circular de RNA monocatenario (de 250 a
400 nt), sin cubierta proteica, con capacidad para infectar plantas. No codifican protena alguna, simplemente
portan seales para replicarse a costa de la maquinaria molecular de las clulas infectadas. Poseen actividad
como ribozimas, de modo que escinden uno de sus propios enlaces fosfodister, como parte de su mecanismo de
replicacin. Se ha descubierto y aqu radica su inters aplicado que son tambin capaces de actuar sobre otras
molculas de RNA.
La estructura secundaria de estas ribozimas les ha merecido el nombre de cabeza de martillo (hammerhead).
La molcula posee dos caractersticas esenciales: por un lado, las secuencias de reconocimiento del RNA
sustrato (mediante emparejamiento de bases complementarias) y, por otro, el centro cataltico, que produce
la escisin.
6:10
Se han ensayado anlogos sintticos de alguna de estas ribozimas en cabeza de martillo (obtenidos mediante
ingeniera gentica) con el objeto de destruir de forma selectiva molculas de RNA con secuencias determinadas. ste es un planteamiento de terapia gnica, dentro de la estrategia de inhibicin dirigida de la expresin
gnica. Se trata de preparar ribozimas artificiales con secuencias de reconocimiento que les permitan unirse en
orientacin antisentido, antiparalela, a un mRNA determinado, de forma que el centro cataltico lo escinda,
suprimiendo en consecuencia la sntesis de la protena correspondiente. (El concepto de cadena antisentido se
introducir en el captulo de transcripcin, pg. 267) Otro tipo de planteamiento de terapia, dentro de la
estrategia de correccin dirigida de mutaciones, consiste en el corte mediante ribozimas de un transcrito
precursor de RNA cuya secuencia estuviese mutada (por proceder de un gen mutado), de forma que la escisin
ocurra alrededor de la mutacin y resulte un transcrito corregido.
73
74
6.3.4 Accin cataltica transpeptidasa en la sntesis de protenas

El cuarto ejemplo y enormemente importante para todos los organismos lo constituye la ribozima que
ejerce la actividad transpeptidasa o peptidiltransferasa, responsable de la formacin del enlace peptdico
en la biosntesis proteica, entre los residuos aminocidos situados en los sitios A y P del ribosoma
(pg. 339). En este caso, la accin ribozimtica radica en el rRNA 23S, uno de los componentes de la
subunidad mayor (50S) del ribosoma procaritico, y en el rRNA homlogo de eucariotas (rRNA 28S de la
subunidad 60S).
6:11
Fisiolgicamente, la RNasa P y la peptidiltransferasa ribosmica son posiblemente los que mejor reflejan el
parecido de las ribozimas con las enzimas proteicas, a saber: actan sobre un sustrato especfico, aceleran la
reaccin varios rdenes de magnitud, no se destruyen durante la catlisis y al parecer se comportan de acuerdo
con la cintica michaeliana.
6.4 LOS RIBOSOMAS

Estructuralmente, los ribosomas son asociaciones supramoleculares de protenas y rRNA (35 y 65% en peso,
respectivamente). Es decir, son nucleoproteidos. (Otros ejemplos de nucleoproteidos son el nucleosoma pg. 84
y los virus, que se abordan en una materia propia, la virologa.) Los ribosomas se pueden considerar tambin
partculas subcelulares (con un tamao de 20 a 23 nm) y orgnulos, aunque no delimitados por una membrana.
Los ribosomas poseen una importancia crucial para la transmisin de la informacin gentica, pues es en
ellos donde se realiza la sntesis de protenas. Se los ha calificado de estructuras qumico-mecnicas pues, por un
lado, se desplazan sobre el mRNA ordenando la interaccin de sus codones con los correspondientes anticodones de los tRNA y, por otro, proporcionan el entorno necesario para que los aminocidos formen los
enlaces peptdicos del polipptido en crecimiento.
La funcin de los ribosomas se estudiar en el Captulo 21, que describe la sntesis de protenas. Aqu se
aborda slo su descripcin estructural.
6.4.1 Ubicacin subcelular

En cada clula existen varios miles de ribosomas (por ejemplo, ms de 15.000 en un E. coli), que llegan a
suponer un cuarto del peso seco de la clula. Se encuentran en el citosol, as como en la matriz mitocondrial y en
el estroma de cloroplastos. Pueden estar en forma libre, como partculas discretas, pero a menudo se observan
en forma de hilera, agrupados sobre un mRNA; en este caso se denominan polisomas o polirribosomas; su
grado de agrupacin o polimerizacin depende de la actividad metablica celular (si la sntesis de protenas es
muy activa, habr mayor nmero de ribosomas asociados a cada mensajero).
Los ribosomas del citosol de eucariotas son ms complejos en composicin y mucho mayores en tamao que
los ribosomas bacterianos. En contraste, los ribosomas de mitocondrias y cloroplastos eucariticos son
semejantes a los bacterianos. Evolutivamente para todos los tipos se ha conservado una misma estructura
tridimensional, pero no la secuencia que la produce.
6:12
6.4.2 Origen
Los precursores del rRNA muestran una gran diversidad en su secuencia, que se manifiesta en la aparicin
(durante el proceso de maduracin postranscripcional, captulo 19) de distintos tipos de rRNA, caracterizados
especialmente por su diferente coeficiente de sedimentacin, s (pg. 63 y 67) (v. web 10.2).
6.4.3 Composicin
Durante su actividad en las clulas, los ribosomas se separan de forma reversible en dos partes, que se
denominan subunidades. stas tienen tamao diferente, ambas una forma irregular, y cada una est
constituida por una o varias molculas de rRNA y numerosas protenas de diversa masa molecular (entre
6 y 75 kDa). Tanto el ribosoma completo como sus subunidades y los rRNA componentes se nombran
de acuerdo con su coeficiente de sedimentacin. Las protenas, por su parte, se designan mediante
nmeros precedidos por L o S, segn pertenezcan a la subunidad grande o pequea, respectivamente
(large/small).
75
76
6:13
Como se ha comentado, los ribosomas de orgnulos son ms parecidos a los de bacterias que a los citoslicos
eucariticos. Por ejemplo, el ribosoma mitocondrial, con 55S, est formado por una subunidad mayor 39S con
rRNA 16S (1560 nt) y 48 protenas, ms una subunidad menor 28S con rRNA 12S (950 nt) y 29 protenas.
6.4.4 Estructura
La estructura de los ribosomas, igual en todas las clulas, es muy caracterstica; se ha dilucidado empleando
difraccin de rayos X, difraccin de neutrones, microscopia electrnica en combinacin con mtodos
inmunolgicos, etc. Debido a su enorme tamao (MDa) y la complejidad de su asociacin interna, el estudio
de la estructura, dinmica y funcin de los ribosomas constituy un importante reto investigador.
Web 6.7. Estructura tridimensional del ribosoma.
Las dos subunidades se asocian mediante interacciones no covalentes, de una forma peculiar: la subunidad
pequea cubre una oquedad de la grande, dejando entre ambas espacio para acomodar 3 molculas de tRNA y
tambin para el paso del mRNA a medida que el ribosoma se desplaza durante el proceso de traduccin. Adems, la
subunidad mayor est atravesada por un tnel por el cual emerge la cadena polipeptdica que se est sintetizando.
6:14
77
78
6.4.5 Separacin de los ribosomas, subunidades y componentes

Tanto los ribosomas individuales como sus subunidades y sus componentes (varios RNA y diferentes protenas)
se pueden separar mediante centrifugacin en gradientes (pg. 126) de sacarosa o de cloruro de cesio, en
presencia de concentraciones definidas de Mg+2. Por otro lado, si se mezclan los componentes (rRNA y
protenas) a pH y fuerza inica correctos puede observarse su asociacin espontnea en ribosomas funcionales.
6:15
CAPTULO 7
Condensacin del DNA

y cromosomas
7.1 SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA

7.1.1 Superenrollamiento del DNA circular
7.1.1.1 Conformacin relajada
7.1.1.2 Conformaciones superenrolladas
7.1.1.3 Demostracin experimental
del superenrollamiento
7.1.2 Anlisis terico del superenrollamiento
7.1.3 Superenrollamiento del DNA lineal
7.2 CONDENSACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS
7.2.1 Protenas componentes de la cromatina
7.2.1.1 Histonas
7.2.1.2 Protenas no histnicas
7.2.2 Niveles de condensacin del DNA nuclear eucaritico
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80
80
80
81
82
83
83
84
84
84
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7.2.2.1 Disposicin en nucleosomas y fibra de 10 nm

7.2.2.2 Formacin de la fibra de 30 nm
7.2.2.3 Cromatina o cromosoma interfsico
7.2.2.4 Cromosoma metafsico
7.3 EL CROMOSOMA METAFSICO
7.3.1 Aspectos citogenticos
7.3.1.1 Morfologa de los cromosomas
7.3.1.2 Cariotipo y su anlisis
7.3.1.3 Bandeado
7.3.2 Regiones con significado funcional
7.3.2.1 Centrmero
7.3.2.2 Telmeros
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87
87
89
89
89
89
90
92
93
93
94
Los cidos nucleicos no se encuentran en las clulas en las formas extendidas correspondientes a su estructura
primaria y secundaria, sino molecularmente ms compactados, lo que hemos denominado (pg. 28) nivel estructural de orden superior. En el caso del DNA, parte de esta compactacin o condensacin viene representada por
el denominado superenrollamiento, o retorcimiento de la cadena sobre s misma. La condensacin se completa
mediante la asociacin estrecha con protenas que inducen el plegamiento de la doble hlice del DNA. La
contribucin de esta asociacin con protenas posee una relevancia especial en el caso del DNA nuclear eucaritico.
7.1 SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA

El superenrollamiento, como parte de la condensacin del DNA en general, posee un especial significado para
entender la organizacin estructural del cromosoma. En concreto, contribuye a explicar cmo un DNA de tan
gran magnitud puede alojarse en el interior de la clula (procariotas) o del ncleo (eucariotas), cuyas dimensiones son muy inferiores a la longitud terica del DNA en doble hlice. Por ejemplo:
DNA
Tamao
Longitud en forma de B-DNA Dimensiones en las que se compacta
E. coli
4,7 106 pb
6
1,6 mm 1.600 mm
2 mm (clula)
4-6 mm (ncleo)
Cada cromosoma humano
50 250 10 pb
17-85 mm
Genoma humano diploide
6,4 109 pb
2,1 m
7:1
79
80
Se entiende por superenrollamiento (enrollar algo que ya est enrollado) del DNA el retorcimiento o giro
sobre s misma de la doble hlice (que ya lleva implcito el enrollamiento mutuo de dos hebras), de forma que el
eje de la doble hlice no sigue una lnea recta, sino otra hlice (una superhlice). Su origen, como se ver a
continuacin, es la introduccin de una tensin estructural en la propia molcula. Aparece de algn modo en
todos los DNA celulares y se encuentra estrechamente regulado in vivo por la accin de las topoisomerasas
(pg. 155). En resumen, las dos hebras del DNA sufren un enrollamiento, mientras que la doble hlice sufre un
superenrollamiento.
Un ejemplo intuitivo del concepto de superenrollamiento es el cordn del telfono, que de por s presenta un
enrollamiento helicoidal y, con el uso cotidiano, termina por adoptar un enrollamiento adicional (cordn
retorcido). Este smil se utiliz para explicar muchas propiedades del DNA vrico (circular y pequeo). Un
modelo ms prximo a la estructura del DNA es una cuerda formada por dos hebras arrolladas entre s.
Aunque la cuerda tiende a mantener ese arrollamiento, puede ser forzada manualmente a un mayor o menor
nmero de vueltas entre sus hebras (torsin), con lo que se genera una tensin que se libera mediante la
formacin de superenrollamientos (v. web 7.1).
7.1.1 Superenrollamiento del DNA circular

Aunque afecta tanto a procariotas como a eucariotas, el superenrollamiento es ms conocido y de comprensin
ms sencilla en los primeros, por lo que as se abordar a continuacin. Estas consideraciones tambin son
vlidas para el DNA de plsmidos procariticos y el de cromosomas mitocondriales y cloroplsticos de
eucariotas, dado que en todos estos casos la molcula de DNA muestra una estructura circular o cerrada
(una doble hlice con sus extremos unidos entre s por enlace covalente), en la que es fcil apreciar los
fenmenos de superenrollamiento.
7.1.1.1 Conformacin relajada

La conformacin adoptada por el DNA en su forma B (aproximadamente 10,5 pb/vuelta) corresponde a un
estado estable, de mnima energa, que se considera no superenrollado o relajado cuando el eje de la doble
hlice se puede disponer por completo sobre un plano.
7:2
7.1.1.2 Conformaciones superenrolladas

En las clulas, el DNA generalmente no se encuentra en la conformacin relajada, sino en un estado no relajado,
superenrollado y ms compacto. ste lo producen topoisomerasas que, mediante el corte transitorio de una
o ambas hebras, introducen un aumento o una disminucin en el nmero de vueltas de hlice (pg. 155).
7. Condensacin del DNA y cromosomas
En ambos casos se produce una tensin estructural, debida a un plegamiento local de las hebras y a una posicin
relativa de los nucletidos diferentes de su geometra energticamente ms estable, la del B-DNA. Esta tensin se
contrarresta en la molcula mediante la formacin de un superenrollamiento: la cadena entera del DNA gira sobre
s misma de forma que las bases puedan disponerse de nuevo del modo ms prximo a la conformacin B-DNA.
En primer lugar, si se reduce el nmero de vueltas de hlice, la tensin se libera formando una superhlice a la
que se le asigna un valor negativo de superenrollamiento.
7:3a
Si, por el contrario, se aumenta el nmero de vueltas de hlice, la tensin se libera por formacin de una
superhlice de sentido opuesto, con un superenrollamiento positivo.
7:3b
Web 7.1. Generacin de superenrollamientos positivo y negativo.
7.1.1.3 Demostracin experimental del superenrollamiento

De estas dos posibilidades, el DNA se encuentra habitualmente en las clulas en un estado de superenrollamiento negativo. El primer indicio experimental que llev a proponer la hiptesis del superenrollamiento de las
cadenas se obtuvo gracias a la aplicacin de la tcnica de ultracentrifugacin isopcnica (basada en el equilibrio
de sedimentacin en un gradiente de densidad de cloruro de cesio, pg. 126).
Se observ que el DNA del polioma, un pequeo virus que causa cncer a ratones, se separaba formando
tres bandas en el gradiente. Las tres fracciones, sin embargo, tenan la misma masa molecular, por lo que la
diferencia deba estar en su forma o estructura. Se pudo comprobar que las molculas menos densas eran
lineales, mientras que las dems eran circulares. Slo tras la hiptesis del superenrollamiento se pudo explicar la
diferencia entre esas dos fracciones ms densas.
81
82
7:4
7.1.2 Anlisis terico del superenrollamiento

El empleo de la topologa (rama de las matemticas que estudia las propiedades de posicin relativa de las
partes de un objeto, propiedades que no cambian al ser sometido a deformacin) ha permitido aclarar la
estructura del DNA superenrollado. El signo y magnitud del superenrollamiento se asignan a partir de dicho
estudio topolgico, del cual slo se comentan aqu los aspectos ms fundamentales.
7:5
Se define el ndice o nmero de enlace topolgico (L o Lk, de linking number) como el nmero de veces que
las dos hebras se cruzan entre s; ms especficamente, el nmero de veces que una hebra cruza el plano definido
por la otra (como anillo o curva cerrada). Se le asigna valor positivo cuando el cruce se produce girando hacia la
derecha.
Se habla de enlace topolgico porque cuando L 0 las dos hebras estn fsicamente ligadas (es decir, no se
pueden separar), a pesar de que no hay enlaces covalentes entre ellas. Slo se podran separar (y conseguir as
L = 0) rompiendo de forma transitoria algn enlace covalente (es decir, cortando una hebra). Lo mismo es
aplicable para cualquier cambio del valor L (por ejemplo, pasar de L = 9 a L = 10 requiere la ruptura de un
enlace fosfodister). Por la misma razn, la deformacin, plegamiento, etc., de las hebras, sin cortarlas, no
alteran el nmero de enlace ni el nmero de superenrollamiento.
Para el caso del DNA, la conformacin relajada posee, por tanto, un nmero de enlace que coincide con el
nmero de vueltas de hlice, siempre positivo puesto que la doble hlice del DNA es dextrorsa. Como ya se ha
estudiado, las situaciones de superenrollamiento surgen de cambios en el nmero de vueltas de hlice, es decir,
en el nmero de enlace L.
Para discernir y cuantificar los estados superenrollados se refiere su valor de L al del estado relajado,
definiendo un nuevo valor numrico de superenrollamiento como la diferencia (DL) entre el nmero de enlace
de una conformacin concreta del DNA y el nmero de enlace de su forma relajada. Este valor de superenrollamiento puede, lgicamente, ser positivo o negativo y coincide con el nmero de vueltas de superhlice
formadas para que la molcula libere la tensin y alcance de nuevo localmente la conformacin ms estable
de doble hlice B.
7:6
7.1.3 Superenrollamiento del DNA lineal

En eucariotas, el superenrollamiento del DNA es menos evidente y ms difcil de estudiar debido a que, por la
naturaleza lineal de las molculas de DNA, las conformaciones superenrolladas no son estables por s mismas.
La libertad de giro de las cadenas con extremos libres permite que las superhlices se deshagan de manera
espontnea, salvo que exista algn impedimento a su libre giro. Precisamente, es la unin de protenas al DNA
lineal lo que permite la estabilizacin de estados superenrollados, y debe considerarse ste como uno de los
componentes que contribuyen a la condensacin del genoma nuclear eucaritico (v. el ejemplo de las asas
radiales en la cromatina, pg. 87).
Por otra parte, en los DNA eucariticos se aprecia otra forma de superenrollamiento: la unin a protenas
permite el superenrollamiento toroidal, diferente al considerado hasta ahora, que se denomina plectonmico.
El ejemplo principal del primero es el resultante del arrollamiento del DNA bicatenario en torno al octmero de
histonas en la estructura de los nucleosomas (pg. 86).
Web 7.2. Superenrollamientos plectonmico y toroidal.
7.2 CONDENSACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS

Para completar la descripcin de la estructura del DNA como material gentico, y como requisito previo
al estudio del genoma en el ciclo celular (Captulo 8), es conveniente analizar el complejo problema de la
condensacin del DNA nuclear, que tiene lugar a lo largo de la interfase de dicho ciclo. Este aspecto, junto
al proceso enzimtico de replicacin del DNA (Captulo 11) durante la fase S, es de la mayor importancia desde
el punto de vista bsico y de sus aplicaciones.
Como ya se ha indicado, la condensacin del DNA comprende dos aspectos, en teora independientes pero
funcionalmente relacionados y subordinados entre s:
7:7
La condensacin del DNA desde la doble hlice extendida hasta cromatina y luego cromosoma tiene lugar
de forma gradual durante la fase G2 del ciclo celular (Captulo 8), mientras que el proceso inverso, la
83
84
descondensacin del DNA, comienza despus de la divisin celular (fase M) y contina durante la fase G1 hasta
alcanzar de nuevo la condicin difusa que permite la replicacin (fase S). No se conocen con precisin los
aspectos moleculares de ambos procesos, aunque se asume una gran analoga y se considera, por tanto, que
ambos transcurren por los mismos mecanismos, pero en sentido inverso.
7.2.1 Protenas componentes de la cromatina

7.2.1.1 Histonas
Las histonas son las principales protenas que forman parte del material gentico de eucariotas; su masa es
equivalente a la del DNA. Su funcin fundamental es estabilizar la estructura del DNA y contribuyen de forma
notable a compactarla. Las histonas constituyen una familia de protenas semejantes, de tamao relativamente
pequeo y con un contenido muy elevado (casi 1/3 del total) de aminocidos bsicos (con pI de 9 a 10). Gracias a
ello, muestran naturaleza policatinica a pH fisiolgico (numerosas cargas positivas en cada molcula) y se asocian
fuertemente, mediante interacciones electrostticas, con los grupos fosfato del esqueleto polianinico del DNA.
H1
% Lisina
% Arginina
% (Lys + Arg)
N de aminocidos
Masa molecular
24,8-29,5
1,3-2,6
27,4-30,8
215-244
21,1-23,0 kDa
H2A
10,9
9,3
20,2
129
14,0 kDa
H2B
16,0
6,4
22,4
125
13,8 kDa
H3
9,6
13,3
22,9
135
15,3 kDa
H4
10,8
13,7
24,5
102
11,2 kDa
Existen cinco tipos principales de histonas, bien caracterizadas, que se diferencian en su composicin y,
como se ver despus, en su papel estructural en la organizacin del nucleosoma y la cromatina. La histona H1
se presenta en distintas especies o tejidos con mayor diversidad de secuencia y de tamao, mientras que las otras
cuatro estn altamente conservadas. En algunos casos, se encuentran histonas alternativas; por ejemplo, H1
puede ser sustituida por una H5 que posee especial afinidad por la cromatina, lo que refuerza el empaquetamiento y la inactividad transcripcional.
El grado de condensacin del DNA se regula en parte mediante la acetilacin, fosforilacin y metilacin de
las histonas (pgs. 284 y 359-361), afectando as a la accesibilidad del DNA para la transcripcin; de este modo
las histonas se ven implicadas en uno de los mecanismos de control de la expresin gnica.
7.2.1.2 Protenas no histnicas

En la cromatina se encuentran, asimismo, otras protenas, aunque menos abundantes, ms variables entre
tejidos y especies y en general peor caracterizadas:
a) Con funcin estructural
Protenas bsicas:
Protaminas: Desempean la funcin equivalente a las histonas en tipos celulares concretos, particularmente el espermatozoide. Son protenas pequeas (50 aminocidos, en algn caso) con elevada proporcin de Arg, Ala y Ser, y estructura predominantemente en hlice a. Su menor tamao permite la compactacin del DNA en el espacio mnimo disponible en el espermatozoide.
Protenas cidas:
HMG: Hasta un 5% de las protenas nucleares son molculas relativamente pequeas que se incluyen en el
grupo llamado HMG (high mobility group), protenas de alta movilidad electrofortica debido a su
carcter cido. De ellas, algunas se asocian al nucleosoma (al menos in vitro), mientras que otras interaccionan con el DNA espaciador (pgs. 86-87). Este grupo incluye tambin algunos factores de transcripcin (Captulo 18).
Protenas del esqueleto o matriz nuclear: Esta estructura, que sirve de soporte o gua en el empaquetamiento de la cromatina (pg. 87), est formada por diversas protenas, incluyendo algunas HMG y otras
protenas de carcter cido.
b) Con otras funciones

Asociadas a la cromatina, aunque en mnima cantidad y sin funcin estructural, se pueden encontrar numerosas protenas, muy diferentes, que intervienen en la replicacin y transcripcin (Captulos 11 y 17), as como
en la regulacin del grado de condensacin de la cromatina: DNA- y RNA-polimerasas, sus protenas auxiliares, factores de replicacin, factores de transcripcin, receptores de hormonas, topoisomerasas, etc.
7.2.2 Niveles de condensacin del DNA nuclear eucaritico

Se puede resaltar el elevado grado de condensacin que alcanza el DNA en las clulas recordando que la
longitud de la molcula en doble hlice es varios rdenes de magnitud superior a las dimensiones de las
estructuras celulares que la albergan (pg. 79). Se denomina grado de condensacin o de empaquetamiento
al cociente entre la longitud del B-DNA bicatenario y el tamao del mismo una vez condensado. Este
parmetro se utilizar para comparar los distintos niveles de compactacin.
Para facilitar su comprensin, la condensacin del DNA se describe aqu en cuatro niveles, aunque esta
divisin es relativa, ya que no hay lmites precisos y la comprensin con detalle de este fenmeno a nivel
molecular es an limitada. Es importante indicar que la condensacin y la descondensacin a travs de esos
niveles estn estrechamente asociadas a la progresin por las distintas fases del ciclo celular (pgs. 102-103).
7:8
85
86
7.2.2.1 Disposicin en nucleosomas y fibra de 10 nm

El nucleosoma es un complejo plurimolecular resultante de la asociacin estrecha del DNA con las histonas; se
trata, pues, de un ejemplo de nucleoproteido. En trminos estructurales, se considera la unidad elemental
constituyente de la cromatina y de los cromosomas, siendo as responsable de la organizacin estructural del
material gentico en todos los organismos eucariticos. Tanto el nucleosoma como sus componentes y las
fibras en las que se integra se han obtenido y analizado gracias a tcnicas diversas, como digestin con DNasas,
entrecruzamiento covalente, hibridacin, difraccin de rayos X, microscopia electrnica, difraccin de neutrones, dicrosmo circular y ultracentrifugacin analtica.
La propuesta de la existencia del nucleosoma surgi del estudio de la accin de DNasas: el tamao de los fragmentos producidos a partir de un DNA nativo es siempre mltiplo de unos 200 pb, mientras que si previamente se le trata para retirar las histonas, los fragmentos de DNA producidos por la DNasa son de tamaos aleatorios. Esto sugiri que las histonas protegen regiones de DNA con una extensin prxima a 200 pb.
Este fenmeno se pudo comprender al averiguar los detalles de la estructura molecular, descrita a continuacin.
Web 7.3. Accin de DNasas sobre el DNA genmico.
Cada nucleosoma est formado por 9 molculas de histonas y un tramo de la molcula de DNA con
aproximadamente 200 pb. En el centro se ubica un octmero de histonas, alrededor del cual se enrolla el
DNA bicatenario, y ms externamente se une la novena histona.
7:9
Web 7.4. Estructura del nucleosoma.
Bajo ciertas condiciones experimentales se puede liberar la histona H1, localizada externamente, lo que hace
accesible a la DNasa una parte adicional del DNA. El nucleosoma queda as reducido a la llamada partcula
central, formada por el octmero de histonas rodeado por DNA.
Una misma molcula de DNA envuelve sucesivamente a distintos octmeros de histonas, de modo que los
nucleosomas estn conectados entre s. La porcin presente entre dos nucleosomas sucesivos se denomina DNA
espaciador, ligador o internucleosmico; su longitud puede variar entre 10 y 80 pb, dependiendo del organismo
o incluso del tejido dentro de un mismo organismo. Esta estructura de nucleosomas espaciados a lo largo de la
molcula de DNA se denomina fibra bsica de cromatina o fibra de 10 nm, pues su grosor corresponde al
dimetro del nucleosoma. El grado de empaquetamiento alcanzado es unas 6 veces superior al de la doble hlice
del DNA extendida. La fibra de 10 nm tambin se denomina estructura en cuentas de rosario, por su aspecto
caracterstico al microscopio electrnico, que en general slo se observa cuando se prepara in vitro a baja fuerza
inica (por ejemplo, 1 mM), mientras que dentro de la clula la cromatina se encuentra mayoritariamente en
formas ms condensadas, y su disposicin en este estado relativamente extendido se limita, en todo caso, a
pequeas zonas.
Tambin participan en la estructura otras protenas no histnicas: HMG-14 y HMG-17 se asocian, al
menos in vitro, con cada nucleosoma, mientras que HMG-1 y HMG-2 interaccionan con el DNA espaciador.
El arrollamiento sinistrorso del DNA sobre el octmero de histonas supone un superenrollamiento toroidal,
de signo negativo, de la cadena. En contraste, en procariotas no existen nucleosomas y el superenrollamiento
plectonmico se consigue por simple retorcimiento del DNA circular, sin una dependencia tan directa de la
unin de protenas.
7.2.2.2 Formacin de la fibra de 30 nm

En las preparaciones de cromatina obtenidas in vitro a mayor fuerza inica (por ejemplo, hasta 100 mM), en
lugar de la fibra de 10 nm se observa una forma ms condensada, denominada fibra de 30 nm, que supone un
grado de empaquetamiento al menos 40 veces superior al de la doble hlice original. An no se ha podido
confirmar su estructura exacta in vivo; uno de los primeros modelos propuestos consiste en el arrollamiento de
la fibra de 10 nm sobre s misma en una espiral o solenoide, de sentido sinistrorso, con algo ms de 6 nucleosomas por cada vuelta y con la histona H1 situada en el interior del solenoide, acercando los nucleosomas entre s; el DNA espaciador se flexiona para conectar los sucesivos nucleosomas a lo largo de la espiral.
En otros modelos se propone que la cadena de DNA describe un zig-zag para que el DNA espaciador, que se
mantiene rgido, conecte nucleosomas dispuestos en caras opuestas de la fibra. Se postulan tambin actualmente modelos en los que las vueltas de solenoide se intercalan consiguiendo un empaquetamiento an ms
denso, y se cree que la disposicin exacta puede ser variable, para acomodar espaciadores de distinta longitud
mientras se mantienen constantes los puntos de contacto entre nucleosomas adyacentes en la espiral de la fibra
de 30 nm. Estas formas ms densas de la fibra podran ya corresponder a los estados de compactacin
superiores que se describen someramente a continuacin (eucromatina y heterocromatina). La fibra de
30 nm es probablemente la forma fisiolgica ms descondensada de la cromatina, adoptada por la mayor
parte del DNA durante la interfase.
Web 7.5. Estructura de la fibra de 30 nm.
En todo caso, de forma experimental se ha confirmado que la histona H1 es un requisito necesario para la
formacin de la fibra de 30 nm, mientras que no lo es para la de 10 nm. Adems, los extremos aminoterminales o colas de las histonas centrales, que sobresalen del octmero, parecen tambin desempear un
papel en la organizacin de la fibra de 30 nm, estableciendo contactos con los tramos de DNA espaciador
y con los nucleosomas vecinos. Dichas colas contienen precisamente los residuos que sufren acetilacin,
fosforilacin y metilacin como mecanismo de regulacin de la condensacin y, en consecuencia, de la
actividad transcripcional de la cromatina (pgs. 284 y 359-361).
7.2.2.3 Cromatina o cromosoma interfsico

Este nivel de condensacin supone la presencia de lazos y superenrollamientos de la estructura anterior. Los
bucles o asas radiales, formados por entre 50 y 100 kb de fibra de 30 nm, emergen de un armazn de protenas
no histnicas denominado andamiaje, matriz o esqueleto nuclear. Estos bucles sufren superenrollamiento,
regulado por topoisomerasas asociadas al esqueleto. Parece que, adems de contribuir al empaquetamiento del
DNA, los bucles constituyen unidades de transcripcin, habindose observado la presencia dentro de un solo
bucle de un gen completo o bien de un grupo de genes regulados de forma conjunta. Es tpica la observacin
de asas radiales en la interfase de cromosomas politnicos gigantes de larvas de insectos y en los cromosomas
plumosos meiticos de oocitos de anfibios.
87
88
A partir de esta estructura se forman enrollamientos superiores, que hacen que la cromatina posea durante
la interfase un grado de condensacin variable; se calcula que se multiplica el grado de condensacin del DNA
por 1.000 o 2.000. Esta diversidad local en la densidad de condensacin se observa en forma de la presencia
simultnea de eucromatina y heterocromatina en una clula en interfase.
Heterocromatina
Eucromatina*
Se tie intensamente con el colorante

May-Grnwald-Giemsa
Se tie dbilmente y con aspecto difuso
Grado de
condensacin
del DNA
Mxima condensacin de la cromatina

(prxima, aunque menor, a la del cromosoma
metafsico)
Forma menos condensada
Contribucin
al total de la
cromatina
Minoritaria; slo algunas porciones del material

gentico se encuentran en esta forma:
Mayoritaria durante la interfase
Aspecto al
microscopio bajo
tincin
(definicin
original)
Heterocromatina constitutiva: regiones del

genoma que se encuentran permanentemente en
forma de heterocromatina (durante toda la
interfase) y en todas las clulas.
Se descondensa el tiempo mnimo necesario para
replicarse durante la fase S del ciclo celular.
Incluye el DNA satlite (pg. 116),
concentrado especialmente en las regiones
telomricas y centromrica de los cromosomas
(pgs. 93-94 )
Heterocromatina facultativa: se encuentra como
heterocromatina slo en algunas clulas de un
mismo organismo o en algunos individuos de
una especie; puede pasar a eucromatina, en
respuesta a determinadas seales.
Uno de los ejemplos es la inactivacin de uno
de los 2 cromosomas X en la mujer, puesto que
se puede inactivar tanto el X materno como el
paterno. Uno permanece condensado como
heterocromatina, mientras el otro est en forma
de eucromatina
Al final de la fase G2, previa a la divisin por
mitosis o meiosis, toda la cromatina de la clula
adopta la forma de heterocromatina (antes de
condensarse an ms para dar el cromosoma)
Accesibilidad de
la molcula de
DNA para su
interaccin con
protenas (DNA
polimerasas,
RNA
polimerasas,
factores de
transcripcin, etc.;
pg. 268)
*
No es accesible, debido a su elevada

condensacin. Se habla de cromatina
transcripcionalmente inactiva. Se replica al final
de la fase S. Los genes que contiene no se
expresan
Es accesible: cromatina transcripcionalmente

activa. Se replica al principio de la fase S. Sus
genes se expresan
El nombre eucromatina significa etimolgicamente cromatina verdadera.
7.2.2.4 Cromosoma metafsico

Aunque al final de la profase cada cromosoma ya est condensado como heterocromatina, durante la metafase
se condensa an ms, adquiriendo el aspecto tpico de los cromosomas metafsicos, corpsculos observables al
microscopio ptico que poseen, en general, aspecto de bastoncillos con dos cromtidas ms o menos separadas
entre s.
Las fibras de heterocromatina se arrollan en una primera espiralizacin para formar una espiral menor
de paso muy pequeo, que se arrolla a su vez sobre s misma (en unas 10 a 30 vueltas) para dar la espiral
somtica. Con esa doble espiralizacin se acorta la cromtida a una vigsima parte, sin aumentar apenas su
dimetro. Esto la hace ms visible al microscopio ptico. Algunas regiones de la cromtida slo alcanzan
el arrollamiento en espiral menor, como, por ejemplo, la zona del centrmero.
7.3 EL CROMOSOMA METAFSICO

7.3.1 Aspectos citogenticos
7.3.1.1 Morfologa de los cromosomas
Se llama centrmero, constriccin primaria o central a la regin ms estrecha del cromosoma metafsico, por
la que permanecen unidas las dos cromtidas hermanas. El centrmero delimita adems los brazos
cromosmicos (cuatro antes de la mitosis, dos tras ella). Los brazos cortos se designan con la letra p y los
largos con q (la p procede del francs petit, pequeo y la q, dependiendo de las fuentes, de queue, cola, o bien
simplemente por ser la letra siguiente a la p). Cada brazo se nombra, pues, por el nmero del cromosoma al
que pertenece, seguido de la letra p o q. Por ejemplo, 6p es el brazo corto del cromosoma 6, 8q el brazo largo
del cromosoma 8, etc. Los cromosomas se clasifican atendiendo a la posicin del centrmero y, por tanto,
segn el tamao relativo de los brazos:
7:10
En los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos (excepto el Y) existen, adems, otros estrechamientos
de la cromtida, denominados constricciones secundarias, zonas en las que la espiral somtica presenta un
dimetro ms reducido. Delimitan una seccin terminal en el cromosoma, a modo de una pequea esfera, a
la que se llama satlite cromosmico.
89
90
7:11
7.3.1.2 Cariotipo y su anlisis
7:12
Son varios los mtodos desarrollados para el anlisis del cariotipo. Habitualmente, este estudio se realiza
sobre cromosomas en el estado de prometafase o metafase. Las preparaciones de cromosomas metafsicos se
emplean, adems, para analizar anomalas cromosmicas y determinar alguna ausencia o la presencia de
cromosomas extra.
A este fin, el mtodo original y ms sencillo de obtencin de cromosomas parte de leucocitos, como clulas
nucleadas del organismo ms asequibles.
7:13
Actualmente, se parte ya no slo de cultivos de leucocitos, con la desventaja de su vida corta, de 3 a 4 das,
sino tambin de cultivos a largo plazo de clulas de diversos tipos de tejidos (fibroblastos, mdula sea,
lquido amnitico, biopsias, etc.). Las ms usadas son las de mayor potencial de divisin o mayor facilidad
91
92
de cultivo. Asimismo, existe una variedad de tratamientos de desnaturalizacin o degradacin enzimtica de la cromatina, y de tinciones con colorantes especficos para el DNA. Por ltimo, se han desarrollado
sistemas de cariotipificacin que pueden ser informatizados de forma que seleccionen automticamente las
clulas a analizar, el tipo de tincin y el anlisis de los cromosomas.
7.3.1.3 Bandeado
Aplicando distintas tcnicas de tincin, utilizadas de forma sistemtica en laboratorios de citogentica, se
pueden observar en los cromosomas bandas plidas y oscuras alternativamente, que definen grandes regiones
cromosmicas llamadas isocoros. Este bandeo o bandeado de cromosomas no es consecuencia de agrupamientos fortuitos, sino que est relacionado con la organizacin estructural del genoma, reflejando variaciones
tales como composicin de bases, grado de condensacin, conformacin de la cromatina, secuencias repetitivas
y no transcritas, etc.
Los patrones de bandas de cada cromosoma son prcticamente idnticos en clulas diferentes, y en casi
todos los tejidos, pero pueden diferir entre individuos; por ejemplo, al menos 12 cromosomas muestran
variaciones en la longitud de ciertos segmentos en distintas personas. Se pueden llegar a apreciar hasta
500 bandas en un cromosoma; en funcin de la resolucin microscpica alcanzada, las bandas principales
se subdividen sucesivamente en subbandas y subsubbandas. A todas ellas se les asigna un identificador, que
incluye el cromosoma, el brazo y un nmero correlativo desde el centrmero hacia los extremos.
7:14
Para el bandeado de cromosomas se emplean diversos mtodos de tincin del DNA con colorantes
especficos:
a) Bandeo G
Es la tcnica ms utilizada. Se basa en una desnaturalizacin controlada de las protenas cromosmicas (en
general por digestin con tripsina), seguida de tincin con Giemsa y observacin al microscopio (el reactivo de
Giemsa es una mezcla compleja de colorantes; de l procede el nombre de bandeo G). Cada par de cromosomas
muestra as patrones caractersticos de tincin, con bandas oscuras (G-positivas o bandas G) y bandas claras
(G-negativas).
b) Bandeo Q
Los cromosomas se tien con un compuesto fluorescente, como mostaza de quinacrina (hidrocloruro
de quinacrina), 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o Hoechst 33258, que se intercalan en el DNA bicatenario.
Se requiere, por tanto, un examen mediante microscopia de fluorescencia. Aparece un patrn especfico
de bandas brillantes (bandas Q o Q-positivas), que se corresponden casi exactamente con las bandas G
(G-positivas, G-oscuras).
Las bandas G y Q contienen DNA que, en general, es algo ms rico en pares AT (55-60%), pues la
quinacrina se inserta preferentemente entre estos pares. Corresponden a cromatina altamente condensada,
con DNA de replicacin tarda dentro de la fase S del ciclo celular, relativamente inactivo transcripcionalmente.
c) Bandeo R
Se basa en un tratamiento de los cromosomas con calor (para desnaturalizar el DNA rico en AT), antes de la
tincin con Giemsa. Resultan as bandas oscuras (bandas R) que coinciden con las bandas G o Q claras
(el nombre deriva de patrn reverso). Tambin se consigue el mismo patrn de bandas empleando olivomicina,
un fluorocromo con afinidad por los pares GC.
Las bandas R contienen DNA rico en GC (50-60%), de baja condensacin cromatnica, que se replica en
etapas tempranas de la fase S y es relativamente activo transcripcionalmente.
d) Bandeo T
Identifica un subconjunto de bandas R especialmente concentradas en los telmeros, las de tincin ms intensa,
y se visualizan empleando un tratamiento trmico particularmente severo antes de teir los cromosomas con
Giemsa o una combinacin de tinciones y fluorocromos.
e) Mtodos especiales
Otros mtodos de cultivo cromosmico y de tincin se utilizan para situaciones particulares: bandeo C, para
regiones heterocromticas; tincin NOR, para la regin organizadora del nuclolo, que contiene los genes de
rRNA 18S y 28S; bandeo de profase y prometafase, o de alta resolucin, sobre cromosomas detenidos en una
etapa temprana de la mitosis, con un estado relativamente descondensado (su mayor longitud permite apreciar
ms detalles, llegndose a observar hasta 850 bandas en un solo cromosoma), etc.
Finalmente, la citogentica molecular emplea sondas de DNA clonado (preparadas por tcnicas de DNA
recombinante, pg. 180) para examinar cromosomas, de forma similar a los ensayos de hibridacin molecular
pero sobre preparaciones de cromosomas completos. sta es la tcnica denominada hibridacin in situ con
fluorescencia (FISH, fluorescence in situ hybridization, pg. 177). Se dispone de sondas especficas para cromosomas individuales y para regiones cromosmicas, que permiten, por ejemplo, identificar reordenamientos
cromosmicos particulares u obtener un diagnstico rpido de la existencia de un nmero anmalo de cromosomas.
7.3.2 Regiones con significado funcional

Los cromosomas eucariticos muestran tres elementos esenciales para una funcin correcta del ciclo celular
y de la divisin, imprescindibles para la expresin, duplicacin y segregacin de los cromosomas: el centrmero
(lugar de unin del cromosoma a las fibras del huso acromtico), los telmeros (regiones que constituyen los
extremos de los cromosomas) y los orgenes de replicacin (puntos numerosos en cada cromosoma donde se
inicia la copia de las dos hebras de DNA). Se tratan a continuacin los aspectos morfolgicos relacionados con
los dos primeros; el anlisis de los orgenes de replicacin se pospone hasta que se estudie el proceso de
replicacin (pg. 153).
7.3.2.1 Centrmero
Adems de ser el punto de contacto de las dos cromtidas y la frontera que delimita los dos brazos del
cromosoma, funcionalmente la importancia del centrmero radica en que sobre l se sitan los cinetocoros,
estructuras proteicas en las que se anclan las fibras que constituyen el huso acromtico o huso mittico. Estas
fibras, filamentos contrctiles o microtbulos, de naturaleza proteica, ejercen la traccin necesaria para separar
las dos cromtidas durante la divisin celular. De esta forma se produce la segregacin ordenada de los
cromosomas y cada clula hija recibe una cromtida de cada cromosoma, es decir, idntica dotacin
gentica. La ausencia de centrmero (cromosoma acntrico) impide que el cromosoma se una al huso mittico y, por tanto, que se reparta de manera correcta entre las clulas hijas.
93
94
Las secuencias esenciales para la funcin de los centrmeros son muy ricas en pares AT, tienen unos 170 pb
en humanos y se repiten entre 2.000 y 30.000 veces en cada centrmero. Forman, pues, parte del llamado DNA
repetitivo (pg. 116) y adems suponen una parte importante de la fraccin de heterocromatina constitutiva, la
que slo llega a descondensarse un tiempo mnimo en el ciclo celular, el preciso para su replicacin.
7.3.2.2 Telmeros
Telmero es una palabra de etimologa griega: telos, extremo, y meros, parte o regin, que hace referencia a
regiones situadas en los extremos de los cromosomas eucariticos. Estn constituidos por secuencias especializadas de DNA asociado a protenas, y con caractersticas estructurales y funcionales propias que las diferencian de otras regiones cromosmicas.
Los telmeros de la mayora de eucariotas estn formados por dos tipos de secuencias de DNA. Una de ellas,
denominada secuencia telomrica, repeticin telomrica o repeticin terminal, constituye el extremo de la
cadena de DNA del cromosoma, mediante la repeticin en tndem de un oligonucletido corto (variable segn
especies; en humanos es TTAGGG). En general esta secuencia telomrica es ms rica en G en una de las hebras,
la que forma el extremo 3, que sobresale unos 12-16 nucletidos sobre la hebra que aporta el extremo 5. Ese
extremo saliente es reconocido por protenas ligantes del telmero (TBP, telomere binding proteins), que
actan a modo de caperuza protectora de dicho DNA terminal. Existen tambin unas secuencias ms
complejas adyacentes a las anteriores (es decir, ms internas en el cromosoma), que se denominan asociadas
a telmeros o secuencias subtelomricas.
7:15
Se han relacionado los telmeros con varias funciones:
Participar en la estabilizacin y mantenimiento de la integridad estructural del cromosoma: en ausencia
de telmeros, el extremo del cromosoma tiende a unirse a otros y aumentan las posibilidades de que
sufra recombinacin y degradacin. Por otra parte, los telmeros permiten a las enzimas encargadas de
la reparacin del DNA diferenciar entre el extremo natural del cromosoma y uno que resulte de la
fragmentacin accidental de la cadena de DNA; en este ltimo caso se detiene el ciclo celular, evitando
la replicacin hasta que se haya reparado la lesin.
La funcin ms importante consiste en asegurar la replicacin completa de los extremos del cromosoma. Este
aspecto se estudiar una vez considerado con detalle el proceso de la replicacin del DNA (pg. 158).
Se especula tambin con la implicacin del telmero en la arquitectura tridimensional del ncleo o la
del emparejamiento cromosmico.
CAPTULO 8
El genoma en el ciclo celular
8.1 DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS

8.1.1 Nmero de cromosomas: valor n, haploida y diploida
8.1.2 Contenido de DNA: valor C
8.1.3 Locus y alelo
8.1.4 Genotipo, fenotipo y dominancia
8.2 INTRODUCCIN AL CICLO CELULAR
8.3 LA CROMATINA EN LA INTERFASE
8.3.1 Variaciones en condensacin y contenido
en DNA de la cromatina
8.4 DIVISIN DE CLULAS SOMTICAS POR MITOSIS
8.5 DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS
POR MEIOSIS
95
95
97
97
98
99
100
101
101
101
8.5.1 Gametognesis
8.5.1.1 Espermatognesis
8.5.1.2 Oognesis
8.5.2 Reparto del material gentico en la meiosis
8.5.2.1 Carcter reductor de la meiosis
8.5.2.2 Comparacin entre meiosis y mitosis
8.5.2.3 Segregacin de cromosomas y diversidad
gentica
8.5.2.4 Recombinacin meitica
8.6 UNIN DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE
LA FECUNDACIN
8.7 RESUMEN INTEGRADO
102
103
104
105
105
106
106
108
108
108
8.1 DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS

Es conveniente completar el conocimiento de la organizacin del material gentico considerando el contenido
total de este material presente en las clulas eucariticas y su relacin con el tipo de clula y el estadio en el que se
encuentra. Para ello, es preciso describir el significado de algunos trminos y conceptos genticos bsicos,
necesarios tambin para la comprensin del ciclo celular y de los dos tipos de divisin, mitosis y meiosis.
8.1.1 Nmero de cromosomas: valor n, haploida y diploida

El nmero de cromosomas en el ncleo es caracterstico de cada especie, y vara mucho de unas a otras. Se habla
de clulas haploides (y de organismos haploides, si estn formados slo por ellas) cuando cada cromosoma se
presenta en forma individual, de modo que cada clula contiene un juego de cromosomas, todos distintos
entre s. El nmero de cromosomas se identifica con el nmero n.
8:1
95
96
Por el contrario, se denomina clulas diploides (y organismos diploides) a aquellas en las que se observan
parejas o pares de cromosomas morfolgicamente iguales entre s; los dos miembros de la pareja se denominan
cromosomas homlogos. Por tanto, cada clula diploide tiene dos juegos de cromosomas, y este carcter
diploide se identifica con el nmero 2n (n parejas de cromosomas). En cada par, un cromosoma se ha heredado
del padre y otro de la madre.
8:2
8:3
En el caso de clulas (u organismos) con ms de 2n cromosomas (4n, 8n, etc.) se habla de poliploida. Hay
clulas que son poliploides de forma natural, porque han formado copias adicionales de su juego de cromosomas inicial mediante una replicacin sin divisin celular (endomitosis). Por ejemplo, las clulas del hgado en
regeneracin son tetraploides (4n), y los megacariocitos gigantes de la mdula sea contienen usualmente 8n,
97
8. El genoma en el ciclo celular
16n o 32n. Hay tambin situaciones patolgicas caracterizadas por poliploida: las ms frecuentes son la
triploida (3n) y la tetraploida (4n). Estas anomalas cromosmicas se estudian en el Captulo 25.
8.1.2 Contenido de DNA: valor C

Durante el ciclo celular, la formacin de gametos y la fertilizacin tienen lugar variaciones en el nmero de
cromosomas de la clula, indicadas mediante los mltiplos de n. En humanos y animales, estas variaciones
transcurren entre n (haploide) y 2n (diploide). No debe confundirse esa variacin con la del contenido en DNA
de cada clula, aunque ste tambin vara durante los procesos citados. Para indicar este contenido se emplea
una notacin basada en denominar C a la cantidad de DNA (bicatenario) correspondiente a un juego haploide
de cromosomas (es decir, n) antes de su replicacin. Se pueden encontrar clulas, tanto haploides como
diploides, cuyo contenido C es diferente:
Clula haploide
Clula diploide
n,C
gameto maduro (vulo y espermatozoide)
n,2C
gametocito secundario (precursor de los gametos maduros)
2n,2C
clula somtica cuando no est en divisin, antes de sufrir la replicacin de su DNA
2n,4C
clula somtica tras sufrir la replicacin, a punto de dividirse por mitosis

gametocito primario, antes de dividirse por meiosis dando 2 gametocitos secundarios
8.1.3 Locus y alelo
8:4
En cualquier clula de una misma especie, un gen ocupa siempre el mismo lugar en un cromosoma
determinado, y la posicin equivalente en su homlogo. (Por ahora, basta con que se entienda por gen una
secuencia de DNA que codifica un producto funcional, bien protena o bien RNA. Ms adelante se define con
mayor precisin [pg. 263].) Para referirse de forma genrica a esa posicin se utiliza el trmino locus. Por
tanto, genes distintos ocuparn diferentes loci (plural de locus), ya sea en el mismo par de cromosomas o en
otro. Estos trminos tambin se utilizan para la posicin de regiones del DNA que no sean genes.
Cada porcin de secuencia concreta de DNA (gnica o no) situada en un locus se denomina alelo. Puesto que
los cromosomas se presentan en pares, en cada individuo hay dos alelos en el mismo locus, que pueden ser
idnticos o diferentes.
En general, los dos alelos que presenta un individuo en un locus determinado son diferentes de los de otro
individuo de la misma especie (diversidad gentica o polimorfismo, pg. 405). Como consecuencia, en el
conjunto de la poblacin existen ms de dos alelos diferentes para un locus. El estudio de enfermedades ha
permitido identificar numerosos alelos, aquellos menos frecuentes en la poblacin, que sirven hoy como
marcadores para identificar dichas patologas.
98
8.1.4 Genotipo, fenotipo y dominancia
8:5
8:6
En las situaciones en las que existen dos o ms alelos en la poblacin se dice que hay polimorfismo,
obviamente referido al locus considerado. Los polimorfismos del genoma humano son objeto de atencin
especial en el Captulo 24.
8.2 INTRODUCCIN AL CICLO CELULAR

Es importante destacar que los aspectos estructurales considerados hasta ahora para la molcula de DNA
deben estudiarse bajo la situacin fisiolgica en la que realmente se encuentra el material gentico en el ncleo
eucaritico, es decir, durante las etapas de reposo y divisin que se alternan en la vida de la clula. Con
frecuencia, estas dos cuestiones se relacionan poco entre s, o se analizan bajo planteamientos que carecen de
una base molecular suficiente. Se pretende en este texto resaltar la conexin entre los cambios moleculares de la
cromatina y los procesos del ciclo celular.
Mediante la divisin celular se generan tanto los gametos (divisin meitica) como, a partir del cigoto, todas
las clulas necesarias para que un organismo crezca y se desarrolle durante los perodos embrionario, fetal y de
crecimiento hasta el estado adulto, as como para la renovacin continua de las clulas que mueren durante
dichos perodos (divisin mittica).
La divisin por mitosis tiene lugar normalmente durante toda la existencia del organismo, desde la primera
divisin del cigoto hasta que el individuo muere. Se calcula que durante la vida humana se producen alrededor
de 1017 divisiones. La transicin entre dos divisiones sucesivas (interfase) constituye, junto a la propia divisin, el
ciclo de divisin celular (o, simplemente, ciclo celular). Su duracin vara ampliamente de acuerdo con el tipo de
clula, as como en funcin de determinados estmulos. Algunas clulas experimentan una sucesin continua
de ciclos de divisin (por ejemplo, clulas epiteliales del intestino y precursores hematopoyticos en la mdula
sea), otras poseen ciclos ms espaciados (una vez al mes en clulas hepticas, una vez cada 3 aos en clulas
endoteliales de vasos sanguneos, etc.) y, como caso extremo, algunas clulas detienen su progresin en el ciclo,
reanudndolo tras un perodo prolongado (quiescencia) o incluso no dividindose ms (caso de las neuronas).
Existen unas pocas clulas especializadas en la produccin de gametos o clulas sexuales, que permitirn la
formacin de un nuevo individuo. Dichas clulas germinales se dividen mediante meiosis, un mecanismo
diferente al del resto (clulas somticas), aunque tambin est precedido de un ciclo celular similar.
Una visin global del ciclo celular permite observar cmo la clula progresa de manera ordenada y sin
discontinuidad por dos grandes etapas bien diferenciadas: la divisin celular propiamente dicha (por mitosis
para clulas somticas y por meiosis para clulas germinales) y la interfase (comn a ambas). Durante esta
ltima, la clula se prepara para la siguiente divisin duplicando su material gentico (DNA) y todo su
99
100
contenido (protenas, RNA, orgnulos, membranas), de modo que se duplica su tamao antes de dividirse en
dos clulas hijas. Clsicamente, el ciclo se plantea en torno al proceso de replicacin, o duplicacin del DNA
nuclear, con lo que se definen dentro de la interfase tres etapas: la fase S (durante la cual tiene lugar la replicacin), la fase G1 (previa) y la fase G2 (posterior). Mientras que algunas clulas completan rpidamente cada interfase para entrar de nuevo en divisin, otras pasan a un estadio modificado de G1, llamado
fase G0 o quiescente, en el que permanecen das o incluso aos hasta emprender un nuevo ciclo, o del que nunca
salen (clulas que no se dividen, como es el caso de las neuronas).
8:7
Siguiendo el planteamiento general de este texto, interesa relacionar los aspectos genticos clsicos del ciclo
con aquellos otros de ndole ms bioqumica y molecular. Para ello, se abordarn en forma detallada la
interfase y los dos tipos de divisin celular, con estos objetivos:
Poner de manifiesto la enorme variacin estructural que supone, durante la interfase, la condensacin de la
molcula de DNA desde cromatina a cromosoma y su descondensacin en sentido inverso.
Resaltar el proceso de la replicacin, que tiene lugar igualmente durante la interfase pero en un momento
diferente del anterior. Sus caractersticas moleculares y enzimticas se estudiarn con detalle en el Captulo 11.
Establecer las analogas y diferencias entre la divisin por mitosis de las clulas somticas y la divisin por
meiosis de las clulas germinales primarias para dar lugar a clulas germinales maduras o gametos.
8.3 LA CROMATINA EN LA INTERFASE

La interfase, o lapso que transcurre entre dos divisiones celulares, es normalmente el perodo ms prolongado
del ciclo celular, con sus tres fases G1, S y G2. Esta etapa termina cuando una clula somtica entra en divisin
por mitosis (para formar clulas somticas hijas), y cuando una clula germinal primaria se divide por meiosis
(para formar las clulas germinales maduras). Se va a estudiar cmo durante la interfase vara el grado de
condensacin del material gentico y tambin cmo vara el contenido de DNA (2C en G1, 4C en G2) sin que se
modifique el nmero de cromosomas (la clula se mantiene diploide, 2n).
8.3.1 Variaciones en condensacin y contenido en DNA de la cromatina

Durante la mayor parte de la vida celular (bien interfase o bien quiescencia, segn los casos), la molcula de
DNA no est presente en la forma extendida de doble hlice ni tampoco en la forma compacta de cromosomas,
sino en el estado parcialmente condensado conocido como cromatina (pgs. 85 y 87).
Al progresar en el ciclo celular, la cromatina se descondensa de manera gradual durante la fase G1 hasta
adoptar localmente una conformacin totalmente extendida (correspondiente a la doble hlice), necesaria para
la separacin de las dos hebras durante la replicacin (fase S). Para ello, la eucromatina ha de pasar antes por los
estados de fibra de 30 y 10 nm (pg. 103).
Durante la fase G1, las clulas, tanto somticas como germinales, son diploides (2n) y su contenido en DNA
es 2C. En la fase S o de sntesis se produce la replicacin del DNA de los 2n cromosomas individuales. Cada
hebra de este DNA sirve de molde para la sntesis de otra nueva, que permanece asociada por emparejamiento
de bases. Las dos molculas de DNA bicatenario resultantes permanecen unidas por el centrmero, dando as
lugar a cromosomas con 4 hebras de DNA; cada doble hebra constituye una cromtida. De este modo, el
nmero de cromosomas permanece constante (diploide, 2n), pero se duplica el contenido de DNA, desde 2C
a 4C. Una vez finalizada la replicacin de todo el genoma, la clula entra en la fase G2 donde se inicia la
condensacin gradual de la cromatina (pg. 102, en secuencia inversa a la descondensacin ocurrida durante la
fase G1, pg. 103), que se completa en las primeras etapas de la mitosis dando lugar a cromosomas visibles al
microscopio, con su aspecto tpico de 2 cromtidas y 4 brazos. La clula sigue siendo 2n, 4C.
Aunque se puede considerar que cada molcula de DNA es un cromosoma en cualquier momento del ciclo,
el trmino cromosoma corresponde estrictamente a esta forma condensada al mximo. A veces se usan los
trminos cromosoma metafsico y cromosoma interfsico para las formas condensada y descondensada
(cromatina), respectivamente. Conviene, finalmente, recordar que slo la cromatina suficientemente descondensada puede sufrir transcripcin, o expresin de sus genes (pgs. 88, 268 y 281).
8.4 DIVISIN DE CLULAS SOMTICAS POR MITOSIS

La mitosis, o fase M, es habitualmente el perodo ms corto del ciclo celular, durante el que tiene lugar la
divisin de la clula, que ya ha duplicado su material gentico y citoplasmtico, en dos clulas hijas idnticas.
Clsicamente se subdivide en cinco etapas: 1) Profase: la cromatina se condensa hasta formar los cromosomas,
dejan de observarse los nuclolos y aparece el huso mittico. 2) Prometafase: comienza a romperse la membrana nuclear, se ven por primera vez las 2 cromtidas de cada cromosoma y los 2n cromosomas dobles migran
hacia el plano ecuatorial de la clula. 3) Metafase: los 2n cromosomas, totalmente condensados, aparecen
alineados en el plano ecuatorial, independientes unos de otros. 4) Anafase: los cromosomas se dividen por sus
centrmeros, separndose en dos cromtidas, que son desplazadas hacia polos opuestos de la clula. Cada
cromtida es ya un cromosoma hijo independiente. 5) Telofase: comienzan a descondensarse los cromosomas
y se forman membranas nucleares para delimitar dos ncleos. Paralelamente, la membrana celular separa el
citoplasma en dos partes, cada una con un ncleo y la mitad de los orgnulos, formando las dos clulas hijas, en
el proceso llamado citocinesis (o citoquinesis).
Web 8.1. Separacin de las cromtidas durante la mitosis.
Como consecuencia de la mitosis, cada clula hija recibe una cromtida de cada cromosoma de la clula
progenitora, es decir, la mitad de DNA, pero constituyendo un conjunto cromosmico completo (23 pares de
cromosomas) con toda la informacin gentica de la clula progenitora. Por ello, se dice que la mitosis es un
proceso de divisin no reductora (pg. 105). La nica diferencia es que la clula justo antes de dividirse tiene
2n cromosomas de 4 hebras y 2 cromtidas cada uno (4C) y tras la divisin cada clula hija tiene 2n cromosomas de 2 hebras y una cromtida cada uno (2C) (pgs. 102-103).
8.5 DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS

La divisin meitica forma parte del proceso de gametognesis, es decir, formacin de gametos o clulas sexuales
haploides a partir de clulas germinales primordiales (que son diploides, al igual que las clulas somticas).
101
102
8:8a
8.5.1 Gametognesis
La oognesis y la espermatognesis se inician a partir de clulas germinales primordiales, clulas especializadas
del vulo y testculo, respectivamente, mediante una serie de divisiones mitticas que, con el consiguiente
proceso de crecimiento y diferenciacin celular, producen sucesivas generaciones de clulas llamadas oogonios
y espermatogonios (tambin oogonia y espermatogonia; pgs. 103 y 104). A continuacin stas, tambin por
mitosis, dan lugar a oocitos y espermatocitos primarios. Todas estas clulas son diploides. Finalmente, a partir
8:8b
de cada oocito o espermatocito primario, y mediante dos divisiones sucesivas diferentes (meiosis I y meiosis II),
se produce la reduccin del estado diploide al haploide. Por ello, el conjunto de esas dos divisiones recibe el
nombre de meiosis o divisin celular reductora.
8.5.1.1 Espermatognesis
En el caso del varn, el proceso, que tiene lugar de forma repetida a lo largo de toda su vida, culmina con la
produccin de espermatozoides o gametos masculinos.
103
104
8:9
Cada uno de los espermatocitos primarios ha dado lugar a un reparto simtrico del citoplasma en cuatro
espermatozoides iguales. El nmero total de divisiones alcanza valores sorprendentes, variables segn la edad,
ya que dependen de los aos transcurridos desde la pubertad. El nmero total de espermatozoides realmente
producidos es obviamente variable; baste indicar que un hombre sano puede formar unos 200 millones diarios
durante toda su vida frtil y que un eyaculado, con unos 2 ml, contiene unos 60 millones de espermatozoides.
8.5.1.2 Oognesis
Por el contrario, en la mujer la oognesis ocurre en su mayor parte durante la vida fetal, a partir de la clula
germinal primordial originada en el endodermo del saco vitelino del embrin. El mayor nmero de oocitos
primarios se alcanza hacia el quinto mes de vida fetal (comprese con la pubertad para el varn) y es muy inferior
al de espermatocitos primarios. A partir de ese momento, el nmero de oocitos se reduce continuamente hasta la
pubertad, se mantiene durante la vida frtil de la mujer y desaparece casi totalmente al llegar la menopausia.
8:10
Otra peculiaridad que diferencia espermatognesis y oognesis es que en las dos divisiones meiticas de esta
ltima el reparto del citoplasma es asimtrico: en la meiosis I se forma una clula pequea que recibe el nombre
de cuerpo polar y un oocito secundario grande. La divisin de ste en la meiosis II origina un segundo cuerpo
polar y un vulo maduro. Ambos cuerpos polares degeneran posteriormente. Por tanto, un oocito primario
slo genera un vulo, mientras que un espermatocito primario produce cuatro espermatozoides.
8.5.2 Reparto del material gentico en la meiosis

8.5.2.1 Carcter reductor de la meiosis
En la meiosis I, el gametocito (oocito o espermatocito) primario separa sus 23 pares de cromosomas homlogos
(2n, 4C, con dos cromtidas cada uno), de forma que pasan 23 cromosomas diferentes (uno de cada par; n, 2C,
con 2 cromtidas) a cada gametocito secundario (primera ley de Mendel). Se dice que se produce la segregacin
de los cromosomas, o que cada par ha sufrido disyuncin; se reduce as a la mitad el nmero de cromosomas.
105
106
Por ello, se afirma que la meiosis es una divisin reductora, debido a la meiosis I. La meiosis II es no reductora y
en cuanto al reparto de material gentico se asemeja a la mitosis, como se discute a continuacin.
8:11
8.5.2.2 Comparacin entre meiosis y mitosis

La diferencia esencial entre la mitosis y las dos etapas de la meiosis radica en la distribucin del material gentico
entre las clulas hijas (somticas diploides en mitosis; gametos haploides en meiosis). El mecanismo de la meiosis
II es equivalente al de la mitosis, puesto que se separan las dos cromtidas y se reduce la cantidad de DNA (2C !
C) sin cambiar el carcter haploide (n). De este modo, cada clula hija recibe copias idnticas de DNA. En
contraste, en la meiosis I se separan los miembros de cada pareja de cromosomas, con lo que se reducen a la vez la
cantidad de DNA (4C ! 2C) y el nmero de cromosomas (2n ! n), y las clulas hijas reciben diferente material
gentico (pues cada cromosoma de un par puede contener alelos diferentes en cada locus, pg. 97).
8.5.2.3 Segregacin de cromosomas y diversidad gentica

En ambas divisiones meiticas el reparto de los cromosomas homlogos de cada par (meiosis I) y de las
cromtidas de cada cromosoma (meiosis II) se hace al azar, de forma totalmente independiente para cada
cromosoma (segunda ley de Mendel). En definitiva, se asegura con creces que cada gameto recibe diferente
material gentico; esta variabilidad es el fundamento del polimorfismo gentico, cuyos detalles y consecuencias
se estudian ms adelante (Captulo 24).
8:12
107
108
8.5.2.4 Recombinacin meitica

Durante la profase de la meiosis I (profase I) tiene lugar un proceso de gran trascendencia en cuanto a la herencia y a
la generacin de la diversidad gentica de cada individuo: se trata de la recombinacin meitica, o simplemente
recombinacin. Los detalles de este proceso no se tratan aqu, pero bsicamente consiste en el sobrecruzamiento, o
intercambio de regiones de DNA entre cromtidas de los dos cromosomas homlogos (es decir, nunca hay
recombinacin entre cromtidas de distinto par). De ah que se llame tambin recombinacin homloga.
Web 8.2. Alteracin de genotipos como resultado de la recombinacin.
8.6 UNIN DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE LA FECUNDACIN

Cuando los dos gametos (n, C) se unen en la fecundacin, el proncleo macho del espermatozoide se funde con
el proncleo hembra del vulo, combinando sus dos genomas haploides para dar un genoma 2n, 2C en el
ncleo de la clula huevo o cigoto. sta es, as, la primera clula somtica propiamente dicha. Como tal, entra en
la fase G1 y posteriores de la interfase. A partir del cigoto se forman en definitiva todas las clulas somticas
(y tambin las germinales primordiales). El mecanismo que rige la transformacin de una simple clula, el
cigoto, en un individuo completo constituye un tema de gran inters biolgico y poco conocido an desde el
punto de vista molecular. Tras mltiples divisiones celulares, se origina un agregado globular de clulas
embrionarias, las cuales se autoorganizan y especializan hasta formar un fantstico conjunto de clulas
(estimado entre 50 y 100 billones para un ser humano adulto), repartidas en alrededor de 250 tipos celulares
diferentes, cada uno con una funcin y disposicin concretas, en las distintas estructuras del organismo
completo (cerebro, ojos, nariz, corazn, etc.). La biologa del desarrollo es un mbito de activa investigacin
y se han podido identificar genes que controlan, por ejemplo, la disposicin dorsal/ventral o derecha/izquierda
de algunos rganos; sin embargo, queda an mucho por conocer sobre los mecanismos moleculares que
gobiernan la organognesis.
8.7 RESUMEN INTEGRADO

Para terminar, el siguiente esquema resume los distintos procesos estudiados, recogiendo de una forma
unificada los cambios en la cantidad de material gentico que sufre la clula durante los procesos de
fecundacin, divisin meitica y mittica y ciclo celular.
8:13
CAPTULO 9
Organizacin del genoma eucaritico
9.1 ESTRUCTURACIN DEL GENOMA EUCARITICO

9.2 DNA CODIFICANTE: INTRODUCCIN
AL CONCEPTO DE GEN
9.3 DNA DE COPIA NICA, SIMPLE O NO REPETITIVO
9.4 DNA REPETITIVO
9.4.1 DNA repetitivo codificante
9.4.1.1 DNA repetitivo codificante agrupado
a) Familias gnicas clsicas
b) Familias multignicas de genes agrupados
9.4.1.2 DNA repetitivo codificante disperso:
familias multignicas de genes dispersos
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9.4.2 DNA repetitivo no codificante

9.4.2.1 DNA altamente repetitivo y agrupado:
DNA satlite
9.4.2.2 DNA moderadamente repetitivo y disperso
a) Bloques dispersos de repeticiones
en tndem: DNA minisatlite y
DNA microsatlite
b) Repeticiones dispersas: SINE y LINE
9.5 ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD
EN EL GENOMA EUCARITICO
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116
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117
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118
115
En los procariotas prcticamente todo el DNA existe en forma de copia nica y codifica productos gnicos
(protenas o RNA). Sin embargo, esto no se cumple en el genoma nuclear de eucariotas; por ejemplo, se calcula
que slo 100 Mb del total de 3.200 Mb del genoma humano haploide son codificantes. Adems, el genoma
eucaritico se caracteriza por la repeticin de secuencias. El objetivo de este captulo es plantear esta distincin
entre DNA de copia nica y DNA repetitivo, as como estudiar con detalle este ltimo en el genoma humano. El
carcter codificante, aunque se incluye tambin aqu, se comprender mejor en captulos posteriores, al
estudiar la expresin gnica (transcripcin, maduracin y traduccin). Los aspectos experimentales que han
permitido la demostracin de la presencia de DNA repetitivo en el genoma eucaritico se describen al final del
captulo. Basndose en toda esta informacin, se podr abordar ms adelante su aplicacin a problemas
biotecnolgicos en general y clnicos en particular.
9.1 ESTRUCTURACIN DEL GENOMA EUCARITICO

Para el estudio de la distribucin de secuencias dentro del genoma humano ste puede subdividirse en distintas
categoras de DNA en funcin de su repetitividad y de su carcter codificante:
9:1
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9:2
A diferencia del nuclear, el genoma de la mitocondria, de tamao muy pequeo (16.569 pb en humanos, por
tanto 200.000 veces inferior al genoma nuclear haploide), est formado casi en su totalidad por DNA
codificante.
Todas estas cifras que cuantifican la proporcin de DNA codificante y los distintos subtipos de DNA
repetitivo varan de forma notable entre diferentes textos. La razn de esta discrepancia puede proceder, entre
otros factores, de si se cuentan como codificantes los intrones o las regiones de control de la expresin gnica. A
todo ello se suma la incapacidad, al menos en este momento, para asignar fehacientemente todas las secuencias
del genoma a un producto gnico o funcin concretos. Respecto a las secuencias repetitivas, la clasificacin
aqu planteada en trminos de tamao, nmero de las repeticiones y ubicacin, posee, obviamente, fronteras no
siempre precisas.
Por tanto, las cifras aqu recogidas deben tomarse como una orientacin con un inters didctico ms que
como valores certeros. La relevancia de conocer esta realidad de los genomas eucariticos no depende de la
frecuencia precisa de cada tipo de secuencia.
9.2 DNA CODIFICANTE: INTRODUCCIN AL CONCEPTO DE GEN

El concepto de gen, aunque ha sufrido una gran evolucin en eucariotas, hacindose ms complicado y con
mltiples componentes, se sigue definiendo bajo un criterio estrictamente funcional, siempre en relacin con la
transmisin de la informacin desde DNA a RNA y, en su caso, desde mRNA a protenas. El estudio detallado
de las caractersticas de los genes eucariticos se deja para ms adelante, cuando se analice su expresin
(Captulo 17).
Brevemente, un gen es aquella regin del DNA necesaria para que pueda sintetizarse una macromolcula funcional, un producto gnico; ste puede ser bien una protena, bien un RNA. Ms en concreto,
un gen comprende tanto secuencias estructurales como secuencias reguladoras. Las primeras comnmente
consideradas como la parte codificante del gen se transcriben de forma exclusiva en RNA (regin estructural
de genes de tRNA, rRNA o RNA pequeos), o bien se transcriben en un mRNA que, a su vez, se traduce a
protena. Las segundas actan en ambos casos controlando la transcripcin de las regiones estructurales.
9. Organizacin del genoma eucaritico
9:3
9.3 DNA DE COPIA NICA, SIMPLE O NO REPETITIVO

El DNA no repetitivo constituye la mayor parte del genoma, aunque en una proporcin variada dependiendo
del tipo de organismo (100% en procariotas, 80% en eucariotas inferiores, 50-70% en animales superiores).
Parte de este DNA (5%) constituye las secuencias de genes, que codifican los RNA y protenas celulares; otra
parte (5%) es responsable del control de la expresin de esas secuencias, mientras que el resto, mayoritario
(50%), es DNA no codificante, cuya funcin, si existe, apenas se conoce.
El DNA de copia nica se asoci durante mucho tiempo al concepto de gen; hoy se sabe que tambin una
pequea parte del DNA repetitivo forma algunos genes eucariticos, como se estudiar a continuacin.
9.4 DNA REPETITIVO

Las secuencias de DNA que aparecen en copias mltiples, o DNA repetitivo, constituyen entre un 30 y un
50% del total del genoma humano, dependiendo de las fuentes. Esta abundancia es una caracterstica
determinante de la gran complejidad del genoma eucaritico. Las secuencias repetidas, llamadas unidades
de repeticin o simplemente repeticiones, poseen tamaos diversos y cada una aparece de forma idntica o
casi idntica muchas veces en el genoma. Su distribucin puede darse en forma dispersa por todo el
genoma, entremezcladas con las secuencias de copia nica, o bien en forma agrupada, localizada en
regiones concretas de un cromosoma. En ambos casos, el nmero de copias de la unidad de repeticin
vara desde unas centenas o miles (DNA moderadamente repetitivo) hasta cientos de miles (DNA altamente
repetitivo). Esto coincide en muchos casos con una distribucin en forma dispersa y agrupada, respectivamente.
111
112
9:4
Una parte del DNA repetitivo tiene carcter codificante, es decir, contiene la informacin para expresar un
producto funcional (RNA o protena). Para el resto del DNA repetitivo no se conoce una funcin clara; alguno
posiblemente contribuya a mantener la estructura de los cromosomas, mientras que se ha llegado a proponer
que una parte sea DNA chatarra o DNA basura, un vestigio evolutivo sin funcin actual. Finalmente, debe
destacarse que algunas de las secuencias repetidas no codificantes (en concreto, las denominadas minisatlites y
microsatlites), aun con funcin desconocida, tienen gran relevancia aplicada en pruebas de identificacin y en
estudios familiares, debido a su variabilidad entre individuos (polimorfismo, Captulo 24).
La repetitividad del DNA posee probablemente un origen evolutivo. Por un lado, las repeticiones agrupadas
pueden surgir debido a errores en la replicacin o en la recombinacin gentica. Por otro, la separacin entre
repeticiones dispersas puede provenir de translocaciones o transposiciones cromosmicas.
9.4.1 DNA repetitivo codificante

Se le llama tambin DNA repetitivo funcional, pues forma genes que se expresan (aunque no todos ellos, como
se ver). Su tamao se estima alrededor del 10% del genoma (esta cifra incluye probablemente las regiones
de control e intrones respectivos, por lo que la fraccin realmente codificante ser inferior). Aparece en forma de familias de genes, cuyos miembros se caracterizan por su homologa, al haberse originado mediante
duplicaciones (pg. 407) y variaciones de un gen ancestral.
9.4.1.1 DNA repetitivo codificante agrupado

a) Familias gnicas clsicas
Contienen secuencias repetidas que codifican un mismo RNA o protena, que puede, as, sintetizarse con
rapidez y en gran cantidad. Son ejemplos caractersticos los genes de histonas y los de RNA ribosmico,
productos ambos que la clula necesita en abundancia (las histonas pg. 84 deben sintetizarse rpidamente
en la fase S del ciclo celular, para asociarse al nuevo DNA procedente de la replicacin, mientras que el
rRNA captulo 6 supone el 75% del total de RNA celular).
9:5
9:6
b) Familias multignicas de genes agrupados

A diferencia de las anteriores, los miembros de cada familia son genes con cierta diversidad de secuencia. Se
pueden incluir en este grupo tres tipos de familias:
Las que presentan homologa slo en parte de la secuencia de DNA, que da lugar a protenas con grandes
regiones de secuencia y estructura comunes (dominios).
Familias con homologa escasa en las secuencias del DNA, lo que genera protenas con pequeos motivos
comunes, cada uno de pocos aminocidos.
Grandes superfamilias, con muy dbil homologa en la secuencia de DNA y, por tanto, en la de las protenas,
a pesar de lo cual stas mantienen una similitud estructural (en parte de su molcula, dominios comunes) y una
relacin funcional. Los genes que forman cada superfamilia parecen estar relacionados evolutivamente, pero
ms distantes entre s que los miembros que componen las familias anteriores.
113
114
9:7
Como consecuencia de los procesos evolutivos que dan lugar a las familias multignicas, aparecen con
frecuencia en ellas miembros con ciertas caractersticas diferenciales:
Copias de genes (variantes) con pequeas diferencias de secuencia, que codifican productos gnicos funcionales pero de caractersticas ligeramente distintas (por ejemplo, diferencias en actividad enzimtica,
parmetros cinticos, especificidad por sustrato, afinidad por su ligando, etc.). Es comn que se active de
forma alternativa la expresin de una u otra variante en funcin del estadio de desarrollo o de diferenciacin
celular, el tipo de tejido, etc.
9:8
Pseudogenes: se aplica este trmino (abreviado como y) a copias inactivas de un gen, es decir, que nunca se
expresan, o que, aun expresndose, no son funcionales. En general, la inactivacin se ha producido por
acumulacin de mutaciones durante la evolucin en lo que inicialmente era un duplicado del gen. Existen
tipos diversos de pseudogenes, en funcin de si se expresan y si sufren procesamiento postranscripcional, as
como de su origen evolutivo.
Genes truncados: se trata de copias incompletas del gen, por prdida de una regin situada en uno de los
extremos (5 o 3).
Fragmentos de genes: en este caso se conserva slo una porcin del interior de la secuencia del gen (se han
perdido ambos extremos).
Obviamente, slo las copias idnticas (familias clsicas) y las variantes conducen a productos gnicos
funcionales, mientras que los pseudogenes, genes truncados y fragmentos de genes parecen ser vestigios
evolutivos sin funcin actual.
Los genes de la globina constituyen uno de los ejemplos ms representativos de familias multignicas con
genes agrupados, implicado en una funcin tan importante como es el transporte de oxgeno en la corriente
sangunea. Su estudio incluye consideraciones evolutivas, de desarrollo y diferenciacin, de regulacin de la
expresin gnica, etc.
9:9
9.4.1.2 DNA repetitivo codificante disperso: familias multignicas de genes dispersos

Mientras que en las familias multignicas anteriores las repeticiones se disponen agrupadas, prximas en la
secuencia lineal del genoma, en otras los genes que forman la familia (copias idnticas, variantes, pseudogenes,
etc.) se localizan de forma dispersa por el genoma, a menudo incluso en cromosomas distintos. Entre estas
familias se encuentran genes que codifican protenas de funciones diversas: enzimticas, reguladoras, de
almacenamiento, estructurales, etc. Por ejemplo, la familia de aldolasa comprende 3 genes funcionales y
2 pseudogenes, repartidos en 5 cromosomas; los genes de actina forman otra familia con 6 genes y ms de
20 pseudogenes en 12 cromosomas.
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116
9.4.2 DNA repetitivo no codificante

sta es la fraccin del genoma a la que el trmino DNA repetitivo se refiere de forma ms habitual. Su tamao se
estima entre un 30 y un 40% del DNA genmico total. Como ya se ha indicado, se subdivide en dos categoras:
el moderadamente repetitivo, que se ubica en forma dispersa, y el altamente repetitivo, que adems es
agrupado. Su distribucin general en el genoma puede representarse de forma grfica como se muestra en la
figura, para dos cromosomas representativos.
9:10
9:11
9.4.2.1 DNA altamente repetitivo y agrupado: DNA satlite

Supone entre un 10 y un 20% del genoma, y se denomina tambin DNA repetitivo en tndem. No debe
confundirse con los DNA minisatlite y microsatlite (ambos corresponden al DNA moderadamente repetitivo
y disperso, pg. 117) ni con los satlites cromosmicos, las pequeas masas de cromatina que forman el
extremo de los brazos cortos de un cromosoma acrocntrico (pg. 89).
Este tipo de DNA est formado por unidades de pequeo tamao (entre 2 y 50 pb) repetidas en tndem entre
miles y un milln de veces, con lo que el bloque de repeticin abarca cientos de kb o incluso varias Mb. Tambin
es caracterstica su localizacin agrupada en lugares especficos de varios cromosomas, correspondientes a las
regiones heterocromticas, principalmente en torno al centrmero y en los telmeros. Se conoce el papel de este
DNA satlite en las regiones telomricas (pgs. 94 y 158), pero an no su funcin exacta en el centrmero.
El nombre de DNA satlite tiene un origen metodolgico: debido a su alta tasa de repeticin, las regiones de
este tipo de DNA poseen una composicin de bases diferente a la del resto del genoma, que es ms promediada.
Cuando el DNA total se fragmenta (por ejemplo, por fuerzas de cizalla) y se analiza en gradientes de densidad
de cloruro de cesio (pgs. 137-138), los fragmentos procedentes de las regiones de DNA satlite, que poseen
menor densidad debido a su menor contenido en G + C, se separan de la banda principal de DNA formando
bandas satlites. Cada una de ellas corresponde a una subfamilia de DNA satlite (como 1, 2, 3, a y b), con
distinta secuencia de repeticin o nmero de repeticiones.
9:12
9.4.2.2 DNA moderadamente repetitivo y disperso

Como indica su nombre, este tipo de DNA se distribuye a lo largo de todos los cromosomas, con un nmero de
repeticiones no muy elevado (entre 102 y 104). Se puede subdividir en dos categoras, en funcin de la forma en
que se distribuyen las repeticiones: en primer lugar, algunas secuencias se repiten en tndem formando bloques,
los cuales aparecen de forma dispersa por el genoma. El segundo tipo consiste en repeticiones igualmente
dispersas por todo el genoma, pero que no se agrupan en bloques.
a) Bloques dispersos de repeticiones en tndem: DNA minisatlite y DNA microsatlite
Se distinguen estos dos subgrupos en funcin del tamao de la unidad de repeticin. Constituyen conjuntamente entre el 15 y el 20% del genoma. A pesar de la similitud de nombre, no deben confundirse con el DNA
satlite (pg. 116), del que se diferencian por estar localizados de forma dispersa por el genoma, aunque se
asemejan a l en la presencia de repeticiones en tndem.
La importancia prctica del DNA minisatlite y microsatlite radica en su gran variabilidad entre individuos, que permite utilizarlo como marcador molecular en medicina forense, pruebas de paternidad y
diagnstico de enfermedades moleculares; estas aplicaciones se describen ms adelante al hablar de polimorfismo gentico (pg. 424).
a1) DNA minisatlite:
Est formado por repeticiones de 10 a 65 pb, ricas en G + C, agrupadas en tndem formando bloques
relativamente grandes, de cientos o miles de repeticiones; dichos bloques se encuentran repartidos por todo
el genoma.
Algunas de estas repeticiones, denominadas DNA minisatlite hipervariable, se caracterizan por su
elevado polimorfismo (diferencias tanto en secuencia como en nmero de repeticiones), no slo entre individuos
de una especie, sino tambin incluso entre dos cromosomas homlogos de un individuo. Sus repeticiones, de 10
a 24 pb, presentan la secuencia consenso GGGCAGGANG (donde N representa cualquier nucletido). Este
DNA es importante por las aplicaciones derivadas de su polimorfismo, principalmente la obtencin de huellas
de DNA, donde una sonda para la secuencia consenso puede hibridar de manera simultnea con mltiples loci
minisatlites diferentes distribuidos por todos los cromosomas, lo que da lugar a un esquema o patrn de
hibridacin distinto para cada individuo (pg. 425).
Algunos autores consideran al DNA telomrico como parte del minisatlite. No obstante, segn los criterios
de clasificacin adoptados en este texto, ni el tamao de su unidad de repeticin ni su disposicin agrupada en
pocos lugares del cromosoma permiten su asignacin a esta categora.
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a2) DNA microsatlite:

Se aplica este trmino cuando la unidad de repeticin es inferior a 7 pb. Se presentan agrupadas en tndem en
bloques de hasta 50 repeticiones, tambin distribuidos de forma dispersa por el genoma. Su polimorfismo se
aplica igualmente para la obtencin de huellas genticas, para pruebas de identidad y para estudios familiares.
Aunque las secuencias telomricas se han clasificado anteriormente como DNA repetitivo agrupado (DNA
satlite), por su ubicacin en puntos concretos del cromosoma, algunos autores las consideran DNA microsatlite por el hecho de compartir con ste caractersticas de tamao, nmero y disposicin en tndem de
las repeticiones.
b) Repeticiones dispersas: SINE y LINE
De nuevo, la longitud de la unidad de repeticin sirve de criterio para subdividirlas:
b1) Secuencias SINE:
Las siglas proceden de Short Interspersed Nuclear Elements, elementos nucleares dispersos cortos. Se habla
comnmente de unidades de entre 100 y 500 pb, repetidas hasta 20 veces. Sin embargo, el ejemplo ms
caracterstico, el elemento Alu, de 300 pb, aparece en el genoma humano entre medio milln y un milln de
veces. Su nombre se debe a que contiene un sitio diana para la enzima de restriccin Alu I. Se trata en realidad
de una familia de secuencias, con un 85% de homologa, que supone por s sola alrededor de un 5% del
genoma, de modo que, en promedio, existe una secuencia Alu cada 4 o 5 kb.
Se cree que los elementos Alu se originaron evolutivamente por la integracin en el genoma de mltiples
copias (retroposones) formadas por transcripcin inversa del gen del RNA 7SL, un RNA citoplsmico pequeo
(scRNA) componente de la partcula de reconocimiento de seal (pg. 357). A pesar de la homologa (parcial)
de secuencia, las secuencias Alu no ejercen la funcin de este scRNA.
b2) Secuencias LINE:
En este caso, se trata de elementos nucleares dispersos largos (Long Interspersed Nuclear Elements), con
unidades de mayor tamao, generalmente varios miles de pb, que se repiten hasta 50.000 veces en forma
dispersa. La principal familia LINE en humanos la constituyen las secuencias Kpn, tambin denominadas L1 o
LINE-1. Se encuentran en el genoma de 50.000 a 100.000 repeticiones dispersas, de tamaos comprendidos
entre 1,4 y 6,1 kb cada una, debido a su diversidad.
9.5 ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA EUCARITICO

El descubrimiento y anlisis del DNA repetitivo, caracterstico del genoma eucaritico, se ha basado fundamentalmente en las tcnicas de reasociacin del DNA desnaturalizado.
Web 9.1. Estudio experimental de la complejidad en el genoma eucaritico.
CAPTULO 10
Preparacin de muestras, extraccin

y anlisis de cidos nucleicos
10.1 OBTENCIN Y PREPARACIN PRELIMINAR

DE LAS MUESTRAS
10.1.1 Tejidos slidos
10.1.2 Clulas embrionarias
10.1.2.1 Clulas del embrin no implantado
10.1.2.2 Lquido amnitico
10.1.2.3 Tejidos o sangre fetales
10.1.3 Clulas de sangre o de mdula sea adultas
10.1.4 Muestras bucales
10.1.5 Semen
10.1.6 Clulas en cultivo
10.1.7 Otros lquidos extravasculares
10.1.7.1 Lquido cefalorraqudeo
10.1.7.2 Lquidos o derrames serosos
10.1.7.3 Lquido articular o sinovial
10.1.7.4 Muestras biolgicas menos habituales
10.2 DISOCIACIN DE LA MUESTRA TISULAR
10.3 SEPARACIN DE CLULAS
10.3.1 Separacin de clulas por mtodos
de sedimentacin y centrifugacin
10.3.1.1 Centrifugacin diferencial
10.3.1.2 Centrifugacin en gradiente de densidad
a) Mtodos de barrera: centrifugacin
a travs de un medio
de densidad constante
b) Centrifugacin zonal o de velocidad
de sedimentacin
c) Centrifugacin isopcnica o
de equilibrio de sedimentacin
10.3.1.3 Elutriacin centrfuga
10.3.2 Caracterizacin y separacin de clulas
por citofluorimetra de flujo
10.3.3 Separacin directa de tipos celulares
10.3.3.1 Separacin por afinidad con
partculas magnticas
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10.4 CARACTERIZACIN CELULAR Y MEDIDAS

DE VIABILIDAD
10.4.1 Ensayos de exclusin
10.4.2 Recuento de clulas viables por incorporacin
de un marcador
10.4.3 Ensayos por medida de la funcin metablica
10.5 LISIS DE LAS CLULAS
10.6 PREPARACIN DE FRACCIONES SUBCELULARES
10.7 TRATAMIENTOS ADICIONALES
O COMPLEMENTARIOS
10.8 EXTRACCIN Y PURIFICACIN
DE CIDOS NUCLEICOS
10.8.1 Extraccin de cidos nucleicos por solubilidad
10.8.1.1 Precipitacin con alcoholes
10.8.1.2 Extraccin del DNA mediante fases
inmiscibles
10.8.1.3 Extraccin del RNA
10.8.1.4 Purificacin de cidos nucleicos por
precipitacin salina diferencial
10.8.2 Extraccin directa de cidos nucleicos
10.9 RECOGIDA Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS
10.10 FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS
10.10.1 Ultracentrifugacin
10.10.1.1 Centrifugacin zonal
10.10.1.2 Centrifugacin isopcnica
10.10.2 Electroforesis
10.10.2.1 Soporte para la electroforesis
10.10.2.2 Deteccin del DNA tras su
separacin ("revelado'')
10.10.2.3 Calibracin de la electroforesis
para el clculo del tamao de los
fragmentos de DNA
10.10.2.4 Electroforesis de campo pulsante
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Las tcnicas derivadas de la biologa molecular y la ingeniera gentica se utilizan de forma creciente tanto con
fines bsicos como aplicados, fundamentalmente al diagnstico clnico, partiendo de muestras biolgicas muy
diversas. Ello requiere la extraccin y anlisis de RNA y DNA y, en su caso, de protenas u otras macromolculas. Todos estos aspectos, como en todo proceso analtico, se desarrollan en tres fases:
Preanaltica, desde la obtencin y preparacin preliminar de la muestra inicial hasta su transporte al
laboratorio.
Analtica o de aplicacin de procedimientos para la extraccin de los cidos nucleicos, sobre los que se
realiza luego el anlisis bioqumico-gentico propiamente dicho: toma y tratamiento de datos, y recogida
de resultados en un informe.
Postanaltica o de validacin tcnica del informe analtico. El conjunto de esta fase y la preanaltica se
denomina fase extraanaltica.
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120
Estas fases, hoy da condicionadas por los continuos avances tecnolgicos, instrumentales, de automatizacin e informticos, han llegado a tal desarrollo que pueden a veces enmascarar el carcter cientfico que
subyace a todo el proceso analtico. Dentro del planteamiento de este libro, corresponde considerar solamente y
de forma breve los aspectos esenciales de las fases preanaltica y analtica. Los detalles concretos, descritos en
libros especializados, protocolos de laboratorio, etc., son objeto de estudio terico-prctico durante los
perodos de formacin y de ejercicio profesional o cientfico en diversas reas de laboratorio. Aunque de
difcil delimitacin y contenido (por ejemplo, a veces se llama procesado de la muestra a la preparacin
preliminar, pero otras en esta expresin se incluye la fase analtica), ambas fases se han integrado aqu, para
su descripcin, bajo un esquema unificado en el que se intenta reunir todas las posibilidades, aunque stas
puedan no darse de forma simultnea en la realidad. Se establecen as una serie de etapas ms o menos
consecutivas, conectadas entre s, en las cuales se aplican tcnicas muy diversas, en ocasiones sencillas y
comunes, a veces muy complejas y especficas.
10:1
10. Preparacin de muestras, extraccin y anlisis de cidos nucleicos
10.1 OBTENCIN Y PREPARACIN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS

La muestra celular se obtiene y prepara a partir de rganos, tejidos o fluidos biolgicos, en funcin del objetivo
perseguido (clnico o de identificacin de individuos), tipo de clula (somtica o germinal), tipo de genoma (nuclear
o mitocondrial), tipo de estudio que debe realizarse (secuencia del genoma, genes, productos gnicos), etc. En
cualquier caso, deben emplearse condiciones que garanticen la calidad de la muestra frente a las diversas variables
que afectan a la fase preanaltica (recogida, anticoagulante empleado en su caso, manipulaciones para la
conservacin, transporte, etc.). En general, la preparacin preliminar se hace rpidamente tras la obtencin
(dentro de 1 hora, como mximo 24 h), o la muestra se mantiene congelada hasta que llega al laboratorio.
10.1.1 Tejidos slidos

Habitualmente se obtienen mediante biopsia (mtodo invasivo de recogida, bajo condiciones quirrgicas, de
clulas o porciones de tejido de un organismo vivo, con fines diagnsticos). Se liberan de restos de sangre, grasa
o tejidos acompaantes mediante lavados con disolucin salina fisiolgica fra y se envan al laboratorio, segn
los casos, refrigeradas o congeladas, protegidas con hielo, nieve carbnica o nitrgeno lquido. La eleccin del
tejido y tipo de extraccin depende de numerosos factores, entre otros, contenido en DNA, finalidad del
estudio, o necesidad de amplificacin por PCR de pequeas muestras. En ocasiones se parte de tejidos fijados
o de DNA antiguo.
Caractersticas generales de las principales muestras de tejidos y rganos de adultos

Tejidos tumorales
Para analizar marcadores de membrana (glicoprotenas, receptores, etc.), de citosol

(receptores hormonales, etc.) y de ncleo (oncogenes)
Tejido heptico
Rico en DNA (15 mg/mg); para enfermedades metablicas
Tejido muscular
Pobre en DNA (3 mg/mg); para enzimopatas
Tejido intestinal
Para enzimopatas
Pobre en DNA (3 mg /mg). Se obtiene de zonas no vellosas
Extensiones de piel
Cantidad mnima de DNA (0,5 mg/raz); con fines forenses; difcil de estudiar
Raz de pelo
Huesos
Pulpa de los dientes o mdula de otros huesos. El tejido seo se tritura por mtodos fsicos
Tejidos fijados
Muestras anatomopatolgicas, fijadas con formaldehdo (formol)
Tejidos incluidos en
parafina
Se debe eliminar la parafina empleando disolventes, como xileno o tolueno
DNA antiguo (restos

humanos y animales)
Inters arqueolgico y antropolgico. Debe evitarse la contaminacin por DNA exgeno

e inhibidores de la polimerasa Taq (que alteran el anlisis por PCR)
DNA atrapado
Originado hace millones de aos. La resina vegetal (mbar) mantiene el DNA en perfecto estado
10.1.2 Clulas embrionarias

El vulo fertilizado origina en el tero, por sucesivas mitosis, estructuras de 2, 4 y 8 clulas totipotentes
(8 blastmeros, que forman la mrula) y luego de 16, 32 y 64 clulas pluripotentes. A partir de ah se forma
una estructura hueca denominada blastocisto o blastodermo, a partir de la cual comienza una especializacin
marcada. La cavidad interior del blastocisto, rellena de lquido, se denomina blastocele.
Web 10.1. Desarrollo embrionario y muestras celulares.
El blastocisto (formado por entre 70 y 100 clulas) pasa a diferenciarse en una capa externa de clulas
o trofoblasto y una masa celular interna o embrioblasto. Las clulas de la masa interna del blastocisto
originarn el embrin. Unos 5 das tras la fecundacin se produce la implantacin, cuando el trofoblasto
invade la pared del endometrio (que reviste internamente el tero), dando lugar a la placenta. Como parte
de este proceso, se forman las vellosidades corinicas (v. a continuacin), que penetran en la placenta para
permitir la circulacin fetal.
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10.1.2.1 Clulas del embrin no implantado

Para observar si el embrin es portador de un trastorno gentico se puede obtener DNA extrayendo 1 o
2 blastmeros de la mrula (lo que no afecta al desarrollo de las otras clulas). Esto permite el diagnstico
preimplantatorio.
De la masa celular interna del blastocisto pueden obtenerse clulas troncales pluripotentes, de elevado
inters potencial para trasplantes, ya que pueden dar lugar en cultivo a clulas especializadas de distintos tipos.
Las muestras de este origen se conocen comnmente como clulas troncales (o clulas madre) embrionarias
(pgs. 196 y 198).
10.1.2.2 Lquido amnitico

A partir de la primera semana de gestacin, el embrin queda protegido al estar inmerso en el lquido amnitico
o fluido amnitico, contenido dentro de una membrana llamada saco amnitico o amnios. La composicin
del lquido amnitico, cuyo volumen alcanza los 1,1 litros a trmino, depende de un equilibrio dinmico de
intercambios con el feto y la madre, y contiene clulas epiteliales que aportan unos 65 ng de DNA/ml. La
obtencin de una muestra, mediante puncin abdominal a travs de la pared del tero, se denomina amniocentesis. sta se usa a partir de las 14 semanas de gestacin para el diagnstico prenatal de anomalas
cromosmicas, enfermedades metablicas congnitas, defectos del desarrollo (como la inmadurez pulmonar
del feto), determinacin del sexo, etc. Por otro lado, las muestras del tercer trimestre sirven, por ejemplo, para
valorar la gravedad de la eritroblastosis fetal y predecir el sndrome de dificultad respiratoria del neonato.
10.1.2.3 Tejidos o sangre fetales

Como alternativa al lquido amnitico se pueden utilizar muestras de las vellosidades corinicas, tejido
fetal procedente del corion (membrana ms externa del embrin, que contacta con la placenta). stas
constituyen la mejor fuente de DNA fetal. Se obtienen por biopsia entre las semanas 8a y 12a de gestacin, y
han de cultivarse.
Se pueden obtener tambin muestras de sangre fetal, dentro del seno materno, empleando dos procedimientos. La fetoscopia (mtodo similar a la endoscopia, vlido tanto para exploracin como para toma de
muestras) se utiliza entre las semanas 16a y 21a de gestacin, para determinar hemoglobinopatas, coagulopatas, anlisis de cariotipo, etc. Una tcnica alternativa ms sencilla, la cordocentesis o funiculocentesis,
permite obtener sangre fetal directamente del cordn umbilical en el tercer trimestre de embarazo; sus eritrocitos (nucleados) y linfocitos se utilizan para diagnstico prenatal sin interferencias con el feto.
10.1.3 Clulas de sangre o de mdula sea adultas

Las ms empleadas son las muestras de sangre perifrica, habitualmente de sangre venosa (unos 40 mg
DNA/ml) recogidasobreanticoagulante.Seutilizalafraccincelulartotalosusdistintostiposseparadospor alguno de los
mtodos disponibles, en especial la centrifugacin segn sus diferencias de tamao o densidad (pgs. 125-126).
Se usan tambin manchas de sangre, que se obtienen de sangre fisiolgica (taln, dedo...) secada sobre un
papel o cartn, o bien de origen accidental (prendas, vehculos, utensilios...). La mancha se raspa y se extrae
mediante lavado con disolucin salina. Se utilizan para metabolopatas, identificacin, fines forenses, etc. Se
pueden destacar las tarjetas Guthrie, para diagnstico neonatal, y las tarjetas de papel FTA, material especialmente tratado en el que se seca la sangre, se lisan las clulas y se extraen sus componentes, quedando fijado
exclusivamente el DNA. Estas tarjetas poseen la ventaja de su fcil transporte y conservacin.
Las muestras de mdula sea roja (activa en hematopoyesis) se obtienen, bajo anestesia local, por aspiracin
mediante puncin medular, en general en el esternn o en la cadera, y se usan para observaciones citolgicas al
microscopio y para estudios genticos e histolgicos.
10.1.4 Muestras bucales

Los raspados y enjuagues bucales se obtienen por mtodos no invasivos, con cepillo suave o algodn y
disolucin salina. Contienen clulas epiteliales de descamacin con suficiente DNA genmico para su deteccin, previa amplificacin por PCR.
Se utiliza cada vez ms la saliva por su facilidad de obtencin (toma directa o presencia sobre la piel, sellos,
colilla de cigarrillo, etc.). Las clulas epiteliales que incorpora, procedentes de descamacin, pueden aportar
cantidad suficiente de DNA (8-9 mg en una toma de muestra con hisopo) para su anlisis con fines forenses o
para el estudio de la paternidad.
10.1.5 Semen
Contiene millones de espermatozoides (5-7% del volumen total, con 1,3 pg DNA por clula) formados en los
testculos, en suspensin en una fraccin lquida de secreciones de las vesculas seminales (50% en volumen),
la prstata (20% en volumen), las glndulas bulborrectales y el epiddimo. Se recoge no slo directamente para
estudios de funcionamiento del tracto genital masculino, marcadores de fertilidad, etc. sino tambin de la
vagina por aspiracin para investigacin criminal por agresin sexual, o por lavado salino de manchas secas
en ropa, piel, pelo, etc. Las muestras frescas deben analizarse antes de 1 h de su recogida, mantenindolas a
temperatura corporal durante su transporte. Debido a su especial resistencia, los espermatozoides se pueden
separar del resto de clulas (que incluyen las de la vctima, en casos de asalto sexual) mediante lisis diferencial de
stas con SDS (dodecilsulfato sdico) y proteinasa K.
10.1.6 Clulas en cultivo

Las clulas aisladas o procedentes de tejidos u rganos disgregados se pueden cultivar en medios especiales. El
cultivo celular constituye per se un rea de estudio independiente, con requerimientos especializados en cuanto
a equipo, procedimientos, sustratos, nutrientes y factores de crecimiento, etc. Pueden citarse como ejemplos
lneas celulares clnicas (gentica y metablicamente uniformes con la clula inicial) y cultivos de clulas de
tejidos, con un potencial de aplicacin como alternativa al trasplante de rganos y tejidos o para la reparacin
de lesiones tisulares; por ejemplo, fibroblastos y queratinocitos para preparar parches de piel artificial
(dermis y epidermis, respectivamente), hepatocitos para patologas hepticas terminales, y clulas de miocardio
para lesiones cardacas.
10.1.7 Otros lquidos extravasculares

Se incluyen en este apartado algunas muestras celulares con inters diagnstico por s mismas o complementario de las anteriores.
10.1.7.1 Lquido cefalorraqudeo

Es un fluido resultante de la ultrafiltracin del plasma (de ah su analoga en composicin) y que recoge los
productos de desecho del metabolismo cerebral. Se encuentra en dos compartimentos que recubren el cerebro y
la mdula espinal, comunicados entre s: el sistema ventricular (30 ml) y el espacio subaracnoideo, delimitado
por las membranas piamadre y aracnoides (120 ml). Se produce y reabsorbe continuamente (con un recambio
de unos 500 ml/da) en los ventrculos de los dos hemisferios cerebrales. Sirve como soporte protector del
sistema nervioso central, para que flote el cerebro evitando su apoyo directo sobre la superficie sea. Se
puede obtener una muestra mediante puncin lumbar. Aunque su aspecto normal es transparente, en condiciones patolgicas aumenta su turbidez por la presencia de clulas (esencialmente leucocitos, eritrocitos,
microorganismos, etc.), en funcin del tipo y gravedad de la enfermedad. Se utiliza para detectar enfermedades
del sistema nervioso central, as como para detectar marcadores tumorales (pg. 476).
10.1.7.2 Lquidos o derrames serosos

Se localizan en las cavidades del cuerpo que rodean los rganos, delimitadas por dos membranas, la parietal
(externa) y la visceral (interna, superficie del rgano). Estas membranas estn formadas por tejido conjuntivo y
una rica red de capilares sanguneos y linfticos, a travs de cuya pared se filtra el plasma cuando se altera el
balance hidrosttico u osmtico; de ah la analoga de composicin entre plasma y lquidos serosos. En la
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124
prctica clnica, se distinguen dos tipos de ultrafiltrado: transudados, de origen no inflamatorio, con pocas
clulas (menos de 300/ml), y exudados, debidos a derrames inflamatorios y con numerosas clulas (ms de
1.000/ml). Las muestras, que suelen ser transparentes, slo se toman en situaciones anormales, presentando
entonces un grado de turbidez variable en funcin de su contenido en leucocitos y eritrocitos, fundamentalmente.
Lquido peritoneal
o asctico
Lquido pleural
Lquido pericrdico
Volumen normal
Ubicacin
Obtencin por puncin

o paracentesis
100 ml
Cavidad abdominal
Puncin peritoneal
10-30 ml
Cavidad pleural
Toracocentesis o pleurocentesis
(se acumula en la base
(puncin de la pared torcica o del
de los pulmones)
espacio pleural)
Contiene clulas de muchos tipos y tiene inters clnico en enfermedades inflamatorias,
infecciosas, marcadores tumorales, etc.
20-50 ml
Espacio pericrdico
Pericardiocentesis
Se usa con menor frecuencia, ya que presenta ms complicaciones que los anteriores
10.1.7.3 Lquido articular o sinovial

Es un ultrafiltrado del plasma, viscoso, con un alto contenido en protenas y cido hialurnico, localizado en la
cavidad articular para conferir un carcter lubricante frente a la friccin propia de las articulaciones durante el
movimiento. Con un volumen normal de 1 a 4 ml, su contenido celular tiene inters tanto en procesos
mecnicos como en procesos inflamatorios patolgicos articulares. Se obtiene por artrocentesis, es decir,
aspiracin tras puncin en el espacio articular.
10.1.7.4 Muestras biolgicas menos habituales

Pueden contener clulas y, por tanto, DNA, una serie de muestras de inters en casos concretos: humor acuoso
(cmara anterior del ojo), humor vtreo (detrs del iris), lgrimas, endolinfa (tubo espiral del odo interno) y perilinfa
(canales del equilibrio), moco cervical, lquidos folicular, oviductal y vaginal, heces, secreciones nasales, uas, etc.
La orina, que en condiciones normales no contiene clulas, se utiliza para la cuantificacin de metabolitos en
enfermedades hereditarias relacionadas con el metabolismo de los aminocidos (fenilcetonuria, alcaptonuria,
cetonuria de aminocidos ramificados, cistinuria, etc.), de las bases purnicas (gota) y pirimidnicas (aciduria
ortica), del grupo hemo (porfirias), etc.
10.2 DISOCIACIN DE LA MUESTRA TISULAR

En los tejidos, las clulas se encuentran atrapadas en una organizacin tridimensional, con interacciones o
adhesiones tanto entre ellas como con la matriz extracelular (gel hidratado formado por protenas fibrosas,
como el colgeno, y polisacridos complejos). El mejor rendimiento en cuanto a disociacin de clulas viables
se alcanza a partir de tejidos fetales o neonatales. Pueden sealarse tres estrategias:
Fragmentacin mecnica: mediante corte, troceado o triturado de la muestra original en una disolucin
amortiguadora de pH, para obtener clulas individuales o fragmentos tisulares pequeos que faciliten su
separacin.
Disgregacin qumica: la rotura de la matriz extracelular y de las uniones intercelulares se suele realizar por
homogeneizacin isotnica o por sonicacin (exposicin a ultrasonidos, ondas sonoras o acsticas no percibidas por el odo humano por poseer una frecuencia superior a 20 kHz), en general en presencia de detergentes
(inicos, como el dodecilsulfato sdico o SDS, o no inicos, como Tween-20 y Tritn X-100). La eliminacin de
cationes divalentes, en especial el Ca2+ (usando agentes quelantes como EDTA), tambin desestabiliza la
adhesin de clulas entre s y con la matriz extracelular.
Digestin enzimtica: las protenas de la matriz se digieren con proteasas como colagenasa, proteinasa K,
pepsina o tripsina. Dependiendo del tipo de muestra, esta digestin puede requerir tiempos prolongados de
incubacin (por ejemplo, clulas en cultivo o races de pelo).
10.3 SEPARACIN DE CLULAS

La obtencin de muestras celulares adecuadas para la fase analtica requiere variados procedimientos de
separacin, fraccionamiento y caracterizacin, que suelen basarse en las propiedades de cada tipo celular
existente en la muestra. Su eleccin en distintas etapas de las fases preanaltica y analtica depende de
numerosos factores: muestra de partida, grado de separacin deseado, conservacin de la viabilidad, operaciones y tcnicas que van a aplicarse posteriormente, etc. Adems de los mtodos ms comunes, que se exponen
a continuacin, existen otros procedimientos especficos, pero que no han alcanzado un uso general (por
ejemplo, reparto en sistemas bifsicos acuosos, electroforesis de flujo libre, etc.).
10.3.1 Separacin de clulas por mtodos de sedimentacin y centrifugacin

La separacin celular puede hacerse por sedimentacin a gravedad unidad, bajo la fuerza de la gravedad terrestre,
pero lo habitual es acelerar el proceso aumentando muchas veces esta fuerza mediante la centrifugacin. Al
realizarse sta en el seno de un medio lquido, la separacin no slo depende de la fuerza centrfuga, sino tambin
de otros factores que modifican la sedimentacin y que dependen de las caractersticas de la clula (o partcula en
general) y del medio. El conjunto define la velocidad de sedimentacin de la clula.
Web 10.2. Parmetros de la sedimentacin y la centrifugacin.
10.3.1.1 Centrifugacin diferencial

Habitualmente, el planteamiento ms sencillo es la separacin por centrifugacin, comenzando con velocidades bajas (precentrifugacin). En la prctica, slo se pueden separar as clulas que muestren grandes diferencias de tamao, al menos de 10 veces (por ejemplo, las plaquetas, mucho ms pequeas que las restantes clulas
10:2
Web 10.3. Centrifugaciones diferencial, zonal e isopcnica.
125
126
sanguneas). Por ejemplo, en el caso de sangre con anticoagulante, a 200 g los eritrocitos sedimentan en la zona
inferior, los leucocitos aparecen en la interfase y queda como sobrenadante un plasma rico en plaquetas (PRP). Se
puede preparar plasma pobre en plaquetas (PPP) empleando mayor velocidad (alrededor de 3.000 g).
10.3.1.2 Centrifugacin en gradiente de densidad

a) Mtodos de barrera: centrifugacin a travs de un medio de densidad constante
Para conseguir separaciones ms eficaces (por ejemplo, la de los leucocitos respecto al resto de las clulas
sanguneas) se centrifuga la muestra sobre un lecho de densidad intermedia entre aquellas de los tipos
celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios comerciales como Ficoll-Paque,
Lymphoprep y otros muchos, formados en general por mezclas de Ficoll (un polisacrido sinttico)
y metrizamida (un compuesto sinttico yodado). (Esta aplicacin no emplea un gradiente en trminos
estrictos, pero utiliza principios comunes y puede considerarse un caso extremo de gradiente de un solo
escaln.)
Se dispone de varios medios con densidades adecuadas para la separacin de tipos celulares concretos;
por ejemplo, Nycoprep-1.077 para clulas mononucleares, Nycoprep-1.068 para monocitos,
Polymorhoprep para clulas polimorfonucleares, o Nycoprep-1.063 para plaquetas.
Web 10.4. Centrifugacin en barrera: aplicacin a la separacin de clulas sanguneas.
b) Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin

Para separar tipos celulares cuyo coeficiente de sedimentacin difiere poco (por ejemplo, linfocitos y
monocitos) es preciso acudir al uso de medios que forman un gradiente de densidad, lo que favorece la
concentracin de cada tipo celular en una banda o zona estrecha; por ello, esta tcnica se denomina
centrifugacin zonal. El gradiente de densidad ms simple se genera en forma escalonada, antes de
aadir la muestra (gradiente preformado), utilizando varias disoluciones de distinta concentracin de un
compuesto adecuado (Ficoll, sacarosa, albmina, suero fetal bovino, etc.). La preparacin puede hacerse
de forma manual (lo que da lugar a un gradiente discontinuo) o empleando un aparato formador de
gradientes (gradiente continuo).
Web 10.5. Preparacin de gradientes de densidad.
Un pequeo volumen de muestra se deposita sobre el gradiente y se centrifuga a alta velocidad durante un
tiempo corto. Habitualmente se disea de modo que la densidad mxima del gradiente sea inferior a la de las
clulas, con lo que stas podran alcanzar el fondo del tubo si se centrifugase durante el tiempo suficiente. Al
emplear tiempos inferiores, el resultado depende del tiempo de centrifugacin; dicho de otro modo, no se
alcanza el equilibrio de sedimentacin. El parmetro clave en la separacin es el coeficiente de sedimentacin de
cada clula. Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguneos, purificar
espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables de tejidos desagregados, muestras con clulas en
suspensin, etc. Asimismo, se puede aplicar para separar orgnulos, estructuras supramoleculares (como las
subunidades ribosmicas) o macromolculas.
c) Centrifugacin isopcnica o de equilibrio de sedimentacin
Se pueden separar clulas en funcin exclusivamente de su densidad empleando otra variante de centrifugacin,
denominada isopcnica (palabra de origen griego que significa de igual densidad). Se realiza tambin sobre un
gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de centrifugacin es lo suficientemente largo como para que
se alcance el equilibrio de sedimentacin (entre la fuerza centrfuga, el empuje hidrosttico o fuerza de
flotacin de la clula y su difusin). Para conseguirlo, se usan gradientes continuos que cubren todo el
intervalo de densidades de las clulas presentes en la muestra: en el fondo del tubo la densidad del medio ha
de ser superior a la de las clulas ms densas. De esta forma, con independencia del tiempo de centrifugacin, las
clulas nunca sedimentarn al fondo, sino que alcanzan una posicin estable intermedia en el gradiente.
Tambin se utiliza esta tcnica para la separacin de molculas cuya densidad es ligeramente diferente (por
ejemplo, DNA, pgs. 137-138 y 145).
Con una variante peculiar de esta tcnica se consigue purificar linfocitos de su mezcla con monocitos,
aprovechando la capacidad de estos ltimos para fagocitar microesferas de oro coloidal, con lo que su densidad
se hace artificialmente muy superior y sedimentan ms abajo del tubo.
10.3.1.3 Elutriacin centrfuga

La elutriacin consiste en la separacin de clulas (o partculas en general) de acuerdo con su velocidad de
sedimentacin. El proceso original, consistente en la realizacin de ciclos sucesivos de sedimentacin y
decantacin, fue facilitado por la incorporacin al sistema de un flujo del propio medio lquido de
suspensin, en sentido contrario a la sedimentacin (contra la gravedad). ste fue finalmente combinado con
el efecto de la fuerza centrfuga, dando lugar a la modalidad de elutriacin de mayor uso actual, la elutriacin
centrfuga. Aqu, las clulas se ven sometidas a dos fuerzas opuestas: por una parte, la fuerza centrfuga y, por
otra, la fuerza de arrastre por el flujo continuo del medio en sentido contrario.
Web 10.6. Elutriacin centrfuga.
El resultado es un mtodo verstil, rpido, eficaz y relativamente suave para separar subpoblaciones
celulares segn su tamao a partir de una mezcla en suspensin. Admite nmeros grandes de clulas e, incluso,
permite obtener una mayor proporcin de clulas viables respecto a la muestra original (al separarse las clulas
daadas, que poseen distinta densidad). Se aplica para obtener una gran diversidad de subpoblaciones enriquecidas, a partir de poblaciones celulares hepticas, clulas en proliferacin (sincronizadas en la fase M, G1, S
o G2), clulas sanguneas y otros tipos celulares.
10.3.2 Caracterizacin y separacin de clulas por citofluorimetra de flujo

Es desde hace aos un mtodo de separacin importante en investigacin biomdica y en el laboratorio
clnico, especialmente por su capacidad para el anlisis automtico de suspensiones celulares. El instrumento empleado se basa en el transporte de una suspensin celular (clulas sanguneas, aspirado medular,
tejidos disociados, etc.), impulsada por un flujo de disolucin isotnica, al punto de medicin o cmara de
flujo. En su aplicacin habitual, la citometra de flujo analiza y separa clulas previamente marcadas con
uno o varios fluorocromos.
Web 10.7. Fundamento de la fluorimetra.
El procedimiento de citometra de flujo consta de dos etapas: caracterizacin y separacin. De hecho,

algunos instrumentos (analizadores) slo realizan la primera, mientras que otros (clasificadores) son capaces,
adems, de llevar a cabo la segunda.
a) Caracterizacin de la poblacin celular: analizador, citmetro de flujo o citofluormetro
El sistema consigue que la suspensin celular llegue en condiciones de flujo laminar, formando un chorro muy
fino que, como consecuencia de la dilucin, contiene las clulas individuales en sucesin. stas pasan as de una
en una a travs de un haz luminoso lser, cuya longitud de onda permite la excitacin de los marcadores
fluorescentes incorporados previamente a la clula. En la luz emergente de cada clula se analizan la dispersin
y la intensidad de la fluorescencia (emisin).
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128
Parmetro medido
Propiedades celulares analizadas
Dispersin frontal de la luz

(refraccin) o FSC
Tamao (dimetro y razn de volumen ncleo/citoplasma)
Dispersin perpendicular
de la luz (reflexin) o SSC
Arquitectura interna (grado de estructuracin subcelular, contenido de

orgnulos, granularidad, rugosidad, etc.)
Intensidad de fluorescencia
(a una o varias longitudes
de onda)
Cantidad de fluorocromos marcadores previamente incorporados a la clula.

Comnmente se usan anticuerpos, marcados con fluorocromos, contra
antgenos de la superficie celular, o bien colorantes o sondas que
se fijan al DNA
Nota: FSC procede de forward scatter; SSC de side scatter.
10:3
b) Separacin de clulas: clasificador de clulas activado por fluorescencia (FACS)

La corriente de lquido, tras pasar por el punto de deteccin, se transforma en una sucesin de gotas muy
pequeas (en general como consecuencia de una vibracin aplicada por ultrasonidos a la cmara de flujo), que
contienen como mximo una sola clula. Al mismo tiempo, en funcin de los resultados del anlisis anterior de
la clula, el clasificador aplica automticamente a cada gota un pulso de voltaje (entre 50 y 150 V) que le
proporciona una carga elctrica.
El usuario define previamente el pulso que se ha de aplicar a cada gota (y, por tanto, el signo y cuanta de la
carga que adquirir), en funcin de criterios sobre los parmetros del anlisis en el citmetro. El sistema
informtico que controla analizador y clasificador permite tomar dicha decisin en el breve intervalo transcurrido entre el paso de cada clula por el detector y la formacin de la gota que la contiene. Al mismo tiempo,
todos los datos de cada clula se almacenan para su estudio posterior.
A continuacin, las gotas cargadas pasan por un campo elctrico, donde se desvan de acuerdo con su carga
para caer en distintos tubos de recoleccin de muestra; de esta manera se consigue la separacin de subpoblaciones celulares de acuerdo con los criterios definidos (combinacin de tamao, estructuracin y fluorescencia).
Como meros ejemplos de las innumerables aplicaciones de esta tcnica se pueden citar: a) el estudio de la
superficie celular con anticuerpos monoclonales, siendo posible seleccionar una clula, con un antgeno
especfico de superficie, de entre 1.000 que no lo tengan y clasificar miles de clulas por segundo; b) la
valoracin del contenido en DNA y RNA de una clula (por ejemplo, en estudios del ciclo celular), y c) la determinacin de su forma y tamao, por ejemplo en neoplasias.
10.3.3 Separacin directa de tipos celulares

Aun siendo un caso particular, es de uso habitual y no puede dejar de mencionarse la posibilidad de aislar
ciertos tipos celulares gracias a su tendencia a adherirse fuertemente a la superficie de un soporte de vidrio o
plstico (adhesin celular), en general la propia placa de cultivo.
Con la llegada de los anticuerpos monoclonales este principio se pudo ampliar a prcticamente cualquier
tipo de clula. La posibilidad de disponer de estos anticuerpos ha contribuido de forma notable a la separacin
de clulas en el laboratorio clnico y de investigacin. Su exquisita selectividad en la unin a eptopos
antignicos de la superficie ha permitido disear mtodos diversos para aislar y caracterizar de forma directa
los tipos celulares presentes en una mezcla heterognea. Estos mtodos pueden aplicarse, por ejemplo, para
definir las clulas que deben trasplantarse en caso de enfermedades graves (clulas precursoras de mdula sea,
evitando clulas T maduras inmunocompetentes), para determinar el fenotipo de tejidos para trasplantes, para
establecer los tipos celulares responsables de procesos en la respuesta inmune, para cuantificar subpoblaciones
celulares, etc.
El uso de anticuerpos ha dado lugar a una gran diversidad de mtodos inmunoanalticos y de separacin,
que se pueden considerar parte de los mtodos de afinidad. Por ejemplo, las clulas de un tipo pueden unirse, a
travs de sus antgenos, a anticuerpos monoclonales previamente fijados en superficies de plstico (tubos,
placas de cultivo, varillas, microesferas, etc.), o matrices de colgeno, polisacrido, etc., lo que permite la
separacin de ese tipo celular. Como ejemplo singular, de entre la multitud de variantes desarrolladas, se
comentan a continuacin los mtodos basados en el uso de microesferas magnticas.
10.3.3.1 Separacin por afinidad con partculas magnticas

Estos procedimientos, de gran sencillez y por ello actualmente en expansin, hacen uso de microesferas
disponibles comercialmente en varios tamaos (entre 0,5 y 10 mm, es decir, menores que las clulas) y con
distintas posibilidades de aplicacin. Estn formadas por un material superparamagntico (esencialmente, un
xido de hierro) recubierto de una capa fina de un polmero plstico que permite la adsorcin o la unin
covalente de distintas molculas. Con frecuencia se les une un anticuerpo, para formar anticuerpos magnticos
o microesferas inmunomagnticas, o bien avidina o estreptavidina, protenas ambas con gran afinidad por la
biotina (microesferas magnticas de afinidad).
129
130
10:4
Web 10.8. Aplicacin de microesferas magnticas para la separacin de tipos celulares.
Estos mtodos de seleccin de subpoblaciones celulares se pueden disear con dos planteamientos:
Seleccin positiva: las microesferas magnticas se unen a las clulas que interesa conservar para su estudio.
Es, por su simplicidad, el abordaje recomendado. Sin embargo, requiere disponer de un mtodo para romper
la unin entre la clula y la microesfera, el anticuerpo o la avidina. Esto puede suponer una limitacin
dependiendo del uso posterior que se quiera dar a las clulas.
Seleccin negativa: se marcan con las microesferas todos los tipos celulares excepto el de inters. Es la nica
solucin cuando no se dispone de anticuerpos especficos o si existe interferencia de los anticuerpos o las
microesferas con posteriores experimentos. Posee la ventaja de que se obtienen las clulas intactas, sin nada
unido a ellas, y as se pueden utilizar de forma directa.
A menudo, el mejor resultado se obtiene combinando varias selecciones negativas previas, que enriquecen la
muestra antes de proceder a la seleccin positiva final.
Ms adelante se exponen aplicaciones similares de estas microesferas magnticas para la extraccin directa
de cidos nucleicos (pg. 137).
10.4 CARACTERIZACIN CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD

Es importante proceder en esta fase preanaltica a la caracterizacin de las clulas por alguno de los procedimientos
de los que se dispone en la biologa moderna: microscopia ptica, como punto de partida ms obvio; microscopia
de contraste de fase, en paralelo a la anterior, para observar con ms detalle la superficie celular; microscopia
electrnica de barrido (SEM, de scanning electron microscopy), para definir la superficie celular y la naturaleza de
las interacciones entre clulas, o microscopia electrnica de transmisin (TEM, de transmission electron microscopy), para observar cortes celulares y examinar los orgnulos o inclusiones. Tambin se caracterizan las clulas
mediante la citometra de flujo o el uso de microesferas magnticas, tcnicas ya comentadas.
Asimismo, es importante confirmar el estado vital de las muestras celulares durante una u otra etapa de la
fase preanaltica. El concepto de viabilidad alude a la capacidad de una clula para realizar sus procesos
fisiolgicos y bioqumicos, en especial en lo que respecta a su metabolismo y a su capacidad de divisin. Sin
embargo, en la prctica el trmino se utiliza con criterios diversos; por ejemplo, es comn que se hable de
viabilidad refirindose simplemente a la integridad de la clula, o bien a su actividad metablica o, finalmente, a
su capacidad de divisin (proliferacin). Para todos ellos existen numerosos ensayos de viabilidad; los ms
empleados se describen a continuacin.
En el diseo de todos los ensayos de viabilidad hay dos parmetros fundamentales: por un lado, la
especificidad y la detectabilidad de los reactivos y, por otro, la capacidad de stos para penetrar en las clulas.
Respecto al primer punto, clsicamente se han empleado colorantes, que pueden detectarse en clulas
individuales por microscopia y en suspensiones por absorciometra (habitualmente, ensayos simultneos de
mltiples muestras en placas multipocillo). Cada vez con ms frecuencia estos ensayos se ven reemplazados por
los que usan fluorocromos, cuya detectabilidad es muy superior, puede combinarse para medir a un tiempo
varios fluorocromos distintos y permite, adems, el uso de la citometra de flujo.
En cuanto a la permeabilidad a travs de las membranas celulares, se trata del factor clave que permite que el
ensayo diferencie clulas intactas de clulas muertas o daadas. Bsicamente la cuestin se reduce a la polaridad
y carga elctrica del reactivo o de su producto; los compuestos polares no atraviesan las membranas, a no ser
que stas se encuentren fsicamente daadas.
10.4.1 Ensayos de exclusin

Corresponden al recuento de clulas que no son capaces de incorporar un colorante (lo excluyen).
10:5
El ejemplo clsico ms conocido es el azul de tripano, un colorante soluble en agua cuyos grupos cargados
amino y sulfonato le impiden atravesar las membranas celulares intactas; por tanto, tie slo las clulas
muertas o daadas. Las clulas vivas no se tien, pero debe resaltarse que el ensayo slo valora la integridad
de su membrana, no la verdadera viabilidad celular.
Un ensayo similar utiliza un compuesto fluorescente con carga (no atraviesa la membrana) y preparado para
reaccionar con grupos amino. Las clulas intactas slo se tien en superficie, dbilmente, mientras que las
131
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clulas daadas se tien en todo su interior, de forma intensa. El uso de un fluorocromo en lugar de un
colorante permite su aplicacin en microscopia de fluorescencia y, en particular, en citometra de flujo.
10.4.2 Recuento de clulas viables por incorporacin de un marcador

Es un mtodo alternativo, basado en la entrada de un compuesto a travs de la membrana de las clulas intactas
y su fijacin en el interior.
10:6
En algunos casos, el colorante (en realidad, casi siempre un fluorocromo) se une a los cidos nucleicos,
particularmente al DNA. Esto permite disear ensayos muy tiles en los que se tien, aunque con distinto color,
tanto las clulas viables como las daadas. El parmetro clave es siempre la lipofilia de los fluorocromos, que
los hace permeantes o no a travs de la membrana celular intacta.
10:7
10.4.3 Ensayos por medida de la funcin metablica

Actividades enzimticas: la presencia en las clulas de actividades enzimticas genricas, tales como esterasas
y deshidrogenasas, permite plantear ensayos de viabilidad basados en la generacin de productos con grupos
cromforos o fluorforos, procedentes de la transformacin enzimtica de sustratos sintticos. Una alternativa, para tipos celulares concretos, es la determinacin de una actividad enzimtica especfica, en cuyo
caso es particularmente importante evitar que las condiciones experimentales afecten a dicha enzima.
10:8
10:9
Sntesis proteica: incorporacin de radiactividad a las protenas formadas durante el cultivo de las clulas en
presencia de aminocidos marcados (como [35S]Met o bien cualquier otro marcado con 14C o 3H).
133
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Sntesis de DNA: incorporacin de radiactividad, u otro tipo de marca, al DNA formado durante el cultivo
de las clulas en presencia de nucletidos marcados. Refleja el concepto ms exigente de viabilidad, la
capacidad de crecimiento o, ms estrictamente, proliferacin celular. Es comn el uso de timidina tritiada o
de bromodesoxiuridina.
Web 10.9. Fundamento del uso de timidina tritiada y bromodesoxiuridina en ensayos de proliferacin.
10.5 LISIS DE LAS CLULAS

Esta etapa supone el punto de conexin entre la preparacin de la muestra celular y la de muestras de genoma o
cido nucleico; comienza, por tanto, la fase analtica, que comprende el fraccionamiento subcelular, la
extraccin directa o el fraccionamiento de los cidos nucleicos y la fragmentacin del DNA. En algunos casos
la lisis es simultnea con la preparacin de la muestra (por ejemplo, la homogeneizacin).
Para la posterior purificacin de cidos nucleicos es imprescindible, obviamente, liberar primero el contenido celular, de modo que sea posible separar las distintas biomolculas en disolucin. La lisis celular requiere
la ruptura de la membrana, que suele conseguirse empleando un medio hipotnico. Es tambin habitual aadir
detergentes para solubilizar los lpidos. De cara a preservar la integridad de los cidos nucleicos que luego se
han de purificar es, asimismo, frecuente incluir en el medio de lisis algn inhibidor de nucleasas, pues stas
particularmente las RNasas estn a menudo presentes como componentes de las clulas.
La lisis se puede aplicar tanto a clulas en suspensin como a las adheridas a placas de cultivo. En la preparacin de
clulas sanguneas es frecuente la aplicacin de reactivos de lisis diferencial (es decir, que afectan slo a determinados
tipos celulares). As, para el recuento y estudio de leucocitos se lisan los eritrocitos con un medio cido (por ejemplo,
lquido de Trk, con cido actico y violeta de genciana) o con una disolucin de cloruro amnico.
10.6 PREPARACIN DE FRACCIONES SUBCELULARES

El procedimiento clsico general parte del sobrenadante que resulta de la disociacin mecnica de un tejido
mediante homogeneizacin en un medio isotnico y posterior lisis celular. Mediante centrifugacin diferencial
se separan sucesivamente ncleos, orgnulos y otras estructuras subcelulares.
10:10
10.7 TRATAMIENTOS ADICIONALES O COMPLEMENTARIOS

Es esencial combinar las operaciones precedentes y posteriores con una serie de tratamientos adicionales o
complementarios. Por ejemplo, el lisado celular se suele someter a tratamientos que eviten la destruccin de sus
molculas componentes o bien que permitan eliminar algunas de ellas. Para mantener la integridad de las
muestras, especialmente en el caso de algunos tejidos (como pncreas y bazo), se debe evitar la accin de
nucleasas endgenas (DNasas y RNasas); de ah la conveniencia de usar muestras frescas o bien mantenerlas
congeladas y particularmente de aadir inhibidores de nucleasas. Para la solubilizacin se acude, durante la
homogeneizacin o resuspensin, al empleo de agentes que disocian y desnaturalizan las protenas, como
detergentes, fuerza inica elevada, catropos y reductores.
Web 10.10. Detergentes, catropos y otros reactivos auxiliares.
Para la inhibicin de nucleasas en general suele utilizarse EDTA (sales del cido etilendiaminotetraactico),
compuesto quelante del Mg2+, ya que este ion es un cofactor requerido por la mayor parte de las nucleasas. Por
lo que respecta especficamente a las ribonucleasas, resultan inactivadas de modo covalente por el dietilpirocarbonato (DEPC), que reacciona con una histidina de su centro activo. Este reactivo se usa, por ello, en los
procedimientos de extraccin de RNA para tratar todo el material (tubos, etc.) y el agua con la que se preparan
todos los reactivos.
Como precaucin general, tanto en la obtencin de RNA como de DNA, el material de vidrio y plstico debe
estar completamente libre de cidos nucleicos y nucleasas exgenos, y debe, evidentemente, evitarse la contaminacin por el analista mediante el uso de guantes y precauciones como el manejo separado de las muestras de distinto origen.
10.8 EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Es difcil describir la gran diversidad de mtodos que se han desarrollado para la purificacin de DNA y
RNA, y ms an hacerlo racionalmente, bajo un planteamiento didctico. Las variaciones son innumerables y estn dictadas por criterios semiempricos, aunque se basen en principios generales que s son
interpretables en funcin de las propiedades fisicoqumicas ya descritas. La dificultad es mayor, si cabe,
con los mtodos directos, de ms reciente aparicin, cuyos fundamentos estn a menudo ocultos tras los
intereses comerciales y las patentes. Se intenta por ello en este texto proporcionar una visin generalista de
los principios y herramientas comunes, sin pretender tipificar los procedimientos descritos como los nicos
aplicables.
El primer factor que debe considerarse, al igual que en cualquier proceso de purificacin, es la necesidad de
separar y eliminar las dems biomolculas presentes en la muestra. Para ello, deben considerarse las propiedades fisicoqumicas de DNA, RNA, protenas y resto de componentes celulares. De acuerdo con ellas, algunas
de las herramientas clave en un proceso de purificacin de cidos nucleicos son las siguientes:
El uso oportuno de enzimas que degradan especficamente un solo tipo de molcula: proteasas, DNasas y
RNasas (pg. 212), o bien de inhibidores para evitar su accin.
El uso de detergentes para la desnaturalizacin de las protenas, lo que facilita su posterior insolubilizacin y
retirada, sin afectar a la estructura de los cidos nucleicos. De modo similar, compuestos con actividad
caotrpica, que desnaturalizan las protenas; destacan entre ellos, por su aplicacin, urea, cloruro de
guanidinio y tiocianato de guanidinio.
La accin diferencial del medio alcalino sobre DNA y RNA (pg. 32), de tal modo que el primero slo se
desnaturaliza (un proceso que, aparte de mantener su integridad, puede ser reversible, pg. 164), mientras
que el segundo se hidroliza rindiendo oligonucletidos y nucletidos libres (cuyas propiedades son muy
diferentes a las de sus macromolculas originarias, los cidos nucleicos y permiten, pues, separarlos con
facilidad).
El ajuste de la fuerza inica (concentracin de sales), que permite controlar la solubilidad diferencial de
DNA, RNA y protenas (en particular si stas se han desnaturalizado previamente).
La escasa solubilidad de los cidos nucleicos (y tambin de las protenas) en alcoholes. Prcticamente todos
los mtodos de purificacin incluyen, al menos, una precipitacin alcohlica.
135
136
10.8.1 Extraccin de cidos nucleicos por solubilidad

10.8.1.1 Precipitacin con alcoholes
Como se ver a continuacin, los alcoholes se utilizan en prcticamente todos los mtodos de purificacin de
cidos nucleicos. Si la concentracin de alcohol (habitualmente etanol o isopropanol) es suficientemente
elevada, tanto DNA como RNA se hacen insolubles y pueden precipitarse mediante centrifugacin. Esta
precipitacin requiere la presencia de sales. Los alcoholes retiran el agua que hidrata los cidos nucleicos y,
al ser menos polares que ella dicho con ms precisin, son disolventes con una menor constante dielctrica
favorecen la unin de los cationes a los grupos fosfato, convirtiendo a los cidos nucleicos en molculas neutras
que pueden agregarse y precipitar. La precipitacin alcohlica es a menudo la etapa final, en la que se consigue
completar la purificacin y, adems, concentrar el material.
10.8.1.2 Extraccin del DNA mediante fases inmiscibles

El protocolo tradicional bsico consiste en el tratamiento del homogenado con cloroformo, cuyo papel es
doble: disolver los lpidos y desnaturalizar las protenas. Muchos mtodos emplean, adems, fenol, que contribye asimismo a la desnaturalizacin de las protenas. Para una extraccin eficaz del DNA hacia la fase acuosa,
sta debe tener un pH neutro o ligeramente alcalino.
10:11
10.8.1.3 Extraccin del RNA

La extraccin del RNA se realiza de manera similar, salvo dos modificaciones. En primer lugar, suele prepararse el homogenado inicial en presencia de una alta concentracin de tiocianato de guanidinio (4 M). ste es
un fuerte catropo que desnaturaliza las protenas de modo que, adems de facilitar despus su retirada,
asegura la inactivacin de las RNasas, esencial para poder obtener el RNA ntegro. Por otra parte, la extraccin
con cloroformo y fenol se hace a un pH cido (entre 4 y 5), condiciones en las que el DNA ya no se mantiene en
la fase acuosa, sino que se distribuye hacia la fase orgnica o la interfase, al igual que las protenas. El RNA, por
el contrario, queda disuelto en la fase acuosa y puede recuperarse mediante precipitacin con etanol o isopropanol. En algunos mtodos el cloroformo se sustituye por 1-bromo-3-cloropropano (BCP), menos txico y ms eficaz en la retirada del DNA.
Otros mtodos prescinden de la extraccin con fenol y cloroformo, y utilizan cloruro de litio (entre 0,5 y
2,5 M), que precipita selectivamente el RNA por neutralizacin de su carga.
Finalmente, se toma la precaucin ya mencionada de inactivar las posibles RNasas tratando tanto el
material como el agua de todos los reactivos con dietilpirocarbonato (DEPC, inhibidor covalente de las
ribonucleasas). Adems, en ocasiones se incluye en las etapas finales una DNasa para asegurar la ausencia
total de contaminacin por DNA.
10.8.1.4 Purificacin de cidos nucleicos por precipitacin salina diferencial

Se trata de un procedimiento alternativo a los anteriores, basado en las diferencias de solubilidad de DNA y
RNA en funcin de la concentracin de sales: tanto DNA como RNA son solubles en disolucin salina
concentrada, mientras que a baja concentracin de sales slo es soluble el RNA.
10:12
Para esta precipitacin salina se suele utilizar NaCl, pero puede tambin emplearse acetato sdico saturado,
en combinacin con alcoholes orgnicos, que conduce a resultados incluso mejores que con fenol y cloroformo,
sobre todo para cantidades pequeas de DNA.
10.8.2 Extraccin directa de cidos nucleicos

Los mtodos de extraccin descritos, basados en solubilidad y particularmente en disolventes inmiscibles, son
los clsicos, suponen la norma de referencia y se acude a ellos cuando se desea obtener una gran cantidad de
cido nucleico o cuando es importante un grado elevado de pureza; por otra parte, resultan laboriosos
(la extraccin a menudo debe repetirse varias veces) y utilizan reactivos txicos.
A veces no es posible emplear los procedimientos descritos, dado el bajo contenido en DNA de algunas
muestras, pero, sin embargo, puede estudiarse el DNA de la muestra sin necesidad de manipulacin alguna,
salvo la lisis de las clulas. ste es el caso de la amplificacin y deteccin del DNA mediante la tcnica de PCR
(v. Captulo 14).
Por otra parte, en muchas ocasiones el tamao de la muestra es pequeo, la pureza no es un requisito
esencial, prima la rapidez en el procesado simultneo de muestras numerosas, en resumen, otros mtodos ms
simples y rpidos pueden ser una solucin adecuada. Se han desarrollado ms recientemente numerosos
137
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mtodos de extraccin que cumplen estos requisitos. Se habla de extraccin directa del DNA pues no se
requiere la manipulacin previa de la muestra y, en poco ms de una etapa, permiten obtener su DNA o RNA.
El fundamento de estos mtodos directos no es tan claro. La mayora se basan en la adsorcin selectiva del
cido nucleico, por ejemplo sobre soportes derivados de slice o membranas porosas especialmente formuladas.
Un procedimiento tpico puede describirse as:
Lisis y pretratamiento: la muestra (sangre, homogenado de tejido, clulas cultivadas, etc.) se somete a la
accin de un tampn de lisis. ste puede incluir detergentes, proteasas o agentes desnaturalizantes de
protenas.
Se aplica el lisado sobre una pequea columna que contiene la membrana o material adsorbente.
Etapa de adsorcin: se fuerza el paso del lquido a travs de la columna, bien mediante presin o bien por
centrifugacin. De ese modo, irn saliendo de la columna los componentes que no se han adsorbido;
habitualmente esa fraccin comprende todo excepto el DNA o el RNA (dependiendo del diseo del material
adsorbente y de los medios lquidos empleados).
Etapa de lavado: se aade ms tampn para desplazar por completo todos los componentes no fijados.
Etapa de elucin: finalmente, se aade un tampn o disolvente diferente que desestabilice la unin del cido
nucleico al soporte.
Web 10.11. Ejemplo de extraccin directa del DNA.
Como una aplicacin particular, se ha extendido el uso para pruebas de identidad de las tarjetas FTA,
papel especialmente tratado que permite absorber una muestra (gota de sangre), lisar sus clulas, desnaturalizar
sus protenas y proteger el DNA, que queda intacto fijado en el papel. Estas tarjetas pueden conservarse sin
especiales precauciones durante varios aos, a temperatura ambiente, enviarse por correo postal, etc.
Tambin se emplean con frecuencia las microesferas magnticas, anlogas a las utilizadas para separacin
de clulas (pg. 130), sobre cuya superficie se fijan los cidos nucleicos, bien por adsorcin directa o bien a
travs de otras molculas con afinidad por ellos. Se consiguen as mtodos de extraccin simples que se pueden
aplicar a una amplia variedad de muestras.
10:13
Web 10.12. Aplicacin de microesferas magnticas para la purificacin de cidos nucleicos.
El RNA mensajero eucaritico, gracias a la singularidad de su cola de poli(A) (pg. 302), puede purificarse
fcilmente sobre soportes de afinidad. Por ejemplo, microesferas magnticas con cadenas oligo(dT), columnas
de oligo(dT)-celulosa o de poli(U)-Sepharosa; todas ellas retienen el RNA mensajero por complementariedad
de bases con la cola de poli(A).
10.9 RECOGIDA Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS

Una vez separados y extrados, los cidos nucleicos deben conservarse de forma adecuada. El precipitado
seco de cidos nucleicos o el ovillo de fibras de DNA obtenido con la varilla pueden disolverse en
disolucin amortiguadora y conservarse a 4 C, o disolverse en agua y mantenerse congelados para su
utilizacin posterior. El DNA genmico en disolucin no se debe congelar, para evitar la rotura de las
molculas por las fuerzas de cizalla provocadas al solidificarse el hielo y al descongelarse. Por el contrario,
el RNA s puede conservarse congelado a 70 C en disolucin acuosa, cuidando de aadir un inhibidor
de ribonucleasas.
10.10 FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

10.10.1 Ultracentrifugacin
Este mtodo se basa en el aumento de la velocidad de sedimentacin mediante campos centrfugos lo suficientemente elevados (superior a 100.000 g) como para superar las fuerzas de difusin. Se emplea en especial
para el DNA, tanto con fines de preparacin (gran cantidad de material) como analticos (pequea cantidad de
material).
10.10.1.1 Centrifugacin zonal

De forma similar a lo estudiado para la separacin de tipos celulares (pg. 126), se puede emplear esta
modalidad de centrifugacin sobre gradientes de densidad para separar molculas de cido nucleico, en
funcin de su velocidad de sedimentacin (determinada por su coeficiente de sedimentacin, en unidades
svedberg, S) (v. web 10.2). Se consigue que las molculas de cido nucleico sedimenten a velocidad
constante, con lo que se sitan en bandas, cuya posicin depende del tamao y la forma de la molcula.
Por ejemplo, pueden separarse as los cuatro tipos de RNA ribosmico eucaritico (pg. 63). El material de
las bandas puede recuperarse despus por separado (por ejemplo, mediante puncin del fondo del tubo)
y cuantificarse midiendo su absorcin a 260 nm.
10.10.1.2 Centrifugacin isopcnica

El mtodo isopcnico o de equilibrio de sedimentacin es quiz el ms utilizado para la separacin de distintos
tipos de cido nucleico, en especial DNA. Debe recordarse que, en este caso, las macromolculas se separan en
funcin de su densidad, en general usando un gradiente que se va formando durante la ultracentrifugacin a la
vez que se separan los componentes de la muestra (gradiente autoformado, pg. 125). El medio habitual
para preparar el gradiente es una disolucin de cloruro de cesio que, gracias a su alta solubilidad y baja
viscosidad, permite alcanzar densidades lo suficientemente elevadas y formar gradientes con un intervalo
estrecho de densidades. La muestra se mezcla con dicha disolucin de CsCl y se procede a la ultracentrifugacin durante un tiempo largo (decenas de horas), hasta alcanzarse el equilibrio de sedimentacin. Cada tipo de cido nucleico se sita, formando una banda, en aquella posicin del gradiente donde la
densidad del medio iguala a la de la molcula.
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10:14
10.10.2 Electroforesis
Como es bien sabido, esta tcnica se basa en la capacidad de las macromolculas cargadas para desplazarse en
un campo elctrico, con velocidad proporcional a su carga e inversamente proporcional a su tamao. Las
molculas de DNA poseen, a pH neutro o alcalino, una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que
hace que su movilidad hacia el nodo (+) slo venga determinada por el tamao de la molcula. Dicho tamao,
cuando la molcula es lineal, depende nicamente de su nmero de pares de bases. Cuando la molcula es
circular (como es el caso de los plsmidos y el DNA cromosmico bacteriano) el tamao depende, adems, de
la conformacin, lo que incluye el estado de superenrollamiento (pg. 79). Debe destacarse, adems, que los
cromosomas eucariticos son demasiado grandes para ser identificados con este tipo de anlisis, por lo que lo
ms comn es que se aplique a DNA fragmentado con nucleasas.
10:15
Web 10.13. Separacin del DNA mediante electroforesis.
10.10.2.1 Soporte para la electroforesis

La separacin de los fragmentos de DNA bicatenario se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa o de
poliacrilamida (que suelen desarrollarse, respectivamente, en horizontal y en vertical). En ambos casos, el gel se
prepara con una concentracin adecuada para el tamao de los fragmentos de DNA que se quieren separar. Los
fragmentos ms pequeos se pueden separar correctamente en geles de poliacrilamida; para tamaos algo
mayores se usan geles de agarosa, ms porosos. Modificando la concentracin de acrilamida o agarosa se
consigue variar el intervalo de tamaos que es posible separar (intervalo de resolucin). En ocasiones se utilizan
geles que combinan agarosa y poliacrilamida.
10:16
10.10.2.2 Deteccin del DNA tras su separacin ("revelado'')

Una vez separadas, las molculas de DNA se visualizan habitualmente a travs de la fluorescencia de distintos
compuestos que se unen a ellas (intercalantes, casi siempre). Aunque el ms utilizado ha sido el bromuro de
etidio, va siendo sustituido por otros fluorocromos con mayor poder de deteccin y menor toxicidad.
10:17
Web 10.14. Estructura y accin de compuestos intercalantes.
10.10.2.3 Calibracin de la electroforesis para el clculo del tamao de los fragmentos de DNA
Las molculas lineales de DNA bicatenario migran en la electroforesis a una velocidad inversamente proporcional a su tamao (dentro del intervalo de resolucin del gel empleado). Esto permite estimar la longitud de los
fragmentos estudiados.
141
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10:18
10.10.2.4 Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 50 kb no se pueden resolver (separar) empleando la
electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la dificultad de manejo de los
geles necesarios: con menos del 0,4% de agarosa la consistencia del gel es muy baja. Adems, las molculas de
DNA poseen un tamao excesivamente grande para atravesar los poros del gel y ya no se separan en funcin de
su tamao. Para solventar este problema se ha ideado una modificacin de la tcnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis, PFGE). Se emplean geles de agarosa al
1%, pero se altera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando de forma alternativa
dos parejas de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue que las molculas se
desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin extendida. Cuanto mayor es su tamao con ms
dificultad se reorientan, por lo que avanzan ms despacio. As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta
varias megabases, lo que supone un progreso significativo, aunque an no sirve para estudiar los cromosomas
humanos enteros (de 50 a 250 Mb cada uno).
10:19
Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo que no sirven las de DNA purificado, que, en
general, ya se ha fragmentado por debajo de 100 kb como consecuencia de las fuerzas de cizalla experimentadas durante los procesos habituales de aislamiento. Para obtener preparaciones con los cromosomas intactos
se mezclan las clulas con agarosa caliente (37 C) y se vierte en pequeos moldes de unos milmetros, de forma
que al solidificarse la agarosa (4 C) forma bloques que incluyen las clulas intactas. En ellos se realizan la lisis
celular y la digestin de las protenas (por ejemplo, con EDTA, SDS y proteinasa K, que difunden a travs de los
poros del gel) sin alterar las grandes molculas de DNA. Tras una dilisis para eliminar los restos de la
digestin, se dispone de un pequeo bloque de agarosa con el DNA intacto en su interior, y dicho bloque se
deposita en un pocillo del gel de electroforesis. Al aplicar la corriente, el DNA sale del bloque de preparacin y
entra en el gel, donde comienza su separacin.
Seccin II
Transmisin
de la informacin gentica
y tecnologas relacionadas
CAPTULO 11
Replicacin del DNA
11.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN 145

11.1.1 Carcter semiconservador
146
11.1.1.1 Demostracin experimental de
la replicacin semiconservadora
147
11.1.2 Sntesis simultnea, secuencial y bidireccional
148
11.1.3 Inicio monofocal o multifocal
148
11.2 ENZIMOLOGA DE LA REPLICACIN
148
11.2.1 Requerimientos de la reaccin de sntesis de DNA 148
11.2.2 Mecanismo de la reaccin
149
11.2.3 Direccin de la sntesis
149
11.2.4 Tipos de polimerasas
149
11.2.4.1 DNA polimerasas procariticas:
actividades polimerasa y exonucleasas.
149
11.2.4.2 DNA polimerasas eucariticas:
actividades polimerasa y exonucleasa
151
11.2.5 Velocidad de replicacin
152
11.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACIN
153
11.3.1 Iniciacin
153
11.3.2 Elongacin
154
11.3.2.1 Conexin entre la iniciacin y la

elongacin: protenas necesarias
a) Helicasas
b) Protenas ligantes de DNA
monocatenario
c) Topoisomerasas
d) Primasa
11.3.2.2 Asimetra de la replicacin en ambas hebras
11.3.2.3 Mecanismo de la elongacin
11.3.2.4 Maduracin de los fragmentos de Okazaki
11.3.3 Terminacin
11.3.3.1 Final de la elongacin
11.3.3.2 Replicacin de los telmeros
11.3.3.3 Telomerasa: componentes y caractersticas
11.3.3.4 Mecanismo de accin de la telomerasa.
11.3.3.5 Funcionalidad de la actividad telomerasa
en las clulas
11.4 REPLICACIN MITOCONDRIAL
154
154
155
155
156
156
157
158
158
158
158
160
160
160
161
11.1 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN

La replicacin es el proceso, conceptualmente sencillo pero molecularmente complejo, mediante el cual a partir
de una molcula de DNA progenitora o parental se sintetiza una nueva, originndose as dos molculas de
DNA hijas, de secuencia idntica a la del DNA original. Esto permite el paso de la informacin gentica a la
descendencia (tanto la de una clula como la del individuo).
Aunque la replicacin constituye el aspecto esencial del metabolismo del DNA, tambin se deben considerar
como parte del mismo otros procesos relacionados directa o indirectamente: la recombinacin o reordenamiento de la informacin gentica, la mutacin o alteracin de la secuencia, y la reparacin de las alteraciones o
daos en el DNA. Cabe tambin aadir la degradacin o catabolismo del DNA hacia nucletidos, mediado por
las nucleasas.
11:1
La replicacin se produce de forma coordinada con la divisin celular (Captulo 8), concretamente en la fase
S, durante las interfases previas tanto a la mitosis como a la meiosis I, de forma que, en el caso de la mitosis, las
dos clulas hijas reciban la misma dotacin gentica que tena la clula progenitora. En cuanto a la meiosis,
145
146
I I . T R A N S M I S I N D E L A I N F O R M AC I N G E N T I C A Y T E C N O LO G A S R E L A C I O N A D A S
puesto que da lugar a cuatro clulas hijas, la replicacin previa permite que stas reciban la mitad de dicha
dotacin gentica, y no una cuarta parte (pg. 104). La relacin entre el estado de replicacin y la progresin
por el ciclo celular se puede resumir en los siguientes principios generales:
El inicio de la replicacin del DNA obliga a la clula a emprender una divisin.
Una vez iniciada la replicacin, no puede tener lugar la consiguiente divisin hasta que se haya completado
dicha replicacin. En realidad, el final de la replicacin constituye posiblemente una seal para la divisin.
El proceso de replicacin se lleva a cabo sin necesidad de una separacin completa de la cadena progenitora: la
doble hlice se desenrolla gradualmente y sus dos hebras se van separando a la par que se produce su replicacin.
Antes de estudiar los detalles moleculares de la sntesis de un nuevo DNA, procede analizar las caractersticas principales del proceso, atendiendo a un criterio eminentemente didctico. stas son: carcter semiconservador, realizacin simultnea en ambas hebras, de forma secuencial y con carcter bidireccional, y origen
monofocal (procariotas) o multifocal (eucariotas). Otra caracterstica destacada, el carcter semidiscontinuo,
se explicar una vez que se conozca el mecanismo de la reaccin.
11.1.1 Carcter semiconservador

Aunque hipotticamente se pueden plantear tres mecanismos para la replicacin, pronto se demostr que slo
el tercero tiene lugar en las clulas:
11:2
Replicacin conservadora
Replicacin dispersante
Replicacin semiconservadora
Un complejo enzimtico
recorrera el DNA, reconociendo
la secuencia en ambas hebras
para copiarlas simultneamente,
de forma que el DNA progenitor
bicatenario se conservara
intacto mientras que la molcula
hija de DNA contendra dos
hebras totalmente nuevas
La sntesis se producira por

fragmentos, que se
combinaran con partes del
DNA progenitor, dando lugar
a las dos molculas hijas de
DNA, ambas con fragmentos
tanto nuevos como de las dos
hebras del DNA progenitor
Es el mecanismo real. Las dos hebras del DNA

progenitor sirven de molde para la sntesis de sus
respectivas hebras complementarias. Cada
molcula hija de DNA est formada por una
hebra progenitora y otra hija (recin
sintetizada). El mecanismo se repite en sucesivas
generaciones de clulas. El nombre alude,
precisamente, a que siempre se conserva la mitad
de la molcula original
11. Replicacin del DNA
11.1.1.1 Demostracin experimental de la replicacin semiconservadora

El mecanismo real de la replicacin lo demostraron por primera vez Mathew Meselson y Franklin W. Stahl
en 1958, mediante experimentos muy completos, sencillos y representativos de muchos otros realizados en
diversas reas de la biologa molecular. Aunque los aspectos moleculares de la replicacin se establecieron
posteriormente con el estudio de la DNA polimerasa, el experimento de Meselson y Stahl tiene inters, aparte
de por su propio diseo, por haber sido la primera vez que se aplicaron tanto la tcnica de sedimentacin en
gradiente de densidad como la introduccin de istopos en las molculas de DNA (15N, infrecuente, y 14N,
istopo habitual).
Para comprender la novedad y trascendencia de estos experimentos en su momento y contexto, se van a
considerar los antecedentes y el planteamiento antes de describir el resultado. Se aprovecha as este ejemplo
para ilustrar el mtodo cientfico, en especial cmo un diseo adecuado del experimento, que parece simple,
permite obtener una informacin notable.
a) Antecedentes
El primer lugar, se examina la posibilidad de aplicar la tcnica de equilibrio de sedimentacin en gradiente
de densidad, o centrifugacin isopcnica (pg. 126), al anlisis de muestras de DNA cuya densidad es diferente
por estar marcado o no con el istopo 15N.
11:3
b) Planteamiento y diseo del experimento

Aplicando esta tcnica de marcaje del DNA con 15N y su anlisis mediante centrifugacin isopcnica, se dise
el experimento de forma que los resultados obtenidos permitieran diferenciar cul de las hiptesis era la
correcta.
Web 11.1. Experimento de Meselson y Stahl.
c) Resultados obtenidos y conclusin

El resultado observado al realizar el experimento fue de una banda de DNA con densidad intermedia en la
primera generacin de clulas y dos bandas en la segunda generacin, con densidades baja e intermedia. Estos
datos experimentales coinciden con los resultados previsibles a partir de la hiptesis semiconservadora, de
modo que sta debe ser la correcta; es decir, en la replicacin del DNA cada una de las molculas hijas conserva
una hebra del DNA progenitor y tiene otra hebra de nueva sntesis.
147
148
11.1.2 Sntesis simultnea, secuencial y bidireccional

De cara a la descripcin del mecanismo de la replicacin es importante destacar algunas caractersticas,
observadas por primera vez en E. coli pero igualmente vlidas para eucariotas. La principal estrategia experimental para obtener estas conclusiones ha sido aadir al medio de cultivo timidina tritiada, con lo que se marca
el DNA de nueva sntesis y luego puede detectarse por mtodos autorradiogrficos.
La sntesis no comienza al azar, sino en puntos concretos de la molcula, denominados orgenes de
replicacin. En cada uno de ellos se produce la apertura local de la doble hlice y comienza la sntesis
simultnea de las dos nuevas hebras (no debe confundirse simultneo con el carcter continuo de la sntesis
de una sola de las hebras, que se estudiar ms adelante).
Como consecuencia, las dos hebras nuevas se van alargando de forma progresiva, por adicin secuencial de
nucletidos.
La separacin de las hebras progenitoras, que comienza en cada origen, progresa en ambas direcciones, por
lo que se afirma que la replicacin es bidireccional. Los puntos de transicin entre doble hebra y hebras
sencillas se denominan horquillas de replicacin, y van alejndose entre s.
Finalmente, no debe pasarse por alto el hecho de que, dado que las dos hebras del DNA son antiparalelas, su
separacin con el avance de la horquilla progresa en sentido opuesto, para una hebra de 3 hacia 5 y para la
otra en sentido 5 ! 3 (y a la inversa en la otra horquilla).
Web 11.2. Formacin y avance de las horquillas de replicacin.
11.1.3 Inicio monofocal o multifocal

En el cromosoma circular nico de procariotas la replicacin comienza siempre en un punto determinado,
denominado origen (y etiquetado como oriC); se afirma que la replicacin es monofocal. En consecuencia,
progresa formando dos horquillas de replicacin. Por el contrario, en eucariotas la replicacin es multifocal,
pues en cada uno de los cromosomas existen mltiples orgenes de replicacin (centenares o miles), que dan
lugar a dos horquillas cada uno. Gracias a ello se hace posible completar en un tiempo razonable la replicacin
de los cromosomas, mucho ms largos que en procariotas.
11.2 ENZIMOLOGA DE LA REPLICACIN

11.2.1 Requerimientos de la reaccin de sntesis de DNA
Sustratos: se utilizan como sustratos el conjunto de los cuatro desoxinuclesidos-trifosfato: dATP, dGTP,
dCTP y dTTP. De cada uno de ellos queda incorporado en el nuevo DNA la parte dNMP de la molcula.
Tanto dNMP como dNDP no sirven como sustratos.
Cofactores: para una actividad ptima se requiere un ion metlico divalente como cofactor, asociado a los
dNTP y a la polimerasa. Aunque in vitro este papel pueden desempearlo tanto Mn2+ como Mg2+, es este
ltimo el que acta in vivo.
Molde o plantilla: sta es, quiz, la principal caracterstica de la reaccin. El orden correcto de incorporacin
de los nucletidos viene determinado por su complementariedad de bases con la secuencia de cada hebra
de DNA, que acta as como molde o plantilla.
Cebador: la sntesis de una nueva hebra de DNA no puede comenzarse a partir de dos nucletidos, sino que
requiere un fragmento monocatenario iniciador, denominado cebador, que aporte un grupo 3-OH libre. Se
trata de un oligonucletido, por lo comn RNA, que debe estar emparejado con la hebra progenitora de
DNA, de forma complementaria y antiparalela. Este requisito puede expresarse afirmando que la replicacin
no es autoiniciadora (a diferencia de la transcripcin, pg. 268), sino que slo elonga o alarga molculas
preexistentes.
149
11.2.2 Mecanismo de la reaccin

Se inicia la reaccin con el emparejamiento de un dNTP complementario al nucletido de la hebra molde
(DNA) en la posicin vecinal al extremo 3 de la hebra en crecimiento (inicialmente, el RNA cebador; luego, la
hebra que se est sintetizando). La reaccin propiamente dicha consiste en la unin del dNTP seleccionado, que
queda como dNMP, liberndose PPi. Ello implica la formacin de un enlace fosfoster entre el fosfato a del
dNTP que se incorpora y el 3-OH libre de la cadena en crecimiento (inicialmente, del cebador). La ruptura
del enlace fosfoanhdrido (a-b) del dNTP proporciona la energa necesaria para impulsar la reaccin, ayudada
por la subsiguiente hidrlisis del PPi a 2 Pi catalizada por la pirofosfatasa. Tras muchas reacciones similares
sucesivas, el producto es la nueva hebra de DNA:
n1 dATP n2 dGTP n3 dCTP n4 dTTP

!
DNA molde;
RNA cebador;
Mg2 ; DNA polimerasa
DNA n1 n2 n3 n4 PPi
Web 11.3. Mecanismo de la reaccin de sntesis de DNA.
11.2.3 Direccin de la sntesis

Puesto que la adicin de nucletidos se realiza siempre mediante 5-trifosfatos y sobre un extremo 3-OH libre,
la hebra crece por su extremo 3, y se afirma que la sntesis transcurre en direccin 5 ! 3. ste es un
mecanismo universal: todas las DNA polimerasas, tanto de procariotas como de eucariotas, as como todas las
RNA polimerasas, sintetizan exclusivamente en dicho sentido.
11.2.4 Tipos de polimerasas

Aunque la reaccin de sntesis de DNA es universal, es decir, tiene lugar de idntica forma en todos los
organismos y ubicaciones subcelulares, su catlisis la efectan en cada caso distintas enzimas, bajo
la denominacin comn de DNA polimerasas (abreviadas como DNApol). Estrictamente su nombre es
ms completo, polimerasas de DNA dirigidas por DNA (o dependientes de DNA), para indicar tanto la
molcula que sintetizan como la que emplean como molde. Ms adelante se estudiarn otras polimerasas
de DNA o de RNA que utilizan distintos moldes; para ofrecer una visin unificada se resumen a continuacin:
Molcula
sintetizada
Molcula molde
Nombre completo
DNA
DNA
Polimerasa de DNA dirigida por DNA
RNA
DNA
Polimerasa de RNA dirigida por DNA
DNA
RNA
Polimerasa de DNA dirigida por RNA
RNA
RNA
Polimerasa de RNA dirigida por RNA
Ejemplos (nombre comn)
DNA polimerasas
RNA polimerasas o transcriptasas
Primasas
Transcriptasas inversas
Telomerasas
RNA replicasas
11.2.4.1 DNA polimerasas procariticas: actividades polimerasa y exonucleasas

La primera DNA polimerasa descubierta (Arthur Kornberg, 1958) y la mejor estudiada hasta la fecha es la
DNApol-I de Escherichia coli. La comprobacin de que su actividad no es suficiente para justificar la velocidad
de replicacin del cromosoma bacteriano in vivo condujo a la bsqueda y descubrimiento de otras enzimas:
DNApol-II y DNApol-III y, ms tarde, DNApol-IV y DNApol-V. Todas ellas coexisten en E. coli, con
funciones especializadas: pol-III realiza la mayor parte de la tarea de replicacin, mientras que las otras se
150
encargan de distintas funciones auxiliares (sus caractersticas particulares se exponen en la tabla de pg. 151,
junto con las de las polimerasas eucariticas).
Varias de las DNA polimerasas presentan, adems de su actividad enzimtica como polimerasa, una o dos
actividades exonucleasa. La actividad 3-exonucleasa (tambin denominada exonucleasa 3 ! 5) permite
hidrolizar el nucletido situado en el extremo 3 de la hebra de DNA, slo un nucletido cada vez. Esta
eliminacin tiene lugar de forma inmediata, cuando el nucletido recin incorporado por la actividad polimerasa a la cadena en crecimiento es errneo, es decir, no empareja correctamente con el de la hebra molde de
DNA. La polimerasa es as capaz de reconocer el error, detener la adicin de ms nucletidos y liberar ese
ltimo dNMP mal incorporado. Los centros activos polimerasa y exonucleasa son diferentes. En resumen, las
DNA polimerasas corrigen sus propios errores, en sentido (3 ! 5) contrario al de la polimerizacin (5 ! 3);
por ello, esta actividad 3-exonucleasa se denomina tambin actividad correctora de pruebas (o de galeradas,
por analoga al proceso en imprenta) o, alternativamente, exonucleasa revisora. De este modo, mejora
la fidelidad de la replicacin, aumentndola entre 102 y 103 veces sobre la que aporta la incorporacin
de nucletidos complementarios por la polimerasa (que tiene una tasa de error de un nucletido por cada
104 o 105).
11:4
Web 11.4. Estructura de la DNA polimerasa, centros activos y unin al DNA.
La DNApol-I de procariotas es nica entre las polimerasas por poseer, adems, una segunda actividad
exonucleasa, en este caso 5-exonucleasa (o exonucleasa 5 ! 3), que le permite hidrolizar secuencialmente
DNA o RNA a partir del extremo 5 de la hebra. De nuevo, el centro activo es independiente de los anteriores;
en este caso est situado en el fragmento pequeo. Esta actividad desempea un papel fundamental en la
replicacin del DNA procaritico, al eliminar el RNA cebador y sustituirlo por DNA durante la sntesis
discontinua de la hebra retardada (pg. 158). Tambin complementa la actividad 3-exonucleasa corrigiendo
errores de distinto tipo, y en ocasiones se denomina actividad de reparacin; por ejemplo, interviene en la
escisin de los dmeros de pirimidina que se forman por exposicin del DNA a luz UV (pg. 398).
Experimentalmente, se aprovecha la actividad 5-exonucleasa, por ejemplo, para la preparacin de sondas
marcadas (pg. 187).
Algunas caractersticas de las DNA polimerasas, desde el punto de vista bioqumico y funcional
151
Procariotas
Polimerasa:
II
Eucariotas
III
Ubicacin subcelular
a
Ncleo
Ncleo Mitocondria
Ncleo
Ncleo
Actividades enzimticas:
Primasa (inicio)
No
No
No
No
No
No
No
Polimerasa 5 ! 3
(elongacin)
3-Exonucleasa
(o 3 ! 5)
(correccin de pruebas)
No
No
5-Exonucleasa
(o 5 ! 3)
(eliminacin de cebadores)
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Slo
inicialmente
No
No
No
No
No
Velocidad de
polimerizacin
(nucletidos/segundo)
16-20
2-7
250-1.000
Procesividad (nucletidos
aadidos antes de su
disociacin)
Baja
3-200
Baja
100-200
Baja
Funcin en la clula:
Replicacin (sntesis
continuada de hebras
nuevas, adelantada
y retardada)
Empalme de fragmentos de
Okazaki
S
(con
nucleasas)
Velocidad de replicacin:
Media
Muy alta
10.000 5 105
Elevada
Elevada Elevada
con PCNA con/sin
5.000 PCNA
11.2.4.2 DNA polimerasas eucariticas: actividades polimerasa y exonucleasa

En eucariotas, las DNA polimerasas son diferentes a las de procariotas, aunque presentan cierta similitud
de secuencia y estructura. Se han descrito ms de cinco enzimas. La DNApol a posee dos actividades
enzimticas independientes: polimerasa (de DNA) y primasa (polimerasa de RNA). Gracias a su actividad
primasa se encarga de formar un RNA cebador necesario para iniciar la replicacin y, por su actividad
polimerasa, de la elongacin inicial de ese cebador. Esta tarea se cede luego a las DNApol d y e, responsables
de la mayor parte de la elongacin de ambas hebras; de hecho, ambas tienen actividades similares, pero an no
est claro si desempean indistintamente la misma funcin o si estn especializadas. La DNApol b no interviene en la replicacin, sino que est implicada en la reparacin de errores o daos en el DNA (procesos en los
que tambin participan otras polimerasas, incluyendo d y e). Mientras estas cuatro enzimas son responsables
de la replicacin, reparacin y recombinacin del DNA nuclear, el DNA mitocondrial lo sintetiza una polimerasa diferente, la DNApol g. Por ltimo, se han descubierto otras polimerasas nucleares, peor conocidas
(u [theta], z [zeta], l [lambda], m [mu], k [kappa], Z [eta], i [iota]), que estn implicadas sobre todo en
reparacin y recombinacin.
En cuanto a la actividad exonucleasa de las DNA polimerasas eucariticas, slo las 3 que se encargan de la
elongacin (d, g y e, v. tabla) poseen actividad 3-exonucleasa, la responsable de la capacidad de correccin de
errores cometidos al incorporar los nucletidos a la hebra que se est sintetizando. Ninguna de las polimerasas
eucariticas parece tener actividad 5-exonucleasa; la funcin de eliminacin de cebadores la desempean
dos nucleasas independientes, aunque las polimerasas d y e s se encargan de rellenar el hueco con DNA; todos
estos detalles se estudian posteriormente (pg. 158).
152
La funcin especfica de cada polimerasa slo se puede comprender en el contexto de los mecanismos de
iniciacin y elongacin de las cadenas de DNA, que se estudian con detalle dentro de la etapa de elongacin
(pg. 157).
Bajo el alcance de este libro no parece adecuado describir las propiedades estructurales de las distintas
polimerasas. En la tabla siguiente se resumen los datos relativos a tamao y composicin en subunidades, pero
debe tenerse en cuenta que la variabilidad de cifras es elevada, en especial para las enzimas eucariticas, e
incluso la interpretacin de stas en los distintos organismos estudiados, como para su generalizacin a todos
los eucariotas.
Caractersticas estructurales de las DNA polimerasas

Procariotas1
Polimerasa:
Masa total (kDa)
II
III
103
90
900
356
39
4
22
(4)
(5)
I
(3)
N. de subunidades
Eucariotas2
Masa de subunidades
160
173
313
2o3
125
35
125
48
258
55
Al menos en E. coli se han identificado otras dos polimerasas, IV y V.

Los datos corresponden a humanos. Existen otras DNA polimerasas minoritarias o no esenciales.
3
Masa molecular de la holoenzima, o enzima funcional con todas sus subunidades.
4
La DNApol-III de E. coli est formada por 22 subunidades de 10 tipos, con una composicin global (a, e, u)2t2(g, d, d , y, c)2b4.
De ellas, la agrupacin (a,e,u) se conoce como ncleo o centro de la polimerasa. El centro activo polimerasa est en la
subunidad a (130 kDa), mientras que el centro 3-exonucleasa o actividad correctora de pruebas est en la e.
5
La DNApol a humana est formada por 4 subunidades diferentes: 180 kDa, con el centro activo polimerasa; 48 kDa, con
el centro activo primasa; 58 kDa, cofactor de la primasa; 70 kDa, reguladora de la polimerasa.
2
11.2.5 Velocidad de replicacin

Dado el gran tamao del genoma de una clula, para que su replicacin completa se lleve a cabo en un
tiempo razonable el proceso de sntesis debe ser muy rpido. En procariotas, la velocidad alcanza 1.000
nucletidos por segundo. En eucariotas, el mayor tamao del genoma hace pensar en la necesidad de una
gran velocidad de replicacin que, sin embargo, no precisa ser tan elevada gracias a la existencia de varios
orgenes de replicacin en cada cromosoma, lo que reduce la longitud de DNA que debe sintetizar cada
molcula de polimerasa.
La consecucin de una alta velocidad de sntesis slo es posible gracias a un mecanismo peculiar, segn el
cual la molcula de DNA polimerasa se mantiene unida a la cadena de DNA molde, a la vez que asociada por su
centro activo al extremo 3-OH de la hebra creciente. De esta forma puede incorporar numerosos nucletidos
sucesivamente, con una reduccin del tiempo necesario para la adicin de cada uno: por ejemplo, la polimerasa
puede tardar un minuto en soltarse y volverse a unir al DNA (por mera difusin de las molculas), mientras que
para aadir un nucletido sin haberse soltado le bastan unos milisegundos. Esta capacidad de las polimerasas,
variable entre ellas, se recoge bajo el trmino procesividad, que se define como el nmero de nucletidos que
son incorporados a la hebra antes de que la enzima se separe del molde (coloquialmente se dira aadidos
de un tirn). Un valor elevado de procesividad en una polimerasa es mucho ms importante para la
replicacin que una velocidad alta de catlisis.
Las polimerasas de mayor procesividad son las que intervienen en la elongacin de las cadenas de DNA
(v. tabla en pg. 151), mientras que las de baja procesividad se encargan de tareas que podran calificarse de
auxiliares, tales como la sntesis y eliminacin de cebadores, su sustitucin por DNA y la reparacin. En
general, la alta procesividad se consigue gracias a una molcula que abraza o rodea la cadena de DNA,
evitando as que la enzima se separe; este mecanismo se denomina de abrazadera deslizante, pues permite el
deslizamiento continuado de la polimerasa a lo largo de la cadena de DNA, sin separarse de ella.
Web 11.5. Estructura de la abrazadera deslizante.
11.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACIN

Mientras que en procariotas es probable que la replicacin tenga lugar en conexin con la membrana celular,
pues el nico cromosoma est anclado a ella en la zona nucleoide, en eucariotas el proceso ocurre, lgicamente,
en la matriz nuclear. El DNA se replica una vez por ciclo celular, durante la fase S.
El mecanismo del proceso de replicacin permite definir una unidad funcional denominada replicn, como
aquella regin de DNA que se replica a partir de cada origen (v. web 11.2). Cada replicn contiene, pues, un
origen de replicacin y se replica mediante dos horquillas. Mientras en procariotas el cromosoma completo
constituye un solo replicn, en eucariotas son numerosos y sufren la replicacin de forma casi simultnea, lo
que supone la existencia de un complejo mecanismo de control que coordine el inicio, elongacin y terminacin
en todos los replicones de cada cromosoma. El conocimiento preciso de estos aspectos est pendiente, al igual
que otros relacionados, por ejemplo, con la replicacin de los centrmeros y de otras regiones heterocromticas
altamente condensadas.
Centrndonos en el inicio y progreso de la replicacin en cada replicn, deben plantearse cuestiones
relativas a cmo son las interacciones especficas entre DNA y protenas que desencadenan la iniciacin, a
la consiguiente actuacin de estas protenas y al control del proceso. Por delante de la horquilla de replicacin
debe producirse la descondensacin de los cromosomas, la disociacin de los nucleosomas y la separacin de
las histonas y las protenas no histnicas (Captulo 7). Por detrs de la horquilla, deben reutilizarse las histonas
y protenas no histnicas para la reasociacin de los nucleosomas, volverse a condensar la cromatina, etc.
11.3.1 Iniciacin
La replicacin siempre comienza en puntos definidos de la molcula de DNA, con secuencias caractersticas.
Como se ha comentado (web 11.2), en procariotas el cromosoma tiene un origen de replicacin nico (llamado
oriC) mientras que en eucariotas la enorme longitud de los cromosomas requiere la existencia de numerosos orgenes de replicacin que, aunque se conocen con menos precisin, tambin poseen secuencias
caractersticas.
La definicin de los puntos de inicio depende de dos regiones en el DNA: el replicador, que es la zona que
determina la apertura inicial de la doble hebra, y el origen propiamente dicho, el punto donde comienza
la sntesis sobre el molde de la molcula abierta. El replicador incluye zonas donde la doble hlice puede
desenrollarse con facilidad (secuencias ricas en pares AT) y otras que interaccionan especficamente con
protenas iniciadoras. La unin de estas protenas provoca la flexin de la cadena de DNA, generando una
tensin superhelicoidal negativa que, sumada a la interaccin ms dbil entre las bases A y T, contribuye a la
separacin de las hebras. En eucariotas, en particular, se han identificado tambin protenas iniciadoras que, en
lugar de flexionar el DNA, se unen a regiones palindrmicas que pueden formar estructuras cruciformes
(pg. 55); el resultado es anlogo, pues las cruciformes reducen la tensin de superenrollamiento y as facilitan
la apertura de la doble hlice.
11:5
153
154
Las protenas iniciadoras tambin actan uniendo otras protenas, que son as reclutadas al sitio de inicio.
Una vez abierta la doble hebra (lo que supone una desnaturalizacin local, v. pg. 164), tanto la helicasa como
el resto de protenas responsables del inicio incluidas las propias DNA polimerasas ya pueden asociarse al
DNA y comenzar el proceso de sntesis.
Web 11.6. Inicio de la replicacin.
11.3.2 Elongacin
11.3.2.1 Conexin entre la iniciacin y la elongacin: protenas necesarias
Una vez formado el complejo de iniciacin, la replicacin precisa el desenrollamiento de la doble hlice, a
fin de hacer accesibles las bases como molde para formar las nuevas hebras. El desenrollamiento inicial en
el tramo correspondiente al origen de replicacin, por efecto de las protenas iniciadoras, debe continuar
avanzando por delante de la polimerasa, encabezando la horquilla de replicacin. Adems, a medida que
se van sintetizando las hebras nuevas se debe ir recuperando el enrollamiento en las dos dobles hlices recin
formadas. En estas operaciones de avance, desenrollamiento o relajacin y enrollamiento o compactacin
intervienen diversas protenas especializadas. El complejo multiproteico formado por stas y por las DNA
polimerasas, que viaja asociado a cada horquilla realizando la replicacin, se conoce como replisoma.
Aunque la identidad molecular y el nombre de las protenas implicadas varan dependiendo del tipo de
organismo (bacterias, levaduras, mamferos, etc.) bsicamente todos utilizan el mismo conjunto de actividades
enzimticas y siguen mecanismos anlogos.
11:6
a) Helicasas
Estas protenas se unen al DNA una vez que ste se ha abierto en el origen y actan propagando la separacin
de sus dos hebras, en un proceso que requiere la hidrlisis simultnea de ATP. En general son hexmeros en
forma de anillo que rodea a una de las hebras del DNA. Una vez creadas las dos horquillas de replicacin,
comienzan a avanzar en sentidos opuestos, cada una liderada por una helicasa seguida inmediatamente por el
resto de componentes del replisoma o complejo de elongacin asociado a la horquilla.
b) Protenas ligantes de DNA monocatenario
Una vez separadas las hebras por la helicasa, intervienen las protenas ligantes de DNA monocatenario, que
evitan el reemparejamiento de las hebras. De esta forma, las hebras molde pueden acoger a los nucletidos que
se incorporan en la replicacin. Se las denomina protenas SSB (single strand binding proteins), tambin de
forma genrica pero de modo especfico en procariotas. En eucariotas desempea esta funcin la protena de
replicacin A (RPA).
c) Topoisomerasas
La apertura de la doble hlice ocasionada por la progresin de la helicasa a lo largo del DNA bicatenario
conlleva la aparicin de superenrollamientos positivos por delante de la horquilla. Si se tratase de un DNA
lineal y corto, el superenrollamiento se podra eliminar por simple rotacin de la molcula, en torno a su eje,
en sentido contrario. Sin embargo, esto no es posible en los DNA circulares (procariticos) ni en los lineales de
gran tamao (eucariticos), que estn restringidos topolgicamente (Captulo 7) debido a su naturaleza
circular y a su unin a protenas, respectivamente. Para aliviar esa tensin de torsin se requiere, pues,
algn tipo de mecanismo giratorio; de lo contrario, el superenrollamiento acumulado por delante de la
horquilla llegara a impedir el avance de la replicacin. Este problema se resuelve gracias a la accin de las
topoisomerasas, enzimas que alteran el estado de superenrollamiento del DNA sin modificar su estructura
en otros aspectos. Es decir, interconvierten topoismeros modificando el nmero de enlace del DNA (nmero
de vueltas que da una hebra respecto a la otra, pg. 82). Las topoisomerasas tambin intervienen en los
procesos de recombinacin y, posiblemente, en la transposicin, constituyendo un mecanismo bsico general
de modificacin topolgica de la molcula de DNA.
Web 11.7. Superenrollamiento asociado al avance de la replicacin.
Atendiendo a su modo de accin, se distinguen dos familias de topoisomerasas:

Las topoisomerasas de tipo I escinden de manera transitoria una hebra del DNA (un enlace fosfodister),
dejan pasar la otra por la brecha abierta y vuelven a ligar la primera hebra. Como consecuencia, el nmero
de enlace aumenta o disminuye en una unidad. La reaccin transcurre a travs de un intermediario covalente
entre uno de los extremos del corte y un residuo de tirosina de la enzima. Al permanecer la enzima unida as al
DNA abierto durante la accin cataltica, se controla en todo momento el grado de tensin liberado.
11:7
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156
Las topoisomerasas de tipo II, cuyo ejemplo clsico es la girasa procaritica, cortan de manera transitoria las
dos hebras del DNA, permiten el paso de otra doble hebra, intacta, por la brecha abierta y finalizan resellando
los cortes. Por consiguiente, el nmero de enlace aumenta o disminuye en dos unidades. La misin de estas
enzimas es generalmente inducir superenrollamientos negativos que facilitan el posterior desemparejamiento
local. El consumo energtico del proceso es importante: se hidroliza una molcula de ATP por cada corte de la
cadena.
d) Primasa
Como ya se ha indicado, las DNA polimerasas no son capaces de iniciar la sntesis de una molcula de DNA, es
decir, unir los dos primeros nucletidos, sino slo de elongar una hebra preexistente; por ello, el inicio de las
hebras nuevas requiere un cebador. ste lo sintetiza una polimerasa de RNA dirigida por DNA (pg. 149),
denominada primasa (de primer, cebador en ingls), que produce cadenas cortas de RNA, complementarias de
cada una de las hebras desemparejadas en el origen de replicacin. En procariotas, la primasa es una protena
independiente que forma parte de un complejo proteico denominado primosoma, asociado a la horquilla. En
eucariotas, la actividad primasa reside en una de las subunidades de la DNA polimerasa a, distinta de la
subunidad que posee el centro activo polimerasa (v. tabla en pg. 152); por ello, esta protena con dos
actividades se llama DNApol a/prim.
En resumen, la replicacin no slo depende de la DNA polimerasa, sino de numerosas enzimas y factores
proteicos (ms de 20 en E. coli). Este conjunto de protenas que, como se ha indicado, recibe el nombre de
replisoma o complejo de replicacin, se asocia en torno a la horquilla de replicacin, participando de forma
directa o indirecta en la sntesis simultnea de ambas hebras.
11.3.2.2 Asimetra de la replicacin en ambas hebras
11:8
Conceptualmente, el principal problema de la replicacin surge al constatar que ambas hebras se copian de
manera simultnea, a medida que avanza la horquilla, mediante enzimas (DNA polimerasas) que slo son
capaces de sintetizar en direccin 5 ! 3. Al abrirse la horquilla, una de las hebras progenitoras se va
exponiendo en el sentido correcto para actuar de molde, 3 ! 5, por lo que la sntesis de su hebra complementaria puede transcurrir por simple avance de la polimerasa a lo largo del molde a la par que avanza la
horquilla. Esta hebra nueva recibe el nombre de hebra adelantada (leading strand; a veces, hebra lder o hebra
gua); en ocasiones, su hebra molde recibe el mismo nombre, pero para evitar confusiones la llamaremos
molde de la hebra adelantada. Por el contrario, la otra hebra progenitora se expone en sentido 5 ! 3, por lo
que no puede actuar como molde a medida que avanza la horquilla. Como se ver en seguida, la sntesis de su
complementaria requiere un mecanismo particular que, entre otras cosas, supone un desfase con la sntesis de la
hebra adelantada, por lo que se denomina hebra retardada o retrasada (lagging strand).
La solucin al problema de sntesis de la hebra retardada se desvel al observar que durante la replicacin
era posible aislar pequeas molculas de DNA recin sintetizado (ms cortas en eucariotas que en procariotas),
conocidas como fragmentos de Okazaki en honor a Reiji y Tuneko Okazaki, quienes fueron sus descubridores.
Se pudo entonces proponer un mecanismo que explicase la sntesis de la hebra retardada en paralelo al
desplazamiento de la horquilla de replicacin. Dicho mecanismo consiste en la sntesis discontinua de la hebra
retardada: cada fragmento de Okazaki corresponde a una porcin de dicha hebra, cuya sntesis slo comienza
(de ah el nombre) cuando el avance de la horquilla ha liberado suficiente longitud de DNA monocatenario
como para que la polimerasa lo utilice como molde, en sentido 3 ! 5. Se propone para ello que la hebra
sencilla forma un bucle para permitir la sntesis en el sentido 5 ! 3 propio de la polimerasa. La sntesis
conjunta de ambas hebras (la adelantada, de forma continua, y la retardada, de forma discontinua), por sendas
molculas de DNA polimerasa se dice que es semidiscontinua.
Lgicamente, la sntesis de cada fragmento de Okazaki requiere un RNA cebador, sintetizado por una
actividad primasa (parte del primosoma en procariotas, DNApol a/prim en eucariotas) que viaja con
la horquilla y que tambin sintetiz en el origen de replicacin el nico cebador requerido por la hebra
adelantada.
11.3.2.3 Mecanismo de la elongacin

Web 11.8. Mecanismo de la elongacin en replicacin y organizacin del replisoma.
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158
11.3.2.4 Maduracin de los fragmentos de Okazaki

Para completar la sntesis de la hebra retardada deben unirse los fragmentos de Okazaki. Este proceso,
denominado globalmente maduracin, requiere la eliminacin de los cebadores, la elongacin del fragmento
adyacente para rellenar con DNA el hueco dejado por cada RNA cebador y la unin o empalme de los extremos
resultantes para dar una hebra continua. Todo ello tiene lugar posiblemente en las proximidades de la propia
horquilla, o bien posteriormente, lejos de ella.
Web 11.9. Maduracin de los fragmentos de Okazaki: eliminacin de cebadores y reemplazo con DNA.
La ltima etapa en esta maduracin de la hebra retardada, la unin de los fragmentos, la catalizan DNA
ligasas (o simplemente ligasas). Estas enzimas forman el enlace fosfoster que falta entre el grupo OH del
extremo 3 de un fragmento de Okazaki y el fosfato del extremo 5 del siguiente, asegurando as que la hebra
retardada sea una cadena continua. Adems de este papel fisiolgico, las ligasas son enzimas de gran utilidad en
el laboratorio, junto con las nucleasas de restriccin, especialmente para la preparacin de molculas de DNA
recombinante (pg. 218).
11.3.3 Terminacin
Una vez descritos los detalles particulares del inicio y la elongacin de la replicacin corresponde estudiar los
mecanismos de la terminacin. Debe indicarse que este proceso no se conoce tan bien como los anteriores, entre
otras razones por la propia amplitud y complejidad del concepto de terminacin. Se tratar aqu de exponer
los problemas que plantea la terminacin desde un punto de vista lgico y asumiendo su limitada confirmacin
experimental.
11.3.3.1 Final de la elongacin

Se puede considerar, conceptualmente, que la terminacin comprende varios aspectos. El primero de ellos es la
finalizacin propiamente dicha de la elongacin por la DNA polimerasa, que se verifica en las dos horquillas
de replicacin de cada replicn, previsiblemente cuando en su avance alcancen a las horquillas respectivas de
replicones adyacentes. ste es un proceso prcticamente desconocido en trminos moleculares, pero cuya
resolucin no plantea dificultad conceptual, pues el relleno de huecos y la unin de los dos tramos de nueva
hebra pueden resolverse de la misma forma que la maduracin y unin de los fragmentos de Okazaki.
Por otra parte, como segundo problema, falta por aclarar cul es el nmero de replicones implicados de
forma simultnea en la replicacin de cada cromosoma, as como los mecanismos de control que coordinan el
proceso en todos ellos. A diferencia del caso anterior, no existe an una hiptesis previsible.
Web 11.10. Sentido de la replicacin en los diferentes replicones y replicacin incompleta de los extremos.
11.3.3.2 Replicacin de los telmeros

La replicacin de los extremos del cromosoma eucaritico supone el tercer problema de la terminacin, pues,
como se ver en seguida, no puede llevarse a cabo mediante la elongacin por la DNA polimerasa. Este proceso
es, por ahora, el mejor conocido de la terminacin, posiblemente por su mayor trascendencia fisiolgica
y patolgica.
Como ya se ha estudiado, los telmeros son regiones situadas en los extremos de los cromosomas lineales
de la mayora de eucariotas (pg. 94), a las que se unen ciertas protenas. Estn constituidos por una de las
familias de DNA repetitivo no codificante (pg. 116), formando bloques de 1 a 12 kb de longitud, con
unidades de 6 a 8 pb repetidas en tndem centenares o miles de veces. Para entender la implicacin de los
telmeros en la replicacin deben recordarse sus dos caractersticas principales: la abundancia de repeticiones
en tndem y el carcter cohesivo de los extremos (que recuerda, aunque sin relacin funcional alguna, a los
extremos resultantes de la accin de ciertas enzimas de restriccin sobre un DNA, pg. 215).
El carcter cohesivo, en forma de salientes 3 en una de las hebras de cada extremo de los cromosomas,
tanto progenitores como filiales, se explica por el mecanismo de replicacin discontinua de la hebra
retardada (v. web 11.10). Como consecuencia adicional de dichos salientes 3, se produce un acortamiento
progresivo de las hebras de DNA en sucesivas rondas de replicacin.
11:10
Web 11.11. Acortamiento de los telmeros en la replicacin.
Este acortamiento de las regiones telomricas (calculado entre 50 y 200 pb por cada divisin celular) supone
la disminucin progresiva de la longitud del cromosoma a lo largo de sucesivas divisiones celulares, con
el consiguiente problema para la perpetuacin del mensaje gentico. Este problema se resuelve en la clula
gracias a la actuacin, tambin durante la fase S del ciclo celular (Captulo 8), de un nuevo tipo de enzima,
la telomerasa, que alarga los telmeros, compensando as la prdida anterior.
159
160
11.3.3.3 Telomerasa: componentes y caractersticas

Se ha propuesto que la telomerasa es un resto evolutivo de una ribozima (pg. 71) que pudo servir anteriormente para catalizar la sntesis de DNA; tambin, que pudo suponer un intermediario en la transicin
evolutiva desde las RNA replicasas a las transcriptasas inversas proteicas. Se trata de una enzima de tipo DNA
polimerasa, concretamente una polimerasa de DNA dirigida por RNA (pg. 149) y, por tanto, es una transcriptasa inversa (pgs. 207 y 223), pero con caractersticas especiales. En efecto, se trata de una ribonucleoprotena que slo es capaz de sintetizar una secuencia determinada de DNA, y que est formada por dos
componentes:
1. Componente ribonucleico o RNA de la telomerasa (TR o TER, de telomerase RNA), de tamao variable
segn especies (desde 146 nucletidos hasta 1.544), que forma parte integral de la enzima. Incluye una
secuencia, caracterstica para cada especie, de 9 a 28 nt y complementaria a la secuencia telomrica
respectiva. Por ejemplo, el RNA componente de la telomerasa humana (hTR) tiene 450 nt entre los que
hay una secuencia rica en C, (5)CCCUAA(3), complementaria y antiparalela a la hebra rica en G de la
repeticin telomrica (5)TTAGGG(3). Gracias a ella, como se ver luego, el TR sirve de molde para
la sntesis de nuevas secuencias telomricas.
2. Componente proteico, que contiene la actividad enzimtica, o transcriptasa inversa de la telomerasa
(TRT o TERT, de telomerase reverse transcriptase). sta es la actividad telomerasa propiamente dicha. A
diferencia de la transcriptasa inversa vrica y del resto de DNA polimerasas, para sintetizar el DNA
telomrico no utiliza un cebador de RNA sintetizado a tal fin, sino que elonga el extremo telomrico
3 precedente. La segunda diferencia importante es que el molde necesario para su accin es la parte
RNA de la propia enzima (el TR). Generalmente el TRT suele ir acompaado de otras subunidades no
catalticas, tambin proteicas.
11.3.3.4 Mecanismo de accin de la telomerasa

Web 11.12. Mecanismo de accin de la telomerasa.
11.3.3.5 Funcionalidad de la actividad telomerasa en las clulas

En las clulas somticas de la mayora de tejidos adultos apenas existe actividad telomerasa, mientras que s est
presente en clulas de la lnea germinal, en tejidos fetales y en ciertas clulas troncales (principalmente,
hematopoyticas), todas ellas clulas poco diferenciadas y en rpida proliferacin. Esto se debe a la regulacin de la expresin gnica, al igual que para cualquier otra protena (Captulo 18), pero aqu no se necesita entrar en los mecanismos por los que se evita la expresin de la telomerasa, sino que interesa destacar sus
consecuencias.
En ausencia de telomerasa, a medida que las clulas se van dividiendo y envejeciendo sufren un proceso
constante de acortamiento de sus telmeros (pg. 159). Dado el carcter repetitivo y no codificante de stos,
inicialmente esa prdida de los extremos de cada cromosoma no tiene consecuencias, pero llega un punto,
agotadas todas las repeticiones telomricas, en que afecta a regiones codificantes, y entonces la funcin celular
se ve perjudicada y la clula termina por morir. Se ha considerado este acortamiento como parte de un reloj
biolgico o celular que mide el proceso de envejecimiento, llevando la cuenta del nmero de divisiones hasta
que la clula debe morir, para controlar as su proliferacin correcta en los tejidos.
Puesto que en la mayor parte de las clulas de un organismo no hay actividad telomerasa, este acortamiento
es fisiolgico y se produce continuamente durante toda la vida de un individuo. En efecto, se ha demostrado que
la prdida de repeticiones telomricas aumenta proporcionalmente al nmero de divisiones mitticas experimentadas o a la edad del individuo al que pertenecen las clulas. En consonancia con este hecho, se ha
observado que la introduccin artificial de telomerasa en clulas somticas normales repone la prdida
de telmeros. Se concluye, por tanto, que el acortamiento telomrico est relacionado de forma inversa con
el grado de inmortalidad celular y, en definitiva, que el envejecimiento es una consecuencia de la prdida
de telmeros con la edad. Ello est tambin de acuerdo con la prdida acelerada de telmeros observada en
pacientes que sufren varios sndromes de envejecimiento prematuro.
161
La telomerasa est presente, por el contrario, en casi todas las clulas que proliferan, en especial las clulas
tumorales, y contribuye, junto a otros factores, a la proliferacin indefinida de los tumores. As, el aumento de
actividad telomerasa observado en fases tardas del progreso tumoral puede ser necesario para el crecimiento
del tumor, al impedir la muerte celular.
Por consiguiente, se ha propuesto la inhibicin de la actividad telomerasa como un principio de terapia
antitumoral y la telomerasa se considera una diana teraputica. Se buscan inhibidores especficos del componente cataltico de la telomerasa humana, frmacos y factores que acten modulando la telomerasa o cualquier
otro componente asociado a los telmeros. Estos aspectos tienen un gran inters aplicado en relacin con los
problemas de envejecimiento y cncer.
11.4 REPLICACIN MITOCONDRIAL

La replicacin del cromosoma mitocondrial humano se realiza por un mecanismo peculiar, diferente al
estudiado para los casos de procariotas y genoma nuclear de eucariotas. Previamente, se deben introducir
algunos conceptos relativos a esta molcula de DNA.
En el cromosoma mitocondrial, circular, una de las hebras posee un mayor contenido de bases purnicas,
por lo que se conoce como hebra pesada o H (de heavy, en ingls), mientras que la otra es la hebra ligera o L
(light). Por otra parte, una zona particular de la molcula recibe el nombre de asa de desdoblamiento o de
desplazamiento, o bucle D (D-loop); se trata de la nica regin no codificante del DNA mitocondrial, que
desempea el papel de regin de control, pues contiene el origen de replicacin de la hebra H y los orgenes
de transcripcin de ambas hebras.
La replicacin requiere un cebador, sintetizado por la RNA polimerasa mitocondrial usando la hebra L
como molde (a partir del promotor PL, situado tambin en la regin del bucle D, pg. 276). Entonces
la DNA polimerasa g comienza la replicacin propiamente dicha a partir del origen OH, elongando el cebador
para sintetizar la hebra H hija. El progreso de la elongacin requiere la participacin de protenas ligantes
de DNA monocatenario, mtSSB. Una vez que la horquilla de replicacin ha sobrepasado la posicin del origen
OL se comienza sobre l la replicacin de la otra hebra, empleando como molde la hebra H y sintetizando
la nueva hebra L.
Web 11.13. Replicacin del cromosoma mitocondrial.
La primera caracterstica singular de la replicacin del DNA mitocondrial es que no tiene lugar de manera
especfica en la fase S, sino a lo largo de todo el ciclo celular. Esto concuerda con la divisin de las mitocondrias
durante la interfase, en desfase con la divisin de otros orgnulos y de la clula. Adems, no todas las molculas
de DNA se replican una vez por ciclo, sino que lo hacen al azar.
La segunda peculiaridad que diferencia esta replicacin de la del genoma nuclear es su avance unidireccional, mediante dos horquillas que parten de orgenes distintos y avanzan en sentido opuesto sintetizando una
sola hebra cada una. Como consecuencia de este mecanismo, la replicacin tambin se diferencia de la del DNA
nuclear por ser no simultnea, bifocal y continua (no se forman fragmentos de Okazaki, las dos hebras se
sintetizan como adelantadas).
Replicacin del genoma
nuclear de eucariotas

mitocondrial de eucariotas

procaritico
Semiconservadora
Simultnea en ambas
hebras
No
Secuencial
Bidireccional
No
Mltiples (multifocal)
Dos, uno para cada hebra

(bifocal)
nico (monofocal)
No (continua en ambas hebras)
Carcter
Origen
Semidiscontinua
CAPTULO 12
Hibridacin de cidos nucleicos
12.1 INTRODUCCIN: DESNATURALIZACIN

Y RENATURALIZACIN DEL DNA
12.1.1 Agentes desnaturalizantes
12.1.1.1 Desnaturalizacin y renaturalizacin
por efecto de la temperatura
12.1.1.2 Desnaturalizacin por cidos y bases
12.1.1.3 Desnaturalizacin por agentes qumicos
12.1.2 Influencia de la desnaturalizacin sobre las
propiedades del DNA
12.1.2.1 Influencia sobre la viscosidad
12.1.2.2 Influencia sobre la absorcin ultravioleta
12.1.2.3 Significado prctico de las curvas de
desnaturalizacin
12.2 ANLISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACIN
DE CIDOS NUCLEICOS
12.2.1 Principio bsico del ensayo de hibridacin
12.2.2 Influencia de algunos factores sobre la hibridacin
12.2.2.1 Rigor de la hibridacin
12.3 MTODOS DE ENSAYO CON HIBRIDACIN
12.3.1 Hibridacin en fase lquida
12.3.2 Hibridacin en soporte slido
12.3.2.1 Hibridacin "dot-blot'' y "slot-blot''
12.3.2.2 Hibridacin de Southern
12.3.2.3 Hibridacin Northern
12.3.3 Matrices de DNA
12.3.3.1 Matrices de oligonucletidos:
chips de DNA
a Matrices de genotipado
b Matrices de expresin
12.3.3.2 Matrices de cidos nucleicos
12.3.4 Hibridacin in situ
12.3.4.1 Hibridacin in situ tisular
164
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12.3.4.2 Hibridacin in situ cromosmica

12.3.5 Tcnicas relacionadas
12.3.5.1 Transferencia Western
12.4 PREPARACIN DE SONDAS
12.4.1 Clasificacin de las sondas, en funcin del mtodo
de preparacin
12.4.2 Sondas convencionales
12.4.2.1 Sondas de DNA obtenidas por clonacin
celular (tecnologa del DNA
recombinante)
12.4.2.2 Sondas de DNA obtenidas por clonacin
acelular (amplificacin por PCR)
12.4.2.3 Sondas de RNA (ribosondas)
12.4.3 Sondas sintticas
12.4.3.1 Sntesis qumica de oligonucletidos
12.4.3.2 Diseo de una sonda sinttica
12.5 MARCAJE DE LAS SONDAS
12.5.1 Marcaje directo en la molcula de sonda
12.5.1.1 Marcaje con DNA polimerasa
a Mtodo de traslado de la mella
b Mtodo de iniciacin o cebado
aleatorio
12.5.1.2 Marcaje terminal
a Marcaje con polinucletido quinasa
b Marcaje terminal por relleno
12.5.2 Marcaje externo a la sonda
12.5.3 Marcaje indirecto
12.5.4 Tipos de marcadores, etiquetas o indicadores
y su deteccin
12.5.4.1 Marcadores radiactivos
12.5.4.2 Marcadores no radiactivos
12.5.4.3 Etiquetas o indicadores
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178
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190
La hibridacin es un fenmeno de importante aplicacin prctica en todas las reas de la biologa molecular
e ingeniera gentica, y en especial en la patologa molecular. Para comprender estas aplicaciones es preciso
estudiar previamente la base molecular que fundamenta este proceso y los mtodos de ensayo desarrollados
para su aplicacin, as como las tcnicas de preparacin de sondas.
La hibridacin est basada en el proceso de renaturalizacin de dos cadenas sencillas de un DNA, que se
observa, por ejemplo, al enfriar de forma lenta una disolucin del DNA bicatenario previamente desnaturalizado por calor. La especificidad del emparejamiento mediante puentes de hidrgeno entre bases complementarias (A-T, A-U o G-C) de molculas monocatenarias contiguas da lugar a estructuras bicatenarias, de gran
estabilidad. Cuando ambas molculas corresponden a las hebras originales de un mismo cido nucleico se
habla de renaturalizacin, mientras que si las dos hebras proceden de molculas diferentes adquiere sentido el
trmino hibridacin. El resultado pueden ser hbridos DNA-DNA, hbridos RNA-RNA o hbridos DNA-RNA.
163
164
I I . T R A N S M I S I N D E L A I N F O R M AC I N G E N T I C A Y T E C N O LO G A S R EL A C I O N A D A S
12.1 INTRODUCCIN: DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN DEL DNA

Puesto que la idea de la hibridacin surge de la observacin del proceso de renaturalizacin de un DNA
previamente desnaturalizado, se estudian como introduccin los procesos de desnaturalizacin y renaturalizacin.
De forma similar a lo que ocurre en las protenas, los cidos nucleicos se desnaturalizan por efecto de agentes
qumicos o fsicos, perdiendo su conformacin tridimensional, y en especial la naturaleza bicatenaria del DNA
(doble hlice). La desnaturalizacin se debe a la desestabilizacin tanto de los puentes de hidrgeno entre bases
como de las interacciones de apilamiento entre bases y a la prdida del efecto hidrfobo. Al desnaturalizarse, las
dos hebras del DNA se separan y pasan a una conformacin al azar (llamada a menudo ovillo aleatorio), sin que se
altere la estructura primaria, pues no hay ruptura de enlaces covalentes. En el caso de los RNA, con muy distinta
conformacin tridimensional a pesar de su analoga en estructura primaria, la desnaturalizacin afecta fundamentalmente a los tRNA y rRNA, ya que son los que presentan ms regiones bicatenarias locales. Al no dar lugar a
aplicaciones experimentales, la desnaturalizacin del RNA no se considera de forma particular en este captulo.
12.1.1 Agentes desnaturalizantes

Aunque pueden considerarse desnaturalizantes los mismos factores que actan sobre las protenas, slo
se citarn aqu, de forma breve, los cidos y bases y ciertos agentes qumicos, para centrar la atencin en el
efecto de la temperatura, como factor representativo. Aunque cada uno de ellos posee un mecanismo particular
de actuacin, todos debilitan las interacciones por puentes de hidrgeno o por apilamiento de bases, conduciendo a un mismo proceso de desnaturalizacin y de separacin de las hebras.
12.1.1.1 Desnaturalizacin y renaturalizacin por efecto de la temperatura

La temperatura, el agente desnaturalizante ms representativo, acta de la forma siguiente:
12:1
12. Hibridacin de cidos nucleicos
En general, se emplea el proceso de desnaturalizacin para el estudio de la estructura del DNA, mientras que
la renaturalizacin es til como base de las tcnicas de hibridacin, de enorme trascendencia en biologa
molecular e ingeniera gentica. La combinacin de desnaturalizacin y renaturalizacin es especialmente
crtica en la tcnica de PCR (Captulo 14).
12.1.1.2 Desnaturalizacin por cidos y bases

Como ya se ha estudiado (pg. 41), el emparejamiento de las bases disminuye o se debilita por valores de pH
alejados de la neutralidad, con la consiguiente desnaturalizacin del DNA. Sin embargo, un medio cido puede
conducir tambin a la ruptura de la estructura primaria de los cidos nucleicos (recurdese que el medio cido
fuerte rompe los enlaces fosfodister y N-glicosdicos, mientras que en condiciones ms suaves por ejemplo, a
pH alrededor de 3 se separan las purinas; pg. 31). Por ello, para la desnaturalizacin del DNA es ms
habitual emplear condiciones alcalinas (en las cuales el DNA, a diferencia del RNA, es estable). La
neutralizacin posterior del medio puede permitir la recuperacin de la estructura de partida, es decir,
la renaturalizacin del DNA (con consideraciones similares a las de la desnaturalizacin por calor).
12.1.1.3 Desnaturalizacin por agentes qumicos

Algunos de los compuestos empleados con frecuencia para desnaturalizar el DNA son molculas sencillas,
altamente polares, con grupos amino y carbonilo. stos les permiten competir en la formacin de enlaces de
hidrgeno con los grupos amino y carbonilo propios de las bases, lo que facilita la ruptura de sus emparejamientos y la consiguiente separacin de las hebras.
12:2
Dependiendo del tipo de accin del agente desnaturalizante y de la forma como ese agente se elimine, se
puede conseguir la renaturalizacin del DNA, de modo anlogo a los casos anteriores.
12.1.2 Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedades del DNA

En la prctica, la desnaturalizacin del DNA se puede seguir fcilmente midiendo aquellas propiedades fsicas
que permiten diferenciar el DNA bicatenario y el monocatenario. Varias de ellas experimentan profundos
cambios durante el proceso: aumento de la absorcin ptica, cambio en la rotacin ptica, incremento de la
densidad de flotacin y descenso de la viscosidad. Las ms utilizadas son la absorcin en el ultravioleta
(a 260 nm) y la viscosidad. A partir de estos cambios tambin puede obtenerse informacin de tipo estructural
acerca del propio cido nucleico (aunque este aspecto no se considera aqu).
12.1.2.1 Influencia sobre la viscosidad

La relativa rigidez de la molcula en doble hlice y su inmensa longitud en relacin con su dimetro hacen que
las disoluciones de DNA bicatenario sean muy viscosas. Por el contrario, en forma monocatenaria el plegamiento al azar de la cadena conduce a una viscosidad menor. De acuerdo con ello, al aumentar la temperatura,
el pH o la concentracin del agente qumico y producirse la desnaturalizacin, se observa una disminucin en
la viscosidad de la disolucin de DNA.
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12:3
12.1.2.2 Influencia sobre la absorcin ultravioleta

Debe recordarse que las bases nitrogenadas, los nuclesidos y los nucletidos poseen valores mximos de
absorcin de la luz cerca de la longitud de onda de 260 nm, debido a la presencia en su molcula de sistemas
conjugados de dobles enlaces (pgs. 16 y 24). Esta propiedad se mantiene en los cidos nucleicos (v. web 3.1),
pero la magnitud de la absorcin no es la misma, ya que el apilamiento y los puentes de hidrgeno la reducen
(esto recibe el nombre de efecto hipocrmico). Por ello, el DNA monocatenario absorbe en magnitud similar
a los nucletidos libres, mientras que el DNA bicatenario absorbe menos. Como consecuencia, la desnaturalizacin del DNA va acompaada de un aumento en la A260 (denominado efecto hipercrmico).
12:4
Obsrvese comparativamente la relacin existente entre disminucin de la viscosidad o aumento de A260

y el proceso de desnaturalizacin del DNA.
El RNA, al presentar en su molcula un grado variable de regiones bicatenarias, presentar una absorcin
intermedia entre la de un DNA bicatenario de tamao equivalente y uno monocatenario (desnaturalizado); la
magnitud depende de la complejidad de su estructura secundaria y, por tanto, tambin del tipo de RNA
(mensajero, ribosmico o transferente).
12.1.2.3 Significado prctico de las curvas de desnaturalizacin

La representacin grfica de la variacin de viscosidad o de A260 frente a la temperatura (o al pH, o a la
concentracin de agente desnaturalizante) permite obtener las curvas de desnaturalizacin, que son caractersticas para cada DNA en disolucin. El carcter sigmoidal de estas curvas indica que la desnaturalizacin se
produce de forma brusca, en un margen muy estrecho de temperatura, de pH o de concentracin de agente
desnaturalizante. Esto contrasta con la transicin ms gradual observada en la desnaturalizacin trmica de las
protenas, y sugiere que las interacciones que mantienen la doble hlice (apilamiento y puentes de hidrgeno)
son cooperativas, es decir, la separacin de las hebras en un punto facilita en gran medida que se sigan
separando en el resto de la molcula.
Al ser la transicin tan brusca, la desnaturalizacin trmica del DNA es similar en cierto modo a la fusin de
un slido, por lo que se habla tambin de curvas de fusin, y la temperatura central del intervalo de transicin
(50% de desnaturalizacin) se llama temperatura de fusin (Tf o Tm, del ingls melting). Bajo condiciones
definidas, cada DNA muestra una curva de fusin con valores caractersticos de Tm y de magnitud del efecto
hipercrmico (diferencia entre A260 mxima y mnima, o cambio de viscosidad). Estos datos son una medida de
la estabilidad estructural de la molcula de cido nucleico. Su valor depende, adems, del pH y la fuerza inica
del medio, y de la composicin en bases del cido nucleico.
Web 12.1. Variacin de la temperatura de fusin del DNA dependiendo de su composicin y de otros factores.
Es importante resaltar la relacin entre Tm y el contenido en pares de bases GC o A=T del DNA: cuanto
ms abundantes son GC, ms desplazada hacia la derecha aparece la curva, es decir, se necesita mayor
temperatura para la desnaturalizacin, Tm es mayor. Y viceversa, cuantos ms pares A = T, mayor desplazamiento a la izquierda y menor Tm. Esto se debe a que, al ser ms fuerte la interaccin en los pares GC
(3 puentes de hidrgeno), necesitan mayor energa para disociarse.
En efecto, al determinar la temperatura de fusin para varios DNA de orgenes diversos, se ha encontrado una
correlacin lineal con su contenido de G + C (que, de acuerdo con una de las reglas de Chargaff, ya estudiadas,
vara entre especies y puede emplearse como ndice en estudios evolutivos, pg. 38). Ello permite utilizar
la Tm de una muestra de DNA para estimar su composicin en bases. Por ejemplo, se puede emplear para
determinar la presencia de regiones ricas en G + C o de islotes CpG, asociados con frecuencia en el genoma
eucaritico a regiones promotoras, reguladoras de la transcripcin y comnmente metiladas (pg. 282).
Finalmente, la representacin grfica de las curvas de desnaturalizacin y renaturalizacin de un DNA
permite observar, como se indic al principio, que la similitud entre ambos procesos depende de las condiciones
en las que se intente la renaturalizacin. Obviamente, ambas curvas discurren en sentidos opuestos, pero slo si
el enfriamiento es lento tiene lugar una renaturalizacin, mientras que un enfriamiento rpido impide la
reasociacin correcta de las hebras:
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12.2 ANLISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Debe tenerse en cuenta que la renaturalizacin depende nicamente de la complementariedad de secuencia de
las hebras. Por ello, aunque lo ms probable es que stas se reasocien formando las mismas parejas o molculas
bicatenarias originales, son posibles otras reasociaciones. En particular, si se parte de una mezcla desnaturalizada de molculas distintas de DNA, pero con secuencias parecidas en parte (por ejemplo, DNA que codifica
la misma protena en especies distintas), al renaturalizar se puede producir la asociacin parcial de dos hebras
procedentes de molculas bicatenarias distintas. Se forman as DNA hbridos, con unas regiones emparejadas y
otras no. Esta formacin de molculas bicatenarias de DNA cuyas hebras tienen distinto origen (distinta especie
o, en general, distinto cido nucleico) recibe el nombre de hibridacin. Es caracterstico el carcter artificial de
su consecucin, de ah que tambin se considere hibridacin la formacin de hbridos entre DNA y RNA, o
entre un cido nucleico y un oligonucletido natural o sinttico, siempre en funcin de la existencia de secuencias total o parcialmente complementarias.
La estabilidad del hbrido es tanto mayor cuanto ms elevada sea la proporcin de bases complementarias y
mayor la longitud de las secuencias emparejadas. El hecho de que cadenas diferentes de cido nucleico hibriden
entre s indica que los organismos de donde proceden comparten un cierto grado de herencia evolutiva comn,
y que sus RNA y protenas tienen estructuras y funciones similares. Se dice que los cidos nucleicos que
codifican estas protenas y RNA tienen secuencias similares, homlogas. A mayor grado de hibridacin, mayor
conexin evolutiva entre especies, y viceversa; por ejemplo, el DNA genmico humano hibrida en mayor proporcin con el DNA de ratn que con el de levadura. Sin embargo, no es sta la nica utilidad de la hibridacin, sino que da lugar a numerosas aplicaciones, muchas entre ellas en el diagnstico clnico.
12.2.1 Principio bsico del ensayo de hibridacin

Todos los ensayos de hibridacin se basan en la gran especificidad de la interaccin entre bases complementarias. Para que la hibridacin permita identificar en un genoma, u otra muestra cualquiera de cido nucleico, una
secuencia particular se requieren dos elementos bsicos:
La presencia de la secuencia diana en uno de los fragmentos de la muestra de cido nucleico, generalmente
obtenidos usando enzimas de restriccin.
El empleo de una sonda (sonda molecular, sonda de hibridacin), que es un oligonucletido (fragmento
corto de cido nucleico) de secuencia conocida, marcado de forma que permita su deteccin. La secuencia de
la sonda ha de ser complementaria a la secuencia diana que se pretenda detectar, y su marcaje puede ser con
un istopo radiactivo, un cromforo, un fluorforo, una enzima, etc. (pg. 185).
Web 12.2. Fundamento y etapas de los ensayos de hibridacin.
12.2.2 Influencia de algunos factores sobre la hibridacin

Adems de la composicin de bases de las cadenas, existe una serie de parmetros que afectan a la posibilidad
de renaturalizacin de dos molculas monocatenarias y, por tanto, condicionan experimentalmente la
realizacin de un ensayo de hibridacin. Estos factores, cuya descripcin detallada corresponde a un tratado
especfico de metodologa en biologa molecular, estn esencialmente relacionados con la concentracin de
DNA o RNA diana (no slo la concentracin de cido nucleico en la muestra, sino tambin el nmero de copias
de la secuencia diana que contiene dicha muestra), la concentracin y tamao de la sonda, la temperatura y
tiempo de hibridacin, y las caractersticas del medio de reaccin, como fuerza inica, pH, concentracin
de agentes desnaturalizantes, adicin de ciertos polmeros, etc. A continuacin se comenta slo un aspecto, de
inters general en los ensayos de hibridacin, determinado por algunos de dichos factores.
12.2.2.1 Rigor de la hibridacin

Se define el rigor (en ingls, stringency) como el grado de especificidad en el emparejamiento conseguido
en los hbridos; supone, pues, una medida de la capacidad de reconocimiento mutuo de dos secuencias. Al
realizar la hibridacin, habitualmente se busca un emparejamiento completo entre sonda y diana, pero en
ocasiones interesa tolerar un cierto grado de desemparejamiento, con el fin de detectar regiones del DNA cuya
secuencia no es exactamente igual a la diana, pero presenta una elevada homologa. Por otro lado, el control del
rigor en cada aplicacin y caso concreto es esencial: ni debe ser tan alto que impida la unin estable de la sonda a
su diana, ni tan bajo que permita la hibridacin inespecfica de la sonda con secuencias poco relacionadas,
dando lugar a una seal de fondo elevada o a falsos positivos.
El rigor depende de diversos factores experimentales: temperatura y tiempo de renaturalizacin (o
hibridacin), longitud y concentracin de las molculas, composicin de bases y ambiente qumico (presencia
de cationes, formamida, urea, pH, etc.). Cuanto ms elevada es la temperatura durante la fase de hibridacin, ms especfica debe ser la interaccin entre las hebras para que se mantengan unidas. Los cationes monovalentes (Na+ ) estabilizan la estructura bicatenaria, pues apantallan la repulsin electrosttica entre los grupos
fosfato, facilitando la aproximacin de ambas hebras. Por ltimo, la formamida y la urea afectan a los enlaces de hidrgeno (pg. 165) y son por ello agentes que desestabilizan la doble hlice, de modo que slo se
mantendrn los emparejamientos ms perfectos.
En consecuencia, los principales factores que se suelen manejar en la prctica para maximizar el rigor de la
hibridacin, y permitir slo los hbridos que estn emparejados completamente, son la elevacin de la temperatura de hibridacin, la disminucin de la concentracin de Na+ y el aumento de la de formamida. Viceversa,
para reducir el rigor de la hibridacin, es decir, para permitir la formacin de hbridos parcialmente desemparejados, se emplean temperaturas de hibridacin relativamente bajas, concentraciones altas de Na+ y bajas de
formamida.
Web 12.3. Rigor en la hibridacin.
12.3 MTODOS DE ENSAYO CON HIBRIDACIN

Todos los ensayos de hibridacin se basan en la mezcla de molculas monocatenarias de cido nucleico muestra
o diana, no marcado, con una sonda de secuencia conocida, marcada, bajo condiciones experimentales que
permitan el emparejamiento entre bases complementarias. Si la sonda o el DNA diana son bicatenarios, deben
desnaturalizarse previamente, en general por calentamiento o por tratamiento alcalino. Una vez mezcladas, se
permite la renaturalizacin en la cual, como ya se ha comentado, se pueden formar hbridos sonda:diana. Se ha de
disponer, adems, de un mtodo para detectar los hbridos formados, que viene determinado por el tipo
de marcaje empleado en la sonda.
Los ensayos de hibridacin pueden clasificarse en tres grupos:
12:6
12.3.1 Hibridacin en fase lquida

ste fue el primer formato de hibridacin diseado. Utilizando una muestra de DNA o RNA en
disolucin, se realiza su hibridacin con la sonda; al estar ambas disueltas, la cintica es ms rpida.
Adems, todas las molculas diana son igualmente accesibles, por lo que la tcnica es ms cuantitativa
que la hibridacin en soporte slido. Sin embargo, es el mtodo que menos se utiliza actualmente, y ha
sido desplazado por otros ms convenientes. Se aplica, por ejemplo, en el estudio de la estructura de los
mRNA empleando nucleasa S1.
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12.3.2 Hibridacin en soporte slido

Se trata de un tipo de ensayo ms simple, que permite procesar varias muestras de forma simultnea y facilita
el control de la hibridacin. Aunque la cintica de la hibridacin es ms lenta y el proceso menos eficiente, se
utiliza mucho ms que la hibridacin en disolucin, porque es ms sencillo de realizar y ms verstil.
Estos mtodos han adquirido hoy da un inters particular como herramientas muy vlidas para el anlisis
de cidos nucleicos y el diagnstico de enfermedades moleculares con base gentica. Como antecedentes,
pueden citarse la inmovilizacin del DNA en nitrocelulosa, su deteccin por primera vez por hibridacin
y el descubrimiento de un mtodo para la lisis in situ de colonias bacterianas en filtros de celulosa.
El esquema general de este tipo de ensayos se puede ilustrar con el mtodo comnmente empleado para
identificar, de entre varias colonias bacterianas en placas de cultivo con agar, las que contienen un gen o
fragmento de DNA de inters bajo la forma de plsmido recombinante (Captulo 15).
12:8
12.3.2.1 Hibridacin "dot-blot'' y "slot-blot''

ste es el mtodo ms simple y comn, gracias a la posibilidad de emplearlo con muestras de cido nucleico sin
purificar. La muestra se aplica, bien gota a gota (dot-blot) o en manchas alargadas (slot-blot), sobre un filtro
de nailon o nitrocelulosa, cuyas propiedades de adsorcin fijan las molculas de cido nucleico y protena.
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12.3.2.2 Hibridacin de Southern

Fue desarrollada por Edwin M. Southern, al que debe su nombre (Southern blot). Es una tcnica simple y fcil
de realizar que detecta fragmentos de DNA, separados por tamao mediante electroforesis en gel (pg. 140).
Combina la separacin electrofortica del DNA con su transferencia a un soporte slido o filtro (nailon o
nitrocelulosa) para su hibridacin. Tanto sta como la posterior deteccin se realizan de forma ms eficaz en el
filtro de lo que se hara en el gel. Esta tcnica ha contribuido de forma notable a aumentar el potencial de
la hibridacin como herramienta analtica, constituyendo hoy da en bioqumica clnica un mtodo habitual
de anlisis del DNA extrado de muestras de sangre, esputos, tejido y clulas (linfocitos, amniocitos, etc.).
Metodolgicamente, implica cinco etapas bien diferenciadas: separacin electrofortica, desnaturalizacin,
transferencia, hibridacin y deteccin:
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Web 12.4. Hibridacin de Southern: procedimiento.
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12.3.2.3 Hibridacin northern

A diferencia del caso anterior, su nombre (northern blot) no corresponde al de ningn investigador, sino a un
simple juego de palabras (southern = del sur, northern = del norte). El procedimiento es idntico, pero el cido
nucleico analizado es RNA. Por su menor tamao, puede no ser necesaria su fragmentacin con endonucleasas,
pero debe tenerse especial cuidado para evitar la accin de RNasas, tanto endgenas como exgenas
(contaminacin muy comn, incluso por las manos del analista, y difciles de inactivar). El uso de agentes
desnaturalizantes sigue siendo necesario para evitar emparejamientos intracatenarios, que alteraran el patrn
de separacin por tamao.
La tcnica de hibridacin northern se emplea principalmente para obtener informacin sobre el tamao
de RNA y sobre el modelo de expresin de genes especficos. stos, una vez clonados, pueden utilizarse como
sondas para hibridar con muestras de RNA aisladas de una variedad de tejidos diferentes, y as conocer los tipos
celulares en los que se expresa el gen, la abundancia relativa y tamao de los transcritos, y diversos detalles de su
procesamiento posterior.
12.3.3 Matrices de DNA

Los llamados biochips, genochips, genosensores o chips de DNA, fruto de una confluencia de la biologa
molecular con la automatizacin y la informtica, estn revolucionando el diagnstico molecular, al discriminar de una manera sencilla, rpida y automatizada el componente gentico de las enfermedades. Se llaman
tambin micromatrices de DNA (o, dependiendo del pas, microarreglos de DNA; en ingls, DNA microarrays), debido a la disposicin de las muestras en una retcula ortogonal.
Se trata de placas de silicio, vidrio u otro material, de unos centmetros de tamao, a cuya superficie se han
adherido segn una disposicin ordenada, conocida, diversas molculas cortas de DNA. La tecnologa
empleada permite fijar en cada biochip entre cientos y cientos de miles de molculas diferentes, por lo que se
puede hacer un nmero de ensayos muy elevado de forma simultnea sobre una muestra muy pequea (por
ejemplo, una gota de sangre o menos de un microgramo de mRNA total purificado de un tipo celular concreto).
Esencialmente, se trata de un ensayo de hibridacin en soporte slido, en el que el papel de sonda
lo desempean las molculas unidas al biochip y en este caso se marca el DNA o RNA de la muestra. La
muestra, desnaturalizada, se vierte sobre el biochip para que hibride con las secuencias de ste, se lava y se
detecta en qu posiciones aparece el marcaje.
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Se utilizan principalmente dos tipos de matrices de DNA:
Matrices preparadas con fragmentos de cidos nucleicos, obtenidos a partir de muestras biolgicas
o mediante clonacin. Habitualmente, las muestras de DNA se aplican (por ejemplo, sobre un portaobjetos) bien por contacto, en forma de microgotas, o bien sin contacto fsico con el soporte, empleando
tecnologas piezoelctrica, trmica o de electroaerosol, similares a las usadas en las impresoras de
inyeccin de tinta.
Matrices de oligonucletidos, que por lo comn se sintetizan qumicamente con las secuencias deseadas
(pg. 182) mediante reacciones realizadas de forma directa sobre el chip, de modo que los oligos quedan
anclados a l de modo covalente. En comparacin con las anteriores, las matrices de este tipo suelen ser de
menor tamao (tpicamente, sobre un cuadrado de vidrio o slice de unos 2 cm de lado) y con un nmero
de muestras muy superior (alcanzando hasta un milln).
En ambos casos, la idea es preparar una coleccin de molculas de DNA monocatenario con secuencias
conocidas o, al menos, con origen biolgico conocido y relevancia para el estudio abordado. La normalizacin
del formato y la miniaturizacin van ligadas a la automatizacin del ensayo, que emplea tcnicas robticas
e informticas para procesar un gran nmero de muestras de muy pequeo volumen, recolectar y analizar los
resultados.
A continuacin se comentan algunas caractersticas y aplicaciones frecuentes a ttulo de ejemplo de ambos
tipos de matriz de DNA.
12.3.3.1 Matrices de oligonucletidos: chips de DNA

Como se ha mencionado, en este planteamiento la matriz se forma con colecciones de oligonucletidos
generados in situ, es decir, mediante sntesis qumica y anclados de forma covalente al soporte tanto desde
el comienzo de su sntesis como durante todo el ensayo posterior. Las secuencias de dichos oligonucletidos
(entre 25 y 60 nt) se disean para corresponder con las que interesa detectar en las muestras de DNA o RNA.
ste es el caso en el que el trmino chip de DNA tiene su mayor implantacin, pues la tecnologa necesaria para
fabricarlo procede de la empleada en circuitos integrados (fotolitografa, vase web 12.6) y el soporte a
menudo es un chip de silicio.
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a) Matrices de genotipado
Una de las principales aplicaciones de estas matrices es la cartografa de mutaciones y el anlisis de polimorfismos. En este caso las matrices se emplean para analizar muestras de DNA genmico, con el fin de diagnosticar una enfermedad o, ms comnmente, para evaluar la predisposicin a una enfermedad o su prognosis y,
asimismo, para la tipificacin o clasificacin molecular de subtipos de cncer y de otras enfermedades.
Veamos un ejemplo que lo ilustra. Estudios previos han llevado a conocer unas centenas de loci con
polimorfismos de un solo nucletido (SNP, pg. 418) relacionados con la hipercolesterolemia familiar. Se
conocen, asimismo, las distintas variantes allicas presentes en la poblacin en cada uno de esos loci y
la incidencia de cada uno de estos alelos sobre la evolucin clnica de la hipercolesterolemia. Se procede a
disear secuencias (de unos 25 nt) que sean complementarias a los distintos alelos para cada SNP. Se sintetizan
entonces todos esos oligonucletidos in situ sobre las distintas posiciones de una matriz, o bien se sintetizan por
separado y se aplican al soporte con alguna de las tcnicas de impresin. Cada posicin de la matriz contiene,
obviamente, mltiples molculas idnticas de oligonucletido con una de las secuencias en concreto.
A partir de sangre o frotis bucal de los pacientes se extrae el DNA genmico, que se amplifica por PCR
(Captulo 14) con cebadores diseados para flanquear cada SNP. El producto de esta PCR mltiplex se marca
con un nucletido biotinilado, bien durante la PCR o tras finalizarla por ejemplo, empleando polinucletido
quinasa o transferasa terminal (pgs. 187 y 223). A continuacin se realiza la hibridacin de las muestras de
DNA amplificado con la matriz de oligonucletidos, y se revela empleando estreptavidina conjugada con un
fluorforo (pg. 189). El anlisis de la fluorescencia obtenida en cada punto de la matriz permite interpretar
cul de los alelos de cada SNP est presente en el genoma del paciente. El ensayo permite as no slo
el diagnstico, sino especialmente la prevencin, la evaluacin de riesgos y la eleccin de la terapia ms adecuada
a cada caso. Asimismo, el conjunto de datos que se va obteniendo permite incrementar el corpus de conocimiento sobre la relacin entre cada una de las variantes allicas y la evolucin de la hipercolesterolemia.
b) Matrices de expresin
Otro gran campo de aplicacin lo constituyen los ensayos de expresin gnica. En este caso, las muestras
analizadas corresponden al RNA que se expresa en el tejido de inters. La cuantificacin de la seal en la matriz
ofrece informacin sobre la actividad relativa de los genes para los que se han diseado los oligonucletidos
componentes de la matriz.
En una de las aplicaciones ms comunes, el denominado anlisis de expresin diferencial, se preparan
muestras de mRNA. Por ejemplo, pueden compararse muestras de individuos sanos con las de quienes
presentan una enfermedad, o bien muestras obtenidas de enfermos que padecen dos tipos de cncer diferentes.
El objetivo es identificar genes relacionados con la aparicin de la enfermedad o con uno de sus subtipos. De
cada una de las muestras se purifica el mRNA total y se realiza in vitro una transcripcin inversa para obtener el
conjunto de molculas de DNA complementario (pg. 223). Bien durante la propia reaccin de retrotranscripcin o bien tras terminarla se marcan los cDNA con un fluorforo, diferente para cada una de
las dos muestras que se quieren comparar. La matriz de oligonucletidos se construye con secuencias correspondientes a los genes de inters, cuya expresin se pretende analizar, o bien con una biblioteca de
secuencias aleatorias (pero conocidas), si es que se persigue la bsqueda de genes cuya implicacin en la
enfermedad es an desconocida. Ambas muestras de cDNA marcado se mezclan y se aplican sobre la matriz
en un ensayo de hibridacin. La deteccin de la intensidad relativa de la fluorescencia en ambos colores para
cada punto de la matriz proporciona la informacin de qu genes estn sobreexpresados en una de las dos
muestras, cules estn reprimidos o expresados ms dbilmente y cules no ven modificada su expresin y, en
consecuencia, no tienen implicacin en la enfermedad estudiada o en los subtipos comparados. As se puede
deducir cules son los genes cuya expresin est relacionada con cada tipo de situacin (por ejemplo, con la
evolucin de un tipo de cncer).
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12.3.3.2 Matrices de cidos nucleicos

Otra aproximacin con abundantes ejemplos de aplicacin consiste en preparar las matrices con fragmentos de
molculas de cido nucleico (por ejemplo, de 300 a 500 nt) depositados sobre el soporte. Dichos fragmentos
suelen proceder de muestras biolgicas o de tcnicas de clonacin (Captulos 13 y 14). En algunos casos
se eligen por ser representativos de secuencias que interesa analizar, por ejemplo para buscar las diferencias
genticas entre pacientes enfermos e individuos sanos. En otros casos, lo que se fija en la matriz es un conjunto
de muestras distintas sobre las que se desea localizar una secuencia o ensayar una actividad bioqumica, como
puede ser el reconocimiento por una protena. Como ejemplo, esto permite la bsqueda de factores de
transcripcin para una secuencia promotora (Captulo 18). Dependiendo de la aplicacin perseguida, las
molculas de DNA candidatas, inmovilizadas en la matriz, se hacen interaccionar con DNA o RNA (ensayo
de hibridacin), o bien con un extracto proteico (ensayo de unin o reconocimiento protena-DNA).
12.3.4 Hibridacin in situ

Es un tipo especializado de hibridacin en soporte slido, en la que la sonda se aplica sobre muestras en
su ubicacin natural (clula o tejido), generalmente las preparadas para microscopia. Supone, por tanto, el
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empleo de la hibridacin bajo un abordaje citolgico e histolgico y, en cuanto a la metodologa, es anloga a

las tcnicas inmunocitoqumicas e inmunohistoqumicas. De forma muy global, cabe distinguir entre sus
aplicaciones tisular y cromosmica.
12.3.4.1 Hibridacin in situ tisular

Se realiza sobre cortes de tejido, clulas intactas, ncleos aislados, etc. En muchos casos, se lleva a cabo
directamente sobre tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina, congelados, etc. Es una modalidad
de hibridacin particularmente relevante para detectar virus patgenos, para diagnosticar clulas cancerosas
como consecuencia de cambios genticos o para estudiar cambios en la expresin gnica, detectando secuencias
en el RNA celular. En este caso, tras una fijacin suave de la preparacin, se aaden sondas de DNA
complementario (cDNA), monocatenario. La deteccin se realiza por autorradiografa y examen de la
pelcula fotogrfica bajo el microscopio, o por microscopia de fluorescencia, si se emple este marcaje para
la sonda (Captulo 12).
12:15
12.3.4.2 Hibridacin in situ cromosmica

Se realiza sobre preparaciones en porta de cromosomas metafsicos o prometafsicos (pg. 91), tratadas
con reactivos fijadores para preservar las caractersticas morfolgicas del cromosoma. Para hacer accesible
la secuencia de DNA, se trata la muestra con enzimas proteolticas y se desnaturaliza el DNA mediante
calor, lcali o formamida para permitir su hibridacin con la sonda. Inicialmente se emplearon sondas
radiactivas, pero problemas tcnicos en la deteccin de la seal limitan su utilidad. Se ha conseguido
aumentar la sensibilidad y la resolucin mediante el uso de sondas marcadas con fluorforos. En esta
tcnica, llamada hibridacin in situ con fluorescencia o FISH (fluorescence in situ hybridization),
la deteccin se hace bajo un microscopio de fluorescencia, bien de forma directa o por un mtodo indirecto
(pgs. 188-189).
En cuanto a sus aplicaciones, dada la gran detectabilidad de los fluorforos actuales se puede emplear
la FISH con fines muy diversos y se ha convertido en una tcnica con elevado potencial diagnstico en
cromosomopatas (Captulo 25), genes tumorales, virologa, trasplantes, etc.
12:16
Uno de los mtodos surgidos de la hibridacin in situ cromosmica es el denominado pintado de cromosomas (chromosome painting), en el que se usa una mezcla de sondas, fragmentos de DNA procedentes de
distintas partes de un mismo cromosoma, con lo cual se consigue fluorescencia a lo largo del cromosoma
completo. Se facilita de esta forma la identificacin visual de cada cromosoma (o de varios simultneamente,
si se emplean sondas con distintos fluorocromos), en lo que se ha denominado un cariotipo molecular. Esto
es til para estudiar grandes reorganizaciones de los cromosomas (pgs. 447-448), que tienen lugar, por
ejemplo, en procesos cancerosos.
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12:17
12.3.5 Tcnicas relacionadas

Se comenta finalmente una tcnica de anlisis que, aun no estando basada en los principios de hibridacin,
posee tal similitud en los planteamientos que hace interesante su exposicin aqu.
12.3.5.1 Transferencia Western

A pesar de que en este caso no existe hibridacin entre cidos nucleicos, se describe este mtodo por su
similitud tcnica y mecanstica con las hibridaciones Southern y northern. El ensayo Western (western = del
oeste) se emplea para detectar las protenas presentes en una muestra. Para ello, se las somete a electroforesis
en gel de poliacrilamida (separndose en funcin de una combinacin de carga, tamao y forma, salvo en el
caso frecuente de la electroforesis en presencia de SDS, que separa slo en funcin del tamao o masa
molecular) y se transfieren a una membrana (western blot). La deteccin de las bandas proteicas en
la membrana o filtro se realiza gracias a la unin especfica de un anticuerpo dirigido contra la protena o
regin proteica que se quiere estudiar. De forma similar al marcaje y deteccin de sondas de cido nucleico, se
puede marcar directamente el anticuerpo o detectarlo mediante la unin de una protena ligante marcada a su
vez, tanto empleando istopos como tcnicas no radiactivas. El paralelismo (y las diferencias) entre los
3 mtodos se resumen en la figura.
12:18
De forma anloga, tambin se realizan ensayos dot-blot y slot-blot para protenas, con un planteamiento similar al expuesto para cidos nucleicos, salvo por el tipo de muestra, y con procedimientos de unin
y deteccin completamente anlogos al del western (en este caso, obviamente, al no realizar electroforesis no es
precisa la transferencia).
Han surgido tambin otros numerosos mtodos de anlisis de cidos nucleicos, variantes de los aqu expuestos, que combinan el reconocimiento de los cidos nucleicos mediante sondas con la interaccin especfica entre
aqullos y protenas, como los ensayos de retardo en gel o los mtodos southwestern y far-western.
Web 12.5. Tcnicas para analizar la interaccin de cidos nucleicos con protenas.
12.4 PREPARACIN DE SONDAS

Como ya se ha indicado, la deteccin de cidos nucleicos mediante ensayos de hibridacin depende de la
presencia de la secuencia diana que debe detectarse en la muestra y de la disponibilidad de una sonda u
oligonucletido de secuencia complementaria a la diana. Por tanto, la utilidad de la hibridacin, el punto
clave, radica en la sonda: de su naturaleza depende que el ensayo sea fructfero. El papel de la sonda equivale
al del anticuerpo en un inmunoensayo y, al estar marcada, permite localizar y cuantificar cualquier secuencia
diana con la cual se pueda hibridar. Gracias al empleo de sondas, la sensibilidad de la hibridacin es muy
elevada, hasta un milln de veces superior a la deteccin directa por otros mtodos, por ejemplo la tincin tras
electroforesis. La sonda se convierte as en un elemento esencial para cualquier estudio molecular, en especial
para analizar la variabilidad o polimorfismo del genoma. De ah la conveniencia de estudiar los mtodos de
preparacin y marcaje de sondas, como aspectos esenciales para su empleo en ensayos de hibridacin.
Se utiliza una gran variedad de mtodos para obtener sondas, tanto de DNA (monocatenario y bicatenario)
como de RNA. Obviamente, para su empleo en el ensayo de hibridacin la sonda siempre ha de ser monocatenaria, para lo cual simplemente es preciso desnaturalizar las sondas bicatenarias.
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12.4.1 Clasificacin de las sondas, en funcin del mtodo de preparacin

Las sondas se pueden clasificar segn varios criterios, como su tamao, longitud o tamao de la secuencia
diana, mtodo de marcaje y deteccin, mtodo de preparacin, etc. Este ltimo criterio es el ms utilizado,
distinguindose entre sondas preparadas por mtodos convencionales (por clonacin celular o acelular,
Captulos 14 y 15) y por mtodos de sntesis qumica.
Tipo de sonda:
Mtodo de
obtencin:
Material de
partida:
Naturaleza de la
sonda formada:
Convencionales
Clonacin celular
clsica
Clonacin
acelular (PCR)
DNA bicatenario
Sintticas
PCR con
Clonacin celular en
transcriptasa
vector especial seguida
inversa (RT-PCR)
de transcripcin
RNA
monocatenario
Fragmento de DNA (oligodesoxirribonucletido)
Sntesis qumica
DNA bicatenario
Nucletidos
Ribosonda, o
fragmento de RNA
(oligorribonucletido)
Oligonucletido
(oligo)
12.4.2 Sondas convencionales

Tambin llamadas sondas genmicas, clonadas o biolgicas, fueron las primeras que se utilizaron y han
contribuido especialmente al progreso de la biologa molecular.
12.4.2.1 Sondas de DNA obtenidas por clonacin celular (tecnologa del DNA recombinante)
Poseen tamao (longitud) variable, entre 100 bases y cientos de kb. Aunque los detalles experimentales de la
clonacin celular se estudian posteriormente (Captulo 15), se adelantan aqu de forma breve las etapas
principales del proceso.
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12.4.2.2 Sondas de DNA obtenidas por clonacin acelular (amplificacin por PCR)
Estas sondas suelen tener menor tamao que las obtenidas por clonacin celular, entre 0,1 y 20 kb. El mtodo
de preparacin (PCR, Captulo 14) consta de un menor nmero de etapas, por lo que las sondas se obtienen de
forma ms rpida y sencilla. En general, partiendo de DNA bicatenario se preparan sondas de la misma
naturaleza, salvo en la PCR asimtrica, que conduce a DNA monocatenario, y en la RT-PCR, que permite
obtener sondas de DNA bicatenario partiendo de un RNA (pg. 207).
12:20
12.4.2.3 Sondas de RNA (ribosondas)

La clonacin celular se puede emplear tambin para preparar sondas de RNA de hasta unos miles
de nucletidos. El proceso, relativamente complejo, se basa en la transcripcin de un DNA previamente
clonado. Se usa un plsmido especial (como el pSP64), que se caracteriza por incluir el promotor de una
RNA polimerasa de fago (promotor SP6). El DNA recombinante que resulta, una vez purificado y linealizado,
se utiliza como molde para la transcripcin por la RNA polimerasa SP6, que transcribe especficamente a partir
de la secuencia promotora SP6, sintetizando as numerosas copias (monocatenarias) del inserto RNA. Si alguno
de los NTP, sustratos de la RNA polimerasa, est marcado (pg. 186), el RNA se puede utilizar directamente
como sonda; si no, deber marcarse el RNA posteriormente a su obtencin.
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Ventajas de las ribosondas
Desventajas de las ribosondas
Al no poderse formar el homodplex sonda : sonda, se favorece

la eficacia de la interaccin de la sonda con la secuencia diana
Las sondas no unidas especficamente pueden ser eliminadas
por digestin con una RNasa, que degrada molculas
monocatenarias pero respeta los hbridos RNA sonda : DNA
diana
Se puede emplear como control negativo la sonda
complementaria (secuencia en direccin antisentido,
pg. 267, conseguida al incorporar el inserto junto al
promotor en orientacin contraria)
Es necesario usar un vector de clonacin

particular, con un promotor de transcripcin
Se aumenta la complejidad al precisarse la etapa
de reaccin de la RNA polimerasa
Puesto que el RNA es mucho ms lbil que el
DNA, y las RNasas son una contaminacin muy
frecuente, se requiere un manejo cuidadoso de
las sondas de RNA para evitar su degradacin
y el uso de tcnicas y material estriles y
especficamente libres de RNasas
12.4.3 Sondas sintticas

La capacidad de sntesis qumica es esencial en ingeniera gentica no slo para preparar sondas, sino
tambin para modificar un producto gnico de forma parcial o notable, o idealmente para sintetizar
genes completos. En general, se obtienen sondas de DNA ms cortas que por clonacin. El mtodo ms
popular es la sntesis de sondas cortas de DNA (de 15 a 45 nucletidos), monocatenarias, denominadas
oligonucletidos o simplemente oligos. stos pueden ser tambin de RNA, aunque se sintetizan con
mayor dificultad.
12.4.3.1 Sntesis qumica de oligonucletidos

El aspecto bsico de la sntesis es la formacin repetitiva de un enlace ster entre el grupo 3-fosfato de un
nucletido y el grupo 5-OH de otro, para dar un enlace fosfodister. Es decir, se parte de los 3-NMP y
se avanza en sentido 3 ! 5, a diferencia de la sntesis de cidos nucleicos en las clulas (tanto replicacin como
transcripcin emplean los 5-NTP y avanzan de 5 a 3). Los NMP se aaden uno a uno partiendo del primer
nuclesido, que est unido por su posicin 3 a un soporte slido y constituir el extremo 3 del cido nucleico
una vez sintetizado.
12:22
El principal problema es la gran reactividad de los dNMP, con un grupo -OH, un grupo fosfato y
grupos amino o carbonilo en la base nitrogenada, por lo que se requieren mtodos de bloqueo y desbloqueo que no afecten de manera irreversible a ninguno de los componentes de la molcula de nucletido. Por otro lado, el grupo fosfato (en 30 ) ha de activarse para que reaccione con el -OH (en 5 del nucletido anterior).
12:23
Web 12.6. Detalles de la sntesis qumica de oligos.
Estos procesos de sntesis estn completamente automatizados, son eficientes y de bajo coste. Debido
a que la longitud de estos oligos se ve limitada por el rendimiento de las reacciones de sntesis,
la sensibilidad alcanzada con ellos es, en general, menor que con las sondas obtenidas por clonacin. Sin
embargo, la continua mejora en los mtodos de sntesis qumica permite la obtencin de oligos cada vez mayores.
Respecto a la sntesis qumica de oligorribonucletidos, se utiliza mucho menos debido principalmente a la
dificultad de proteger el grupo OH 2 sin afectar al 3, y habida cuenta de que el resultado de la hibridacin y sus
aplicaciones son los mismos que con los oligodesoxirribonucletidos.
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184
12.4.3.2 Diseo de una sonda sinttica

Las sondas sintticas se disean de forma que contengan la secuencia complementaria a una zona del DNA
diana; por ejemplo, de una parte del gen que interesa detectar. El objetivo es preparar un oligonucletido que
pueda hibridarse con dicho DNA. Por ejemplo, con frecuencia se pretende localizar el gen que codifica una
protena determinada. Para disear la sonda, es necesario:
1. Conocer la secuencia completa de la protena, o al menos de un fragmento de ella, al que corresponder
la secuencia diana de DNA.
2. A partir de esa secuencia de aminocidos se establece (empleando el cdigo gentico) la secuencia de
nucletidos que habr de tener el DNA. Sin embargo, debido a la degeneracin del cdigo gentico
(distintos trinucletidos codifican un mismo aminocido, pg. 318), hay un nmero elevado de secuencias
de DNA que codifican el mismo polipptido y, obviamente, no se puede conocer a priori cul es la que est
presente en el genoma de la clula, por lo que es preciso sintetizar sondas que cubran todas las posibilidades.
3. Para reducir el nmero de sondas necesarias, se selecciona el segmento de secuencia que posea la menor
degeneracin posible.
4. Una vez sintetizadas todas las sondas, se ensaya su hibridacin con el DNA de partida; una de ellas ser
la correcta.
12:24
En este tipo de experimentos, los mtodos de sntesis y secuenciacin de protenas y de DNA convergen y
se complementan. Como se acaba de ver, la secuencia de una protena aislada puede usarse para localizar e
incluso aislar el gen correspondiente; de una forma similar, aunque inversa, un gen clonado (y, por tanto,
secuenciado) puede usarse para aislar la protena producto: la secuencia del gen permite disear y sintetizar
qumicamente un pptido corto que representa una parte del producto proteico del gen. Entonces, una de las
posibilidades es, por ejemplo, preparar anticuerpos contra este pptido sinttico y emplearlos para identificar y
purificar la protena para su estudio posterior.
12.5 MARCAJE DE LAS SONDAS

El empleo de sondas de DNA o RNA como herramientas analticas para localizar secuencias diana mediante
ensayos de hibridacin requiere obligatoriamente un proceso de marcaje de la sonda, que permita su deteccin.
La molcula o grupo marcador puede tener diversa naturaleza, siempre y cuando se pueda detectar su presencia
de forma directa o indirecta; los marcadores ms empleados son istopos radiactivos, fluorocromos y enzimas.
En general, dan lugar a mtodos sencillos de realizar, que detectan concentraciones muy bajas de la sonda.
El marcaje debe ser estable bajo diversas condiciones de temperatura, detergentes, disolventes, etc., y no afectar
a la reaccin de hibridacin. Clsicamente se utilizaron los mtodos radiactivos, pero en gran medida se han
visto desplazados por otros marcadores, sobre todo para evitar los riesgos derivados de la radiacin y la gestin
de residuos, para aprovechar la mayor vida media de sus reactivos de marcaje y, en algunos casos, para mejorar
el lmite de deteccin.
De forma genrica, pueden plantearse dos tipos de proceso de marcaje:
In vivo (ms correctamente, en cultivo): se hace suministrando nucletidos radiactivos a clulas en cultivo,
que los incorporan en sus cidos nucleicos de nueva sntesis. Su uso es limitado; por ejemplo, para preparar
DNA viral marcado en clulas infectadas por virus.
In vitro: es ms verstil. Pueden emplearse istopos radiactivos u otros mtodos alternativos. Se describen a
continuacin algunas de las diversas variantes metodolgicas.
En muchas ocasiones, en especial con ribosondas y sondas sintticas, la sonda se marca al mismo tiempo que
se prepara incluyendo, con los nucletidos que hay que suministrar a la reaccin de sntesis, alguno de ellos
marcado (con un istopo radiactivo, un fluorocromo o cualquier tipo de grupo indicador), mientras que en
otras el marcaje se realiza tras haber completado la sntesis de la sonda. Puesto que la preparacin de sondas
ya se ha estudiado, nos centraremos ahora en este ltimo caso, aunque las consideraciones relativas a la
deteccin sirven tambin para sondas marcadas durante su obtencin.
El principio bsico del marcaje es la unin qumica o conjugacin del marcador a la sonda (en el caso
radiactivo, en realidad el istopo forma parte de la molcula de sonda, no se une a ella). Como se acaba de
indicar, esto puede hacerse uniendo el marcador a la sonda ya preparada o a un nucletido que se incorporar
durante la sntesis de aqulla. Por otra parte, la sonda puede llevar unido el marcador detectable (mtodos
directos de marcaje, a continuacin) o bien otra molcula no detectable, etiqueta o grupo indicador (en
ingls, reporter), con la capacidad de ser reconocida posteriormente por una protena detectora, que es la
que va marcada para la deteccin (mtodos indirectos, pg. 188).
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12:25
12.5.1 Marcaje directo en la molcula de sonda

El grupo marcador se une de forma covalente, bien a grupos funcionales especficos o bien de forma
inespecfica. Los cidos nucleicos ofrecen menos grupos funcionales adecuados para este fin que las
protenas; bsicamente, algunos tomos de las bases nitrogenadas (en especial, los no implicados en el
emparejamiento con la base complementaria) y los grupos terminales 3-OH y 5-P.
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En esta categora de mtodos pueden considerarse tanto la inclusin de nucletidos marcados durante
la preparacin de la sonda (ya sea por sntesis qumica o biolgica) como el marcaje de la sonda ya terminada.
Se comentan a continuacin los ms representativos.
12.5.1.1 Marcaje con DNA polimerasa

Se trata de mtodos de sntesis enzimtica, los ms comunes. Los cuatro tipos de nucletido (al menos uno de
ellos marcado) se incorporan durante la reaccin de sntesis de una cadena de DNA. Existen dos variantes
principales: traslado de la mella (nick translation) e iniciacin o cebado aleatorios (random priming).
a) Mtodo de traslado de la mella
Es un mtodo fcil y rpido, considerado el ejemplo clsico de incorporacin enzimtica de un marcaje.
Requiere dos enzimas distintas: una desoxirribonucleasa (DNasa I pancretica) y una DNA polimerasa
(DNApolI de E. coli). El resultado del marcaje es la sustitucin de una gran parte (30-60%) de los nucletidos originales de cada hebra de DNA por otros marcados con istopo radiactivo en su posicin a5P.
Web 12.7. Mtodo de traslado de la mella.
Puesto que el nucletido marcado se incorpora a la sonda, en lugar del marcaje radiactivo pueden emplearse
tambin nucletidos conjugados con fluorocromos o con grupos indicadores (pgs. 185 y 189).
b) Mtodo de iniciacin o cebado aleatorios
Esta alternativa, a diferencia de la anterior, requiere la desnaturalizacin inicial del DNA bicatenario para que
hibride un oligonucletido que acta como cebador de la replicacin por DNApolI de E. coli. Ahora bien, en
este caso slo se requiere la actividad polimerasa, por lo que se prescinde del fragmento pequeo y se suele
utilizar el fragmento de Klenow (pg. 150). Esta tcnica ofrece una serie de ventajas de carcter tcnico
respecto a la anterior, cuya consideracin escapa a nuestros objetivos de carcter esencialmente conceptual.
Web 12.8. Mtodo de cebado aleatorio.
Al igual que el mtodo anterior, admite tambin nucletidos conjugados con fluorocromos o con grupos
indicadores.
12.5.1.2 Marcaje terminal

En este caso se aplica, en lugar de una sntesis, una modificacin enzimtica de las hebras de cido nucleico
existentes, mediante la incorporacin de uno o unos pocos nucletidos marcados a uno o ambos extremos de la
sonda de DNA o RNA. Aunque se utilizan menos que los anteriores, son mtodos tiles en ciertos casos, por
ejemplo para marcar oligos monocatenarios. Se emplean dos planteamientos: el marcaje con polinucletido
quinasa y el marcaje terminal por relleno (fill-in end-labeling).
a) Marcaje con polinucletido quinasa
Este mtodo no depende de la existencia de una hebra molde y, por tanto, puede emplearse para cualquier tipo
de sonda, mono- o bicatenaria, de DNA o de RNA. Consiste, en esencia, en un intercambio del 5-P terminal
de cualquier hebra por el fosfato (marcado) en posicin g de un ATP, con la intervencin de polinucletido
quinasa y, opcionalmente, fosfatasa alcalina.
Web 12.9. Mtodo de marcaje con polinucletido quinasa.
En este caso slo pueden usarse marcajes radiactivos, pues lo nico que se incorpora a la sonda es el fosfato g
del ATP.
b) Marcaje terminal por relleno
Este mtodo es el nico que utiliza una enzima de restriccin especfica para formar dos extremos cohesivos
(pg. 215), que luego son rellenados por la DNApol-I.
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188
Web 12.10. Mtodo de marcaje terminal por relleno.
Al igual que algunos de los anteriores, es posible el uso tanto de nucletidos radiactivos como de los
conjugados con fluorocromos o con grupos indicadores.
12.5.2 Marcaje externo a la sonda

En lugar de marcar sus propios nucletidos, es posible hacer que la sonda se una a otra molcula que a su vez
lleva el marcador. Una forma es la unin de protenas mediante reactivos entrecruzantes (formaldehdo,
glutaraldehdo, etc.; en ingls, crosslinkers). Tambin puede unirse el marcador por interaccin electrosttica con el DNA o emplearse agentes intercalantes (v. web 10.14), que se insertan entre los pares de bases
de la doble hlice (hbrido sonda: DNA) de forma no covalente.
12:27
12.5.3 Marcaje indirecto

Como se ha mencionado (pg. 185), puede convenir que a la sonda se una un grupo no detectable, etiqueta o
indicador, el cual en una segunda etapa es reconocido por otra molcula, por lo general una protena, que
incorpora el marcador detectable. Para la unin del indicador son aplicables las consideraciones ya realizadas
respecto a la unin del marcador en los mtodos directos. Se ilustra un ejemplo correspondiente a la
modificacin de los NTP:
12:28
Web 12.11. Marcaje indirecto de las sondas.
12.5.4 Tipos de marcadores, etiquetas o indicadores y su deteccin

12.5.4.1 Marcadores radiactivos
El marcaje radiactivo o isotpico es el que se ha empleado histricamente con ms frecuencia, aunque est
siendo desplazado de manera progresiva por los mtodos no radiactivos. Aunque no existe consenso acerca
del marcaje ideal, en la mayora de los casos se hace con 32P. Puesto que la breve vida media de este istopo
(14,2 das) crea dificultades en la preparacin, comercializacin y uso rutinario de los ensayos, se utilizan
tambin otros alternativos (35S, 3H, 125I o 14C).
La deteccin y registro de la hibridacin se hace por autorradiografa: el soporte con el material hibridado se
pone en contacto con una pelcula fotogrfica (del tipo empleado para las radiografas), la cual queda
impresionada con una imagen que muestra la presencia de la radiactividad (v. por ejemplo, el mtodo de
Southern, pg. 171). La intensidad de la seal depende de la intensidad de la radiacin emitida por el istopo y
del tiempo de exposicin. La deteccin empleando pelcula est siendo desplazada por el uso de instrumentos
que detectan la radiacin y la ofrecen directamente como seal digitalizada.
12.5.4.2 Marcadores no radiactivos

En funcin del marcador empleado, la deteccin se hace mediante fluorimetra o aadiendo un sustrato
especfico cuya transformacin por la enzima marcadora pueda detectarse empleando alguno de los siguientes
principios:
Espectrofotometra: medida de la absorcin de la luz debida a los productos de la reaccin, sean solubles
o insolubles, en el ultravioleta o el visible (colorimetra).
Fluorimetra: medida de la luz emitida por productos de la reaccin que posean un fluorforo (web 10.7).
Quimioluminiscencia: medida de luz emitida como consecuencia de reacciones con esta caracterstica (por
ejemplo, la transformacin de las luciferinas catalizada por luciferasa, o la oxidacin del luminol).
Debe sealarse que stos y otros procedimientos no son exclusivos del marcaje de sondas, sino que se aplican
tambin en otros ensayos de deteccin de protenas, antgenos, pequeos ligandos, etc.
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12.5.4.3 Etiquetas o indicadores

Los grupos que se usan ms habitualmente son la biotina (una vitamina natural y coenzima) y la digoxigenina
(un esteroide de la planta Digitalis). Ambos se pueden conjugar fcilmente a los nucletidos y se unen con gran
afinidad, respectivamente, a las protenas avidina o estreptavidina y a anticuerpos anti-digoxigenina. Al igual
que para los derivados fluorescentes, se dispone comercialmente de dNTP ya conjugados tanto a biotina como
a digoxigenina.
La deteccin de las sondas que llevan biotina o digoxigenina se realiza mediante ensayos de unin, similares
a los empleados para el inmunoensayo. A este fin, la protena detectora, con afinidad por el grupo indicador, se
marca previamente con un istopo radiactivo, un grupo fluorescente o una enzima.
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CAPTULO 13
Clonacin y clulas madre
13.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN

13.2 CLONACIN DE CLULAS
13.2.1 Clonacin por transferencia nuclear
13.2.2 Caractersticas de la clonacin de clulas
13.2.3 Aplicaciones teraputicas de las clulas
obtenidas por clonacin
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193
193
196
197
13.3 CLULAS TRONCALES O CLULAS MADRE

13.3.1 Fuentes de obtencin de clulas troncales
13.3.2 Capacidad de diferenciacin de las clulas
13.3.2.1 Totipotencia
13.3.2.2 Pluripotencia
13.3.2.3 Multipotencia
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199
200
200
13.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN

Conceptualmente, el proceso de clonacin (tambin clonado o clonaje) consiste en la obtencin de un clon,
entendido como un conjunto de elementos genticamente idnticos entre s y a su precursor. Estos elementos pueden ser molculas, clulas, tejidos, rganos u organismos pluricelulares completos. Cada componente individual de un clon contiene la misma informacin gentica, el mismo genotipo, que el elemento de
partida; por ello, se puede considerar que la clonacin supone una amplificacin gentica. Ahora bien, a pesar
de la definicin anterior, entre los componentes de un clon tambin se afirma que cada uno es un clon de los
otros (por ejemplo, cinco ovejas genticamente idnticas forman un clon, y a la vez cada oveja es un clon de
cualquiera de las dems, o todas son clnicas entre s).
Debe indicarse que la clonacin es un proceso fisiolgico normal: son clnicas las clulas embrionarias
totipotentes formadas por mitosis a partir del cigoto (v. web 10.1 y pg. 199); cada una de estas clulas da
lugar (mediante complejos procesos de diferenciacin y desarrollo) a individuos adultos formados por clulas
somticas clnicas, genticamente iguales entre s y a la clula embrionaria de partida (excepto en lo que afecta
a su diversidad o polimorfismo gentico, resultante de mutacin, recombinacin, transposicin, etc.). En el
nivel de organismos completos, son clnicos los gemelos monocigticos o univitelinos, procedentes de un
mismo vulo fecundado.
El inters de la clonacin radica, esencialmente, en su carcter biotecnolgico como proceso de
multiplicacin de molculas de DNA o RNA, clulas, tejidos u organismos completos, mediante mecanismos
de manipulacin gentica. La biologa en general, y la investigacin biomdica en particular, estn avanzando
enormemente y lo harn an ms en el futuro, con la variada gama de copias de elementos genticos ya
empleadas para estudiar y resolver problemas tanto de carcter bsico como aplicado. En particular, la
clonacin molecular ha sido una tcnica clave para la aparicin de la ingeniera gentica y se emplea con fines
muy diversos (aislamiento, amplificacin, hibridacin, secuenciacin, etc.) y con aplicaciones de todo tipo a
partir de DNA de cualquier procedencia, entre las que cabe citar las de inters teraputico (produccin de
insulina, interfern, eritropoyetina, hormona del crecimiento, factores de la coagulacin, etc.).
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13. Clonacin y clulas madre
Globalmente, interesa describir la clonacin desde el punto de vista de su finalidad, es decir:

Clonacin de organismos: plantas o animales completos.
Clonacin de clulas, aisladas o formando tejidos u rganos.
Clonacin de molculas, sean stas genes o fragmentos de DNA o RNA. De acuerdo con el proceso
experimental, esta clonacin puede dividirse a su vez en dos tipos:
Clonacin acelular, es decir, clonacin de molculas sin intervencin de clula alguna. Es sinnimo
de amplificacin in vitro de molculas de DNA o RNA mediante la reaccin en cadena de la DNA
polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). Se describe en el Captulo 14.
Clonacin celular (con clulas, no de clulas). Es la amplificacin de molculas de cido nucleico mediante
su introduccin, asistida por vectores, en clulas anfitrionas en cultivo. Se emplea la tecnologa del DNA
recombinante. Se estudia en el Captulo 15.
13.2 CLONACIN DE CLULAS

La clonacin de clulas implica toda manipulacin que conduzca a la obtencin de clulas iguales entre s y a la
clula precursora (progenitora). No debe confundirse este concepto con el trmino clonacin celular, empleado
en general en el sentido de clonacin en clulas, designando la obtencin de un clon de molculas de DNA (por
tanto, una clonacin molecular) mediante la tecnologa del DNA recombinante, ya que requiere el uso de
clulas anfitrionas para duplicar el DNA que se quiere clonar.
La clonacin de clulas ha adquirido trascendencia en aos recientes por constituir una etapa necesaria para
la preparacin real o potencial tanto de clulas troncales embrionarias, tejidos u rganos con fines aplicados en
clnica (clonacin teraputica) como de organismos completos con diversos fines, teraputicos o no (clonacin
reproductora). Este ltimo objetivo posee un gran impacto en la agricultura y en la ganadera; por ejemplo,
para la produccin y la mejora gentica.
Sin pretender llevar a cabo una descripcin exhaustiva de estas metodologas, el objetivo del presente
captulo es analizar los conceptos y principios bsicos de la clonacin de clulas, en particular la concebida
con fines teraputicos. Corresponde, por tanto, analizar las peculiaridades de este planteamiento desde un
punto de vista terico, para poder despus comprender su aplicacin real o potencial, presente o futura, en
el tratamiento de determinadas enfermedades.
13.2.1 Clonacin por transferencia nuclear

El proceso de preparacin de clones celulares est ntimamente relacionado con la obtencin de clulas
troncales, ms frecuentemente conocidas como clulas madre (pg. 197). El mtodo ms comn corresponde a lo que se denomina transferencia nuclear, entendida como la insercin de un ncleo en una clula
receptora. ste es el mtodo que condujo a la famosa oveja Dolly, y a muchos ms animales clonados posteriormente.
El paso esencial en la clonacin de clulas consiste en la formacin, in vitro, de una clula precursora que
dar lugar al clon celular. Debe destacarse que esta clula, a diferencia del cigoto, no comparte el genoma de dos
gametos, sino que se forma mediante la transferencia del ncleo de una clula al interior de otra, previamente
desprovista del suyo. La nueva clula posee, por tanto, la misma dotacin gentica que la clula donante del
ncleo (salvo la parte de genoma mitocondrial, que corresponde a la clula receptora). El citoplasma de
la clula receptora (que habitualmente es un oocito) contiene factores responsables de la reprogramacin,
que son protenas citoplasmticas capaces de interaccionar con los genes y devolverlos al patrn de expresin
tpico de un embrin.
1. Como clula donante se utiliza una clula somtica, tomada de cualquier tejido de un individuo normal
adulto o, si se trata de un paciente, de un tejido que no se encuentre afectado por la enfermedad. Dicha clula
se somete, en cultivo con nutrientes, a un proceso de desdiferenciacin para convertirla en una clula similar
a la embrionaria multipotencial.
193
194
2. Se extrae entonces el ncleo de dicha clula donante mediante tcnicas de micromanipulacin y aspiracin
con una pipeta de microinyeccin.
13:2
3. Como clula receptora, anfitriona u hospedadora se utiliza un oocito (vulo no fertilizado), del cual
se elimina el ncleo (enucleacin) de forma anloga al apartado anterior.
4. Mediante tcnicas de microinyeccin se introduce el ncleo de la clula somtica reprogramada en el oocito
enucleado, sin alterar su citoplasma.
5. Una vez microinyectado el ncleo somtico, se facilita su fusin con el oocito enucleado mediante una breve
descarga elctrica, dando lugar as a una clula hbrida, combinacin de la donante y la receptora, a la que se
ha denominado nuclvulo.
6. Se estimula el nuclvulo en cultivo para que inicie su divisin y para lograr que se desarrolle, primero hasta
varias clulas y luego hasta un blastocisto (embrin muy precoz, previo a la implantacin, v. web 10.1),
cuya identidad gentica depende, en exclusiva, del ncleo donante.
7. Se toman las clulas troncales pluripotentes de la masa celular interna del blastocisto (clulas troncales
embrionarias) y se cultivan de modo adecuado para que se diferencien y generen clulas de uno u otro tejido:
neuronal, muscular, seo, cardaco, etc. Una vez diferenciadas, las clulas pueden trasplantarse al paciente
que don el ncleo de la clula inicial (podran tambin, en el caso de un individuo sano, guardarse como
reserva para una eventual enfermedad).
13:3
195
196
13:4
13.2.2 Caractersticas de la clonacin de clulas

Una vez descrito someramente el proceso de clonacin, conviene detenerse a sealar algunas caractersticas
esenciales, que ayuden a comprender su naturaleza, as como similitudes y diferencias con los procesos
biolgicos de desarrollo embrionario.
En primer lugar, se trata de un procedimiento completamente artificial para la duplicacin de una clula
precursora, generando una poblacin de clulas genticamente idnticas a aqulla y entre s (un clon). Esto
tambin ocurre, pero de forma natural, en el proceso de renovacin de las clulas de cualquier tejido en
el organismo.
Respecto al origen, puede partirse de clulas de cualquier tipo, que se encuentren bien libres (por ejemplo,
una suspensin celular o un cultivo), bien circulantes en el organismo (como las clulas sanguneas), o bien
agrupadas formando tejidos slidos u rganos. En este ltimo caso habr que proceder, obviamente, a
su disgregacin previa (pg. 124).
El proceso de clonacin tiene lugar in vitro, tanto en lo referente a la preparacin del nuclvulo como a
su desarrollo posterior hasta embrin temprano. El nuclvulo posee cierta semejanza con un cigoto, puesto
que puede dar lugar por divisin a otras muchas clulas (hipotticamente, a un organismo completo). Sin
embargo, debe destacarse que el nuclvulo no comparte el genoma de dos gametos, sino que contiene los 2n
cromosomas del ncleo somtico y el citoplasma del oocito. El cigoto, por el contrario, posee n cromosomas
del vulo, n cromosomas del espermatozoide y, al menos, parte del citoplasma de ambos.
Otro aspecto que debe resaltarse es que la clonacin de clulas se inicia con la divisin por mitosis del
nuclvulo, en un medio de cultivo, lo que da lugar a un cmulo creciente de clulas, un clon celular en el que
todas las clulas son iguales genticamente entre s y al nuclvulo que sera anlogo a un embrin temprano.
No se conoce cmo puede producirse la diferenciacin celular en este proceso de desarrollo embrionario, pero
se admite que sea anloga a la embriognesis normal en el ambiente materno. El problema que aqu se plantea
deriva, precisamente, del proceso de desdiferenciacin necesario para que el ncleo de una clula somtica
pueda dar lugar a una clula similar a las embrionarias. Se requiere una total reprogramacin, muy precisa, de
toda la informacin contenida en dicho ncleo.
13.2.3 Aplicaciones teraputicas de las clulas obtenidas por clonacin

El principal beneficio de la clonacin, que justifica su creciente inters, tcnico y prctico, es la posibilidad de
aplicacin teraputica. Lo que se pretende es la obtencin de clulas troncales embrionarias, pluripotentes,
indiferenciadas, extradas de la masa interna del blastocisto (embrin clonado) y que puedan luego generar,
empleando condiciones de cultivo adecuadas, clulas de diferentes tejidos: corazn, hgado, piel, tejido
nervioso, etc. Por ejemplo, la clonacin de clulas sanas de un paciente permitira obtener clulas madre
embrionarias con capacidad para diferenciarse a clulas sanas del tejido afectado por la enfermedad. En
realidad, la aplicacin es idntica a la descrita para clulas troncales naturales (no procedentes de clonacin).
La gran ventaja radica en que al ser las clulas clonadas inmunolgicamente idnticas a las clulas donantes
del paciente se evitara el rechazo en el tratamiento celular o tisular de enfermedades del propio individuo
donante.
Se han desarrollado ya aplicaciones, aunque an no de forma generalizada, de utilizacin de clulas
troncales para la regeneracin de tejidos daados. Con este fin se utilizan sobre todo las clulas madre de
tejidos de adultos. Un ejemplo representativo es el cultivo directo de clulas troncales de la epidermis para
producir cantidades de piel suficiente para remediar grandes quemaduras. La terapia con clulas madre del
propio paciente podra tambin resolver la prdida de funcionalidad de un rgano, hoy da dependiente de la
donacin de rganos o tejidos de otra persona, con la dificultad de disponibilidad y la problemtica derivada de
las reacciones de rechazo.
13.3 CLULAS TRONCALES O CLULAS MADRE

Como ha quedado reflejado en el apartado anterior, la clonacin de clulas pasa por la obtencin de clulas
troncales (traduccin ms fidedigna de la expresin inglesa stem cells, aunque est ms extendida la expresin
alternativa, clulas madre). Con este nombre se hace referencia a aquellas clulas indiferenciadas, poco
especializadas, que al dividirse son capaces de diferenciarse dando lugar a todos los tipos de clulas especializadas que forman parte del conjunto de tejidos y rganos de un organismo (estimado, en total, en unos
200 tipos celulares en el ser humano).
Para comprender el origen, las caractersticas y la potencialidad de las clulas madre es preciso conocer el
proceso natural de embriognesis (vase web 10.1). La descripcin completa de ste excede los propsitos de
esta obra, por lo que slo se presentan las lneas generales imprescindibles para comprender las diferencias y el
potencial de los distintos tipos de clulas madre. El lector interesado en profundizar deber acudir a un texto
ms especfico.
Aunque las clulas madre embrionarias se conocen desde hace ms de 40 aos, fue a raz de su obtencin por
primera vez a partir de embriones de ratn (aos 1980) y, sobre todo, desde que se consigui aislarlas de
muestras humanas y cultivarlas (ao 1998), cuando se produjeron los mayores avances. La obtencin
de clulas madre vive en la ltima dcada una etapa brillante de expansin, y se ha convertido en noticia
cientfica casi diaria, de gran impacto en la informacin general y en la formacin profesional. De forma
simultnea, este tema es objeto de un candente debate biotico. Existen opiniones de todo tipo, desde aquellas
para las que es imperativo buscar opciones que no conlleven destruccin, a las que, en el otro extremo,
justifican cualquier medio ante el imparable fin investigador del cientfico. Una posicin intermedia, posiblemente mayoritaria, sera la de los que aceptan el uso de los embriones congelados, sobrantes de procesos de
197
198
fertilizacin en clnicas de reproduccin asistida. Debe recordarse que estos embriones, en un nmero elevado
(estimado entre 35.000 y 40.000 en Espaa), siguen pendientes de uno de estos tres destinos finales: su
destruccin transcurrido el plazo legal de utilizacin (5 aos), su uso para investigacin o su desarrollo por
parejas adoptivas, una posibilidad dudosa.
13.3.1 Fuentes de obtencin de clulas troncales

Para una comprensin correcta de las implicaciones, tanto tcnicas como ticas, del trabajo con clulas
troncales deben distinguirse, claramente, tres fuentes distintas para su obtencin.
A) Clulas madre de embriones tempranos:
A-1) El propio cigoto fisiolgico, resultante de la fecundacin (natural o asistida) del vulo por el espermatozoide.
A-2) El nuclvulo, formado en laboratorio mediante transferencia del ncleo de clulas del propio paciente a un oocito enucleado (clonacin de clulas).
A-3) Clulas procedentes de los embriones desarrollados de forma natural (en tero) a partir de un cigoto.
A-4) Clulas procedentes de embriones desarrollados in vitro a partir del cigoto formado por reproduccin asistida.
A-5) Clulas procedentes de embriones desarrollados in vitro a partir de un nuclvulo.
B) Clulas madre germinales de fetos:
B-1) De fetos normales animales, incluso humanos, procedentes de abortos.
B-2) De fetos clnicos por haberse desarrollado a partir de un nuclvulo.
C) Clulas madre de adulto. Obtenidas por desdiferenciacin de clulas especializadas de tejidos de individuos
adultos, jvenes o nios:
C-1) De tejidos normales de cualquier procedencia anatmica.
C-2) De tejidos de animales previamente obtenidos por clonacin.
13:5
Esta variada procedencia (real o hipottica), junto con la relacin de cada tipo de clula madre con el
proceso en que se encuentra implicada de forma directa (fecundacin, embriognesis, formacin del feto,
desdiferenciacin celular), constituyen parmetros, variables, que pueden determinar las innumerables posibilidades de aplicacin teraputica, descritas o an incluso pendientes de proponerse.
13.3.2 Capacidad de diferenciacin de las clulas

13.3.2.1. Totipotencia
El cigoto, formado por fecundacin natural, asistida o in vitro, puede considerarse un embrin unicelular,
cuya caracterstica principal es la totipotencia. Puede definirse as como la nica clula normal con capacidad de formar, mediante procesos de divisin, especializacin y diferenciacin, todos los tipos de clulas
pluripotentes, multipotentes, precursoras y progenitoras, a partir de las cuales se originan despus los
distintos tipos de clulas especializadas del nuevo individuo. Un nuclvulo obtenido por clonacin tambin tendr esta misma capacidad, contando con que su fusin y su estimulacin posterior se consigan con
xito.
13:6
Otro aspecto molecular importante en la aparicin del cigoto es el fenmeno de la reprogramacin del
genoma, que empieza a tener lugar en la fecundacin. Como consecuencia, la dotacin gentica del cigoto o
embrin unicelular es algo ms que la simple suma de los materiales genticos paterno y materno que lo
originaron. El genoma del cigoto se mantiene sin variacin en todas las clulas del organismo a las que da
lugar, pero el desarrollo del organismo, el proceso de diferenciacin celular individual, se debe a una
seleccin ordenada de los genes que se expresan, mientras otros permanecen silenciados. Existe una red
de seales genticas que controla las decisiones que deben tomarse en cada momento del desarrollo. Estos
mecanismos (una especie de memoria molecular) aparecen en el cigoto y se mantienen en todas las
clulas derivadas; conocidos como procesos epigenticos, implican modificaciones reversibles del DNA
(nunca la alteracin de su secuencia), fundamentalmente la metilacin de los islotes CpG (citosina-guanina)
(pgs. 282 y 286).
199
200
13.3.2.2. Pluripotencia
Las clulas tempranas formadas a partir del cigoto, constituyentes de los embriones de 2, 4, 8, 16... clulas
(v. web 10.1), se consideraban inicialmente idnticas entre s y al cigoto inicial. Sin embargo, se han encontrado
pruebas de que desde la primera divisin del cigoto las clulas comienzan a diferenciarse, diferencia que
aumenta a medida que progresa la divisin del embrin temprano. Esto significa que las clulas troncales
embrionarias, que se obtienen en cualquier momento de este desarrollo temprano, sern pluripotentes pero
nunca totipotentes.
Las clulas troncales embrionarias (clulas ES, de embryonic stem) son, como ya se ha indicado, el conjunto
de clulas que forman la masa celular interna del blastocisto, o embrin de cinco das. Por tanto, se obtienen a
partir de los embriones tempranos formados en cultivo a partir de un cigoto o un nuclvulo. Estas clulas
troncales pueden diferenciarse para dar todo tipo de clulas (excluidos la placenta y otros tejidos extraembrionarios) y son, por tanto, pluripotentes. Aunque no servirn para generar un organismo completo (pues el
hipottico embrin no se podra implantar), pueden utilizarse para formar cualquiera de sus tejidos y, por
tanto, ofrecen potencial teraputico. Por el contrario, las clulas del trofoblasto la capa externa del blastocisto se diferencian dando lugar a tejidos extraembrionarios, como la placenta y otros tejidos implicados en
el desarrollo del feto, de modo que no pueden originar un embrin completo y no son clulas pluripotentes
en sentido estricto.
Otra fuente de clulas troncales son las clulas germinales embrionarias (clulas EG, de embryonic germ),
que aparecen en el embrin ya en el estado de gstrula y que son las precursoras de los futuros gametos. A
diferencia de las clulas madre embrionarias ES, pueden obtenerse del feto o, en todo caso, de embriones ya
muy desarrollados. Tanto la pluripotencia como la capacidad de dividirse de manera indefinida en cultivo son
comunes a ES y EG, por lo que no se suele distinguir entre ambas, e incluso se denominan ES de forma global, a
pesar de su distinto origen.
Se han establecido lneas celulares estables de clulas madre embrionarias, obtenidas mediante transferencia
de ncleos de clulas somticas, que estn disponibles comercialmente. La normativa a este respecto es diversa
dependiendo del pas. A modo de ejemplo, en los Estados Unidos el registro oficial del NIH comprende todas las
cepas de clulas ES aprobadas para su empleo en investigaciones con fondos pblicos estadounidenses,
en nmero variable segn se consideren o no las protegidas por patente. Con esta coleccin se pretende evitar
la destruccin de embriones y competir con las investigaciones que ya se vienen realizando con fondos
privados.
13.3.2.3. Multipotencia
En principio, no se crea que las clulas madre con capacidades de multiplicacin independiente y de
diferenciacin hacia un determinado tejido pudieran proceder de clulas no embrionarias. Ms tarde se
encontr que esto era posible a partir de clulas madre de adulto, presentes en pequea cantidad en la
mayora de los tejidos del cuerpo. Como consecuencia, surgieron planteamientos de terapia celular, alternativos a los que implican la destruccin de embriones necesaria para obtener clulas ES. En todo caso, un
inconveniente general es su escasa abundancia en los tejidos, que supone una dificultad para obtenerlas
en cantidad suficiente.
Las clulas troncales de adulto se caracterizan por ser multipotentes, a diferencia de las clulas embrionarias
pluripotentes. Aunque estn especializadas, retienen un gran potencial de maduracin y diferenciacin, si bien
inferior al de las clulas madre embrionarias. En particular, se estn consiguiendo notables avances en
cuanto al modo de inducir desdiferenciacin para que estas clulas madre puedan dan lugar a diversos
tipos celulares especficos, diferentes de aquellos propios del tejido en el que se encuentran.
CAPTULO 14
Clonacin acelular: reaccin

en cadena de la polimerasa (PCR)
14.1
14.2
14.3
14.4
14.5
PRINCIPIO DEL MTODO

ETAPAS DEL PROCESO
CARACTERSTICAS
AUTOMATIZACIN
VARIANTES DEL MTODO
14.5.1 PCR en tiempo real
14.5.2 RT-PCR: amplificacin de RNA
202
203
204
205
205
205
206
14.5.3
14.5.4
14.5.5
14.5.6
14.5.7
14.5.8
PCR con "comienzo en caliente"

PCR "larga"
PCR "anidada"
PCR inversa
PCR con adaptadores
PCR asimtrica
208
208
208
208
209
209
Se comienza en este captulo la descripcin de la clonacin molecular, o clonacin de molculas de cido

nucleico, con la tcnica que permite amplificar el DNA (o RNA) sin emplear clulas. Por ello, se trata de una
clonacin acelular de acuerdo con la clasificacin establecida en el captulo anterior.
La PCR (acrnimo de polymerase chain reaction, reaccin en cadena de la polimerasa) es hoy da una
herramienta imprescindible en los laboratorios de biologa molecular e ingeniera gentica. El objetivo de esta
tcnica es la amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA, presente en muestras muy diversas, sin
necesidad de una purificacin previa. Cuando el objetivo es un RNA, puede aplicarse la PCR de forma
indirecta, si previamente se sintetiza su DNA complementario. Se pueden emplear como muestra para hacer
PCR homogenados, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezclas de fragmentos de DNA obtenidos con
enzimas de restriccin, muestras resultantes de la extraccin y aislamiento de DNA, etc. Sin embargo, debe
resaltarse que, por razones que se comprendern ms adelante, es un requisito imprescindible que se conozca la
secuencia de una parte de la regin de DNA o RNA que se quiere amplificar (salvo en el caso de algunas
variantes como la PCR inversa, pg. 208).
Por estas caractersticas, en especial la capacidad de amplificacin, la PCR es un mtodo idneo para
preparar cidos nucleicos en una cantidad muy superior a la presente en la muestra original, tanto con fines de
clonacin acelular como para la deteccin.
14:1
Las aplicaciones de la PCR son muy numerosas y variadas. Como ejemplos, pueden citarse: clonacin
acelular de fragmentos de DNA, deteccin de secuencias sin purificacin previa, preparacin de muestras para
secuenciacin de cidos nucleicos, establecimiento de polimorfismos de secuencia, rastreo de mutaciones,
tipificacin de DNA para trasplantes, diagnstico de enfermedades genticas (incluido el diagnstico prenatal),
determinacin de secuencias especficas de DNA relacionadas con situaciones patolgicas definidas, resolucin
de problemas forenses o arqueolgicos, estudios evolutivos, deteccin de microorganismos infecciosos, deteccin de clulas tumorales, amplificacin de DNA para su posterior clonacin celular, etc.
201
202
14.1 PRINCIPIO DEL MTODO

La PCR no es una tcnica analtica per se, sino ms bien una metodologa, resultante de la aplicacin prctica de
tres conceptos, ya descritos (pgs. 164, 168 y 145, respectivamente):
1. Desnaturalizacin del DNA para dar molculas monocatenarias.
2. Hibridacin especfica de la molcula monocatenaria con un oligonucletido. sta es la etapa que justifica
por qu se debe conocer parte de la secuencia.
3. Replicacin de la molcula monocatenaria mediante una DNA polimerasa que emplea el oligonucletido anterior como cebador: tambin se puede denominar elongacin o extensin del cebador, o polimerizacin.
Mediante la aplicacin en forma cclica de estos tres procesos se consigue un nmero muy alto de copias del
fragmento de cido nucleico en un corto espacio de tiempo, como se ver a continuacin.
A pesar de esta aparente complejidad, en teora es un mtodo sencillo, sensible y relativamente rpido para
amplificar secuencias. En la prctica, se requiere un control preciso de las variables que condicionan este triple
proceso (secuencia diana, cebadores, enzimas y resto de componentes), adems de instrumentos adecuados
(termocicladores) para establecer con precisin las condiciones de cada etapa y repetirlas cclicamente (tiempo,
temperatura, nmero de ciclos, etc.). Se consigue de esta forma amplificar secuencias de tamaos diversos,
comprendidos entre 50 pb y 2,5 kb.
Para la realizacin prctica se precisan en la mezcla de reaccin los siguientes "reactivos":
a) Los cuatro dNTP, en exceso, como sustratos para la sntesis de las innumerables copias de DNA. Para ser
reconocidos por la polimerasa, deben ir acompaados de Mg2+ que es, adems, una coenzima requerida por
la polimerasa.
b) Dos oligonucletidos monocatenarios (coloquialmente, "oligos"), por lo comn sintticos, de 18 a 30 nt.
Sus secuencias han de ser complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3 de la regin diana, uno
en cada hebra, de modo que los oligos puedan ejercer de cebadores para la replicacin de las dos hebras en la
regin diana. Por esta razn no puede amplificarse una regin de DNA si no se conoce la secuencia de sus
dos extremos. De hecho, es la posicin donde hibridan los cebadores la que define cul es el fragmento que
se amplifica (secuencia diana).
14:2
c) Una DNA polimerasa termoestable, es decir, enzimticamente activa a temperaturas relativamente altas
(habitualmente en torno a 75 C). La replicacin a temperaturas elevadas impide la formacin de hbridos
parcialmente desemparejados y contribuye as a la especificidad y rendimiento del proceso. Por otra parte,
la estabilidad de la polimerasa a temperaturas de hasta 95 C (aunque no mantenga su actividad, no se
desnaturaliza) permite que recupere su actividad al enfriarse de nuevo y evita as la necesidad de reponer
la enzima en sucesivos ciclos. La enzima ms empleada se denomina polimerasa Taq, por proceder de la
bacteria Thermus aquaticus, que vive en manantiales de agua caliente. Esta enzima tiene el inconveniente de
carecer de la actividad correctora de pruebas (exonucleasa 3) (pg. 150), por lo que la frecuencia de errores
es superior a la propia de la replicacin (alrededor de un error por cada 5.000 nucletidos incorporados); a
pesar de ello, es suficiente para los propsitos de la tcnica. Hoy da existen otras DNA polimerasas
termoestables que pueden emplearse como alternativa.
14. Clonacin acelular: reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
14.2 ETAPAS DEL PROCESO

Como ya se ha indicado, se requiere una sucesin de ciclos (en general entre 20 y 40, de 1,5 a 5 minutos de
duracin cada uno) formados por desnaturalizacin, hibridacin y replicacin, para conseguir una enorme
amplificacin del nmero de molculas que contienen la secuencia de inters o diana. La duracin total es
cercana a 2 horas, dependiendo de las condiciones experimentales concretas.
Cada ciclo de una PCR consta, pues, de tres etapas:
1. Desnaturalizacin: calentamiento para la separacin de las dos hebras del DNA, mediante una incubacin
breve (30-120 s) a una temperatura comprendida entre 68 y 97 C, que debe ser superior a la de fusin (Tm,
pg. 167) de la regin de DNA que quiere amplificarse.
2. Hibridacin: enfriamiento rpido por debajo de Tm, de forma que se permite el emparejamiento (pg. 168)
del DNA monocatenario de inters con los oligos cebadores. En general se usan temperaturas comprendidas
entre 37 y 65 C que se mantienen entre 10 y 120 s.
3. Elongacin (o replicacin): etapa de amplificacin propiamente dicha (72-75 C, 1-3 min), en la que la
DNA polimerasa termoestable elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales. La
replicacin transcurre (pg. 147) en direccin 5 ! 3 a partir del extremo 3-OH de cada cebador,
empleando como sustrato los cuatro dNTP, hasta terminar la lectura del molde o hasta que se eleve la
temperatura en una nueva etapa de desnaturalizacin (siguiente ciclo).
14:3
Adems de las 3 etapas de cada ciclo, suelen aadirse una etapa previa y una final al conjunto de todos los
ciclos. La previa, a elevada temperatura (incluso superior a la de las etapas de desnaturalizacin), sirve
principalmente para inactivar proteasas y nucleasas de la muestra, as como para asegurar la desnaturalizacin completa del DNA de partida, en especial si ste tiene gran tamao o posee regiones muy
compactadas (caso de un DNA genmico completo). La etapa final, por su parte, consiste en una prolongacin
de la ltima elongacin, para permitir que se completen todos los fragmentos.
Web 14.1. Mecanismo de la PCR: reacciones y resultados en los 4 primeros ciclos.
Debe destacarse que si la muestra de partida, como ocurre en el ejemplo descrito, est formada por
molculas de DNA de mayor tamao que la regin diana slo aparecen copias exactas de la diana a partir
del tercer ciclo. Si la muestra de partida hubiese sido el propio fragmento diana, todas las copias aparecidas
desde el primer ciclo seran iguales a l.
203
204
Adems de la amplificacin global, por aumento del nmero de molculas de DNA, debe notarse cmo el
nmero de copias de la diana se incrementa mucho ms rpidamente que el de otras copias ms largas. Todo
ello hace que en la mezcla final, al terminar la PCR, los fragmentos diana superen abrumadoramente en nmero
a cualquier otro tipo de fragmento, incluyendo, obviamente, las molculas de DNA originales de la muestra
(que no se han amplificado). En la siguiente tabla se observa el enorme grado de amplificacin conseguido, de
un milln de veces en 20 ciclos y un billn en 40 ciclos. Esto es lo que permite aplicar la PCR a muestras sin
necesidad de purificar su DNA, y analizar de manera directa los resultados, en los que slo se podr detectar el
fragmento amplificado.
N. de ciclos realizados
N. total de copias
N. de copias "largas"
N. de copias diana
Dianas/total
25%
16
50%
32
10
22
69%
10
1.024
20
1.004
98%
20
106
40
106
99,996%
40
1012
80
1012
100%
2x
2 -2x
14.3 CARACTERSTICAS
A continuacin se comentan algunas caractersticas del proceso de PCR.
Rendimiento: puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulacin de
copias (tanto totales como dianas) es exponencial en vez de lineal. Sin embargo, en la prctica el rendimiento
de cada etapa no es completo, por lo que las cifras se ven algo reducidas. A pesar de ello, siguen siendo muy
elevadas. El nmero de copias al final de los ciclos realizados puede calcularse como:
N = N0 (1 + R)X
siendo:
N = nmero de copias obtenidas

N0 = nmero de molculas iniciales
R = rendimiento de cada ciclo (generalmente, de 70 a 85%),
expresado en tanto por uno (0,70-0,85)
X = nmero de ciclos
Se han desarrollado modificaciones del mtodo descrito, encaminadas a aumentar la eficiencia, sobre todo
en lo relativo a la concentracin de Mg2+ (habitualmente entre 1 y 4 mM) y al tiempo y temperatura de hibridacin.
Duracin: la duracin de cada una de las tres etapas de cada ciclo y el nmero de ciclos deben optimizarse,
dependiendo de la secuencia concreta que quiera amplificarse. En muchos casos la eleccin de estas condiciones
debe hacerse de forma emprica.
Especificidad: es muy elevada. Est determinada especialmente por la secuencia de los dos cebadores
utilizados y por las condiciones de hibridacin. Se puede determinar la especificidad analizando en electroforesis el producto de la PCR: la aparicin de una banda nica indica que la tcnica ha actuado con buena
especificidad. Por ejemplo, si la temperatura de hibridacin se reduce en exceso se producen falsos positivos
debidos, fundamentalmente, a emparejamientos imperfectos del cebador con secuencias distintas de la diana,
aunque similares, que resultan as tambin amplificadas.
Capacidad de deteccin (comn aunque incorrectamente denominada sensibilidad): es muy alta (bajo lmite
de deteccin), tanto que la PCR puede permitir detectar una nica molcula de DNA en casi cualquier tipo de
muestra clnica, forense o arqueolgica (pelo, sangre, semen, etc.). Sin embargo, esta caracterstica supone
tambin un elevado riesgo de contaminacin por molculas de origen ajeno a la muestra.
Fidelidad: es decir, la capacidad de copiar secuencias con precisin, sin introducir mutaciones (cambios en la
secuencia de nucletidos). Esta caracterstica depende sobre todo de que la polimerasa empleada tenga o no
actividad correctora de pruebas (3-exonucleasa, pg. 150). As, la frecuencia de error oscila entre 2 104 de
una polimerasa Taq convencional y 1 106 de la polimerasa Pfu, que s tiene actividad 3-exonucleasa. En
todo caso, la eleccin de la enzima depender del objetivo de la PCR. No es crtica la fidelidad si slo se pretende
obtener una sonda, pero es fundamental si el objetivo es la identificacin de mutaciones poco frecuentes.
14.4 AUTOMATIZACIN
La automatizacin de la PCR es sencilla y de bajo coste, dado el carcter cclico repetitivo del proceso, el empleo
de componentes estables al calor, la necesidad de aadir reactivos nicamente al comienzo y el desarrollo de
sistemas electrnicos para programar los cambios de temperatura. Al mismo tiempo es imprescindible, pues
slo mediante la automatizacin se hace factible la realizacin de un nmero elevado de ciclos y se aumenta la
precisin del proceso. Ello facilita un empleo cada vez ms especfico y sensible en el laboratorio clnico. Los
instrumentos diseados para el desarrollo de reacciones de PCR se denominan termocicladores y suelen admitir
varias decenas de muestras simultneas, con volmenes comprendidos entre 25 y 100 ml.
14.5 VARIANTES DEL MTODO

Han surgido numerosas modificaciones derivadas del mtodo bsico inicial, con el propsito de mejorar el
rendimiento o la especificidad, adaptarse a muestras particulares, amplificar molculas de RNA en lugar de
DNA, producir molculas monocatenarias, etc. A continuacin, se comentan de forma breve algunas de las
variantes ms significativas.
14.5.1 PCR en tiempo real

La PCR, en su diseo original, es una tcnica de punto final, es decir, analiza el producto obtenido tras finalizar
la reaccin. Este planteamiento resulta ser poco cuantitativo: muestras con diferente cantidad de DNA inicial
pueden producir resultados similares tras la amplificacin, y viceversa. Por supuesto, esto no es un problema
para algunas aplicaciones, pero existen casos en los que es importante analizar mltiples muestras de forma
comparada (notablemente, la expresin de genes bajo diferentes situaciones). Debido a esta necesidad, se
ha desarrollado la tcnica de PCR cuantitativa (qPCR) o PCR en tiempo real, que mide la velocidad a la que
se va amplificando el DNA. (En ocasiones, se usa RT-PCR para indicar real time PCR, pero este acrnimo es
poco adecuado, pues se confunde con la PCR con transcriptasa inversa, descrita a continuacin.)
Las razones por las que la PCR tradicional no es cuantitativa comprenden, a grandes rasgos, la baja
detectabilidad y la poca proporcionalidad de la seal propias de los mtodos empleados para revelar el
DNA (tradicionalmente, la tincin de los geles de electroforesis con etidio, un intercalante, pg. 141) y la
tendencia de la reaccin a saturarse en los ciclos finales (por agotamiento de los sustratos, inhibicin por los
productos finales y degradacin de stos, entre otros factores). El planteamiento cintico de la qPCR consiste en
medir no la cantidad de producto formado al final, sino la velocidad a la que se est formando en momentos
moderadamente tempranos de la reaccin. En concreto, se observa la fase en la que la reaccin es an
exponencial por tanto, mantiene la proporcionalidad respecto a la cantidad inicial de DNA y se cuantifica
el nmero de ciclos que han sido necesarios para alcanzar una cantidad prefijada de DNA producto. Cuanto
mayor sea la abundancia en la muestra, antes se alcanzar la cantidad prefijada.
La cuantificacin depende de un compuesto que se una al DNA bicatenario, producto de la reaccin de
amplificacin. Habitualmente se utilizan fluorocromos (bien intercalantes o bien ligandos en el surco menor,
con mejor detectabilidad que el etidio) que se unen muy preferentemente al DNA bicatenario e incrementan de
forma notable su fluorescencia. De forma automatizada, prcticamente en continuo, se mide la intensidad
de fluorescencia en cada muestra al finalizar cada ciclo de amplificacin, como ndice del nmero de copias
conseguidas. Obviamente, esta determinacin no es demasiado selectiva, pues es independiente de la secuencia
del DNA y no permite diferenciar si ese DNA bicatenario corresponde efectivamente a la amplificacin
selectiva del DNA diana. Por ello, se ha desarrollado una segunda generacin de mtodos de deteccin basados
en el uso de sondas de hibridacin (Captulo 12), dirigidas contra una secuencia interna del DNA diana. Tras la
etapa de desnaturalizacin de cada ciclo la sonda hibrida con el DNA amplificado. Puesto que es preciso
diferenciar la fluorescencia de la sonda unida al DNA diana de la que posee la sonda libre, se han diseado
diversas estrategias para asegurar que la sonda libre no muestre seal.
205
206
14:4
14.5.2 RT-PCR: amplificacin de RNA

El nombre, "PCR con transcriptasa inversa" (iniciales de reverse transcriptase), indica que se trata de una
amplificacin de RNA (especialmente mensajero) a travs de la sntesis previa de su cDNA (DNA
complementario al RNA), que despus se amplifica por PCR. Es decir, no se obtienen copias del RNA de
partida, sino de DNA, aunque se conserva, obviamente, la secuencia de aqul.
Es el mtodo con mayor capacidad de deteccin de los disponibles para la medida de la expresin gnica in
vitro. Se utiliza preferentemente para amplificar mRNA de clulas asequibles con una expresin elevada de
ciertos genes, aunque tambin se ha aplicado al anlisis de transcritos de genes expresados en grado mnimo.
La mezcla inicial contiene todos los componentes necesarios: muestra de RNA, transcriptasa inversa, DNA
polimerasa, cebadores y dNTP. El proceso comienza (por ejemplo, 45 min a 48 C) con la sntesis de una hebra
de cDNA por la accin de la transcriptasa inversa, una polimerasa de DNA dirigida por RNA (pg. 149),
permaneciendo el cDNA unido al molde como molcula bicatenaria hbrida RNA:cDNA. En una segunda
etapa (por ejemplo, 2 min a 94 C) se desnaturaliza la molcula bicatenaria y comienza la amplificacin segn
el mecanismo de una PCR normal: la hebra de cDNA liberada acta como molde para una segunda hebra de
DNA y luego la molcula bicatenaria se amplifica en sucesivos ciclos.
14:5
Web 14.2. Tcnica RT-PCR.
207
208
En teora, basta con una molcula de RNA que est intacta entre los dos sitios de unin a los cebadores para
conseguir la amplificacin. Bajo el mismo principio, tambin puede amplificarse RNA usando la
polimerasa Tth (tambin termoestable, aislada de la bacteria termfila Thermus thermophilus), que contiene
al mismo tiempo actividades DNA polimerasa y transcriptasa inversa.
14.5.3 PCR con "comienzo en caliente"

Esta modificacin (hot start PCR) consiste en privar a la mezcla de reaccin de alguno de sus componentes
(frecuentemente la polimerasa) hasta que se haya alcanzado una temperatura superior a la de hibridacin. De
este modo, se evita la elongacin de cebadores que hayan podido asociarse al comienzo con poco rigor (a
secuencias parcialmente homlogas con la diana) y, como resultado, se aumenta de manera sealada la
especificidad de la amplificacin.
14.5.4 PCR "larga"

Denominada L-PCR (Long PCR) o LA-PCR (Longer and Accurate PCR, "PCR ms larga y exacta"), su
objetivo es superar los lmites de la PCR convencional para amplificar con fidelidad regiones diana de gran
tamao (entre 5 y 40 kb). El principal factor limitante es la ausencia de actividad correctora de pruebas en la
polimerasa Taq (pg. 202), por lo que se aade una cantidad menor de otra enzima con capacidad de
correccin de pruebas (por ejemplo, la Pfu) para contrarrestar la carencia de esta actividad y, al mismo tiempo,
seguir aprovechando la eficacia de elongacin de la polimerasa principal (Taq o similar).
14.5.5 PCR "anidada"

La especificidad puede aumentarse realizando una segunda reaccin de PCR, con dos cebadores nuevos que
hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par, lo que da lugar a productos de PCR ms
cortos, pero ms especficos. Las copias correctas de la primera diana contendrn ambas secuencias complementarias a los nuevos cebadores, a diferencia de los productos no especficos generados en la primera PCR
(que se observan en la electroforesis como varias bandas o una banda difusa) que, por ello, no resultarn
amplificados en la segunda. Este mtodo tambin sirve para aumentar el factor de amplificacin conseguido, al
suponer dos rondas de amplificacin.
14:6
14.5.6 PCR inversa

Esta variante se emplea para clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocidas. Es decir, en lugar de amplificar la regin interna, flanqueada por los dos cebadores (PCR
convencional), se amplifica la regin externa, que flanquea a los cebadores. Para ello es necesario cortar el DNA
a ambos lados de la regin diana con una enzima de restriccin (pg. 212), de tal forma que los extremos
cohesivos resultantes puedan hibridar entre s, formando una molcula circular. sta se cierra mediante una
ligasa y se realiza la PCR con cebadores que hibridan con los extremos 5 de la secuencia conocida, por lo que la
elongacin se extender alrededor del crculo. Se generan copias de un DNA lineal delimitado, como en la PCR
normal, por la posicin de ambos cebadores.
Web 14.3. Tcnica de PCR inversa.
14.5.7 PCR con adaptadores

Tambin puede amplificarse una regin de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de
restriccin unos adaptadores, oligonucletidos sintticos con extremos cohesivos (pg. 215) compatibles
con los generados en la muestra. A continuacin, una vez desnaturalizados, se aaden cebadores especficos
para las secuencias 3 de los adaptadores. Se amplifica as el conjunto de adaptadores y secuencia diana, pero
debe sealarse que se amplifican por igual todos los fragmentos de restriccin presentes, no slo uno.
14:7
Web 14.4. Tcnica de PCR con adaptadores.
14.5.8 PCR asimtrica

En este caso, se trata de generar copias monocatenarias de un DNA. En la variante ms simple, se aaden
cantidades muy diferentes de ambos cebadores, de modo que tras los primeros ciclos de PCR uno de ellos se
agota y, disponibles ya suficientes copias del DNA diana, slo una de sus hebras sigue amplificndose gracias al
cebador ms abundante.
209
CAPTULO 15
Clonacin celular:
tecnologa del DNA recombinante
15.1 MANIPULACIN EXPERIMENTAL DE MOLCULAS

DE DNA
15.1.1 Introduccin a las nucleasas
15.1.2 Enzimas de restriccin
15.1.2.1 Caractersticas generales
15.1.2.2 Papel biolgico del sistema
metilacin-restriccin
15.1.2.3 Accin de las enzimas de restriccin
de tipo II
15.1.3 Ligasas
15.2 CLONACIN CELULAR DE MOLCULAS DE DNA
15.2.1 Objetivos de la clonacin de DNA
15.2.2 Descripcin global del proceso de clonacin
15.2.3 Preparacin del DNA para su clonacin
15.2.3.1 Insertos de DNA
15.2.3.2 Insertos de DNA complementario
procedente de un mRNA
15.2.4 Preparacin del vector de clonacin
211
212
212
212
213
215
218
219
219
219
221
221
222
223
15.2.5 Formacin de la molcula de DNA recombinante

15.2.6 Tipos de vectores
15.2.6.1 Plsmidos
15.2.6.2 Bacterifagos
15.2.6.3 Csmidos
15.2.6.4 Cromosomas artificiales
15.2.7 Incorporacin del DNA recombinante a la clula
anfitriona
15.2.7.1 Tipos de clula anfitriona
15.2.7.2 Mtodos de introduccin del DNA
recombinante
15.2.8 Propagacin en cultivo
15.2.9 Deteccin y seleccin de los clones recombinantes
15.2.10 Expresin gnica
15.3 GENOTECAS
15.3.1 Genotecas genmicas
15.3.2 Genotecas de DNA complementario
225
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230
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238
Continuando la descripcin de la clonacin molecular, o clonacin de molculas de cido nucleico, se aborda

en este captulo la tcnica que permite amplificar el DNA aprovechando la capacidad de replicacin propia
de las clulas. Por ello, se trata de una clonacin celular, en el sentido ya definido previamente: clonacin
con clulas.
El mtodo clsico de clonacin de cidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las clulas para
replicar el DNA. Surge gracias a la aparicin de las tcnicas que permiten el aislamiento del DNA y al
descubrimiento en la dcada de 1970 de las enzimas de restriccin, que hacen posible, en el laboratorio, cortar
el DNA de modo controlado e incorporar los fragmentos a vectores, que, a su vez, se introducen en clulas
anfitrionas, en las que tiene lugar su replicacin. Aunque, en principio, esta tecnologa slo se planteaba para
clonar el DNA, existen hoy da variantes que extienden su aplicacin al RNA.
15.1 MANIPULACIN EXPERIMENTAL DE MOLCULAS DE DNA

Antes de describir el proceso de clonacin del DNA, es necesario estudiar con cierto detenimiento las enzimas
que permiten en el laboratorio la manipulacin experimental de las molculas de DNA. El descubrimiento,
caracterizacin y purificacin de estas enzimas hoy en da disponibles de forma comercial como un reactivo
ms fue lo que defini el concepto de ingeniera gentica en general y, en particular, las tcnicas del DNA
recombinante. En una analoga informal, pero intuitiva, se han comparado estas enzimas con tijeras y pegamento moleculares. Para cortar molculas de cido nucleico se emplean las nucleasas, que son fosfodiesterasas
especficas para hidrolizar el enlace entre dos nuclesidos; de entre ellas, las ms tiles con mucho son las
enzimas de restriccin. Por otra parte, para unir molculas de cido nucleico se utilizan las ligasas, que
restablecen el enlace fosfodister.
Se comenzar con el estudio de las propiedades y caractersticas de las endonucleasas de restriccin. Aunque
estas enzimas desempean una funcin propia en las clulas procariotas en las que se descubrieron, son
211
212
particularmente importantes por su empleo experimental, de inters tanto bsico como aplicado al diagnstico
clnico. Adems de su uso en la clonacin molecular, se aplican en otras tcnicas, como la secuenciacin
del genoma y el estudio de los polimorfismos (v. Captulos 16 y 24). Antes de abordar estas enzimas se plantea
un breve resumen de las nucleasas en general.
15.1.1 Introduccin a las nucleasas

Se denomina de forma genrica nucleasa a cualquier enzima que hidroliza cidos nucleicos; ms concretamente, que tiene capacidad de escindir los enlaces fosfodister de la cadena polinucleotdica. Pertenecen,
por tanto, a la categora de las fosfodiesterasas.
La caracterstica ms relevante es su especificidad, que puede analizarse con respecto a varios criterios:
1. Posicin del corte con respecto a la cadena. Las endonucleasas hidrolizan enlaces entre nucletidos internos,
mientras que las exonucleasas separan nucletidos terminales.
2. Posicin del corte con respecto al fosfato. Actan slo sobre uno de los dos enlaces ster que forman el
fosfodister (lado 3 o lado 5).
3. Reconocimiento de molculas mono- o bicatenarias, o bien de cadenas formadas por ribonucletidos o por
desoxirribonucletidos (desoxirribonucleasas o DNasas; ribonucleasas o RNasas), o incluso de cadenas
hbridas DNA:RNA.
4. Reconocimiento de nuclesidos especficos a travs de su base nitrogenada.
Web 15.1. Clasificacin de las nucleasas y ejemplos.
15.1.2 Enzimas de restriccin

15.1.2.1 Caractersticas generales
Las enzimas de restriccin se denominan tambin nucleasas de restriccin, endonucleasas de restriccin y,
en ocasiones, enzimas restrictivas o restrictasas. Pertenece a este grupo una gran diversidad de endodesoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias. Se dispone hoy comercialmente de un
gran nmero de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza.
Se nombran con tres letras tomadas del gnero y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente,
seguidas a veces por una letra ms, que identifica el serotipo (variante antignica de la bacteria) y, finalmente,
por un nmero romano que las identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas
con distinta especificidad:
15:1
La importancia de las enzimas de restriccin radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia
corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodister en cada hebra, siempre en la misma posicin.
Cada enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restriccin, o secuencia
diana. Los fragmentos de DNA resultantes son tiles para iniciar la clonacin celular o acelular, para el
anlisis del DNA, para elaborar mapas fsicos de restriccin (pg. 248) o para la deteccin de polimorfismos
(pg. 420).
213
15. Clonacin celular: tecnologa del DNA recombinante
Las diversas enzimas de restriccin se suelen agrupar en tres familias, de acuerdo con sus propiedades:
Endonucleasas de restriccin
Tipo I
Tipo II
Tipo III
Endonucleasa y metilasa
en una misma protena
(en distintas subunidades)
Endonucleasa (metilasa
en una protena
independiente)
Endonucleasa y metilasa
en una misma protena
(en distintas subunidades)
ATP, Mg2+, SAM (*)
Mg2+
ATP, Mg2+, SAM (*)
Estructura proteica
3 subunidades:
S reconocimiento,
R restriccin, M metilacin
1 subunidad, aunque acta

como homodmero
2 subunidades:
MS reconocimiento y
metilacin, R restriccin
Sitio de
reconocimiento
No palindrmico, dos partes

separadas
(p. ej.: TGA(N)8TGCT)
Palindrmico (4-8 pb) (**)
No palindrmico
Punto de corte
Corta las 2 hebras en puntos

cercanos entre s,
poco especficos, a unos
1.000 pb del sitio
de reconocimiento
Corta las 2 hebras en puntos

equivalentes, muy especficos,
dentro de la secuencia de
reconocimiento
Corta las dos hebras en

puntos distantes entre s
2 o 3 nt, situados a
24-26 pb del sitio
de reconocimiento
Punto de metilacin
Dentro de la secuencia
de reconocimiento.
En ambas hebras
Adenina o citosina muy

especficas dentro de la
secuencia de reconocimiento.
En ambas hebras
Adenina dentro
de la secuencia de
reconocimiento.
En una sola hebra
Inters en ingeniera
gentica
No
No
Eco K, Eco B ...
Numerosos (***)
Eco PI, Eco P15, Hinf III

Actividad
enzimtica
Coenzimas
o cosustratos
Ejemplos
(*)SAM: S-adenosilmetionina, vase pg. 214

(**)Palndromo no interrumpido, vase pg. 52
(***)Vase pg. 216
Nos concentraremos en el estudio de las enzimas de tipo II pues, al cortar en un punto muy definido dentro
de su secuencia diana, son las utilizadas como herramientas en ingeniera gentica.
15.1.2.2 Papel biolgico del sistema metilacin-restriccin

La existencia natural de las nucleasas de restriccin en muchas bacterias ofrece a stas un mecanismo de defensa
contra la entrada de material gentico de otro organismo, concretamente de virus bacterifagos (cuya
reproduccin depende de la maquinaria gentica de la bacteria): se trata de los sistemas de restriccinmodificacin o metilacin-restriccin. Para cada enzima de restriccin, una metilasa reconoce la misma
secuencia que constituye el sitio de restriccin y une covalentemente grupos metilo a determinadas bases
del DNA en dicha secuencia. En el caso de enzimas de tipo II, la metilasa es una protena independiente,
mientras que las de tipo I y III poseen las actividades nucleasa y metilasa en su molcula oligomrica, como
subunidades que actan de forma coordinada (v. la tabla anterior).
El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria se metila de una forma especfica,
caracterstica de cada especie bacteriana, en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por
la metilasa de esa especie. La metilacin de las bases impide la unin de la enzima de restriccin, con lo que
el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la clula DNA de otro organismo, no metilado o
con un patrn de metilacin diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restriccin, ya que
carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma
habr un cierto nmero de secuencias de 4, 6 u 8 pb iguales a la reconocida por la enzima, luego habr
secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo de accin combinada surgi precisamente el nombre
de enzimas de restriccin: la accin de la nucleasa restringe la posibilidad de infeccin por virus.
214
15:2
Si est metilada una sola hebra del DNA, el sitio no es reconocido por la enzima de restriccin, pero s por
la metilasa, que aade el grupo metilo a la otra hebra. Esto es lo que ocurre, por ejemplo, al final de la
replicacin, cuando el DNA bicatenario est formado por una hebra molde preexistente y, en consecuencia,
metilada y otra hebra recin sintetizada, que an carece de grupos metilo. Esta accin de las metilasas asegura
que todo el DNA destinado a las dos clulas hijas quede metilado lo antes posible.
La metilacin del DNA afecta principalmente a citosinas y adeninas de la secuencia reconocida. En la
reaccin, las metilasas utilizan como donador del grupo metilo el compuesto S-adenosilmetionina (pg. 19).
15:3
Debe adelantarse que la metilacin del DNA interviene en eucariotas como un mecanismo de regulacin
de la expresin gnica, aunque este proceso no tiene nada que ver con el mecanismo de proteccin que
desempean los sistemas metilasa-restrictasa en procariotas. Esencialmente, en eucariotas los genes tienden a
estar desmetilados en los tejidos donde se expresan y metilados donde no se expresan, en especial en las
regiones de DNA denominadas islotes CpG, por tener esta secuencia dinucleotdica en la que C sufre la
metilacin. Este mecanismo es parte importante de lo que se conoce como regulacin epigentica del genoma
(pg. 282).
15.1.2.3 Accin de las enzimas de restriccin de tipo II

Son stas las restrictasas de estructura ms simple y las mejor estudiadas por su utilidad en ingeniera gentica
para el corte del DNA. El sitio de restriccin es una secuencia palindrmica (pg. 51) y ejerce a un tiempo de
lugar de reconocimiento y de hidrlisis. Se hidrolizan de forma muy especfica enlaces fosfoster del DNA, uno
en cada hebra, generndose dos fragmentos de restriccin. El enlace hidrolizado es siempre el 3-P (es decir, son
endonucleasas del tipo a, web 15.1), por lo que el fosfato queda unido a 5, dejando en ambos fragmentos
extremos 3-OH y 5-P. La reaccin no necesita ATP, lo que la diferencia de la catalizada por las enzimas de los
tipos I y III.
15:4
215
216
Algunas enzimas de restriccin de tipo II empleadas en ingeniera gentica
Nombre
de la enzima
Acc 65I
Alu I
Bam HI
Bgl II
Bacteria de origen
Secuencia reconocida
y puntos
de corte ( / \ )
(N = cualquier
nucletido)
Acinetobacter
calcoaceticus 65
-G/G-T-A-C-C-C-C-A-T-G\G-
Cohesivos,
saliente 5
Arthrobacter
luteus
-A-G/C-T-
Romos
Bacillus
amyloliquefaciens H
-G/G-A-T-C-C-
Bacillus globigii
-A/G-A-T-C-T-
Hae III
Hin dIII
Kpn I
Mbo I
-C-C-T-A-G\G-
Pst I
Pvu II
Cohesivos,
saliente 5
-A
-G
cohesivos,
saliente 5
Haemophilus
aegyptius
-G-G/C-C-
Romos
Haemophilus
influenzae Rd
-A/A-G-C-T-T-
Klebsiella
pneumoniae OK8
-G-G-T-A-C/C-
Moraxella bovis
-N/G-A-T-C-N-
-C-C\G-G-
Tth 111I
15:5
-T-C-T-A-Gp
-C-T-T-A-Ap
-G-G
-C-Cp
-A
Cohesivos,
saliente 3
-G-G-T-A-C
Cohesivos,
saliente 5
-N
Cohesivos,
saliente 5
-G-C
Cohesivos,
saliente 3
-C-T-G-C-A
Cohesivos,
saliente 3
-C-G-A-T
-G-C\T-A-G-C-C-A-G/C-T-G-
Romos
-C\C-A-T-G-G-
-G-C/G-G-C-C-G-C-
Providencia stuartii
-C-T-G-C-A/G-
-C-G-C-C-G-G\C-G-
-C-G-A-T/C-G-
-G-T-C\G-A-C-
Sau 3AI
-C-C-T-A-Gp
Cohesivos,
saliente 5
-T-T-C-G-A\A-
Nocardia otitidiscaviarum
Proteus vulgaris
-A-G -T-Cp
-G
-C-T-T-A-A\G-
Proteus vulgaris
-C-C-A-T-Gp
Cohesivos,
saliente 5
-G/A-A-T-T-C-
-G\A-C-G-T-C-
Pvu I
-G
Staphylococcus
aureus 3A
-N/G-A-T-C-N-
Thermus
thermophilus
strain 111
-G-A-C-N/N-N-G-T-C-
-N-C-T-A-G\N-C-T-G-N-N\N-C-A-G-
pG-T-A-C-CGpC-TG-A-
Escherichia coli
RY13
-N-C-T-A-G\N-
Not I
Productos resultantes de la escisin
-T-C\G-A-
-T-C-T-A-G\A-
Eco RI
Tipo de
extremos
-T-T-C-G-Ap
-Cp
-N-C-T-A-Gp
-C-G-C-C-G-Gp
-Gp
-G-Cp
-C-A-G
-G-T-Cp
Cohesivos,
saliente 5
-N
Cohesivos,
saliente 5
-G-A-C-N
-N-C-T-A-Gp
-C-T-G-N-Np
pG-A-T-C-CGpG-A-T-C-TApA-A-T-T-CGpC-CG-GpA-G-C-T-TApCC-A-T-G-GpG-A-T-C-NNpG-G-C-C-G-CC-GpGA-C-G-T-CpC-GT-A-G-CpC-T-GG-A-CpG-A-T-C-NNpN-N-G-T-CN-C-A-G-
Puede observarse que, en todos los casos, los extremos de los dos fragmentos generados son idnticos,
tienen la misma secuencia (puede comprobarse girando 180 uno de ellos). Esto es consecuencia de la
simetra del palndromo y de la posicin tambin simtrica de los puntos de corte en cada hebra. Todo ello
se debe a que la enzima acta en forma de dmero, por tanto reconociendo una misma secuencia y cortando
un mismo tipo de enlace en las dos hebras: por ejemplo, Eco RI corta el enlace (5) GAATTC (3) en
ambas hebras.
Web 15.2. Frecuencia de corte y tamao de los fragmentos de restriccin.
La formacin de extremos cohesivos es de gran inters aplicado en ingeniera gentica (pg. 225), pues
fragmentos generados con una misma restrictasa a partir de dos DNA distintos pueden interaccionar mediante
el emparejamiento de las bases de sus extremos cohesivos (dicha interaccin no es posible entre extremos
romos). Asimismo, pueden asociarse los fragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles.
Debe resaltarse que el producto de la reasociacin de los dos fragmentos en ninguno de los casos
es idntico al DNA de partida, ya que est formado por dos molculas. La falta de enlace covalente entre
los extremos de los fragmentos reasociados se indica con el nombre de mella o muesca (en ingls, nick,
pg. 218). sta se puede cerrar o sellar por la accin de las enzimas ligasas (o DNA ligasas), dando una
molcula bicatenaria nica. Como se ver a continuacin, las ligasas catalizan la formacin en cada hebra
del enlace fosfoster que faltaba, con consumo de energa. Pueden, incluso, unir o ligar dos fragmentos
de DNA con extremos romos, aunque con mucha menor eficacia, pues no hay emparejamiento entre ellos
que los asocie previamente.
15:6
217
218
15.1.3 Ligasas
Las ligasas, o DNA ligasas, desempean su funcin en las clulas durante el proceso de replicacin, entre otros.
Su capacidad para catalizar la unin de cadenas de DNA es de particular relevancia en la sntesis de la hebra
retardada de DNA, cuyos fragmentos de Okazaki deben unirse entre s (pg. 158). Por otra parte, la
experimentacin con cidos nucleicos aprovecha esta actividad enzimtica como herramienta de uso frecuente,
para conectar molculas de DNA, en una actuacin formalmente opuesta a la de las nucleasas.
La reaccin de las ligasas requiere la presencia de un grupo fosfato en el extremo 5 de una hebra de DNA y
un grupo OH en el extremo 3 de la otra. Estas enzimas catalizan, pues, la formacin de un solo enlace
fosfoster, parte del fosfodister resultante. El mecanismo qumico de la reaccin es el siguiente:
15:7
La accin de las ligasas es, por tanto, contraria a la de las nucleasas (formacin de enlace fosfoster frente a
su hidrlisis), pero el mecanismo de la reaccin no es exactamente opuesto, debido al requerimiento energtico
de las primeras. Debe resaltarse que la ligasa siempre requiere un grupo 5-P para su actuacin, propiedad sta
que posee utilidad experimental (pg. 226).
15.2 CLONACIN CELULAR DE MOLCULAS DE DNA

15.2.1 Objetivos de la clonacin de DNA
Como se ha presentado en los dos captulos precedentes, la clonacin cumple el propsito bsico de amplificar
la muestra gentica de partida, generando un nmero elevado de copias. Para el caso de la clonacin
de molculas de cido nucleico, a la mera amplificacin se aaden las aplicaciones derivadas de la expresin
de su producto gnico. La clonacin acelular por PCR cubre bsicamente el primero de dichos objetivos,
mientras que la clonacin celular permite, adems, abordar el segundo.
15:8
15.2.2 Descripcin global del proceso de clonacin

El objetivo central de esta clonacin es la produccin de un gran nmero de copias de una regin de DNA
(fragmentos o genes) o de cDNA (formado a partir de un mRNA). Se trata, por tanto, de un proceso
de clonacin de tipo celular (pues se consigue gracias al empleo de clulas, pg. 192-193) que, por
contraposicin a la clonacin acelular por PCR, in vitro, se puede considerar que se realiza in vivo (estrictamente hablando, en cultivo). Se basa esta clonacin, al igual que la PCR, en la realizacin de mltiples rondas
de replicacin, pero en este caso catalizadas por la DNA polimerasa propia de la clula en la que se lleva a cabo
el proceso, clula anfitriona. Para ello, el fragmento de DNA o cDNA que debe clonarse (llamado inserto,
por razones que se comprendern despus) se une a otro DNA (vector de clonacin) y la molcula resultante
(DNA recombinante o recombinado) se incorpora a la clula anfitriona donde tiene lugar la amplificacin
por replicacin. Una vez detectada la presencia del DNA de inters y seleccionados los clones que lo han
amplificado, se asla el gen o fragmento de DNA o cDNA, que se emplea con distintos fines.
Por razones didcticas, a la vez que de enfoque experimental, puede describirse la clonacin
en siete etapas: dos de preparacin de muestras, cuatro sucesivas de clonacin propiamente dicha y, segn
los casos, una de expresin. En ocasiones, se aade la amplificacin por PCR del DNA clonado (en este caso, el
proceso comprendera dos clonaciones sucesivas, celular la primera y acelular la segunda). Hoy da, todas las
etapas se realizan de forma sistemtica, a veces incluso automatizada, al disponerse de forma comercial de las
enzimas, sustratos, vectores, etc., e instrumentos adecuados para su realizacin.
219
220
15:9
Web 15.3. Esquema y etapas de la clonacin celular de DNA.
15.2.3 Preparacin del DNA para su clonacin

Esta primera etapa de la clonacin, la preparacin inicial del cido nucleico que se quiere clonar, es una parte
esencial del proceso. Aunque por simplicidad se describe la clonacin de un solo fragmento, en la realidad es
difcil aislar un fragmento nico de DNA y, en la prctica, se clonan de manera simultnea mltiples
fragmentos que ms tarde deben seleccionarse (genotecas, pg. 236). Sin embargo, los planteamientos son
idnticos desde el punto de vista conceptual, por lo que se aborda en primer lugar la descripcin del caso
simplificado.
15.2.3.1 Insertos de DNA

Se parte de un lisado de clulas nucleadas, a partir del cual se purifica el DNA (Captulo 10). ste posteriormente se fragmenta con enzimas de restriccin, para dar lugar a una mezcla cuyo contenido, en nmero y
tamao de fragmentos, depende del nmero de sitios de restriccin y de su accesibilidad para las enzimas. En
principio, el fragmento que se va a clonar debe aislarse, o separarse del resto, mediante alguna tcnica
adecuada, por ejemplo electroforesis en gel de agarosa, centrifugacin en gradiente de densidad o cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), entre otras. En la prctica, en muchos casos es ms difcil aislar un
nico fragmento de DNA para su clonacin que clonar la mezcla de fragmentos y ms tarde seleccionar el clon
que contiene el fragmento de inters (pgs. 234-236).
Cuando se desee expresar el fragmento clonado (etapa 7) es necesario, adems, preparar un inserto auxiliar
que contenga elementos reguladores de la expresin gnica (salvo que dichos elementos estn ya preincorporados en el vector empleado).
15:10a
221
222
15:10b
15.2.3.2 Insertos de DNA complementario procedente de un mRNA

En muchos casos interesa clonar la secuencia codificante de un gen eucaritico, para lo cual se parte de muestras
de mRNA que debe convertirse en el cDNA correspondiente para poder clonarse.
En este caso no es indiferente la eleccin de las clulas de partida, pues cada tipo celular expresa un
conjunto de protenas diferente y, por consiguiente, no contiene los mismos mRNA. Una vez lisadas las
clulas del rgano, tejido, tipo celular, estadio de desarrollo, etc., elegidos, se purifica el mRNA, generalmente aprovechando la presencia en su molcula de la cola de poli(A) (pg. 302). Se emplea para ello
cromatografa de afinidad en columna o microesferas magnticas de afinidad (pg. 138); en ambos casos,
la matriz cromatogrfica o la microesfera magntica llevan unido un oligo(dT). Cuando el mRNA que va a
clonarse no es abundante, puede amplificarse mediante PCR, lo que facilita su clonado posterior en clulas.
Para preparar el cDNA se emplea la transcriptasa inversa, de forma anloga a lo estudiado en la RT-PCR
(pg. 208):
15:11
15.2.4 Preparacin del vector de clonacin

El vector es un portador, una molcula de DNA cuya misin es unirse con el fragmento de DNA que se quiere
clonar para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacin. En general, el vector tiene un tamao
pequeo, es fcil de aislar y caracterizar, se conocen su secuencia y su mapa de restriccin (pg. 248), es fcil de
introducir en la clula anfitriona y una vez all posee capacidad de replicacin autnoma, es decir, independiente de la replicacin del genoma de la clula anfitriona. Es conveniente que el vector posea la mayor variedad
posible de sitios de restriccin, para facilitar su unin con el fragmento de DNA que se quiere clonar,
y que incluya al menos un gen marcador (por ejemplo, un gen de resistencia a un antibitico) que permita
223
224
identificar o seleccionar las clulas que llevan el DNA recombinante (pg. 234). Lo comn es que los vectores
naturales no posean todas estas caractersticas, por lo que habitualmente se emplean vectores modificados (a su
vez, obtenidos por tcnicas de DNA recombinante, pero ya disponibles comercialmente con todas las prestaciones deseadas).
Para poder unir con facilidad el vector con el fragmento de DNA que se quiere clonar (llamado entonces
inserto) se debe cortar el vector con las mismas enzimas de restriccin que se utilizaron para escindir el DNA
de la muestra, o bien con enzimas que proporcionen extremos compatibles; de ese modo, sus secuencias
complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa, dando lugar a una sola molcula de DNA
bicatenario, que recibe el nombre de DNA recombinante (rDNA).
En funcin de los objetivos de la clonacin (amplificacin y expresin), se suele hablar de dos grandes grupos
de vectores. Por un lado, los vectores de clonacin, que se emplean nicamente para amplificar el DNA de inters;
tambin se denominan a veces vectores de insercin o vectores de propagacin. Tericamente, slo incorporaran
el inserto de inters (pg. 221). Por otro lado, se encuentran los vectores de expresin, que poseen, adems,
caractersticas que facilitan la expresin del DNA de inters por parte de la clula anfitriona. En este caso deber
incorporarse, adems del DNA que se quiere clonar, el ya mencionado inserto auxiliar que proporciona una
regin de control de la expresin (pg. 222). En la prctica, los vectores de expresin comerciales suelen incluir ya
una regin de control, comnmente un promotor potente que se induce fcilmente bajo condiciones experimentales controlables, vlido para expresar cualquier inserto de inters que se site tras l en el rDNA.
Aunque existen diversos tipos de vectores (pg. 226), por ahora la descripcin se har con un ejemplo
sencillo, un plsmido, molcula pequea de DNA circular.
15:12
15.2.5 Formacin de la molcula de DNA recombinante

El DNA que sufre la clonacin se denomina recombinante porque combina dos fragmentos de DNA
de orgenes diferentes. Su preparacin consiste en la unin covalente, in vitro, del inserto de DNA al vector
cortado, empleando una ligasa. La especificidad de dicha unin depende del tipo de extremos que hayan
resultado al preparar el inserto y el vector: si son cohesivos, su secuencia es la especfica de la enzima
de restriccin empleada y slo se asocian los extremos compatibles (pg. 216); una vez asociados por emparejamiento de bases, la ligasa establece la unin covalente sellando las dos mellas. Si se trata de extremos romos,
no pueden asociarse previamente, pero la ligasa los puede unir, aunque con menor eficacia, y no supone
ninguna diferencia la enzima de restriccin con la que se prepararon (se puede decir que todos los extremos
romos son compatibles).
15:13
En la prctica, pueden tener lugar diversos tipos de asociacin entre fragmentos de restriccin con extremos
compatibles, y todos ellos sern fijados por la ligasa. En primer lugar, siempre puede darse la asociacin
intramolecular, es decir, entre los dos extremos de una misma molcula (vector o inserto); si se trata de
un vector circular, da lugar a su recircularizacin. Esta interaccin est favorecida cuando la concentracin
de DNA es baja (pues la probabilidad de que se encuentren dos molculas es menor). En segundo lugar, puede
tener lugar una asociacin intermolecular, tanto la que conduce al rDNA (vector inserto) como otras que
conducen a productos no deseados: vector vector, inserto inserto, unin de ms de dos molculas, etc.;
todas ellas pueden ser circulares o lineales. La probabilidad de estas interacciones aumenta al hacerlo la
concentracin del DNA.
225
226
15:14
Para evitar la formacin de estos productos secundarios, que disminuye el rendimiento de la clonacin, se
acude a estrategias experimentales, previas a la mezcla de vector e inserto, como la escisin con dos enzimas
de restriccin diferentes (ya expuesta, pg. 224), que evita la recircularizacin del vector o, como se describe a
continuacin, la desfosforilacin del vector con fosfatasa alcalina.
15:15
15.2.6 Tipos de vectores

Los vectores empleados para la clonacin de insertos de DNA son muy variados. Pueden clasificarse segn
varios criterios, tales como:
Su procedencia procaritica o eucaritica.
El tamao de inserto que admiten.
227
El tipo de molcula a partir de la que se preparan:

Plsmidos: bacterianos, de levadura o de plantas.
Virus: que infectan bacterias (bacterifagos o simplemente fagos), plantas, invertebrados o vertebrados.
Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosmicos de fagos (PAC), de bacterias (BAC)
o de levaduras (YAC).
Quimeras, es decir, molculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es diferente. Normalmente, quimeras de plsmido y fago: csmidos, fagmidos, fsmidos.
El
tipo de clula anfitriona en la que se puede luego incorporar el DNA recombinante producido
(etapa 4).
El gen de resistencia incluido en el vector para su posterior deteccin o seleccin (etapa 6).
Tipo de vector
Tamao del inserto

que admite
Mtodo de propagacin
Plsmidos normales
0-10 kb
Replicacin autnoma natural del plsmido
Bacterifagos, por insercin (fago l)
0-10 kb
Replicacin propia del fago
Bacterifagos, por sustitucin (fago l)
9-23 kb
Replicacin propia del fago
Csmidos
30-44 kb
Replicacin a modo de plsmido
Bacterifago P1
70-100 kb
PAC (cromosomas artificiales de P1)
130-150 kb
BAC (cromosomas artificiales de bacteria)
Hasta 300 kb
YAC (cromosomas artificiales de levadura)
0,2-1 Mb
Adems, debe sealarse que continuamente surgen nuevos tipos de vectores como consecuencia del avance
en las tcnicas de ingeniera gentica y las necesidades impuestas por el desarrollo acelerado de los proyectos
genoma.
15.2.6.1 Plsmidos
Son molculas de DNA bicatenario, de pequeo tamao (de 2 a 5 kb) y estructura circular cerrada, presentes
en forma libre en el citosol de numerosas bacterias (de 1 a 3.000 plsmidos/clula) y de algunos eucariotas
unicelulares (por ejemplo, el plsmido m de levaduras, que tambin recibe el nombre de crculo de 2 mm).
Se purifican fcilmente a partir del cultivo celular. Permiten la incorporacin de insertos de DNA de hasta
10 kb, aproximadamente. Los plsmidos naturales contienen pocos genes propios, ninguno esencial para la
viabilidad de la clula, por lo que pueden ser modificados sin afectarla. Para su replicacin autnoma
(independiente de la del cromosoma bacteriano, aunque utilizando las mismas enzimas), se requiere una
secuencia origen de replicacin. Mientras que en cada divisin celular se produce una sola copia del
cromosoma por cada clula hija, el plsmido (en su caso, el rDNA formado a partir de l, etapa 3) sufre
replicaciones mltiples y origina varias copias por clula (entre 20 y 50). Los plsmidos son as replicones
(unidades de replicacin, pg. 153) que se transmiten y mantienen de manera estable como crculos
extracromosmicos.
El empleo de un plsmido como vector de clonacin se favorece cuando incluye genes marcadores, cuya
presencia pueda detectarse o cuya expresin confiera a la clula anfitriona portadora del rDNA alguna
propiedad especial (pg. 234). Por ello, se suelen utilizar plsmidos artificiales o sintticos, obtenidos a
su vez por tcnicas de DNA recombinante y disponibles comercialmente. Baste como ejemplo el plsmido
pUC19.
228
15:16
15.2.6.2 Bacterifagos
Los virus en general se replican mediante la introduccin de su genoma en clulas procariticas o
eucariticas (infeccin). Esta propiedad biolgica resulta til para conseguir una alta eficiencia de
clonacin, empleando como vectores virus modificados. Cada especie de virus infecta a clulas especficas
y, dependiendo del tamao del genoma vrico, admite insertos ms o menos grandes, pero en general
mayores que los que se pueden insertar en plsmidos. As, se usan bacterifagos para clonar en bacterias,
baculovirus para clulas de insecto, y virus SV40 o retrovirus para clulas de mamfero. La proliferacin de
los virus recombinantes se consigue en un cultivo de las clulas anfitrionas respectivas, en las que el virus se
reproduce. El uso de virus es especialmente adecuado para la clonacin en clulas de mamfero, por su
elevada eficacia de introduccin del rDNA, pero dada su complejidad y por razones de extensin no se
tratar en este captulo.
Los virus empleados ms comnmente como vectores son los parsitos bacterianos fago M13 y fago l
(lambda). El tamao del vector recombinante se ve limitado por la necesidad de que pueda empaquetarse
dentro de la cpsida. El inserto se puede introducir de la misma forma que para los vectores plasmdicos, es
decir, cortando inserto y DNA del fago con las mismas enzimas de restriccin y ligando para obtener un rDNA;
esto se denomina tcnica de insercin y existen vectores especficos para ella. Cuando el tamao del DNA de
inters que se quiere clonar es mayor, se puede incorporar eliminando previamente la parte del genoma vrico
que no se requiere para la infeccin y replicacin; se habla entonces de tcnica de sustitucin o reemplazamiento.
15:17
15.2.6.3 Csmidos
Son vectores sintticos, quimeras que combinan caractersticas de plsmidos y fagos para aunar ventajas
de ambos tipos de vectores. El fragmento plasmdico proporciona las caractersticas de tamao pequeo
(5-7 kb), circularidad, un origen de replicacin, algunos sitios de restriccin donde se puede insertar el DNA,
uno o ms marcadores seleccionables y la propagacin en bacterias como si fuesen plsmidos. Del fago l
se toman las secuencias cos (del ingls cohesive sites), que proporcionan al csmido la capacidad, propia
del DNA del fago, de empaquetarse en cpsidas vricas in vitro.
Los csmidos son tiles para clonar insertos de gran tamao (hasta 45 kb), en especial en la
preparacin de genotecas genmicas de organismos superiores, ya que disminuyen en gran medida el
nmero de clones necesarios para que todo el genoma est representado en la genoteca (pg. 238). Los
mtodos de introduccin del csmido recombinante (etapa 4) dependen del tamao del inserto. Si ste es
pequeo, se puede introducir por transformacin (las clulas se hacen competentes para incorporarlo en
forma de plsmido recombinante, pg. 231). Si el tamao es relativamente grande, la transformacin se
complica y debe acudirse al empaquetamiento previo en forma de fagos, aprovechando las secuencias cos.
229
230
15.2.6.4 Cromosomas artificiales

Este tipo de vectores se ha diseado en especial para adaptarse al gran tamao de insertos requeridos en el caso
del genoma humano y de otros mamferos, y para la clonacin en clulas eucariticas.
a) Cromosomas artificiales bacterianos
Suelen denominarse habitualmente BAC (bacterial artificial chromosomes). Se trata de vectores sintticos
derivados del plsmido F o del fago P1. Se caracterizan, en primer lugar, por aceptar grandes insertos de
DNA, entre 100 y 300 kb. En comparacin con otros tipos de vectores, los BAC contienen genes que reducen su
capacidad de copia, es decir, de replicacin en la clula anfitriona del rDNA formado (etapa 4). Como
resultado, se consigue mayor estabilidad de los insertos de DNA de origen eucaritico, que en csmidos sufren
con frecuencia reordenamientos internos. Gracias a estas dos caractersticas, los BAC son vectores adecuados
para la elaboracin de genotecas eucariticas (pg. 236).
b) Cromosomas artificiales de levadura
Los YAC (yeast artificial chromosomes) son vectores sintticos que contienen las tres regiones relacionadas con la funcionalidad de un cromosoma (pg. 93): secuencias constituyentes de un centrmero,
de dos telmeros y de un origen de replicacin. Adems, incorporan en general genes marcadores
seleccionables (etapa 6) y un sitio de clonado mltiple (etapa 2) en el que admiten un inserto de gran
tamao, que puede alcanzar 1 Mb, lo que constituye una caracterstica fundamental. En ocasiones, este
tipo de vectores se denominan ARS/CEN/TEL, por los 3 tipos de secuencias que contienen. La secuencia
centromrica permite la segregacin correcta de las copias hijas del cromosoma durante la divisin de la
clula (pg. 101), mientras que los telmeros estabilizan, como ya se ha estudiado, los cromosomas a lo
largo de sucesivas divisiones (pg. 158). El origen de replicacin o secuencia de replicacin autnoma
(ARS, autonomously replicating sequence) permite la formacin de copias del cromosoma artificial de
forma independiente a la del genoma propio de la clula anfitriona. Los YAC se utilizan en particular
para preparar genotecas de genomas muy grandes, o para mantener un gen completo en un nico clon.
15.2.7 Incorporacin del DNA recombinante a la clula anfitriona

La replicacin de las molculas de rDNA (clonacin) requiere que stas se introduzcan en una clula
anfitriona (receptora, hospedadora u hospedera; el trmino clula husped, usado con frecuencia, no
transmite inequvocamente el significado). Para que esta incorporacin, que en general tiene lugar por
mecanismos poco conocidos, sea eficaz es preciso emplear clulas especializadas (con un genotipo
seleccionado), adecuadas para el vector de clonacin utilizado y con capacidad para dividirse rpidamente.
15.2.7.1 Tipos de clula anfitriona

Con frecuencia, las clulas anfitrionas son procariticas, principalmente cepas de E. coli, porque son fciles de
obtener, manipular y multiplicar, y porque se conocebien sugentica. El proceso de introduccin del rDNA
plasmdico se denomina transformacin (pg. 231). La o las molculas de rDNA plasmdico incorporadas se
replican luego varias veces dentro de la clula, de acuerdo con las propiedades naturales de los plsmidos. El
inserto de DNA puede permanecer unido al plsmido (lo ms frecuente) o recombinarse con el DNA del
cromosoma. Si se integra en el vector ms de un tipo de DNA por ejemplo, dos genes o un gen y un regulador
de la transcripcin el proceso de incorporacin del rDNA a la clula anfitriona recibe el nombre de
cotransformacin.
Las clulas anfitrionas eucariticas son ms difciles de preparar y mantener, por lo que slo se utilizan con
fines especficos, fundamentalmente para el anlisis de la regulacin gnica, la expresin de una protena
eucaritica, etc. De entre ellas, las ms manejables en cultivo son las levaduras que, aunque mantienen algunas
caractersticas similares a procariotas (clulas individuales, crecimiento rpido y econmico, manipulables,
etc.), tienen una organizacin celular propia de eucariotas y son de inters biotecnolgico por su capacidad
de expresin y maduracin de protenas.
Entre las clulas animales que pueden establecerse en cultivo, se pueden citar las clulas HeLa de carcinoma
epidrmico humano, los fibroblastos NIH de ratn y BHK de rin de hmster, los oocitos de ratn, etc. En
general, pueden dividirse multitud de veces conservando los mismos caracteres, por lo que su rendimiento
de clonacin es elevado.
15.2.7.2 Mtodos de introduccin del DNA recombinante

Puesto que habitualmente la membrana plasmtica muestra una permeabilidad selectiva y no permite el
paso de las molculas de rDNA, se acude a diversos mtodos para facilitar su captacin por alteracin
transitoria de la permeabilidad celular (mtodos pasivos) o para introducir el rDNA directamente (mtodos
activos). En muchos casos, los mecanismos son poco conocidos y los mtodos resultan ms o menos
eficaces dependiendo del tipo de vector y de clula. El proceso suele denominarse transformacin o
transfeccin, aunque estrictamente el primer trmino corresponde a la introduccin en bacterias anfitrionas
y el segundo al empleo de virus como vectores. Los mtodos utilizados pueden dividirse tambin en fsicos y
qumicos.
El tratamiento ms frecuente es de tipo fsico-qumico y se dice que la clula se hace competente. Se comienza
con una incubacin en presencia de CaCl2 a 0 C, seguida de un calentamiento brusco hasta 37-43 C, lo que
induce a las bacterias a aceptar molculas de DNA. Aunque el mecanismo de este proceso no se ha podido
confirmar, posiblemente la neutralizacin de la carga del DNA por parte de los iones calcio posibilite el paso
del DNA a travs de la membrana celular. Se dispone de cepas establecidas que son especialmente susceptibles a este proceso.
La incorporacin pasiva de DNA se favorece cuando sus molculas se han agregado o coprecipitado por
interaccin con cationes, habitualmente fosfato clcico o DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano, un
polmero policatinico).
Otros agentes qumicos, en especial el polietilenglicol (PEG), aumentan la permeabilidad de la membrana
celular, con lo que se incorpora ms fcilmente el rDNA, tambin de forma pasiva.
El DNA se puede incorporar en liposomas, que luego con facilidad se fusionan con la membrana celular
y liberan su contenido al interior (incluyendo el DNA aunque, en realidad, parece ms bien asociarse a la
superficie exterior hidrfila del liposoma).
Un mtodo con elevada eficacia es el empleo de vectores de tipo vrico, que por su va natural de infeccin
introducen en la clula anfitriona su DNA, en este caso recombinante. Para este tipo de incorporacin se ha
acuado el trmino transfeccin.
Aplicando descargas elctricas en forma de pulsos breves de alto voltaje se consigue la apertura de poros
transitorios en la membrana, por los que puede pasar el rDNA. Este mtodo de electroporacin es bastante
habitual para clulas eucariticas, aunque de resultados muy variables.
Un mtodo curioso y de aplicacin creciente, la biolstica, consiste en el bombardeo de las clulas
anfitrionas con microesferas (de tungsteno u oro) recubiertas con el rDNA. Se emplean dispositivos adecuados (pistolas de genes) que impulsan esos microproyectiles mediante un gas a presin, y pueden
aplicarse sobre suspensiones celulares, clulas en cultivo o incluso in vivo (sobre la piel, hojas, etc.).
Algunos de los proyectiles impactan y penetran en las clulas, cuya membrana se resella rpidamente,
quedando el DNA incorporado en su interior.
En casos en los que la eficiencia de suministro del rDNA debe ser mxima se acude a la microinyeccin
directa del DNA en la clula o en su ncleo, empleando micromanipuladores y agujas de vidrio (microjeringas o micropipetas, de punta extremadamente fina) (pg. 194), bajo observacin al microscopio.
Obviamente, el inconveniente es el escaso nmero de clulas que se pueden tratar por este mtodo manual,
por lo que en general se utiliza slo sobre oocitos y cigotos. Dado su carcter directo, se puede incluso
prescindir del vector y suministrar el fragmento de DNA deseado sin modificar.
231
232
15:18
233
Agente promotor de la incorporacin

2+
Ca
(generalmente como fosfato)
Nombre especfico del mtodo

Transformacin, clulas competentes
DEAE-dextrano
PEG (polietilenglicol)
Carcter
Qumico
Pasivo
Qumico
Pasivo
Qumico
Pasivo
Liposomas
Lipofeccin
Fsico
Pasivo
Vectores virales
Transfeccin
Fsico
Activo
Descargas elctricas
Microproyectiles
Inyeccin directa con micropipetas
Electroporacin
Fsico
Activo
Biolstica
Fsico
Activo
Microinyeccin
Fsico
Activo
15.2.8 Propagacin en cultivo

La divisin de las clulas anfitrionas en cultivo producir, junto con la replicacin de su propio genoma,
la formacin de copias del rDNA que haya podido incorporar y, por tanto, la clonacin propiamente dicha.
El proceso de incorporacin del DNA a la clula anfitriona posee una tasa de eficacia muy baja. Esto
significa que slo una pequea fraccin de las clulas presentes incorporan rDNA y, en consecuencia, por
razones estadsticas las que lo hacen captan una nica molcula. Esto tiene dos consecuencias importantes.
En primer lugar, es esencial en la prctica aplicar mtodos de deteccin y seleccin de las clulas que han
incorporado rDNA (etapa 6). En segundo, la progenie de cada clula una colonia en el cultivo celular
contiene copias de una nica molcula de DNA: el clon celular es tambin un clon de DNA, no hay mezcla
de molculas de DNA de secuencia diferente. Es importante, pues, propagar las clulas en tal dilucin que
asegure que cada colonia est fsicamente separada del resto.
En la prctica, suele hacerse una primera siembra celular sobre una placa de agar para que crezcan las
colonias y una resiembra posterior de stas en medio lquido, en la que se forman poblaciones con mltiples
copias de cada clula original (clones celulares). Adems, dependiendo de las propiedades del vector, el rDNA
puede replicarse de forma rpida e independiente del genoma de la clula anfitriona, con lo cual el nmero
de copias del DNA recombinante es an mayor.
15:19
234
Simultneamente con esta etapa de propagacin suele tener lugar la seleccin de clones recombinantes y la
expresin opcional del gen clonado.
15.2.9 Deteccin y seleccin de los clones recombinantes

Dado el gran nmero de clulas empleadas en la clonacin, y la diversidad de productos que pueden originarse
en el proceso de formacin del DNA recombinante, es esencial poder diferenciar qu clulas (o colonias a las
que han dado lugar en cultivo) han incorporado realmente el DNA recombinante deseado. Esta deteccin se
puede combinar con una seleccin, es decir, conseguir que slo las clulas adecuadas sobrevivan en el cultivo.
Esto facilita mucho la tarea de propagacin celular, al reducir el nmero de clones que se deben seguir
cultivando. En funcin del mtodo utilizado, es posible distinguir clulas que han incorporado el vector
(recombinante o no), que han incorporado rDNA o incluso que han incorporado el rDNA con el inserto
dispuesto correctamente.
Se pueden considerar tres categoras de mtodos de deteccin:
Mtodos de hibridacin: deteccin de una secuencia del DNA clonado, o del mRNA transcrito a partir de l,
por hibridacin con una sonda marcada (pg. 170).
Mtodos inmunoqumicos: deteccin de la protena codificada por el gen clonado, mediante un anticuerpo
especfico.
Mtodos genticos o de seleccin fenotpica: en ciertos casos, la expresin del propio inserto produce
cambios apreciables en la clula anfitriona, que sirven para reflejar su clonacin con xito. Sin embargo,
la estrategia ms comn es la deteccin y seleccin basadas en la presencia de genes marcadores en el
vector:
Genes que codifican una protena detectable, habitualmente una enzima para la que se dispone de
un ensayo. Por ejemplo, la b-galactosidasa (gen lacZ de E. coli) transforma el sustrato sinttico X-gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiransido) en un producto de color azul.
Genes de resistencia a un antibitico, que codifican una protena que permite el crecimiento de la
clula anfitriona en presencia de un determinado antibitico. Por ejemplo, el gen ampr codifica una
b-lactamasa capaz de degradar la ampicilina, una penicilina semisinttica. El gen de resistencia a
tetraciclina (tetA) codifica una protena de membrana que acta como una bomba, extrayendo este
antibitico de la clula.
Genes que complementan defectos nutricionales. En este caso, se emplean cepas mutantes de la
clula anfitriona, que no pueden crecer en ausencia de un determinado nutriente. Por ejemplo,
clonando en levaduras con un defecto metablico en la ruta de biosntesis de triptfano, se emplea
un vector que contiene el gen TRP1 correcto, con lo que slo las clulas transformadas crecen en un
medio carente de Trp.
Los planteamientos experimentales son muy diversos y en general combinan varios de estos marcadores.
Por razones didcticas, se recogen unos ejemplos que ilustran el uso de varios genes marcadores, aunque no se
ajusten a la prctica real del laboratorio. Un concepto importante a este respecto es el de inactivacin
insercional, consistente en la inclusin de un policonector o sitio de clonado mltiple (pgs. 224 y 228) en
el interior de un gen marcador. Como consecuencia, la accin de ste se ejerce slo en las clulas que han
incorporado vector sin inserto.
15:20
Web 15.4. Fundamento y ejemplos del uso de genes marcadores para la deteccin y seleccin de clones.
235
236
15.2.10 Expresin gnica

En algunos casos se pretende no slo la amplificacin del DNA clonado, sino tambin su expresin, bien para
estudiar este proceso o bien para investigar o aplicar el producto (RNA o protena). sta es la gran diferencia
entre los objetivos o aplicaciones de la clonacin acelular in vitro (PCR) y la clonacin celular, que abre
la puerta a una gran rea aplicada: el uso de las protenas recombinantes. Hablamos de la posibilidad de
fabricar protenas, en cierta medida a la carta, con aplicaciones en terapia, diagnstico, sensores, detergentes, produccin de alimentos y otros muchos mbitos.
Lgicamente, el DNA clonado ser en estos casos un gen y, por ello, con frecuencia se tratar de un cDNA.
Para conseguir esta expresin se emplean vectores de expresin, distintos de los vectores de clonacin porque
presentan caractersticas que favorecen la transcripcin del gen una vez incorporado a la clula anfitriona.
Habitualmente, un vector de expresin incluye un promotor, que es una regin reguladora de la transcripcin
(pg. 288). (Si el vector no lo incluye, debe insertarse a la vez que el inserto del gen, pg. 222.) Es frecuente
emplear promotores inducibles, ajenos al organismo del que procede el gen clonado pero que se activan bajo
condiciones experimentales controlables, como al aadir un nutriente u otro tipo de compuesto, disparando
entonces la transcripcin del gen clonado.
Web 15.5. Ejemplo de clonacin con vectores de expresin.
Una de las aplicaciones particularmente tiles, y de uso cada vez ms frecuente con fines de investigacin,
es la produccin de las llamadas protenas de fusin, protenas recombinantes que combinan en un mismo
polipptido la protena de inters y una protena marcadora o etiqueta que, por sus propiedades, permitir el
seguimiento y la deteccin de la primera.
Web 15.6. Preparacin de protenas de fusin.
15.3 GENOTECAS
Se llama genricamente genoteca o biblioteca de DNA a una coleccin de clones preparada con todos
los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisin del genoma de una especie o de un tejido. Es decir,
se hace la clonacin en paralelo de todos los fragmentos de DNA que componen un genoma. En el caso de la
clonacin celular, cada uno de estos fragmentos se presenta integrado, bajo la forma de rDNA, en un vector
incorporado a uno de los clones celulares que componen la genoteca. En la clonacin acelular se presentan
como fragmentos individuales independientes (al no existir vector ni clula anfitriona).
Dependiendo de si las muestras de partida para la clonacin son fragmentos del DNA genmico o
molculas de mRNA (pgs. 221-223), se distingue entre genotecas genmicas y genotecas de cDNA. Es
importante indicar que la informacin proporcionada por ambas genotecas no es idntica, pues slo las
primeras incluyen tanto las regiones codificantes como las no codificantes; adems, las genotecas de cDNA
son diferentes segn el tejido particular con el que se han preparado, pues slo contienen las regiones codificantes que se expresan en ese tejido, tipo celular, etapa del desarrollo o diferenciacin, entorno bioqumico, etc.
15:21
Una vez preparada una genoteca, sta se convierte en el punto de partida para la bsqueda de cualquier
regin del DNA o de genes concretos, y para su estudio mediante clonacin adicional (que recibe el nombre de
subclonacin), secuenciacin, expresin, etc. Con respecto al uso de las genotecas como fuente para otros
estudios, el problema genrico que se plantea es la localizacin en la genoteca del clon que contiene el DNA
buscado. Para ello se acude a los distintos mtodos de deteccin y seleccin, previamente comentados al
describir la clonacin de un solo fragmento (pg. 234).
15.3.1 Genotecas genmicas

El concepto original de genoteca corresponda estrictamente al de genoteca genmica, representativa
del genoma completo. El nmero de clones componentes debe ser, en la prctica, suficiente para abarcar
todo el genoma, incluyendo tanto el DNA codificante como el no codificante (Captulo 9). La preparacin
del DNA de partida se realiza por escisin del genoma con enzimas de restriccin bajo condiciones de
rotura parcial, es decir, que no permitan la actuacin exhaustiva de la enzima sobre todos los sitios
de restriccin presentes en el DNA. La rotura se produce en cada molcula aleatoriamente sobre el
conjunto de sitios de restriccin, de forma que aparecen un nmero menor de fragmentos y stos son
de mayor tamao, respecto a lo tericamente posible, y diferentes de una a otra molcula. Tambin se
favorece este resultado usando enzimas cortadoras infrecuentes, aquellas cuya secuencia diana aparece
pocas veces en el genoma.
237
238
15:22
A partir del tamao del genoma completo y el tamao medio de los insertos se puede calcular el mnimo
nmero de clones necesario para que la genoteca represente al genoma completo. Sin embargo, el carcter
aleatorio de la preparacin de fragmentos y del proceso de clonacin hace que, para tener certeza de que una
genoteca contiene cualquier regin del genoma, se requiera en la prctica un nmero de clones muy superior al
terico. Este nmero de clones reales dividido por el nmero de clones tericos define el parmetro conocido
como equivalente genmico, que debe alcanzar valores de 10 para asegurar un 99% de probabilidad de
cobertura completa.
Relacin entre tamaos de genoma e inserto y nmero de clones tericos y prcticos

Tamao de
inserto (kb)
N. de clones
independientes
(tericos)
N. de clones en
la prctica
Equivalente genmico
4
20
4.000 / 20 = 210
900
900 / 210 4
Levaduras
14
20
14.000 / 20 = 700
3.500
3.500 / 700 5
Humanos
3.200
20
3.200.000 / 20 = 160.000
760.000
760.000 / 160.000 4,7
Tamao
del genoma
(Mb)
Bacterias
Organismo
15.3.2 Genotecas de DNA complementario

A diferencia del caso anterior, las genotecas de cDNA representan de manera exclusiva a la parte codificante del
genoma. Son especialmente tiles en eucariotas, donde una clula expresa una fraccin muy pequea de su genoma (menos del 3% en humanos), lo que reduce el tamao del material gentico necesario para construir la
genoteca y, por tanto, el nmero de clones. El material de partida, el mRNA de la clula, comprende menos
de 20.000 molculas diferentes, con un tamao medio de 2 a 3 kb. Por otro lado, dado que el nmero de copias
de los distintos tipos de mRNA es muy variable en eucariotas, su representacin en la genoteca no ser
uniforme. Puesto que los cDNA carecen de seales de expresin, cuando se pretenda la expresin del gen
clonado es imprescindible incluir en el vector de expresin un potente promotor adecuado para la clula
anfitriona, de modo que sta exprese la protena codificada por el cDNA respectivo.
CAPTULO 16
Genmica, cartografa
del genoma y secuenciacin
16.1 INTRODUCCIN
16.2 MAPAS GENTICOS
16.2.1 Fraccin de recombinacin como medida
de distancia en un mapa gentico
16.2.2 Obtencin del mapa gentico
16.3 MAPAS FSICOS
16.3.1 Obtencin de mapas fsicos a baja resolucin
16.3.1.1 Mtodos basados en empleo de lneas
celulares somticas hbridas
16.3.1.2 Obtencin de mapas mediante ensayos
de hibridacin con sondas fluorescentes
a) Mapas por hibridacin in situ (FISH)
cromosmica
b) Mapas por citometra de flujo
16.3.2 Mapas fsicos de alta resolucin
16.3.2.1 Mapa fsico por hibridacin in situ (FISH)
de alta resolucin
239
240
241
243
244
244
244
246
246
247
247
16.3.2.2 Mapa fsico con enzimas de restriccin

16.3.2.3 Mapas fsicos de STS y EST
16.3.2.4 Mapas de cntigos
16.4 SECUENCIACIN
16.4.1 Mtodo qumico de secuenciacin del DNA
16.4.2 Mtodo enzimtico de secuenciacin del DNA
16.4.2.1 Sntesis de un DNA complementario
de longitud variable
16.4.2.2 Separacin de los fragmentos y anlisis
16.4.2.3 Automatizacin
16.4.2.4 Variantes del mtodo
16.4.3 Mtodos de secuenciacin masiva
16.4.4 Secuenciacin del RNA
16.5 EL PROYECTO GENOMA
248
248
250
252
252
252
253
254
255
256
257
257
257
247
16.1 INTRODUCCIN
Se conoce como genmica el conjunto de estrategias y tecnologas empleadas para la caracterizacin molecular
del genoma y, en general, el estudio del genoma de un organismo en su conjunto (por contraposicin a cuestiones que afecten a genes individuales). Una buena parte de la genmica corresponde a la cartografa, u
obtencin del mapa de un genoma, que a su vez puede considerarse como la estructura fina del material
gentico de cualquier especie. Por tanto, constituye tambin la base de una biologa molecular e ingeniera
gentica modernas aplicadas a la sanidad.
De acuerdo con estos objetivos, se pueden distinguir dos reas dentro de la genmica, consecutivas, en
apariencia independientes pero totalmente relacionadas entre s:
En primer lugar, la genmica estructural, que corresponde al estudio de las tcnicas y estrategias necesarias
para obtener tanto los mapas fsicos del genoma, posibles a distintos niveles de resolucin, como la secuencia
completa del DNA genmico, o mapa fsico a la resolucin mxima, el nucletido individual.
En segundo lugar, la genmica funcional, correspondiente a la caracterizacin del proteoma, es decir, el
conjunto de todas las protenas originadas por el genoma, bajo los diversos patrones posibles de expresin
gnica a protenas, modificacin y degradacin de stas y desarrollo de su funcin, todo ello dentro de cada tipo
de clula, momento celular, condiciones particulares in vivo, etc. Corresponde, en definitiva, al estudio
funcional del DNA codificante. Por analoga, se denomina protemica al conjunto de tcnicas y estrategias
utilizadas para el estudio del proteoma. En contraste con la genmica estructural, la protemica progresa con
un desfase, y el nmero de organismos modelo para los que se dispone de datos es ms limitado. Aunque los
avances conseguidos en los ltimos 10 aos son extraordinarios, an se necesita tiempo para conocer al
completo la funcin de todos los genes humanos y sobre todo para dar utilidad prctica, en su caso, a las
protenas, tanto con fines bsicos como aplicados en favor de la humanidad (por ejemplo, a la biomedicina).
Los Proyectos Genoma poseen tal envergadura que sus objetivos no se pueden alcanzar con el simple
planteamiento de buscar mtodos para la etapa de secuenciacin, a pesar de su creciente eficiencia. De hecho,
el progreso conseguido ha supuesto la implicacin de numerosas iniciativas y metodologas que superan con
239
240
creces dicha etapa. Ante la imposibilidad material de recoger toda esta informacin (por otro lado, ya
disponible de forma especializada da a da en internet), se presentan en este captulo las lneas bsicas para
un enfoque lgico del conocimiento del genoma.
La elaboracin del mapa, o cartografa, de un genoma, tanto del ser humano como de otros organismos, se
ha abordado a lo largo del tiempo en varias etapas consecutivas, en niveles crecientes de resolucin. stos se
corresponden, a grandes rasgos, con tres grandes estrategias metodolgicas, complementarias entre s:
cartografa gentica, cartografa fsica y secuenciacin. Adems, ha sido necesario el desarrollo de tcnicas
informticas para recoger, almacenar, distribuir y analizar el creciente volumen de datos obtenidos.
Fases del Proyecto Genoma
Cartografa
Caractersticas
Mapa gentico o de
ligamiento
Proporciona la menor resolucin. Sita de forma

aproximada en los cromosomas diversos loci (de genes y
de otros marcadores o secuencias identificables). El clculo
de la distancia y, por tanto, la ubicacin relativa de genes
o marcadores, se basa en la frecuencia con la que los pares
de loci se transmiten conjuntamente a la descendencia
Mapa fsico
Asigna localizaciones a los marcadores, definidas por

distancias en pares de bases. Destacan entre sus variantes los
mapas de restriccin (ordenacin en el cromosoma de las
dianas para enzimas de restriccin)
Secuenciacin
Equivale a la obtencin del mapa genmico en su nivel ms

detallado. Su objetivo es establecer la secuencia nucleotdica
completa del genoma. Se lleva a cabo en paralelo y con el
apoyo de la informacin proporcionada por los mapas
gentico y fsico. Hace uso de planteamientos y mtodos
sumamente especficos, completamente automatizados
e informatizados
Trabajo posterior
Refinamiento
Se resecuencian algunas regiones para corregir errores

o completar los tramos difciles que no se haban podido
analizar.
Se aade la anotacin: sobre la secuencia se marcan
las posiciones para las que se dispone de informacin sobre
funcin biolgica: identificacin de genes, regiones
de control, exones, mutaciones relacionadas con
enfermedades, etc.
Variabilidad individual
Anlisis del genoma de diferentes individuos para ubicar las

posiciones de variabilidad, normal o patolgica, en la
secuencia. Polimorfismos genticos y mutaciones
Genmica comparada
Secuenciando otras especies y comparando resultados se

observan los tramos fuertemente conservados, indicativos de
secuencias gnicas o, al menos, funcionales. La comparacin
ofrece adems informacin til sobre el desarrollo evolutivo
del genoma
16.2 MAPAS GENTICOS

En un principio, los mapas genticos consistan en una representacin grfica de la ordenacin y ubicacin de
los genes en cada cromosoma. Sin embargo, hoy da se incluyen en estos mapas no slo genes, sino tambin
otras regiones del DNA, de modo que para englobar a ambos se emplea la expresin marcador gentico; este
papel puede desempearlo cualquier caracterstica fsica o molecular del DNA que difiera entre individuos y
que sea detectable en el laboratorio, para poder seguir su patrn de herencia. Como marcadores genticos, por
tanto, se incluyen tanto regiones que forman parte de un gen (marcadores gnicos) como segmentos no
codificantes (marcadores no gnicos). La gran mayora de marcadores genticos en los mapas actuales son
marcadores no gnicos.
16. Genmica, cartografa del genoma y secuenciacin
16:1
16.2.1 Fraccin de recombinacin como medida de distancia en un mapa gentico

Durante la meiosis tiene lugar el sobrecruzamiento, o intercambio recproco de fragmentos de DNA entre
cromosomas homlogos (recombinacin homloga o meitica, pg. 108). Debe destacarse que la recombinacin nunca tiene lugar entre cromosomas diferentes, sino nicamente entre los dos miembros de un
par de cromosomas homlogos. Los mecanismos moleculares de la recombinacin no se describen en esta obra;
puede consultarse para ello un texto de gentica. Aqu interesan, esencialmente, las consecuencias del proceso.
Por un lado, que los cromosomas recombinantes que aparecen en cada gameto ya no son idnticos a los
originales (paterno y materno) y, por otro, que la variacin gentica resultante depende, obviamente, de la
posicin del sobrecruzamiento en cada par de cromosomas.
Como fase previa a la obtencin de mapas genticos, deben recordarse algunos trminos bsicos (v. tambin
pg. 97 y web 8.2):
16:2
241
242
La caracterstica que define la cartografa gentica es el anlisis de la fraccin o frecuencia de

recombinacin, definida como la probabilidad de que los alelos presentes en dos loci diferentes (correspondientes a la posicin de los marcadores considerados) se separen o segreguen como consecuencia de la
recombinacin meitica. Dicho de otro modo, es la frecuencia con la que dos alelos determinados aparecen
recombinados en la descendencia. Como se discute a continuacin, esta fraccin depende de la distancia entre
los dos loci en el cromosoma, lo que permite emplearla para establecer el mapa.
16:3
16:4
16.2.2 Obtencin del mapa gentico

Una vez conocidas las posiciones relativas de un nmero elevado de marcadores genticos, se puede estudiar la
frecuencia de recombinacin con respecto a ellos de cualquier nuevo gen o secuencia y as situar su locus en el
mapa definido por aqullos. De esa forma, se dice que se ha cartografiado su posicin en el cromosoma.
Una vez localizado, el nuevo gen o secuencia pasa a engrosar el conjunto de marcadores que forman el mapa.
La escala en los mapas genticos se mide en unidades centimorgan (cM); 1 cM corresponde, por definicin, a
la distancia que separa dos loci que experimentan recombinacin en el 1% de las meiosis. Empricamente, en el
genoma humano esta distancia corresponde aproximadamente a 106 pb (1 Mb). A partir de la frecuencia de
recombinacin se deducen las distancias relativas entre varios loci y se puede establecer su ordenacin en el
cromosoma, comenzando as a precisar el mapa gentico.
Web 16.1. Construccin del mapa gentico.
Experimentalmente, los mapas genticos requieren estudios familiares con rboles genealgicos, en los que
se examina, para alguno de los marcadores, la combinacin de alelos que se va heredando. stos se analizan en
los distintos individuos a lo largo de varias generaciones. La presencia de una u otra forma allica se detecta por
los procedimientos, variados, que permitan distinguirlas: bien a travs de su influencia sobre el fenotipo
(caracteres observables, aparicin de enfermedad, etc.) o bien mediante tcnicas moleculares de deteccin de
secuencias (hibridacin in situ por fluorescencia, hibridacin de Southern, amplificacin por PCR, incluso
secuenciacin actualmente). A partir de la informacin de la herencia de alelos se calculan las frecuencias de
recombinacin entre stos.
En contraste con organismos modelo experimentales como plantas, levadura, Drosophila o ratn, en los
seres humanos es difcil determinar mediante estudios familiares las frecuencias de recombinacin de loci
gnicos. Esto se debe, por un lado, a la escasez de casos en los que se transmiten de forma simultnea dos alelos
representativos, por ejemplo los que causan dos enfermedades. Por otra parte, la baja tasa de reproduccin del
ser humano dificulta el clculo fiable de dicha frecuencia. Para superar esta limitacin, en la prctica se acude a
marcadores polimrficos, es decir, los que presentan en la poblacin un elevado nmero de alelos (formas
alternativas), con lo cual son muy frecuentes los individuos heterocigticos y la recombinacin podr detectarse en un alto porcentaje de la descendencia (debe recordarse que la recombinacin de loci homocigticos no
243
244
puede apreciarse). Los marcadores polimrficos son en general no gnicos, no relacionados con enfermedades
o con genes, sino simplemente secuencias de DNA detectables en una posicin fija del cromosoma. Entre ellos
destacan los basados en el DNA mini- y microsatlite que presentan polimorfismo en el nmero de repeticiones
(VNTR, pg. 421). El nmero de marcadores polimrficos caracterizados, especialmente los microsatlites, ha
crecido de forma exponencial a lo largo del tiempo. En aos ms recientes se han empleado cada vez ms como
marcadores los polimorfismos de un solo nucletido (SNP, pgs. 418 y 424). Hoy da se dispone de un mapa
para cada cromosoma con la ubicacin de un elevado nmero de marcadores.
La utilidad del mapa gentico se ilustra, por ejemplo, con la posibilidad de localizar el gen responsable de
una enfermedad hereditaria, aun sin conocer la identidad de dicho gen ni la base molecular de la enfermedad.
Para ello, se busca, entre todos los que componen el mapa, un alelo de un marcador que est presente en los
individuos afectados, pero no en los sanos, lo que indica que el locus de dicho marcador est ligado al del gen
buscado. Por consiguiente, el gen debe estar muy prximo a la posicin conocida del marcador en el mapa. Esta
posibilidad de ubicacin de genes se potencia si se elabora el mapa con marcadores dispuestos a lo largo de todo
el genoma; se asegura as, por puro azar, que siempre exista algn marcador suficientemente prximo al gen
como para que ambos estn ligados. De esta forma se ha podido encontrar, por ejemplo, la localizacin
cromosmica de los genes responsables de la fibrosis qustica, la anemia drepanoctica, la enfermedad de
Tay-Sachs, el sndrome del cromosoma X frgil y la distrofia miotnica.
16:5
16.3 MAPAS FSICOS

Como se ha indicado, estos mapas miden de manera directa distancias fsicas (es decir, en pares de bases) entre genes
u otros marcadores de DNA en el genoma. Las estrategias metodolgicas son muy diversas y conducen a distintas
variantes de mapas y niveles de resolucin. Dependiendo de la escala o nivel de resolucin, conocida como unidad
cartogrfica o de mapa, se distinguen tres estrategias: baja resolucin (con una precisin de varias Mb), alta
resolucin (por debajo de 105 bases) y mxima resolucin (secuencia nucleotdica, 1 pb).
16.3.1 Obtencin de mapas fsicos a baja resolucin

Este nivel cartogrfico corresponde a la asignacin de cada marcador a un cromosoma o regin cromosmica. Se
utilizan distintos planteamientos que, adems, implican muestras diferentes, segn se describe a continuacin. En
general, el marcador se detecta mediante el empleo de sondas o de cebadores de PCR, ambos especficos para la
secuencia de aqul; en el caso de un marcador gnico, puede acudirse tambin a la deteccin de su producto
funcional (protena o RNA).
16.3.1.1 Mtodos basados en lneas celulares somticas hbridas

Consisten en la bsqueda del marcador (gnico o no) en lneas celulares hbridas, preparadas de tal forma que
contienen material gentico de dos orgenes diferentes: el genoma completo de un roedor (aunque con una
mutacin til, explicada ms adelante) y una parte del genoma humano que se quiere cartografiar, que puede
consistir en varios cromosomas, uno solo o un fragmento de cromosoma. Disponiendo de una coleccin (o
panel) de tales clones celulares hbridos, cada uno con partes distintas del genoma humano, se puede ensayar la
presencia del marcador en cada uno de ellos y as ubicar en qu cromosoma o parte de ste se encuentra.
Repitiendo el proceso para distintos marcadores se llega a construir un mapa fsico.
16:6
245
246
16:7
Un aspecto sumamente importante para la cartografa mediante clulas somticas hbridas es la capacidad
de seleccionar los hbridos, es decir, que en cultivo slo sobrevivan estas clulas. (Esta misma estrategia se
emplea en la preparacin de anticuerpos monoclonales.) El sistema de seleccin ms utilizado hace uso del
medio HAT, as llamado por contener hipoxantina, aminopterina y timidina.
Web 16.2. Seleccin de las clulas hbridas empleando medio HAT.
La preparacin de hbridos a partir de clulas somticas humanas slo permite identificar el cromosoma en
el que est situado el DNA de inters. Se puede alcanzar mayor resolucin cartogrfica empleando hbridos
similares preparados con una porcin menor del genoma humano: hbridos monocromosmicos, conteniendo
un solo cromosoma, e hbridos subcromosmicos, con un fragmento de cromosoma. Con estos ltimos se
construye lo que se denomina mapa de asignacin regional, es decir, la localizacin de cada marcador en una
regin determinada de un cromosoma.
16.3.1.2 Obtencin de mapas mediante ensayos de hibridacin con sondas fluorescentes

La ubicacin de marcadores para formar un mapa fsico de baja resolucin puede tambin conseguirse
realizando ensayos de hibridacin con sondas que contengan la propia secuencia del marcador. Esta tcnica
adquiri gran aplicabilidad en la cartografa con el desarrollo de las sondas fluorescentes (hibridacin in situ
por fluorescencia o FISH, pg. 177). La sonda se marca con un fluorocromo, bien de forma directa o a travs de
un grupo indicador (por ejemplo, biotina o digoxigenina, pgs. 188-189). Para identificar el cromosoma o
la regin del mismo donde hibrida la sonda se puede acudir a la observacin bajo el microscopio de fluorescencia o a la citometra de flujo (pg. 127).
a) Mapas por hibridacin in situ (FISH) cromosmica
La hibridacin se realiza sobre preparaciones para el microscopio de cromosomas metafsicos, previamente
desnaturalizados. La identidad de los cromosomas se revela por las tcnicas habituales de establecimiento del
cariotipo (forma, tamao y bandas bajo tincin, pg. 90). El DNA diana (marcador) se manifiesta bajo el
microscopio de fluorescencia como puntos luminosos dobles, debido a la hibridacin de la sonda con las
dos cromtidas (pg. 168). Se alcanza con esta tcnica un nivel de resolucin cromosmico o subcromosmico,
y es posible localizar o cartografiar de forma simultnea varios marcadores empleando varias sondas marcadas
con fluorocromos distintos.
16:8
b) Mapas por citometra de flujo

La identificacin del cromosoma en el que se encuentra cada marcador puede tambin realizarse si la sonda se
hibrida con muestras que contienen cada una un solo tipo de cromosoma. stas pueden conseguirse aplicando la
clasificacin de clulas activada por fluorescencia (FACS, pg. 127), adaptada a la cartografa del modo siguiente:
los cromosomas se tratan con fluorocromos que se intercalan entre las bases nitrogenadas apiladas del DNA; los
de mayor longitud pueden incorporar mayor cantidad de ese agente intercalante, por lo que adquieren ms
fluorescencia. Esto permite diferenciar los cromosomas en la etapa de anlisis o caracterizacin, proporcionando
lo que se ha llamado un cariograma de flujo, as como separarlos en la etapa de clasificacin y obtener muestras,
cada una con un solo tipo de cromosoma. Finalmente, estos cromosomas separados pueden emplearse, por
ejemplo, en hibridacin en formato dot-blot (pg. 171) con la sonda especfica para el marcador buscado.
16.3.2 Mapas fsicos de alta resolucin

Estos mtodos, complementarios a los anteriores, permiten alcanzar una resolucin inferior a 1 Mb, incluso
hasta llegar a unos pocos nucletidos, lo que ya supone el nivel molecular de resolucin; de ah que sean los
mtodos de cartografa fsica ms importantes. Sirven de enlace entre los mapas fsicos anteriores y los de
secuenciacin o mapas de resolucin total a escala de un nucletido (pg. 252). Se plantean principalmente dos
tipos de abordaje: hibridacin y enzimas de restriccin.
16.3.2.1 Mapa fsico por hibridacin in situ (FISH) de alta resolucin

La baja resolucin asequible sobre cromosomas metafsicos puede aumentarse mediante la hibridacin sobre
cromosomas menos compactados.
16:9
247
248
16.3.2.2 Mapa fsico con enzimas de restriccin

Antes de que se descubrieran las endonucleasas de restriccin y se extendiera su uso en el laboratorio de
investigacin, se emplearon otras nucleasas para secuenciar RNA (pg. 257), siguiendo el mismo enfoque
utilizado previamente para secuenciar polipptidos, es decir, la fragmentacin de la molcula por puntos de
caractersticas conocidas y la reconstruccin del conjunto mediante solapamiento de los fragmentos. Este
mtodo no dio los resultados esperados con DNA, debido a su mayor longitud y, sobre todo, a la menor
especificidad de las DNasas, por lo que slo se consigui secuenciar algunos oligodesoxirribonucletidos.
Web 16.3. Reconstruccin de la secuencia mediante alineacin de fragmentos.
La ventaja de estos planteamientos iniciales es que sirvieron de pauta para la confeccin de los actuales mapas
fsicos del genoma a partir de fragmentos de DNA originados por enzimas de restriccin. Un mapa de restriccin
para una regin determinada del genoma est constituido por una relacin ordenada de sitios que pueden
cortarse con enzimas de restriccin concretas, con indicacin de las distancias entre ellos (en pb). A diferencia de
los mapas genticos, para su elaboracin no afecta la funcionalidad de la regin de DNA (su carcter gnico) ni
la presencia en ella de mutaciones (salvo que stas alteren precisamente el sitio de restriccin). Por el contrario, s
importan algunas alteraciones que puede sufrir el DNA, como translocaciones, deleciones o inserciones.
La resolucin o escala de los mapas de restriccin depende de la separacin entre los sitios de corte o, dicho
de otro modo, de la frecuencia con que la secuencia diana reconocida por la enzima aparece en el genoma
(frecuencia de reconocimiento del genoma por la enzima). Por ejemplo, asumiendo que en un DNA de gran
longitud las cuatro bases queden distribuidas aleatoriamente, cuanto ms corta sea la secuencia del sitio de
restriccin, ms probabilidad habr de encontrarla, por puro azar, es decir, mayor ser la frecuencia de
reconocimiento (v. web 15.2).
La construccin de un mapa de restriccin se simplifica si el nmero de sitios de restriccin es reducido. Esto
es especialmente necesario para cartografiar molculas grandes de DNA, en las que las secuencias especficas
para las enzimas de restriccin habituales se hacen muy numerosas. Para estos fragmentos grandes la
cartografa slo se puede abordar empleando enzimas cortadoras infrecuentes y electroforesis en campo
pulsante (pg. 142). En cualquiera de los casos, el revelado de los geles y la hibridacin Southern con diversas
sondas permiten deducir la distribucin de los sitios de restriccin, o cartografa del mapa.
Para facilitar la comprensin del mtodo de obtencin de mapas fsicos de restriccin, se proponen a
continuacin unos ejemplos prcticos. En el primer caso, se emplean dos enzimas (A y B), que actan de
forma aislada o conjunta (experimento de digestin doble). En el segundo ejemplo, las dos enzimas actan
de forma sucesiva. En el tercero, la digestin enzimtica es idntica al primero, pero se emplea la
hibridacin para enriquecer la informacin obtenida.
Finalmente, debe resaltarse que, puesto que un mapa de restriccin no identifica la posicin de genes, su
utilidad es tanto mayor cuando ms pueda relacionarse con un mapa gentico. Para establecer esta relacin es
necesario encontrar mutaciones que afecten a los sitios de restriccin y determinar su ligamiento con alteraciones que afectan a genes, como las que producen enfermedades u otros cambios fenotpicos. Ello permite
situar ese gen dentro del mapa de restriccin (y otros que puedan haberse localizado respecto a aqul en un
mapa gentico); ste es un ejemplo de cmo se complementan los diversos abordajes de cartografa para ir
construyendo el mapa completo del genoma.
16.3.2.3 Mapas fsicos de STS y EST

Cada vez con mayor frecuencia, para la construccin de mapas fsicos se utilizan marcadores no gnicos
(pg. 240). Dos de los tipos de marcador ms extendidos son los STS (sequence-tagged sites), tambin llamados
secuencias de referencia, sitios marcados nicos o sitios de secuencia marcada, y los EST (expressed
sequence tags), tambin denominados etiquetas o marcas de secuencias expresadas. En ambos casos, se trata de
regiones cortas del genoma (entre 50 y 500 pb) que se han podido secuenciar y para las que se han desarrollado
cebadores de PCR (Captulo 14), lo que permite su amplificacin y consiguiente deteccin. Reciben el nombre de
STS los marcadores encontrados en el DNA genmico, mientras que los EST se identifican en molculas de cDNA,
resultantes de la transcripcin inversa de mRNA. En consecuencia, los STS son marcadores que sirven para
elaborar mapas fsicos de todo el genoma, mientras que los EST slo sirven para mapas de la parte del genoma de
16:10
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250
16:11
mayor inters aplicado, los genes responsables de la sntesis de protenas. Entre otras cosas, estos ltimos se han
empleado para estimar el nmero de genes del genoma humano suprimir cita.
A pesar de que la posicin de estos marcadores en el genoma se desconoce inicialmente, se puede usar una
coleccin de ellos para caracterizar los clones componentes de una genoteca (pg. 238) genmica en el caso de
los STS, genoteca de cDNA con los EST, mediante la deduccin del solapamiento de clones, o construccin de
mapas de cntigos.
16.3.2.4 Mapas de cntigos

Se denomina as a los mapas que se obtienen mediante el solapamiento de fragmentos de DNA. Estos
fragmentos proceden en general de la digestin parcial con enzimas de restriccin de otros fragmentos mayores,
cada uno de los cuales se ha obtenido a su vez por fragmentacin de los 24 tipos diferentes de cromosomas
(humanos) de la muestra. El planteamiento de la cartografa es idntico en ambos niveles, y similar al descrito
para las nucleasas. Para la deduccin del orden o solapamiento de los diferentes fragmentos se acude a la
comparacin de los marcadores presentes en cada uno, que constituyen generalmente mapas de restriccin o
mapas de STS o EST.
16:12
251
252
16.4 SECUENCIACIN
Los esfuerzos iniciales para secuenciar cidos nucleicos dieron pocos resultados. Hasta la dcada de 1970 era
difcil y costoso secuenciar incluso fragmentos de slo 5 a 10 nucletidos. Fueron los mtodos qumico de
Maxam y Gilbert (1977) y enzimtico de Sanger (1980) los que abrieron el camino a dicho gran objetivo. Se
consigui secuenciar molculas mayores de DNA y se definieron algunas secuencias concretas como las del fago
fX174 (5,4 kb), mitocondria humana (16,5 kb), fago lambda (48,5 kb) y virus animal de Epstein-Barr
(170 kb).
Estos dos mtodos pioneros de la secuenciacin tienen en comn algunos aspectos, como la utilizacin de
fragmentos del DNA original escindidos con enzimas de restriccin, el marcaje del DNA de forma radiactiva o
qumica (con fluorforos) y el empleo de mtodos electroforticos para separar los fragmentos generados, entre
otros. El auge de los Proyectos Genoma lleg cuando se consiguieron los avances tecnolgicos que permitieron
acelerar la tasa de secuenciacin, an aplicando de manera bsica el mtodo de Sanger. A continuacin se han
desarrollado mtodos de nueva generacin y de secuenciacin masiva, algunos basados en principios
radicalmente diferentes a los dos anteriores, que suponen un nuevo salto en el progreso de los proyectos de
secuenciacin de genomas de forma rpida y econmica.
La muestra de DNA de partida para la secuenciacin procede en general de clonacin celular, de
amplificacin por PCR o de la digestin controlada con una enzima de restriccin de un genoma, un cromosoma u otro fragmento de DNA. Con frecuencia, las muestras se amplifican mediante PCR para disponer de
suficiente cantidad. Asimismo, es conveniente la purificacin para eliminar DNA contaminante en la muestra
(por ejemplo, DNA bacteriano) y reactivos procedentes de la purificacin o de otros procesos previos (como
cebadores y nucletidos remanentes de la PCR). Se puede acudir tambin a recuperar el DNA contenido en una
banda de electroforesis, extrayndolo del gel.
16.4.1 Mtodo qumico de secuenciacin del DNA

Este procedimiento, que se utiliz mucho pero ha quedado desplazado por el mtodo enzimtico, se basa en la
hidrlisis qumica y en un diseo original aplicable a secuencias de DNA de menos de 250 nucletidos. Se suele
conocer como mtodo de Maxam y Gilbert. Puede describirse en tres etapas: marcaje del DNA, hidrlisis
qumica selectiva del DNA y anlisis de los productos.
Web 16.4. Mtodo de Maxam y Gilbert.
16.4.2 Mtodo enzimtico de secuenciacin del DNA

El mtodo enzimtico o de Sanger es la base de las variantes que se han utilizado exhaustivamente durante aos
para la secuenciacin a gran escala del DNA. Slo en la dcada posterior a la finalizacin del Proyecto Genoma
Humano ha comenzado a ser desplazado por mtodos ms modernos. En l no se degrada el DNA como en el
mtodo qumico, sino que se acude a la interrupcin controlada de la sntesis de una hebra complementaria
durante una replicacin in vitro. Esta sntesis, catalizada por una DNA polimerasa, define el carcter
enzimtico del mtodo. La comprensin de los principios del mtodo y el gran cambio introducido con la
utilizacin de fluorocromos son de inters tanto por s mismos como para la interpretacin de mtodos
posteriores.
El mtodo se apoya en dos conceptos fundamentales: la sntesis a cargo de una DNA polimerasa y el uso de
nucletidos terminadores. Dado que la actividad 5-exonucleasa de las DNA polimerasas naturales no es
conveniente aqu, se suelen usar variantes, como el fragmento de Klenow o fragmento grande de la DNApolimerasa I de E. coli (pg. 150), o formas alteradas artificialmente de la DNA polimerasa del fago T7
(algunas comercializadas con el nombre de secuenasa, Sequenase). Tambin se emplean en ocasiones
transcriptasas inversas o la DNA polimerasa Taq (polimerasa termoestable de la arquea Thermus aquaticus,
conocida por su aplicacin en PCR, pg. 202). Estas alternativas intentan, adems de evitar la actividad
5-exonucleasa, conseguir mayores procesividad, actividad enzimtica y eficacia sobre regiones homopolimricas y regiones con tendencia a adoptar estructura secundaria. Todo ello ha conducido a la posibilidad
de secuenciar cada vez fragmentos ms largos y con menor margen de error.
Asimismo, han ido surgiendo distintas variantes del mtodo inicial en lo relativo al tipo y posicin de
marcaje de los nucletidos, en especial al aparecer los fluorocromos como alternativa a los istopos radiactivos.
Para simplificar, y puesto que el fundamento no vara, se expone a continuacin una de ellas, que emplea cuatro
fluorocromos distintos y ofrece la posibilidad de automatizacin. El mtodo puede describirse en tres secciones:
sntesis enzimtica, anlisis de los fragmentos y automatizacin. Al final se indicarn los matices que supone el
empleo de variantes alternativas del mtodo.
16.4.2.1 Sntesis de un DNA complementario de longitud variable

Dado que se emplea una DNA polimerasa para sintetizar hebras complementarias a la que se quiere secuenciar,
una primera caracterstica del mtodo es la necesidad de un cebador, un oligonucletido diseado para que se
hibride con el extremo 3 de la regin que se quiere secuenciar.
La segunda, y principal, caracterstica de este mtodo de secuenciacin es el uso de didesoxinucletidos, anlogos estructurales de los desoxinucletidos pero que provocan la detencin de la
reaccin de sntesis de DNA. Por ello, el mtodo se conoce tambin como secuenciacin didesoxi o de
terminacin de cadena.
16:13
Web 16.5. Estructura de didesoxinucletidos.
La razn por la que se emplean didesoxinucletidos es que compiten con los desoxinucletidos en la
reaccin de sntesis. La DNA polimerasa utiliza el ddNTP como sustrato, por su analoga estructural con el
dNTP, y queda incorporado a la hebra en crecimiento como ddNMP, pero a partir de l la cadena no se puede
elongar debido a la falta de grupo -OH en 3, que impide que forme enlace fosfodister con el siguiente
nucletido. Los ddNTP, por tanto, detienen la sntesis de la molcula a la que se incorporan.
253
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16:14
16.4.2.2 Separacin de los fragmentos y anlisis

Para analizar las 4 mezclas de molculas obtenidas, se separan todos ellas de acuerdo con su tamao,
empleando electroforesis. El tamao de cada molcula marcada indica directamente la posicin en la secuencia
del didesoxinucletido responsable de la interrupcin de su sntesis.
16:15
16.4.2.3 Automatizacin
La posibilidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las 4 reacciones de sntesis permite automatizar el
mtodo, de forma que se lean simultneamente las hebras marcadas componentes de las 4 mezclas. Adems,
esta lectura de la fluorescencia se puede hacer en continuo, con lo que la electroforesis sigue transcurriendo, las
molculas de menor tamao, ya detectadas, salen por el extremo inferior del gel, y se sigue consiguiendo la
separacin de molculas mayores en el gel, de modo que se ampla el nmero de nucletidos que es posible
secuenciar en un solo experimento.
16:16
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A ttulo ilustrativo, de los numerosos fluorocromos disponibles se indica un grupo de cuatro que se ha usado
con frecuencia para la secuenciacin (todos como N-hidroxisuccinimidilsteres, forma activa que permite su
unin a un grupo amino del nucletido).
Propiedades de fluorescencia
Nombre completo
lex (nm)
lem (nm)
Color emitido
FAM
(5 o 6)-carboxifluorescena
494
518
Rojo anaranjado
JOE
(5 o 6)-carboxi-4,5-dicloro-2,7-dimetoxifluorescena
520
548
Rojo-prpura
(5 o 6)-carboxitetrametilrodamina
553
576
Prpura
(5 o 6)-carboxi-X-rodamina
578
604
Azul verdoso
Nombre comn
TAMRA
ROX
Web 16.6. Estructura y propiedades espectrales de fluorocromos para la secuenciacin.
16.4.2.4 Variantes del mtodo

El mtodo que se ha ilustrado es representativo, una de las variantes posibles, pero sirve para comprender el
diseo y los fundamentos, vlidos para todos. El marcaje de la hebra recin sintetizada puede conseguirse de
otras maneras, aplicndolo a otros componentes de la reaccin en la que se sintetizan dichas hebras:
16:17
16.4.3 Mtodos de secuenciacin masiva

Bajo este epgrafe se pretende recoger las tcnicas de secuenciacin diseadas despus de la consecucin del
Proyecto Genoma Humano, que abandonan la estrategia del mtodo enzimtico de Sanger. En muchos casos
algunas de estas tcnicas se han denominado de ltima generacin o de prxima generacin, trminos
muy atrayentes pero que, obviamente, pierden su sentido de forma rpida. La indicacin masiva, si bien no
aporta informacin precisa, transmite la idea de que una de las principales caractersticas es la capacidad de
procesar cada vez mayor nmero de muestras en paralelo, en un tiempo cada vez menor. Los detalles de estas
nuevas aproximaciones estn en ocasiones oscurecidos por los intereses comerciales y de patentes, as como
sometidos a continua evolucin, por lo que se intentar proporcionar una descripcin global de sus principios.
Web 16.7. Evolucin de los mtodos de secuenciacin masiva.
16.4.4 Secuenciacin del RNA

La secuenciacin del RNA es, en general, ms difcil que la del DNA, entre otras causas por su menor
estabilidad. Es posible deducirla a partir de la secuencia del DNA del que se transcribe, o tambin sintetizar
un cDNA a partir del RNA de inters y secuenciar aqul. Sin embargo, a veces es necesario secuenciar
directamente el RNA, sobre todo cuando se desea determinar las posiciones de nuclesidos modificados,
caractersticos de los tRNA y rRNA. Para ello, se ha desarrollado un procedimiento que emplea distintas
RNasas que cortan en el lado 3 de nucletidos especficos, con lo que se puede obtener una serie de fragmentos
que reflejan las posiciones de cada base. Siguiendo un planteamiento anlogo al de la secuenciacin qumica del
DNA se puede entonces deducir la secuencia del RNA.
16:18
Asimismo, al menos en teora, es posible aplicar el mtodo de secuenciacin didesoxi a RNA. Lgicamente,
en lugar de la DNA polimerasa usada para secuenciar el DNA, se precisa una transcriptasa inversa, capaz de
emplear el RNA de inters como molde para sintetizar una hebra de DNA complementario (pg. 207),
partiendo de la misma mezcla de cuatro dNTP y de un ddNTP distinto en cada tubo.
16.5 EL PROYECTO GENOMA

La consecucin del mapa completo del genoma humano comenz en la segunda mitad del siglo XX con la introduccin de los mapas genticos y fsicos. A mediados de los aos 1980 se concibi el Proyecto Genoma Humano
(PGH), un enorme esfuerzo internacional de investigacin dirigido a conseguir la secuencia de todo el DNA del
genoma humano (los 3.200 millones de pares de bases del genoma haploide). El proyecto comenz en 1990 y se
plante con una duracin de 15 aos, pero los avances tecnolgicos permitieron culminarlo en poco ms de 10.
El desarrollo experimental del PGH consta, a grandes rasgos, de las siguientes etapas:
1. Obtencin de las muestras de DNA (comnmente a partir de los leucocitos de muestras de sangre).
257
258
2. a) En la aproximacin del PGH de fondos pblicos, escisin del DNA de forma controlada en fragmentos,
empleando enzimas de restriccin. Al principio se originan fragmentos relativamente grandes, de unos
150 kb, y luego, a partir de ellos, una segunda escisin produce fragmentos ms pequeos. (Esta doble
etapa facilita la ordenacin posterior de los datos y la reconstruccin de la secuencia completa.)
b) En la aproximacin del proyecto privado (Celera Genomics), la metodologa bautizada como shotgun
sequencing (que algunos traducen como en tiro de escopeta) consiste en la fragmentacin del DNA al
azar, con una repeticin mucho mayor de los fragmentos. El orden de stos, desconocido por completo,
se deduce mediante algoritmos de clculo basados en el mltiple solapamiento de sus secuencias.
3. Clonacin de los fragmentos, mediante la insercin de cada uno en un vector (plsmido, BAC, YAC, etc.) e
incorporacin a una clula anfitriona.
4. Aislamiento del DNA a partir de cada clon y, en su caso, amplificacin por PCR para obtener suficiente
cantidad de cada fragmento.
5. Secuenciacin completa de cada fragmento de DNA (repetida en promedio unas 7 veces), mediante los
mtodos automatizados derivados del de Sanger.
6. Ordenacin de los fragmentos secuenciados para establecer su posicin original en el genoma.
A finales del ao 2000, justo antes de publicarse los resultados del PGH, se dispona de la secuencia
genmica de 42 especies, todas con genomas relativamente pequeos y simples. Diez aos despus, el
nmero de genomas secuenciados supera los 4.000, con un total de 125109 pares de bases.
Genomas con secuencia completa

Finales de 2000
Febrero de 2001
38 bacterias
1 hongo (la levadura Saccharomyces cerevisiae)
2 invertebrados (Caenorhabditis elegans y
Drosophila melanogaster)
Finales de 2010
4.000 bacterias y virus
(5 Gb en total)
Proyecto
Genoma
Humano
250 eucariotas (120 Gb en total)
1 planta (Arabidopsis thaliana)

9
Gb = 10 pares de bases
Saccharomyces cerevisiae es la levadura de la cerveza y del pan
Caenorhabditis elegans es un gusano nematodo de 1 mm de longitud
Drosophila melanogaster es la mosca de la fruta o del vinagre
Arabidopsis thaliana es una planta herbcea con flor, con una altura de 10 a 30 cm
En junio de 2000 la Casa Blanca anunci la consecucin (anticipada casi 5 aos sobre lo previsto inicialmente) de la secuencia completa del genoma humano. A principios de 2001 se publicaron los resultados de lo
que se llam el borrador de la secuencia secuenciacin y anlisis iniciales del genoma, que cubra
alrededor del 90% de las regiones de eucromatina (pg. 88), an con 250.000 brechas y numerosos errores.
Poco despus se abord la secuenciacin de otros vertebrados, como ratn, perro, rata, chimpanc y vaca, as
como algunos marsupiales, monotremas y aves. Hoy da se dispone de muchos ms, e incluso de secuencias
parciales de especies extintas como el mamut lanudo y el Neandertal.
En 2004 se public la secuencia final o casi completa del genoma humano, de alta calidad: cubre
aproximadamente el 99,7% de las regiones de eucromatina, con slo 300 brechas y un error en cada 105
nucletidos. Adems de una mejor definicin de la secuencia, en este perodo se produjo la anotacin,
principalmente gracias a la genmica comparada. Las publicaciones oficiales en revistas cientficas se extendieron hasta el ao 2006. Las brechas, que no se han conseguido secuenciar, comprenden 28 Mb de eucromatina con secuencias repetitivas y 200 Mb de heterocromatina (centrmeros grandes y brazos cortos de los
cromosomas acrocntricos, pg. 89).
Toda la secuencia obtenida y la informacin relacionada (conocida como anotaciones, que incluyen
identificacin de genes, secuencias expresadas, polimorfismos y mutaciones conocidos, etc.) est disponible
pblica y gratuitamente a travs de las bases de datos del proyecto en internet.
Actualmente el mayor nfasis se est dedicando a completar la identificacin de genes y al estudio de las
pequeas diferencias del genoma en cada persona (polimorfismo gentico, Captulo 24). Por ejemplo, en enero de
2008 se puso en marcha el Proyecto de los 1.000 Genomas, que pretende establecer un catlogo de variacin
gentica de los seres humanos secuenciando el genoma de, al menos, mil individuos de distintos grupos tnicos.
Seccin III
Expresin gnica
CAPTULO 17
Transcripcin
17.1 INTRODUCCIN Y CONCEPTOS GENERALES

17.1.1. La transcripcin en el flujo de informacin gentica
17.1.2. Transcripcin inversa
17.1.3. Concepto de gen
17.1.3.1 Definicin clsica, no molecular
17.1.3.2 Definicin molecular y funcional
17.1.3.3 Situaciones particulares
17.1.3.4 Nomenclatura de los genes
17.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE
LA TRANSCRIPCIN
17.2.1. Carcter secuencial y multifocal
17.2.2. Carcter no simultneo y monodireccional
17.2.3. Slo se transcribe una pequea parte del genoma
17.2.4. Terminologa de las cadenas
17.2.5. Orientacin y numeracin
17.2.6. Resumen comparado con la replicacin
17.2.7. Relacin con la condensacin del DNA
17.3 ENZIMOLOGA DE LA TRANSCRIPCIN
17.3.1. Requerimientos
17.3.2. Reaccin de sntesis de RNA
17.3.3. RNA polimerasas
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17.3.3.1. Especificidad respecto al tipo de gen

transcrito y RNA formado
17.3.3.2. Localizacin y cantidad
17.3.3.3. Susceptibilidad a inhibidores
17.3.3.4. Estructura de las RNA polimerasas
17.4 ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCIN
17.4.1. Iniciacin
17.4.1.1 Formacin del complejo de iniciacin
17.4.1.2 Desnaturalizacin del promotor
17.4.1.3 Formacin de los primeros enlaces
fosfodister
17.4.1.4 Liberacin del promotor: transicin
de iniciacin a elongacin
17.4.2. Elongacin o alargamiento del RNA
17.4.3. Terminacin
17.5 TRANSCRIPCIN DEL GENOMA MITOCONDRIAL
17.6 INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIN
17.6.1. Antibiticos de tipo I
17.6.2. Antibiticos de tipo II
17.6.3. Antibiticos de tipo III
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17.1 INTRODUCCIN Y CONCEPTOS GENERALES

17.1.1 La transcripcin en el flujo de informacin gentica
La transcripcin es el proceso encargado de la sntesis de una molcula de RNA a partir de la informacin
gentica contenida en la regin codificante de un DNA. Es decir, de dar lugar a una copia de RNA (con
secuencia no idntica, sino complementaria y antiparalela) a partir de una de las hebras del DNA empleada
como molde. Este proceso constituye el segundo paso del esquema clsico de transmisin de la informacin
gentica (pg. 3).
Se trata de un proceso enzimtico catalizado en todos los organismos por una enzima RNA polimerasa
(polimerasa de RNA dependiente de DNA, o transcriptasa, pg. 147). La presencia del OH 2 en la ribosa, que
hace al RNA ms reactivo (pg. 32), puede explicar que el papel del RNA como material gentico (probable en
todos los organismos al inicio de la evolucin) se haya desplazado al DNA, una molcula ms estable.
261
262
III. EXPRESIN GNICA
17:1
El proceso de transcripcin es notablemente similar en los diversos organismos. Existen, sin embargo,
diferencias relevantes en cuanto a lo que ocurre despus con los RNA recin sintetizados:
En procariotas, la molcula de mRNA resultante de la transcripcin es ya funcional, no experimenta
transformaciones adicionales y se utiliza de inmediato como molde para la traduccin (Captulo 21), en el
mismo compartimento subcelular (puesto que no hay membrana nuclear). Existe por ello una asociacin
temporal y espacial ntima entre transcripcin y traduccin; de hecho, un mRNA puede empezar a traducirse
antes de haberse completado su sntesis por transcripcin. Por el contrario, la mayora de los tRNA y rRNA
deben sufrir maduracin, anloga a la de los RNA eucariticos.
En eucariotas, el RNA resultante de la transcripcin se denomina transcrito primario, y experimenta en el
ncleo la maduracin o procesamiento postranscripcional (Captulo 19). Los RNA maduros se transportan
despus al citosol para participar en la traduccin (Captulo 21). Existe, por tanto, una separacin espacial y
temporal entre transcripcin y traduccin, que supone una regulacin ms compleja de la expresin gnica,
contribuyendo a la riqueza en variedad y funcin propia de las clulas eucariticas. Este control se lleva a cabo
en gran medida por regulacin de la actividad de la RNApol-II (Captulo 18). El hecho de que esta enzima no se
una de forma especfica por s misma a las secuencias promotoras en el DNA es otro signo de la complejidad
respecto a procariotas.
263
17. Transcripcin
17:2
17.1.2 Transcripcin inversa

Como excepcin, los retrovirus, que poseen un genoma formado por RNA, utilizan ste como molde para la
sntesis de un DNA complementario (cDNA), gracias a una polimerasa de DNA dependiente de RNA, una
transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (pgs. 149 y 207). Por esta razn, el esquema general del flujo de
informacin gentica se considera actualmente que es bidireccional en su primera parte (pg. 4).
17.1.3 Concepto de gen

17.1.3.1 Definicin clsica, no molecular
En trminos genticos clsicos, el gen se define como la unidad elemental de la herencia, la regin fsica y
funcional que controla una caracterstica hereditaria concreta, la portadora de la informacin gentica de una
generacin a la siguiente, la que gobierna, en definitiva, las caractersticas de un rasgo particular. Es un
concepto, pues, estrechamente asociado al del fenotipo. Por entonces (1910-1930) se consideraba, asimismo,
al gen como la mnima unidad de recombinacin, mutacin y funcin.
17.1.3.2 Definicin molecular y funcional

En trminos moleculares, la definicin de gen ha ido evolucionando de manera sucesiva desde la visin original,
para adaptarse a los nuevos descubrimientos (v. tambin pg. 110).
En una fase previa, la definicin de gen se bas en planteamientos muy simples, relacionados con los avances
producidos con el tiempo:
Hiptesis un gen-una enzima. Basada en el papel del gen como responsable de la sntesis de enzimas, primeras
molculas con funciones catalticas en las clulas.
#
Hiptesis un gen-una protena. Basada en la nocin original de que todas las enzimas son protenas (hoy se sabe que
algunas molculas no proteicas, las ribozimas, tambin poseen funciones catalticas) pero hay numerosas protenas
no enzimticas.
#
Hiptesis un gen-un polipptido. Basada en que muchas protenas estn formadas por varios polipptidos, cada uno
codificado por un gen diferente.
264
III. EXPRESIN GNICA
Como consecuencia, la definicin bsica, la considerada normalmente como vlida y aceptada, es:
Un gen es aquella regin del genoma que contiene la informacin necesaria para sintetizar una molcula de
polipptido.
Este concepto debe ser, sin embargo, matizado y ampliado para dar entrada a dos nuevas caractersticas de
un gen cualquiera: existencia de dos tipos de secuencias con funciones diferentes, una estructural o realmente
codificadora y otra reguladora de la expresin, y presencia en la regin estructural de regiones codificantes y no
codificantes.
17:3
La regin estructural define la secuencia del producto gnico. Comprende a su vez dos tipos de regiones, en
funcin de su capacidad de expresin: intrones, o regiones no codificantes presentes en el interior del gen
(pg. 298), y exones, que incluyen todas las secuencias codificantes, as como las no codificantes de ambos
extremos del gen. El conjunto de exones e intrones de la regin estructural se transcribe para dar lugar a un
RNA denominado precursor o transcrito primario. ste requiere un proceso adicional, posterior a la
transcripcin, para dar las molculas funcionales de RNA (Captulo 19). La mayor parte de los transcritos
formados en procariotas y eucariotas sufre dicho proceso, que recibe el nombre de maduracin postranscripcional; la excepcin son los mRNA procariticos, que se sintetizan directamente en su forma funcional. Como
parte de ese proceso se pierden los intrones, y los exones se unen linealmente, hasta constituir el RNA maduro o
funcional (pg. 303).
La regin reguladora, sin funcin codificante, suele estar situada cadena arriba (es decir, hacia 5, pgs. 267268) de la regin estructural. Contiene distintas regiones promotoras, encargadas de interaccionar con los factores
de transcripcin proteicos para regular positiva o negativamente el inicio de la transcripcin (pg. 288).
Otra consideracin importante para una definicin molecular actual del gen es la formacin a partir del
DNA de dos tipos de productos gnicos: RNA y protenas funcionales. Para la formacin de los primeros se
requiere la transcripcin y, en su caso, la maduracin postranscripcional. Slo uno de los tipos de RNA, el
mensajero, sirve como punto de partida para sintetizar el segundo producto gnico, la protena funcional. Ello
requiere, adems de la transcripcin y maduracin postranscripcional, la traduccin o sntesis del polipptido
265
17. Transcripcin
y, en la mayora de los casos, el plegamiento proteico, necesario para su distribucin hacia el lugar de accin y
para el ejercicio de su funcin.
Como consecuencia, la definicin molecular se ha ampliado: un gen es el conjunto de regiones del DNA
de cualquier tipo, estructurales (intrones y exones) y reguladoras, necesarias para codificar y expresar un
producto gnico, sea ste un RNA maduro de cualquier tipo o una protena funcional.
Se observa que ambas definiciones moleculares estn basadas en la hiptesis un gen-un polipptido; pueden
extenderse, aunque no sea frecuente hacerlo, a:
Hiptesis un gen-un RNA, como primer producto gnico.

#
Hiptesis un gen-un producto gnico funcional.
Por ltimo, debe sealarse que para el caso de los ribovirus y retrovirus, cuyo genoma est formado por
RNA, la definicin del gen debe hacerse de forma equivalente como regin de RNA, y no de DNA.
17.1.3.3 Situaciones particulares

Algunos genes poseen caractersticas que requieren forzar las definiciones establecidas; en esos casos, se debe
acudir a la interpretacin ms funcional del concepto moderno de gen, ms que a los detalles de la definicin. Se
indican algunos ejemplos.
Dos genes pueden ser solapantes, es decir, compartir una misma regin de DNA (pg. 266), bien porque
cada uno est codificado en una hebra distinta (y, por tanto, sus secuencias son completamente diferentes,
pg. 42) o bien incluso en la misma hebra (lo cual no implica que las protenas codificadas compartan
secuencia de aminocidos, debido a la existencia de tres marcos de lectura, pg. 314).
Algunos genes dan lugar a varios productos (pg. 298). Un ejemplo es el gen de los rRNA, que se
transcribe en un RNA precursor que por maduracin se fragmenta dando varios rRNA funcionales
(pgs. 307-308). Otro caso est en el DNA mitocondrial, cuyos 3 transcritos primarios maduran para
dar cada uno varios RNA (pg. 309). Finalmente, muchos genes procariticos se transcriben a un
mRNA nico que, sin embargo, da lugar por traduccin a varias protenas (mRNA policistrnicos,
pgs. 324-325)
En otros casos, una misma secuencia de DNA puede dar lugar de manera alternativa a dos productos
gnicos, a travs de variantes de su expresin gnica; por ejemplo, por un diferente procesamiento postranscripcional o postraduccional (Captulos 19 y 22). ste es un fenmeno cuya relevancia se percibe hoy
como extraordinaria: se ha estimado que el 90% de los genes de protenas humanas experimentan ayuste
alternativo (pg. 311)
De igual manera, en numerosos casos la protena est formada por varias subunidades; en este caso, no existe
un gen para la protena, sino para cada uno de esos polipptidos (por ejemplo, no se habla del gen de
hemoglobina, sino de los genes de la globina a y la globina b).
En casos excepcionales, como las inmunoglobulinas, un gen nico sufre reorganizaciones internas en su
secuencia antes de transcribirse, de forma que da lugar directamente a una variedad de polipptidos (los
distintos anticuerpos con especificidad para antgenos diversos).
17.1.3.4 Nomenclatura de los genes

Los genes se nombran en general con tres letras y en cursiva (por ejemplo, gen ras). Suele escribirse todo en
maysculas en el caso de genes silvestres eucariticos, slo la primera mayscula si es un gen silvestre
procaritico, y todo en minsculas si es un gen mutado. Cuando hay varios genes con el mismo nombre, es
frecuente completar con una letra mayscula en procariotas o con nmeros en eucariotas.
La protena codificada por el gen recibe a veces el mismo nombre, pero sin cursiva y en maysculas bien todo
o la inicial (protena Ras). En ocasiones, para evitar la confusin, se aade una p al final del nombre.
266
III. EXPRESIN GNICA
17.2 CARACTERSTICAS GENERALES DE LA TRANSCRIPCIN

Al comenzar el estudio de la replicacin se expusieron una serie de descripciones relativas a su carcter
simultneo, secuencial, bidireccional, mono- o multifocal y semiconservador. Con fines comparados, se puede
describir el proceso de transcripcin como no simultneo, secuencial, monodireccional y multifocal. (El
carcter conservador de la replicacin no tiene aqu equivalente conceptual, pues el producto RNA no
comparte nada con el molde DNA.) A continuacin se desarrollan en detalle algunas de estas caractersticas; el resto son implcitas en los apartados siguientes.
17.2.1 Carcter secuencial y multifocal

La sntesis de RNA comienza en paralelo, pero no coordinadamente, en numerosos puntos de la molcula
de DNA que se emplea como molde (un origen para cada gen: multifocal). A partir de ellos, al igual que ocurre
en la sntesis de DNA, progresa mediante la adicin sucesiva de nucletidos individuales a la cadena en
crecimiento (secuencial).
17.2.2 Carcter no simultneo y monodireccional

A diferencia de la replicacin, en la que las dos hebras se copian simultneamente (pg. 148), la transcripcin
nunca se produce a un tiempo en las dos hebras. De hecho, no es slo una cuestin de momento, sino que lo
comn es que slo se transcriba una hebra; se afirma tambin que el proceso es asimtrico. Adems, tambin al
contrario que la replicacin, la transcripcin de distintas regiones del DNA no se realiza de forma coordinada
en todo el genoma, sino independiente para cada gen. Dado el sentido nico 5 ! 3 de la sntesis,
la transcripcin tiene lugar en sentido contrario en cada hebra.
17:4
A pesar de lo mencionado, en algunos casos s se transcriben las dos hebras de una regin de DNA, pero
de forma independiente y no simultnea, portando mensajes genticos diferentes; se dice entonces que contienen dos genes solapantes (pg. 265).
17:5
17. Transcripcin
17.2.3 Slo se transcribe una pequea parte del genoma

Como ya se indic, una gran mayora del DNA genmico de eucariotas nunca se transcribe (DNA no
codificante, pg. 109). Asociadas a este carcter no funcional o simplemente no transcribible aparecen copias
defectuosas de genes (pseudogenes y fragmentos de genes, pg. 115), estructuras cromosmicas que no se
transcriben, as como gran cantidad de DNA intergnico. La parte que s se transcribe corresponde a los exones
de las regiones estructurales de los genes, sean de secuencia nica o repetida, y a sus intrones (aunque stos,
estrictamente, son DNA no codificante). Adems, dentro del DNA que se puede transcribir, clulas diferentes
transcriben distintas regiones (distintos genes), atendiendo a las seales de diferenciacin celular y tisular, o de
adaptacin al medio, a situaciones metablicas diversas, etc. Todo ello forma parte del complejo proceso
de control de la expresin gnica (Captulo 18).
En este contexto parece adecuado insistir en que no es vlida actualmente la definicin de gen como
secuencia de DNA que se transcribe, porque excluye la regin del genoma que controla la transcripcin
(pg. 263).
17.2.4 Terminologa de las cadenas

Para una descripcin didctica de la transcripcin es aconsejable trazar en horizontal el DNA bicatenario que se
va a transcribir; la hebra superior (extremo 5-P a la izquierda) es la que no sirve de molde, mientras la inferior,
antiparalela (extremo 5-P a la derecha), se convierte una vez girada en el molde sobre el que se empareja el
RNA sintetizado. Para la nomenclatura de ambas hebras del DNA, la referencia es la de RNA, que o bien es la
molcula funcional o en el caso del mRNA contiene el mensaje que originar, por traduccin, la secuencia
de aminocidos de la protena. La sntesis del RNA, que se marca a menudo con lnea y flecha, tiene lugar en
sentido 5 ! 3 del RNA naciente. Esto equivale a decir que la hebra molde de DNA se transcribe (se lee)
en direccin 3 ! 5.
17:6
Finalmente, puede observarse que al ser la nueva cadena de RNA complementaria a la hebra de DNA molde,
ambas aparecen formando un hbrido RNA:DNA. Como se ver, ste desaparece a medida que progresa la
sntesis, de modo que al final de sta el RNA queda libre.
17.2.5 Orientacin y numeracin

La posicin de un nucletido en cualquier gen o regin de DNA relacionada con el proceso de la transcripcin
siempre se refiere a la hebra codificante, la que no hace de molde. Por convenio, su orientacin es la del sentido
de transcripcin. Los nucletidos de esta hebra se numeran a partir del punto de inicio de la transcripcin, al
que se asigna el valor +1 (no existe el nucletido nmero cero).
267
268
III. EXPRESIN GNICA
17:7
17.2.6 Resumen comparado con la replicacin

Es conveniente sintetizar las caractersticas recin expuestas, as como otras que se estudiarn a continuacin,
comparadamente con el proceso de replicacin.
17:8
17.2.7 Relacin con la condensacin del DNA

Al igual que en la replicacin eucaritica (pg. 155), un problema especialmente importante es el grado
de condensacin del DNA al inicio del proceso de transcripcin. En los cromosomas metafsicos
eucariticos, en los que la condensacin es mxima, est totalmente impedida la transcripcin. sta tiene lugar
durante la interfase, pues slo ocurre sobre la conformacin de fibras de 10 nm, de mnima condensacin
(pg. 85) y, por tanto, mayor accesibilidad a las RNA polimerasas y a otras protenas necesarias para el
17. Transcripcin
proceso. La descondensacin mxima nunca se da simultneamente a todo lo largo del cromosoma, lo que
explica la correlacin observada de forma experimental entre actividad transcripcional y posicin de las
regiones descondensadas (eucromatina, pg. 88).
17.3 ENZIMOLOGA DE LA TRANSCRIPCIN

17.3.1 Requerimientos
Sustratos: se utilizan como sustratos el conjunto de los cuatro ribonuclesidos-trifosfato: ATP, GTP, CTP
y UTP. De cada uno de ellos queda incorporado en el nuevo RNA la parte NMP de la molcula.
Cofactores: para una actividad ptima se requiere un ion metlico divalente como cofactor, asociado a los
NTP y a la polimerasa. Aunque in vitro este papel pueden desempearlo tanto Mn2+ como Mg2+, es este
ltimo el que acta in vivo.
Molde o plantilla: al igual que en la replicacin, el orden correcto de incorporacin de los nucletidos viene
determinado por su complementariedad de bases con la secuencia de una de las hebras de DNA, que acta
como molde o plantilla.
Cebador: a diferencia de la replicacin, la sntesis de RNA comienza simplemente a partir de dos nucletidos.
No es necesaria la presencia de un cebador. Puede expresarse esta situacin diciendo que la transcripcin s es
autoiniciadora.
17.3.2 Reaccin de sntesis de RNA

Web 17.1. Antecedentes histricos: sntesis de RNA por la polinucletido fosforilasa.
Como ya se ha indicado, todos los organismos, procariotas y eucariotas, sintetizan el RNA de acuerdo con
una reaccin catalizada por la RNA polimerasa (que es una polimerasa de RNA dirigida por DNA, pg. 149).
El mecanismo de la reaccin es bsicamente idntico al de la DNA polimerasa (pg. 149). La reaccin global es
la siguiente:
17:9
El descenso de energa libre de la reaccin, para cada nucletido aadido, es DG = 2,6 kcal/mol = 9 kJ/
mol. Es decir, es ligeramente exergnica y espontnea. Al igual que en la DNA polimerasa, la reaccin est
asistida termodinmicamente por la ruptura del enlace fosfoanhdrido del NTP y por la hidrlisis del PPi
catalizada por la pirofosfatasa. Se asegura as que la reaccin transcurra de forma irreversible en la direccin de
sntesis.
La adicin de nucletidos a la hebra de RNA nueva y las caractersticas de la reaccin se exponen
comparativamente con las de la replicacin:
Web 17.2. Mecanismo de la reaccin de sntesis de RNA.
17.3.3 RNA polimerasas

Web 17.3. RNA polimerasas en procariotas.
En el ncleo de las clulas eucariticas existen tres RNA polimerasas diferentes (I, II y III), que sintetizan
cada una distintos tipos de RNA. Sus caractersticas diferenciales les confieren una especializacin, ausente
en procariotas, en cuanto a su labor de sntesis de RNA. Adems, cada una emplea distintos factores de
transcripcin que se unen a promotores situados en distinta posicin (Captulo 18). Por otro lado, la
transcripcin en los orgnulos (mitocondrias y cloroplastos) corre a cargo de una nica RNA polimerasa para
los tres tipos de RNA (mRNA, tRNA y rRNA).
269
270
III. EXPRESIN GNICA
RNA polimerasas eucariticas

Transcrito primario
que sintetiza
Producto gnico final
Localizacin
Actividad
enzimtica
Inhibidor
RNApol-I
pre-rRNA grande
rRNA de 28S,
18S y 5,8S
Nuclolo
50-70%
Ninguno
RNApol-II
hnRNA (pre-mRNA)
pre-snRNA
pri-miRNA
mRNA
snRNA
miRNA
Nucleoplasma
20-40%
a-amanitina (fuerte)
RNApol-III
pre-tRNA
pre-rRNA pequeo
pre-snRNA U6
pri-miRNA
tRNA
rRNA de 5S
snRNA U6
miRNA
Nucleoplasma
3-10%
a-amanitina (dbil)
RNApol Org
rRNA, mRNA y tRNA

de la mitocondria
o el cloroplasto
Mitocondrias
y cloroplastos
Rifampicina
17.3.3.1 Especificidad respecto al tipo de gen transcrito y RNA formado

Cada RNApol transcribe un grupo de genes y da lugar a transcritos primarios que originarn por maduracin
postranscripcional distintos tipos de RNA maduros. Por ahora se comenta slo el primero de estos aspectos.
La RNApol-I transcribe el gen del precursor grande de RNA ribosmico (45S), precursor nico que da lugar
a 3 de los 4 tipos de rRNA componentes del ribosoma citoplasmtico (pgs. 63 y 76).
La RNApol-II transcribe todos los genes de protenas, sintetizando los RNA nucleares heterogneos
(hnRNA), que son los precursores de los mRNA (por ello, el hnRNA est constituido por molculas de
tamaos muy variados, de lo que procede su nombre). La misma RNApol-II transcribe tambin la mayora
de genes de los RNA nucleares de tamao pequeo, en concreto, todos los snRNA de tipo U excepto el U6
(pg. 304), y algunos microRNA. Puesto que RNApol-II transcribe la gran mayora de genes, los que
codifican protenas, esta enzima se considera representativa de las polimerasas eucariticas.
La RNApol-III, por su parte, transcribe los genes de todos los tRNA, sintetizando sus pre-tRNA respectivos,
as como el gen del precursor pequeo del RNA ribosmico que madurar para dar lugar al cuarto tipo
de rRNA (5S), el gen del snRNA U6 y los de otros RNA pequeos, incluidos algunos microRNA (pgs. 69 y
309).
17.3.3.2 Localizacin y cantidad

De acuerdo con su especificidad, las RNApol se localizan en el nucleoplasma (RNApol-II y III) o en el nuclolo
(RNApol-I). ste es una regin densa del ncleo, de tincin ms intensa, rica en RNA y protenas, no rodeada
por membrana alguna ni observable durante la mitosis. Su existencia y sus caractersticas son el resultado de la
propia transcripcin de los genes de rRNA, proceso muy activo para proporcionar la elevada cantidad de
ribosomas que necesita la clula.
La cantidad de cada tipo de RNApol (medida como fraccin de la actividad enzimtica total) refleja la
demanda de sus productos gnicos respectivos: es mxima para RNApol-II, intermedia la de RNApol-II y casi
residual en RNApol-III.
17.3.3.3 Susceptibilidad a inhibidores

El estudio y empleo de inhibidores de las RNA polimerasas ofrece inters experimental, para poder analizar sus
actividades por separado, as como aplicado, por ser una de las estrategias comunes para combatir las
infecciones bacterianas (antibiticos que inhiben la transcripcin, pg. 276).
17. Transcripcin
La diferencia ms significativa que permite diferenciar de manera experimental las 3 polimerasas nucleares
es su sensibilidad a la a-amanitina, una toxina de Amanita phalloides (pg. 277). En clulas animales este
compuesto no afecta a la RNApol-I, inhibe fuertemente (a baja concentracin, 108 M) a la RNApol-II y
dbilmente a la RNApol-III (a mayor concentracin, entre 105 y 106 M, aunque de forma variable segn la
especie).
En cuanto a la RNApol mitocondrial, no se ve afectada por la a-amanitina, pero s por la rifampicina
(pgs. 276-277), que no afecta a las polimerasas nucleares. En la respuesta a ambos inhibidores la polimerasa
mitocondrial se comporta igual que la RNApol de clulas procariticas (un dato ms que apoya el probable
origen endosimbitico de las mitocondrias, pg. 10).
17.3.3.4 Estructura de las RNA polimerasas

Las RNA polimerasas eucariticas estn formadas por entre 10 y 15 subunidades o cadenas polipeptdicas,
y alcanzan una masa cercana a 600 kDa. (El nmero de subunidades es impreciso debido a que algunos factores
de transcripcin (Captulo 18) permanecen asociados de forma ms o menos estable con algunas polimerasas,
lo que hace difcil precisar si son subunidades de la RNApol o protenas independientes.)
Las 3 subunidades de mayor tamao son homlogas en las 3 polimerasas, as como con las bacterianas.
Constituyen el centro de la enzima (enzima ncleo, enzima mnima, polimerasa central) y contienen tanto el
sitio de unin al DNA como el centro cataltico. Algunas de las subunidades menores son tambin comunes a
las 3 polimerasas y resultan esenciales para su accin; el resto probablemente modula dicha accin.
17:10
Web 17.4. Estructura de algunas RNA polimerasas. (v. tambin web 17.3)
La subunidad mayor de la RNApol-II contiene un dominio C-terminal (denominado CTD, de C-terminal

domain) que sobresale de la protena (se le llama la cola CTD de la polimerasa) y se encuentra prximo al
punto de salida del RNA naciente. El CTD posee mltiples repeticiones de la secuencia heptapeptdica Tyr-SerPro-Thr-Ser-Pro-Ser (repetida 52 veces en la RNApol humana). Este dominio experimenta fosforilacin
reversible en los residuos 2 y 5 de serina de cada repeticin, adquiriendo as una elevada carga negativa, lo
271
272
III. EXPRESIN GNICA
que se relaciona con su implicacin en la transicin de la fase de iniciacin a la de elongacin (pg. 273); su
proximidad al canal de salida del RNA puede explicar esta actividad. Asimismo, ejerce de punto de unin para
reclutar varios de los factores de iniciacin y de elongacin.
17.4 ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCIN

Para que tenga lugar la transcripcin es necesaria la presencia en la hebra molde de la llamada unidad
de transcripcin, que incluye la secuencia del DNA que se ha de transcribir ms las dos secuencias consenso
que la flanquean (denominadas de forma genrica promotor y terminador). Se reserva el trmino opern para
la unidad de transcripcin en procariotas.
17:11
Al igual que la replicacin, la transcripcin transcurre en las tres fases de iniciacin, elongacin y
terminacin, con notables diferencias entre eucariotas y procariotas en cuanto al reconocimiento de las
secuencias promotora y terminadora.
17.4.1 Iniciacin
Es, con mucho, la etapa ms compleja de la transcripcin (y, por ello, en la que tiene lugar la mayor parte de la
regulacin, Captulo 18). Requiere la separacin de las hebras del DNA en un pequeo tramo cercano a la secuencia del promotor basal, para permitir que la RNA polimerasa sintetice un fragmento corto de RNA (de
unos 10 nucletidos) por emparejamiento con la hebra molde. La regin de DNA que sufre este desenrollamiento parcial recibe el nombre de burbuja de transcripcin; sta se forma en el inicio y posteriormente, durante
la elongacin, se desplaza a lo largo del DNA junto con la RNApol. Para la iniciacin tambin se requiere la
unin al DNA de protenas llamadas factores de inicio de la transcripcin o, ms comnmente, factores de
transcripcin (TF). Tanto stos como los promotores se estudiarn en detalle ms adelante (Captulo 18).
En procariotas y en las mitocondrias es frecuente que un mismo promotor inicie la cotranscripcin de varios
genes contiguos. Por el contrario, en el genoma nuclear de eucariotas, a partir de cada promotor slo se
transcribe un gen. Distintos genes, en especial dependiendo de cul sea la RNApol, utilizan distintos tipos
de secuencias promotoras, a las que se unen distintos factores de transcripcin. El proceso de iniciacin que se
describe como tpico de eucariotas utiliza promotores que tienen la secuencia TATA, pero no la Inr (llamados
por ello de tipo TATA+ Inr), cuyas caractersticas se describen posteriormente (pg. 289). La secuencia TATA
no la reconoce la RNApol directamente, sino a travs de la mediacin de los TF. Es importante resaltar que,
tanto en procariotas como en eucariotas, la iniciacin requiere la presencia de la RNApol completa u holoenzima (es decir, la RNApol bacteriana con la subunidad s y las RNApol eucariticas con todas sus subunidades y
con los factores de transcripcin).
La iniciacin puede subdividirse en cuatro subetapas, que slo se describen aqu para los genes de clase II,
los transcritos por la RNApol-II. Los genes de clases I y III se transcriben por mecanismos similares, salvo por la
identidad y peculiaridades de sus polimerasas, promotores y factores de transcripcin (pgs. 294-296).
17.4.1.1 Formacin del complejo de iniciacin

Este complejo plurimolecular es imprescindible para que la RNApol pueda actuar. Supone la unin de varios
TF a las regiones promotoras del DNA y la incorporacin de la enzima, que participa en su forma con dominio
CTD no fosforilado (pg. 271). Se han propuesto dos modelos para el mecanismo de formacin de este
17. Transcripcin
complejo, pero ambos conducen al mismo resultado; sus detalles se describen posteriormente, cuando se
estudien los promotores y los TF (pg. 291).
El modelo del holoenzima, en el que la RNApol-II se une previamente a los TF y luego el conjunto se une al
promotor.
El modelo escalonado, en el que los TF se van asociando a la regin promotora uno a continuacin del otro y
en un cierto orden, y la polimerasa se une al final.
17.4.1.2 Desnaturalizacin del promotor

El complejo de iniciacin produce en la regin de inicio de la transcripcin el desenrollamiento y separacin de
las dos hebras del DNA (una desnaturalizacin local), esencial para la exposicin de las bases como molde a la
RNApol. Esta zona de hebras separadas, burbuja de transcripcin o complejo abierto, es el lugar en el que va a
tener lugar la sntesis de la cadena de RNA. Esta etapa requiere, al igual que el inicio de la replicacin
(pg. 154), una actividad helicasa de DNA, presente ahora en dos de los factores de transcripcin, TFIIF y
TFIIH, con un gasto energtico (hidrlisis del ATP). Otro factor, el TFIIE, estabiliza la regin desnaturalizada
del promotor (papel en cierto modo similar al ejercido por la RPA en la replicacin, pg. 155).
Web 17.5. Formacin de la burbuja de transcripcin en torno a la RNA polimerasa.
Web 17.6. Iniciacin, elongacin y terminacin de la transcripcin.
17.4.1.3 Formacin de los primeros enlaces fosfodister

El enlace fosfodister inicial se forma entre dos ribonucletidos, a partir de sus NTP en forma libre. Uno de
ellos, que con frecuencia es ATP, se empareja con el nucletido +1 en la hebra molde de DNA. El otro se
empareja con el nucletido +2 de la misma hebra.
17:12
Este primer enlace corresponde, por tanto, al extremo 5 del RNA naciente. La reaccin se repite sobre el
extremo 3 del dinucletido resultante, y as sucesivamente hasta formar un oligorribonucletido de unas
10 bases, que permanece unido temporalmente a la hebra molde de DNA como hbrido RNA:DNA. Una vez
que se produzca la transicin a la etapa de elongacin, la polimerasa continuar aadiendo nucletidos a la
cadena de RNA al tiempo que se va desplazando sobre la hebra molde (recorrindola en sentido 3 ! 5).
17.4.1.4 Liberacin del promotor: transicin de iniciacin a elongacin

Web 17.7. Transicin de iniciacin a elongacin en procariotas.
En eucariotas la transicin viene marcada por la fosforilacin del dominio CTD de la RNApol-II (pg. 271):
en la fase de iniciacin participa la forma no fosforilada, mientras en la de elongacin lo hace la fosforilada.
Esta fosforilacin la llevan a cabo el factor de transcripcin TFIIH (pg. 291) y el factor de elongacin P-TEFb.
Como consecuencia, la RNApol-II se desprende de la mayor parte de los TF (lo que se denomina liberacin del
promotor) y comienza a desplazarse a lo largo del DNA.
273
274
III. EXPRESIN GNICA
17.4.2 Elongacin o alargamiento del RNA

La RNA polimerasa contina alargando la cadena de RNA mientras avanza por el DNA, desplazando junto
con ella la burbuja de transcripcin. El complejo de elongacin ya est slo formado por el DNA abierto, la
RNApol y el RNA naciente. Durante este avance continuo ocurre lo siguiente (v. web 17.6):
Por delante de la polimerasa se separan las dos hebras del DNA por ruptura de los puentes de hidrgeno
(avance de la burbuja). La tensin de superenrollamiento resultante debe ser compensada por topoisomerasas (pgs. 80 y 155).
La polimerasa alarga el RNA aadiendo nucletidos al extremo 3 del RNA naciente. El ltimo tramo
permanece dentro de la burbuja, emparejado de manera transitoria como hbrido RNA:DNA.
Por detrs de la polimerasa, la cadena de RNA nuevo se va separando de la hebra molde de DNA, saliendo de
la burbuja y quedando como RNA monocatenario. En el DNA se vuelven a emparejar las dos hebras y se
produce el re-enrollamiento de la doble hlice, de nuevo asistido por topoisomerasas.
Las RNA polimerasas poseen una procesividad muy elevada (pg. 152), que les permite sintetizar la cadena
completa de RNA de una vez, sin separarse del molde. En contraste con la replicacin, ello se consigue sin
protenas accesorias, pues la propia RNApol abraza la cadena de DNA molde.
En cuanto a la tasa de error en la incorporacin de nucletidos correctamente emparejados al molde, es
prxima a uno por cada 10.000, lo cual es unas mil veces superior a la tasa de error de la replicacin. Los
errores en la transcripcin son ms tolerables porque el producto RNA tiene una vida corta y su informacin
gentica no se perpeta en el organismo. La RNApol posee cierta capacidad de correccin de pruebas
(pg. 150), bien mediante la reversin de la reaccin de polimerizacin (actividad pirofosforoltica) o bien
mediante un centro activo separado con actividad hidroltica, ribonucleasa. Esta ltima se ve estimulada por el
factor de elongacin TFIIS.
Para que la elongacin sea eficiente se requiere, adems, la participacin de hasta 16 protenas llamadas
factores de elongacin. Varios de ellos se unen a la cola CTD de la RNApol cuando est fosforilada. Su
actuacin est mediada por varios mecanismos:
(a) Estimulacin de la actividad enzimtica de la polimerasa: factores ELL, CSB y SIII (o elonguina).
(b) Mantenimiento del estado fosforilado del CTD: adems del factor de iniciacin TFIIH, tambin lo fosforila
el factor de elongacin P-TEFb. Cuando el CTD est desfosforilado, se inhibe la elongacin.
(c) Regulacin de la procesividad de la polimerasa: TFIIS (antes llamado SII) reduce las pausas transitorias de la
RNApol, que pueden ser causa de una terminacin prematura. Tambin interviene DSIF.
La eficacia de la elongacin depende de un equilibrio entre acciones de estimulacin y freno. El principal
elemento que regula la procesividad es la protena DSIF, un heterodmero formado por hSPT4 y hSPT5.
Cuando DSIF se une a la protena NELF (negative elongation factor) frena la elongacin. Pero cuando DSIF
es fosforilado en su subunidad hSPT5, se separa de NELF y activa la elongacin. La principal quinasa
responsable de fosforilar hSPT5 es precisamente P-TEFb (positive transcription elongation factor b), la misma
que tambin fosforila el CTD de la RNApol.
17:13
17. Transcripcin
Para completar tan complejo panorama, la presencia junto a la RNApol de algunos de estos factores de
elongacin facilita el reclutamiento de otras protenas necesarias para la maduracin postranscripcional del
mRNA y para la remodelacin de la cromatina (retirada temporal de los nucleosomas, imprescindible para el
acceso de la RNApol a las hebras desemparejadas). La elongacin y la terminacin de la transcripcin y la
maduracin del mRNA estn ntimamente interconectadas y necesitan estar coordinadas con precisin.
17.4.3 Terminacin
El complejo de transcripcin responde a seales especficas para finalizar el proceso, separndose el RNA
formado (v. web 17.6). Los detalles de esta etapa estn an poco caracterizados. En todo caso, la etapa de
terminacin s est relacionada con las seales que marcan la poliadenilacin del extremo 3 de los mRNA. El
resultado final es la separacin de los componentes del complejo de transcripcin y, en el caso de la RNApol-II,
su desfosforilacin para que pueda ensamblarse a un nuevo complejo de iniciacin y comenzar otro ciclo de
transcripcin.
Finalmente, e independientemente de los mecanismos precisos, es importante adelantar que el extremo 3 del
RNA funcional no corresponde al punto donde la polimerasa deja de elongar, debido a que durante la maduracin
postranscripcional se corta la molcula de RNA recin transcrita (pg. 302). Por esta razn es menos importante
precisar la terminacin en eucariotas que en procariotas, y tambin se explica la dificultad del estudio de las
secuencias y mecanismos de terminacin eucariticos (pues es difcil aislar los transcritos primarios, de corta vida).
Web 17.8. Mecanismos de terminacin en procariotas.
La terminacin se produce como consecuencia de la combinacin de dos factores o mecanismos: la

detencin o pausa de la RNA polimerasa y la desestabilizacin del hbrido RNA:DNA. La influencia de estos
dos mecanismos es distinta para cada una de las tres polimerasas eucariticas. A diferencia de procariotas,
parece ser un hecho comn la ausencia de regiones palindrmicas del RNA que participen en la terminacin de
la transcripcin.
17:14
275
276
III. EXPRESIN GNICA
17.5 TRANSCRIPCIN DEL GENOMA MITOCONDRIAL

Como ya se ha indicado, el cromosoma circular mitocondrial humano, y de mamferos en general, lo transcribe
una nica RNApol que est formada por un solo polipptido y que, para la iniciacin, requiere la presencia de
un factor de transcripcin mtTFA. El mtDNA se transcribe a partir de 3 lugares de iniciacin, dos para la hebra
pesada (H1 y H2) y uno para la ligera (L), producindose as tres transcritos primarios diferentes (dos de ellos
complementarios y correspondientes a toda la longitud del cromosoma, 16,5 kb). Los 3 promotores se
encuentran situados en la regin no codificante de control o bucle D (pgs. 161 y 416). An se desconoce si
el inicio en H1 y H2 depende de un mismo promotor o de dos independientes (principal y secundario),
uno de ellos todava desconocido.
Web 17.9. Transcripcin del genoma mitocondrial.
A partir del primer lugar de iniciacin de la hebra pesada (H1) se transcribe el DNA que codifica los
tRNAPhe, rRNA 12S, tRNAVal y rRNA 16S; la transcripcin se detiene tras este ltimo, mediante la
participacin de un factor de terminacin (mTERF). Cuando la transcripcin comienza en el segundo punto
de inicio H2, localizado inmediatamente tras el tRNAPhe, el transcrito primario (L2) contina ms all del
punto de terminacin anterior, completando el resto del cromosoma. Por tanto, el lugar de iniciacin define qu
tipo de RNA, ribosmicos o mensajeros, deben sintetizarse; la seleccin del punto de inicio est, a su vez,
regulada por las hormonas tiroideas. Gracias a esta doble unidad de transcripcin la mitocondria sintetiza
mucha mayor cantidad de RNA ribosmicos que del resto de productos gnicos (unas 60 veces ms).
(Comprese con la situacin anloga en el genoma nuclear, conseguida gracias a la abundancia de la
RNApolI, especializada en transcribir rRNA, pg. 270.)
A partir del promotor de la hebra ligera se sintetiza una sola molcula (que es una hebra pesada, H) que slo
codifica 8 tRNA y un mRNA.
Los 3 transcritos primarios sufren luego maduracin para dar lugar cada uno a varios rRNA, tRNA y
mRNA maduros (pg. 309); del transcrito H se origina tambin el RNA cebador para la replicacin de la
hebra H (pg. 161).
17.6 INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIN

Existe una serie de compuestos que inhiben la transcripcin al actuar sobre la RNA polimerasa a travs de
distintos mecanismos. Poseen inters desde el punto de vista experimental y por su aplicacin como
antibiticos, por mostrar algunos distinta actividad sobre las clulas procariticas y eucariticas.
Web 17.10. Estructura tridimensional de antibiticos inhibidores de la transcripcin.
17.6.1 Antibiticos de tipo I

Este grupo est formado por los compuestos que se unen a la RNA polimerasa y la inactivan de modo directo.
Pertenecen a este grupo:
Rifamicinas (producidas por Streptomyces mediterranei) y sus derivados semisintticos como la rifampicina,
que se unen especficamente a la subunidad b de la RNApol bacteriana, impidiendo el inicio de la
transcripcin. La permanencia sobre el promotor de la enzima inactiva impide la unin de otras
molculas de RNApol no modificadas. Sin embargo, las rifamicinas no tienen efecto sobre las polimerasas
nucleares eucariticas, por lo que se utilizan como agentes bactericidas frente a diversos tipos de infecciones.
La RNApol mitocondrial tambin se ve inhibida, aunque con menor potencia que la procaritica.
Estreptolidigina (producida por Streptomyces lydicus), que tambin se fija a la subunidad b, pero inhibe la
elongacin.
17. Transcripcin
17:15
La a-amanitina es un inhibidor especfico de la etapa de elongacin de la sntesis de RNA en eucariotas y no
en procariotas. Su efecto inhibidor se ha empleado como un aspecto diferenciador entre las tres RNApol
eucariticas (pg. 270). Este agente txico es un mecanismo de defensa de la seta venenosa Amanita
phalloides para evitar su ingestin. La intoxicacin no provoca sntomas inmediatos, sino el deterioro de
la funcin heptica en los das siguientes, debido a la falta de produccin de nuevos mRNA para la sntesis
continua de protenas. Su estructura es de un octapptido bicclico con varios aminocidos infrecuentes.
17.6.2 Antibiticos de tipo II

En este caso, la transcripcin se inactiva de manera indirecta, pues el antibitico se une al DNA impidiendo bien
la unin de la polimerasa o bien su avance. Por ello, se inhiben por igual todas las RNApol, as como las
DNApol (es decir, la replicacin). ste es el caso de la actinomicina D, sintetizada por varias especies de
Streptomyces, formada por dos pentapptidos cclicos unidos a un sistema anular plano de fenoxazona. ste se
intercala en la doble hlice del DNA, entre dos pares de bases GC sucesivos, deformando el DNA. Al mismo
tiempo, las dos estructuras pentapeptdicas cclicas abrazan a la doble hlice, situndose en el surco menor. Esta
alteracin impide el movimiento de la DNApol a lo largo del molde. La actinomicina D es muy txica, pues
impide la formacin de los complejos abiertos, bloqueando el paso de cualquier tipo de polimerasa. Al inhibir la
elongacin en clulas intactas y en extractos celulares, es muy til para identificar procesos celulares que
dependen de la sntesis de RNA.
Los intercalantes como la actinomicina deforman la geometra de la doble hlice. En concreto, su insercin
entre los pares de bases apilados los separa alrededor de 0,7 nm y desenrolla parcialmente la doble hlice (unos
23 ). Dicha distorsin coloca al DNA en una conformacin ms parecida a la hlice A y cambia la forma de los
surcos, por lo que las polimerasas no reconocen correctamente el molde.
17:16
277
278
III. EXPRESIN GNICA
Otros compuestos intercalantes son la acridina y sus derivados, que inhiben la sntesis de RNA de una forma
similar, y la daunomicina y sus derivados, que se emplean como quimioteraputicos en diversos tipos de cncer, ya
que actan preferentemente sobre clulas con crecimiento rpido. Por ltimo, el bromuro de etidio, de uso comn en
el laboratorio para la tincin de DNA en electroforesis (pg. 141), es tambin un agente intercalante (aunque no
empleado como antibitico), lo que justifica su toxicidad, que debe tenerse en cuenta durante su manipulacin.
17:17
17.6.3 Antibiticos de tipo III

Los antibiticos de tipo III son tambin inhibidores indirectos, que actan en este caso impidiendo la accin de
la DNA girasa, una de las topoisomerasas procariticas, que introduce superenrollamientos negativos en el
DNA (pg. 156). Se comprueba as que stos son necesarios para la separacin de las hebras de DNA, lo que
permite la replicacin y la transcripcin. Los principales antibiticos en este grupo son la cumermicina, la
novobiocina y los del grupo de las quinolonas, como el cido nalidxico y sus derivados fluorados norfloxacina
y ciprofloxacina.
La girasa es un tetrmero A2B2; la novobiocina se une a la subunidad B, bloqueando la unin e hidrlisis del
ATP, mientras que las quinolonas se unen a la subunidad cataltica A, inhibindola.
17:18
CAPTULO 18
Control de la expresin gnica:

pretranscripcional y transcripcional
18.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA REGULACIN

DE LA EXPRESIN GNICA
18.2 CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL
18.3 REGULACIN EPIGENTICA
18.3.1 Metilacin del DNA
18.3.2 Modificacin de las histonas
18.3.2.1 Acetilacin de las histonas
18.3.2.2 Metilacin de las histonas
18.3.2.3 Otras modificaciones de las histonas
18.3.3 Integracin de las seales epigenticas
18.3.4 Cambios epigenticos en el desarrollo
18.3.5 Cambios epigenticos en el cncer y otras
enfermedades
18.4 REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN
18.4.1 Elementos que actan en cis y trans como
reguladores de la transcripcin
279
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282
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286
287
288
288
18.4.2 Promotores de los genes de clase II

18.4.2.1 Secuencias o elementos basales
del promotor
18.4.2.2 Secuencias o elementos proximales
18.4.2.3 Secuencias o elementos distales
18.4.3 Factores de transcripcin de clase II
18.4.3.1 Factores de transcripcin generales
a) Ensamblaje consecutivo de los factores
generales (modelo "escalonado'')
b) Modelo de la holoenzima
18.4.3.2 Factores de transcripcin proximales
18.4.3.3 Factores de transcripcin inducibles
18.4.3.4 Interaccin de los factores de
transcripcin con la polimerasa
18.4.4 Regulacin de la transcripcin de genes
de las clases I y III
288
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290
290
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293
293
295
18.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

La visin global del control de la expresin gnica es especialmente difcil en los eucariotas, particularmente en
organismos pluricelulares. Por ejemplo, aunque todas las clulas humanas contienen el mismo genoma (salvo
mutaciones somticas), existen claras diferencias frente a las clulas procariticas. Es todo un reto al conocimiento comprender cmo las clulas de organismos complejos, procedentes del desarrollo de una sola (el
cigoto) y conteniendo un DNA idntico, son capaces de expresar funciones tan diferentes y nicas en cada
rgano o tejido particular. Esta enorme flexibilidad en el control de sus genes viene determinada por los
siguientes tipos de expresin gnica diferencial:
a) Distintos tipos celulares en cada especie y, dentro de stas, en cada rgano o tejido. En el ser humano se
calculan unos 200 tipos celulares, agrupados en familias segn su funcin especfica: clulas epiteliales,
contrctiles, sanguneas, del sistema inmunitario, sensoriales, neuronales, etc.
b) Variedad en el nmero de genes en cada especie. En el ser humano existen entre 20.000 y 25.000 genes.
c) Proporcin de genes expresados en cada tipo celular. Una clula humana slo expresa en cada momento
entre 10 y 20% del total de genes (es decir, entre 2.000 y 5.000).
d) Influencia sobre la expresin de cada gen de los estadios del ciclo de divisin celular y del desarrollo del
individuo, necesidades metablicas o de otro tipo, respuesta a agentes externos, etc.
Dentro de estas posibilidades, es de destacar la variacin de la expresin gnica durante el proceso de
diferenciacin celular, es decir, la adquisicin de propiedades especficas por parte de las diversas clulas de un
organismo, que tiene lugar especialmente durante la embriognesis. Ello hace que existan genes que no
responden a cambio fisiolgico alguno o que, por el contrario, estn sometidos a fuerte control como parte
del desarrollo, de la organizacin de clulas en tejidos y de los tejidos en organismos completos.
279
280
III. EXPRESIN GNICA
La expresin de los genes de un organismo superior puede regularse en distintos puntos del proceso de
expresin gnica. Desde el punto de vista patolgico es tambin importante resaltar que la alteracin
de cualquiera de los pasos implicados en la expresin gnica puede causar enfermedades.
18:1
El estudio en profundidad de todos estos puntos de control debe hacerse en tratados especializados. En este
texto slo trataremos de desglosar de forma paulatina lo esencial, cada uno de ellos dentro de su correspondiente proceso de expresin gnica (Captulos 18, 19 y 21).
18. Control de la expresin gnica: pretranscripcional y transcripcional
18.2 CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL

El inicio de la transcripcin requiere que la maquinaria molecular responsable (RNA polimerasa y factores
de transcripcin, pg. 288) pueda acceder fsicamente a las bases nitrogenadas de la hebra de DNA que se ha de
transcribir. Ello supone la descondensacin previa del cromosoma durante la fase G1 del ciclo de divisin
celular (pg. 100) y, particularmente, la descondensacin ms completa de las regiones correspondientes a
cada gen que deba transcribirse en un momento y circunstancias determinados.
La transcripcin no puede tener lugar sobre DNA en estados de condensacin superiores a la fibra de
10 nm (cadena de nucleosomas, pg. 85). En ocasiones, el DNA se puede transcribir cuando se encuentra
formando complejos con las histonas (nucleosomas), pero tambin puede ser necesario que stos se
desensamblen para permitir el acceso al DNA. En general, la accesibilidad del DNA a la transcripcin, o
actividad transcripcional de la cromatina, est relacionada estrechamente con el grado de condensacin
(pg. 88) y puede valorarse experimentalmente, por ejemplo, midiendo la sensibilidad a la accin de
DNasas.
Se puede considerar que el acceso al DNA necesario para la transcripcin es una combinacin de tres
mecanismos:
a) Posicin precisa de los nucleosomas. El reconocimiento de las secuencias promotoras del DNA por los
factores de transcripcin (pg. 288) puede tener lugar, al menos en algn caso, gracias a una posicin
muy especfica de los nucleosomas, de forma que tales secuencias queden en la regin internucleosmica
(DNA espaciador, pg. 86) o, si forman parte del nucleosoma, queden orientadas hacia su superficie
externa.
18:2
b) Retirada de los nucleosomas. Tanto el reconocimiento de las secuencias promotoras por los factores de
transcripcin como la unin y avance de la RNApol pueden requerir la liberacin de las histonas, o al menos
el desplazamiento de posicin de los nucleosomas, para hacer el DNA accesible. Se han encontrado
protenas capaces de efectuar este remodelado de la cromatina gracias a la hidrlisis de ATP.
18:3
c) Avance compatible con la presencia de nucleosomas. La transcripcin puede tambin tener lugar en
regiones de DNA con nucleosomas ntegros; posiblemente, la RNA polimerasa se desplaza a lo largo de
la fibra de 10 nm, transcribiendo una hebra gracias a un desensamblado parcial y reversible de los
nucleosomas a su paso.
281
282
III. EXPRESIN GNICA
18:4
Un factor importante en los mecanismos b y c anteriores es la modificacin covalente experimentada por las
histonas. Tal modificacin se considera parte de los mecanismos epigenticos de regulacin, que se describen a
continuacin.
18.3 REGULACIN EPIGENTICA

El control de la transcripcin debe plantearse de acuerdo con dos componentes, ambos relacionados aunque
de modo distinto con la estructura del genoma: la secuencia de bases (regulacin gentica) y las modificaciones
experimentadas por el DNA y las histonas sin afectar a la secuencia (regulacin epigentica).
Se puede describir la epigentica como el estudio del conjunto de cambios en el patrn de expresin gnica
que no implican alteracin de la secuencia del DNA y son heredables. De forma ms concreta, corresponde al
conjunto de marcas moleculares y mecanismos que sealizan y perpetan la actividad funcional de las
diferentes regiones de la cromatina a travs de su estado de condensacin (pg. 88).
Se trata, pues, de una regulacin ejercida a nivel pretranscripcional, que tiene consecuencias sobre el
fenotipo y es importante para explicar la diversidad morfolgica y funcional de clulas que poseen un
mismo genoma. Bajo el concepto de epigentica se incluyen la metilacin del DNA en residuos de citidina,
diversas modificaciones covalentes reversibles de las histonas (en particular en las colas amino-terminales
de H3 y H4, pg. 87), la remodelacin de los nucleosomas y la reorganizacin de la cromatina a mayor
escala.
18.3.1 Metilacin del DNA

En el DNA de vertebrados una parte de los residuos de citidina (en torno al 4% en los seres humanos) se
encuentran metilados. Esta metilacin aparece de manera casi exclusiva sobre la secuencia dinucleotdica
CG, que adems es especialmente abundante en las regiones promotoras de los genes, constituyendo los
denominados islotes CpG. Gran parte de los genes humanos poseen islotes CpG en su promotor y su
primer exn.
Los residuos de citidina presentes en secuencias CG pueden experimentar la metilacin en el carbono 5 de la
citosina, de forma especfica catalizada por DNA metiltransferasas (DNMT) (o simplemente metilasas). La
enzima acta de manera similar a las metilasas que forman parte de los sistemas de metilacin-restriccin en
bacterias (pg. 213) y de la maduracin del mRNA en eucariotas (pg. 301), empleando Sadenosilmetionina como coenzima donadora de los grupos metilo (pg. 19) y, en este caso, con especificidad por citidina
adyacente a guanosina.
18:5
La reaccin opuesta, responsable del proceso de desmetilacin, la cataliza una desmetilasa, que reconoce las
secuencias metiladas mCpG y elimina el grupo metilo de la citosina. Tambin es posible que se elimine la base
completa (mediante una glicosilasa) y luego se reponga la citosina no metilada gracias a los mecanismos de
reparacin del DNA (pg. 402).
Se ha observado que los genes que se transcriben de forma activa en un tejido poseen islotes CpG sin metilar
(o islotes hipometilados), mientras que en los tejidos donde el gen no se expresa s estn metilados (o
hipermetilados). Por tanto, la metilacin de la citosina desempea un papel en la regulacin de la expresin
gnica.
El bloqueo de la transcripcin de un gen como consecuencia de la presencia de grupos metilo en la molcula
de DNA se puede explicar mediante varios mecanismos, no excluyentes:
283
284
III. EXPRESIN GNICA
18:6
18.3.2 Modificacin de las histonas

Las histonas, componentes esenciales de la cromatina (pg. 84), experimentan varios tipos de modificacin
postraduccional una vez que ya estn formando parte de los nucleosomas. Dichas modificaciones covalentes
son reversibles y estn reguladas con precisin mediante parejas de enzimas con accin opuesta. La principal
diana de modificacin son los residuos aminocidos de las colas amino-terminales de las histonas H3 y H4, que
sobresalen de la estructura central del nucleosoma y son por ello fcilmente accesibles (v. web 7.4).
Web 18.1. Reacciones, enzimas y coenzimas implicadas en la modificacin de las histonas.
18.3.2.1 Acetilacin de las histonas

Existen enzimas en la clula que unen grupos acetilo a ciertos residuos de lisina de las histonas. Varias de estas
histona acetiltransferasas (HAT) son factores de transcripcin (en especial, coactivadores, pg. 294).
Asimismo, existen histona desacetilasas (HDAC) que catalizan la reaccin opuesta de eliminacin del grupo
acetilo.
18:7
Los genes activos, los que se estn expresando, corresponden a regiones con histonas acetiladas, mientras
que en las zonas de cromatina transcripcionalmente inactiva las histonas no estn acetiladas. Como ejemplo, el
cromosoma X inactivo en la mujer, en forma de heterocromatina (pg. 88), est hipoacetilado, lo que indica
que esta forma de las histonas es un requisito para la mxima condensacin de la cromatina, mientras que el
otro cromosoma X, transcripcionalmente activo, tiene un grado de acetilacin normal.
Adems del efecto directo del cambio de carga sobre la interaccin entre histonas y DNA nucleosmico, los
residuos de lisina acetilada los reconocen ciertas protenas, actuando as como seal para la asociacin de ms
factores relacionados con la condensacin de la cromatina. Por ejemplo, uno de los TAF que forman el factor de
transcripcin TFIID y alguna histona acetiltransferasa poseen una regin denominada bromodominio, que se
une a la lisina acetilada.
18.3.2.2 Metilacin de las histonas

Otra modificacin comn es la adicin de grupos metilo a los residuos de lisina y arginina. La reaccin,
con S-adenosilmetionina como donador del grupo metilo, la catalizan histona metiltransferasas (HMT); se
han identificado mltiples enzimas diferentes, que son especficas para modificar residuos concretos de
una histona en particular y asimismo en cuanto al nmero de metilos que pueden aadir (hasta 3 metilaciones sucesivas en la lisina, dos en la arginina). La modificacin se revierte por la accin de histona desmetilasas.
En este caso, no existe una clara alteracin de la carga elctrica, sino que el residuo mono-, di- o
trimetilado supone una marca o seal que reconocen algunas protenas. La consecuencia es diferente
dependiendo de cul sea el residuo metilado (y del nmero de metilos). Por ejemplo, las metilaciones de
Lys4, Arg17 y Lys36 de la histona H3 activan la transcripcin, mientras que las metilaciones de Lys9 y
Lys27 la reprimen. Los residuos de lisina metilada son tambin reconocidos por protenas, en este caso con
una estructura llamada cromodominio (el nombre deriva de chromatin organization modifier, modificador
de la organizacin de la cromatina).
285
286
III. EXPRESIN GNICA
18.3.2.3 Otras modificaciones de las histonas

Las histonas pueden sufrir otros tipos de modificacin en sus residuos aminocidos, menos frecuentes o con un
papel no tan claramente definido, pero que tambin contribuyen a controlar el estado de condensacin del
material gentico y, en consecuencia, su accesibilidad para la transcripcin.
Fosforilacin en residuos de serina; de forma similar a la metilacin, introduce marcas que reconocen otras
protenas.
Ubicuitinacin en lisinas (es decir, unin de la protena ubicuitina, pg. 377). Por ejemplo, se ha observado
que la ubicuitinacin de H2A y H2B descondensa el nucleosoma.
Sumoilacin en arginina y lisina (adicin de radicales SUMO, small ubiquitin-related modifier). Las
protenas SUMO son similares a la ubicuitina, pero no marcan para la degradacin.
ADP-ribosilacin (unin de ADP-ribosa).
18.3.3 Integracin de las seales epigenticas

Las modificaciones epigenticas no tienen lugar de forma aislada, sino que actan de forma coordinada. La
metilacin del DNA puede ser la seal que provoca la modificacin de las histonas, mientras que en otras
ocasiones sucede al contrario; adems, muchas reacciones sobre las histonas tienen como resultado la
captura o reclutamiento de las enzimas responsables de otras modificaciones adicionales. Se puede resumir
esto como una accin sinrgica de las diferentes seales epigenticas. De acuerdo con ello, las marcas
epigenticas definen compartimentos o dominios en el genoma: activos (eucromatina), potencialmente
activos (heterocromatina facultativa) y silenciados (heterocromatina constitutiva) (pg. 88). Como
ejemplo:
En la eucromatina predominan la hipometilacin del DNA, la fosforilacin de la histona H3, la acetilacin
de H3 y H4, y la metilacin de H3 y H4.
La heterocromatina constitutiva se caracteriza por la metilacin del DNA, la hipoacetilacin de H3 y H4, y
la trimetilacin de Lys9 de H3 y Lys20 de H4.
En la heterocromatina facultativa abundan los islotes CpG metilados, la hipoacetilacin de H3 y H4, la
trimetilacin de Lys27, la dimetilacin de Lys9, la metilacin de Lys36 (todas en H3) y la mono- o
dimetilacin de Lys20 en H4.
Como ejemplos de situaciones reguladas por mecanismos epigenticos pueden mencionarse:
La inactivacin de uno de los cromosomas X en las mujeres (pg. 88), asociada con hipermetilacin de
todo su DNA y modificacin de sus histonas.
La supresin en ciertos casos de la expresin de uno de los dos alelos de un gen en cromosomas homlogos,
conocida como sellado gnico o impronta genmica (en ingls, genomic imprinting).
La expresin de genes especficos de tejido durante el proceso de diferenciacin.
En general, el control de la organizacin de la cromatina y de la estabilidad genmica. Por ejemplo, la
completa condensacin de las regiones prximas al centrmero es clave para el reparto correcto de los
cromosomas durante la mitosis.
18.3.4 Cambios epigenticos en el desarrollo

En el cigoto incluso antes, en las clulas germinales primordiales que darn lugar a los gametos se
pierden todas las marcas epigenticas del genoma que luego, al progresar la diferenciacin, deben recrearse
de forma selectiva en cada clula del embrin temprano; esto se denomina reprogramacin, y est estrechamente relacionado con el carcter totipotente, pluripotente o multipotente de cada estadio celular
(pg. 199).
Como manifestacin de la regulacin mediante metilacin del DNA, cada tejido presenta un patrn
caracterstico de metilacin en sus clulas. ste se consigue y conserva durante el desarrollo embrionario,
mediante tres procesos sucesivos de distribucin de los grupos metilo.
18:8
De forma similar, se reproduce el patrn especfico de modificacin de las histonas (lo que se ha llamado el
cdigo histnico). Para que el DNA se replique en cada divisin celular las histonas deben separarse; una vez
que ha pasado la polimerasa, las molculas originales de histonas (incluyendo sus marcas epigenticas) se
reasocian con el DNA repartindose entre las dos cadenas hijas y se complementan con histonas de nueva
sntesis. La interconexin mencionada entre las diversas marcas epigenticas permite que las nuevas histonas
reciban rpidamente las modificaciones equivalentes a las antiguas, en cada regin del genoma.
18.3.5 Cambios epigenticos en el cncer y otras enfermedades

Las alteraciones en la regulacin de las seales epigenticas desorganizan la regulacin de la expresin de los
genes, por lo que son causa de numerosas enfermedades. Se ha identificado un componente epigentico, por
ejemplo, en el lupus, el sndrome del cromosoma X frgil, la aterosclerosis, la inmunodeficiencia y el sndrome
de Rett. Destaca, obviamente, la implicacin en procesos cancerosos, dado que la prdida del control transcripcional conduce fcilmente a la proliferacin celular desordenada y a la aparicin de fenotipos alterados,
caractersticos de este grupo de enfermedades (Captulo 26).
Los procesos de metilacin y desmetilacin del DNA se han podido investigar gracias a la observacin en
clulas cancerosas de alteraciones en el patrn de metilacin del DNA, posiblemente responsables de la
modificacin en el programa de expresin gnica caracterstica del proceso tumoral, aunque no su causa
nica. En esas clulas el DNA est globalmente hipometilado, pero al mismo tiempo algunos genes estn
hipermetilados (en concreto, los genes oncosupresores, pg. 456). Esta aparente contradiccin es el resultado,
por mecanismos complejos, de una elevada expresin de ambas enzimas, la metilasa y la desmetilasa. La
hipometilacin provocara la expresin de genes que suelen estar silenciados (incluido el de la desmetilasa), lo
que conduce posiblemente a algunos de los desajustes causantes del cncer, mientras que la hipermetilacin de
los genes oncosupresores bloquea su expresin, eliminndose su funcin natural, el freno de la proliferacin
celular, y conduciendo a la multiplicacin anrquica de las clulas que genera el tumor (Captulo 26).
El conocimiento creciente de las seales epigenticas ofrece un potencial prometedor en la deteccin precoz
del cncer y en la definicin de marcadores con valor pronstico para diferenciar tipos de cncer, as como en la
terapia, pues ya se dispone de varios inhibidores especficos para algunas de las enzimas que modifican el DNA
y las histonas.
287
288
III. EXPRESIN GNICA
18.4 REGULACIN DE LA TRANSCRIPCIN

El mecanismo de control que se ha descrito tradicionalmente como regulador de la transcripcin se basa en el
componente gentico, la secuencia de bases del DNA (por contraposicin al componente epigentico). En
efecto, la expresin de la mayora de los genes eucariticos se controla en el inicio de la transcripcin, por
mecanismos conceptualmente muy similares a los encontrados en bacterias. Esta regulacin se centra en la
interaccin de los promotores con los factores de transcripcin (TF). A fin de simplificar nuestro estudio, se
prestar atencin preferente al control por promotores y TF de la sntesis del mRNA por la RNApol-II, es decir,
la transcripcin de genes de clase II. Ms adelante se describir de forma breve el control de la transcripcin de
los genes de clases I y III.
18.4.1 Elementos que actan en cis y en trans como reguladores de la transcripcin

Debido a la magnitud del genoma eucaritico, el nmero de unidades de transcripcin es mucho mayor que en
procariotas. Adems, cada una de ellas est controlada por varios promotores, con lo que en total el nmero de
stos es an superior (decenas o centenares de miles de promotores en un genoma). Es decir, las regiones
promotoras estn ms extendidas y tienen ms elementos de control en eucariotas que en procariotas.
Un promotor o secuencia promotora es una regin de DNA que regula el inicio de la transcripcin de un gen.
Corresponde, por tanto, a lo que hemos denominado regin reguladora del gen (pg. 264). Actualmente
suelen recibir el nombre tambin de factores que actan en cis, o factores cis, simplemente por encontrarse en la misma molcula de DNA cuya expresin regulan. Existen numerosos promotores, diferentes para
los genes de las clases I, II y III, as como algunos de ellos distintos para cada gen.
Una caracterstica de la transcripcin eucaritica es que su regulacin se debe a la afinidad especfica por los
promotores de ciertas protenas denominadas factores de inicio de la transcripcin, o simplemente factores de
transcripcin (TF). A cada promotor se une un nmero variable de factores de transcripcin, que actan
favoreciendo o dificultando la unin y la actividad de la RNApol o de otros factores de transcripcin y, en
consecuencia, determinando la posicin y la eficacia del inicio de la transcripcin. Por tanto, los TF tienen ms
responsabilidad que la propia RNApol en el reconocimiento de la secuencia del promotor y se encargan de la
regulacin de la transcripcin. Su diversidad es an mayor que la de promotores, lo que permite la gran
flexibilidad existente en el control de la expresin de los genes. Los TF se denominan tambin factores que
actan en trans o factores trans, pues sus genes estn en posicin alejada y no relacionada con aquella
regin gnica cuya expresin regulan. Su capacidad de unin a la molcula de DNA, casi siempre reconociendo
ciertas secuencias de bases, depende habitualmente de que las molculas de TF contienen motivos estructurales
ligantes del DNA, como dedos de zinc, homeodominios, etc. (pg. 58).
La especializacin de las RNApol eucariticas para transcribir slo determinados genes (pg. 270) viene
determinada por la regulacin de estos genes mediante secuencias promotoras y factores de transcripcin
diferentes. Antes de describir los pormenores del control de la transcripcin de los genes de clase II conviene
recopilar la terminologa empleada para las molculas que intervienen. Se distingue as entre promotores para
genes de la clase I, de la clase II y de la clase III. Los factores de transcripcin respectivos se nombran con las
iniciales TF seguidas del tipo de RNApol con la que pueden actuar (I, II o III) y una letra que los identifica (por
ejemplo, TFIIA, TFIIB, TFIID son 3 factores de transcripcin para la RNApol-II).
Polimerasa
(enzima)
Genes que
transcribe (DNA)
Producto gnico
(RNA o protena)
Promotores
(DNA)
Factores de transcripcin
(protenas)
RNApol-I
de clase I
rRNA de 28S, 18S y 5,8S
de clase I
TFI
RNApol-II
de clase II
protenas y snRNA
de clase II
TFII
RNApol-III
de clase III
tRNA, rRNA de 5S
y RNA pequeos
de clase III
TFIII
18.4.2 Promotores de los genes de clase II

La regulacin de los genes de clase II (transcritos por la RNApol-II) posee mximo inters por ser responsable
de la sntesis de los mRNA y, por tanto, de la sntesis de todas las protenas. Sus promotores se localizan
habitualmente en direccin 5 del origen de transcripcin (cadena arriba) y muestran una mayor variacin de
secuencia que los promotores de clases I y III.
Los promotores en general, pero de forma caracterstica los de clase II, se pueden dividir en 3 categoras,
de acuerdo con su accin y con su ubicacin. Su funcin se comprender mejor al estudiar los factores de
transcripcin que se unen a ellos.
18.4.2.1 Secuencias o elementos basales del promotor

El promotor basal comprende las secuencias que definen el punto de inicio de la transcripcin y son imprescindibles para que sta comience. Es una regin situada en posicin adyacente al origen de transcripcin y se
extiende, segn los casos, entre la posicin 37 y la +32. Dentro de esta regin se ubican dependiendo del gen
distintas combinaciones de unas pocas secuencias caractersticas, presentndose habitualmente entre 2 y 4 de
ellas.
18:9
18.4.2.2 Secuencias o elementos proximales

En general, el promotor basal no es suficiente por s mismo para provocar el inicio de la transcripcin, sino que
se requiere la intervencin adicional de otra regin conocida como promotor proximal. ste est cercano al
promotor basal, pero ms alejado cadena arriba del origen, comnmente entre las posiciones 30 y 200. Es
decir, esta regin de DNA suele ser de mayor tamao que la del promotor basal. Los elementos proximales no
especifican la posicin de inicio, sino que determinan la frecuencia con la que se produce el inicio de la
transcripcin. Ello es posible gracias a que sobre ellos se unen diversos factores de transcripcin que favorecen
la interaccin de la RNApol-II con el DNA en el punto de inicio y su actividad enzimtica. Aunque en general
las secuencias son ms variadas que las basales, las dos ms caractersticas son la caja o secuencia CAAT, entre
60 y 80, y la caja GC, que aparece en copias mltiples y con cualquier orientacin a ambos lados de la caja
CAAT.
18:10
289
290
III. EXPRESIN GNICA
18.4.2.3 Secuencias o elementos distales

La expresin de algunos genes sufre una regulacin an ms compleja, que depende de secuencias situadas a gran
distancia del punto de inicio, incluso a varios miles de pb, cadena arriba o cadena abajo. Esto ocurre en especial
para los genes inducibles, los que no se expresan continuamente en la clula, sino cuya expresin sufre una
regulacin amplia y precisa como respuesta a diversas seales (por ejemplo, las hormonas esteroides y tiroideas).
En general se denominan secuencias promotoras distales, por encontrarse alejadas del origen, o tambin, de
acuerdo con su funcin, elementos especficos de regulacin, mdulos de control o elementos de respuesta.
Algunos autores prefieren incluir como promotores nicamente los elementos basales y proximales,
dejando a los distales como secuencias reguladoras. No obstante, atendiendo al concepto funcional de gen
(pg. 263) parece apropiado contemplar estas secuencias promotoras tambin como parte del gen.
18:11
Estas secuencias promotoras son muy variadas y especficas para cada gen. Otra particularidad es que
actan tanto activando la transcripcin como frenndola. De acuerdo con ello, se clasifican en tres tipos:
Potenciadores, activadores, intensificadores, amplificadores o estimuladores (enhancers). Pueden aumentar
mucho la velocidad de inicio de la transcripcin (y, por consiguiente, la del proceso completo) conseguida a
partir de promotores basales y proximales situados en la misma molcula de DNA.
Silenciadores o inhibidores (silencers). Tienen el efecto opuesto, en general debido a que los factores de
transcripcin que se unen a ellos compiten con la accin de aquellos especficos para los promotores
potenciadores y proximales.
Aisladores (insulators). En esta categora se incluyen ciertas secuencias que impiden que la accin de
potenciadores y silenciadores se extienda ms all de ellas. Se ha propuesto que los factores que se unen a
ellos forman lazos en la cromatina, que quedan as aislados del resto evitando que los factores de
transcripcin que se unen a los promotores distales se desplacen ms all. Ms que meras barreras fsicas
deben considerarse como reguladores, pues interaccionan de manera especfica con diversas protenas.
Quiz parezca extrao que secuencias tan alejadas puedan actuar sobre el inicio de la transcripcin. En
realidad, esta lejana es relativa, considerando el giro de la cadena en la doble hlice y el enrollamiento de sta en
torno a los nucleosomas. Adems, la molcula de DNA (con o sin nucleosomas) es flexible y regiones distantes
pueden acercarse sin problemas.
18.4.3 Factores de transcripcin de clase II

La RNApol-II interacciona con gran variedad de factores de transcripcin (TFII) dependiendo del gen, habitualmente de forma simultnea con un nmero considerable de ellos. Estos factores se pueden clasificar en
generales, proximales e inducibles, de acuerdo con su unin a uno de los 3 tipos de secuencias o elementos
promotores recin estudiados. Se estudiarn a continuacin con cierto detalle los que actan sobre el promotor
TATA, mejor conocidos.
18.4.3.1 Factores de transcripcin generales

Reciben este nombre los TF que reconocen los elementos basales de un promotor. Son protenas muy conservadas evolutivamente, que promueven la formacin alrededor del punto de inicio de un complejo plurimolecular que incluye el promotor basal, los propios TF generales y la RNApol-II. Se puede afirmar que al
reconocer el promotor basal actan de mediadores para que se fije la polimerasa, definiendo as el punto de
inicio de la transcripcin y activando a la enzima para que comience a sintetizar el RNA.
Se conocen las funciones de algunos de los factores de transcripcin generales asociados a la RNApol-II:
TFIID es el ms significativo de todos ellos. Este factor determina que la RNApol-II acte a una cierta
distancia del promotor, definiendo as el punto de inicio de la transcripcin (nucletido +1). Adems, la
interaccin asimtrica con TFIIB (descrita ms adelante) define el sentido de la transcripcin. TFIID tiene
mayor tamao incluso que la polimerasa (cerca de 800 kDa), pues est formado por dos tipos de
componentes:
Una molcula de TBP, o protena ligante de TATA (TATA binding protein), que confiere a TFIID la
capacidad para reconocer la secuencia promotora. Su unin a sta es el primer paso en la formacin
del complejo de inicio, con la particularidad de unirse en el surco menor del DNA (a diferencia de la
mayora de protenas, que se unen al DNA en el surco mayor) y as provocar la flexin de la molcula
de DNA.
Varias molculas de TAFII o factores asociados a TBP (TBP-associated factors), diferentes entre s y
que pueden variar para la unin a promotores diferentes. Son subunidades de 30 a 250 kDa que
forman parte del TFIID en nmero de 9 a 12, habitualmente. El papel de los TAF va ms all de una
activacin genrica: muchos son protenas reguladoras y especficas de un tejido, otros son mediadores en la interaccin con otras protenas reguladoras. Algunos TAF reconocen de manera directa las
secuencias Inr, DPE y MTE.
A travs de TBP, el TFIID posee especificidad para unirse a los promotores con caja TATA. A travs de los
diferentes TAF, otras variantes de TFIID pueden unirse a promotores carentes de caja TATA.
TFIIH es particularmente importante por su doble actividad enzimtica, como helicasa y como protena
quinasa, residentes en distintas subunidades (por ello, en ocasiones se denomina TFIIH/TFIIK). La helicasa
(H) est implicada en la separacin de las hebras del DNA en el sitio de inicio, necesaria para el acceso de
la polimerasa a las bases, mientras que como quinasa (K) fosforila el dominio C-terminal de la subunidad
mayor de la RNApol-II (CTD, pg. 271), provocando en sta un cambio conformacional que induce el
comienzo de su desplazamiento a lo largo del DNA, la separacin de algunos TF y, en definitiva, la transicin
entre el inicio y la elongacin de la transcripcin. Este factor de transcripcin es tambin singular porque
interviene en un proceso independiente, la reparacin del DNA por escisin de nucletidos (pg. 401).
Web 18.2. Detalles de la interaccin molecular de TBP con la caja TATA en el DNA.
Para la formacin del complejo de inicio se han propuesto dos mecanismos, cuyo resultado final es el mismo:
a) Ensamblado consecutivo de los factores generales (modelo "escalonado'')
Segn esta hiptesis, los TF y la RNApol-II se van asociando a la regin promotora en un cierto orden uno tras
otro; se considera que cada factor va estableciendo un complejo que posee la estructura adecuada para que se
una el siguiente. La formacin del complejo de iniciacin comienza con la unin de TFIID al DNA en la
secuencia TATA (u otra promotora) y, a continuacin, se van asociando los factores TFIIA y TFIIB, que
permiten la unin de la polimerasa junto con el factor TFIIF. Finalmente se incorporan TFIIE y TFIIH.
Web 18.3. Asociacin de los TFII y la RNApol-II sobre el DNA para formar el complejo de inicio.
291
292
III. EXPRESIN GNICA
b) Modelo de la holoenzima
En esta hiptesis alternativa, tambin apoyada por estudios in vitro, la RNApol-II se asocia previamente a
varios factores de transcripcin, formando una enzima activa u holoenzima, que luego se une al DNA en la
secuencia promotora definida por la unin del TFIID.
18:12
El resultado es el mismo complejo de iniciacin que en el modelo escalonado, que permite el comienzo de la
transcripcin, y la polimerasa luego lo abandonara y avanzara igual que se ha indicado en aquel modelo.
18.4.3.2 Factores de transcripcin proximales

Tambin llamados factores ligantes cadena arriba, son protenas que reconocen especficamente los elementos
proximales del promotor, contribuyendo a aumentar la eficiencia de formacin del complejo de inicio o
favoreciendo su actividad sobre la polimerasa. Cada promotor en particular requiere un conjunto preciso de
estos factores para su expresin plena.
Como ejemplos, el factor de transcripcin CTF (o NF1) interacciona con la caja CAAT, siendo aparentemente el mximo responsable de la eficiencia del promotor, mientras que el factor de transcripcin SP1 se une a
las cajas GC (gracias a 3 dedos de zinc) y contacta con TFIID. En tipos celulares concretos existen otros factores
que se unen a las variantes respectivas de caja CAAT.
18:13
Los promotores que slo contienen elementos reconocidos por TF generales y proximales controlan los
denominados genes constitutivos, los que se expresan de una forma constante, a la misma velocidad en todo
momento de la vida celular. En general, se asume que este concepto es sinnimo de genes de mantenimiento
(housekeeping genes), los que se expresan en todas las clulas del organismo; el nombre se debe a que codifican
los productos que aseguran las funciones indispensables para la vida de la clula. Ambos conceptos incluyen
tanto genes que se transcriben con eficiencia, porque sus productos gnicos se precisan en forma abundante,
como genes que se transcriben a baja velocidad porque sus productos se necesitan en pequea cantidad, pero
siempre de forma continua en ambos casos.
18:14
18.4.3.3 Factores de transcripcin inducibles

Este tercer grupo de factores de transcripcin lo constituyen aquellos que reconocen los elementos distales del
promotor. All actan de forma similar a los factores proximales, es decir, facilitando la formacin y la
actividad del complejo de inicio de la transcripcin o, por el contrario, dificultndolas. Regulan, por tanto,
la transcripcin tanto de forma positiva como negativa (de acuerdo con ello, sus promotores sern potenciadores o silenciadores, pg. 290).
A diferencia de los generales y proximales, estos factores de transcripcin no estn presentes en la clula de
forma continua, sino que se sintetizan o se activan en momentos especficos o en tejidos particulares. Como
consecuencia, la expresin de los genes cuya transcripcin controlan est igualmente regulada en tiempo y
lugar, es decir, se expresan de forma activa en ocasiones y no lo hacen en absoluto en otras; con frecuencia, en
muchos tipos celulares un gen concreto no se expresa nunca. Por ello reciben el nombre de genes inducibles,
regulables o de expresin diferencial (por contraposicin a los genes constitutivos).
Como ejemplo caracterstico se pueden citar los receptores nucleares para hormonas esteroides o tiroideas.
La unin de la hormona cambia la conformacin del receptor, que acta como factor de transcripcin
aumentando su afinidad por ciertos promotores distales, denominados elementos de respuesta a hormonas
(HRE). Como consecuencia, se activa o se bloquea, segn los casos, la transcripcin de genes especficos; los
productos proteicos de estos genes representan para la clula el mecanismo de respuesta a la hormona.
18.4.3.4 Interaccin de los factores de transcripcin con la polimerasa

Cabe preguntarse cmo los factores que se unen a promotores alejados del origen de transcripcin pueden
participar en el complejo de inicio (mecanismos de regulacin a distancia). Para explicarlo se debe considerar la
flexibilidad de la cadena de DNA, que puede permitir la aproximacin fsica de los tres tipos de secuencias
promotoras a pesar de su lejana en la secuencia lineal de DNA.
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III. EXPRESIN GNICA
De esta forma, los factores de transcripcin unidos a las regiones basal, proximales y distales pueden
contactar entre s y con la RNApol-II, por lo que participan al unsono en el control del inicio de la
transcripcin.
Algunos TF no interaccionan de manera directa con la polimerasa, sino que ejercen de intermediarios entre
otros TF; esto es particularmente comn para los elementos promotores distales. Se han identificado protenas
o complejos de protenas que cooperan con los factores activadores, conectndolos con la maquinaria basal
para regular la transcripcin. Por esta razn, se conocen como coactivadores o tambin cofactores generales;
entre ellos se incluyen algunos TAF (pg. 291). Un coactivador puede, pues, definirse como una protena que
es necesaria para que acten los activadores que se unen al DNA, pero no para la transcripcin basal, y que no
se une por s mismo a una secuencia especfica del DNA. Habitualmente los coactivadores poseen mltiples
subunidades, lo que les permite recibir seal de distintos potenciadores. A uno de los mejor conocidos, bastante
bien conservado entre especies, se le ha puesto el nombre de mediador; con 20 subunidades, es ms grande que
la polimerasa. Mediador interacciona con activadores y con el dominio CTD de la polimerasa, y puede regular
la actividad quinasa de TFIIH/K.
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18.4.4 Regulacin de la transcripcin de genes de las clases I y III

Como ya se ha indicado, las secuencias promotoras y el conjunto de factores de transcripcin empleados
por cada una de las RNA polimerasas eucariticas son diferentes (pg. 288). La diversidad de promotores
y TF para el inicio por RNApol-I y III es muy inferior a la correspondiente a la RNApol-II. Esto puede
reflejar simplemente el menor nmero de genes que transcriben aquellas dos enzimas: la RNApol-I
sintetiza un solo transcrito primario (el precursor grande de RNA ribosmico), mientras que la
RNApol-III transcribe unos pocos genes (el pre-rRNA 5S, los cerca de 40 tRNA y algunos RNA pequeos, pg. 270). Ello contrasta con las decenas de miles de genes proteicos de cuya transcripcin es responsable la RNApol-II, por lo que necesita una maquinaria ms compleja para su regulacin individual,
como se acaba de estudiar.
Los promotores de genes de la clase I (para RNApol-I) se localizan, al igual que los de la clase II estudiados
hasta ahora, en direccin 5 del punto de inicio (cadena arriba).
18:18
Entre los genes transcritos por la RNApol-III se encuentran el de rRNA 5S, los de tRNA, el del snRNA U6
(uno de los nucleares pequeos que intervienen en la eliminacin de intrones; pg. 304), algunos microRNA y
otros RNA pequeos; todos ellos tienen promotores y TF diferentes. Los promotores de rRNA 5S y tRNA
aparecen en direccin 3 del inicio (cadena abajo), situndose dentro de la regin estructural del gen; por ello se
llaman regiones internas de control (ICR). La posicin e identidad de las secuencias promotoras y de los
correspondientes TF son diferentes para los genes de rRNA 5S, tRNA y snRNA.
18:19
Web 18.4. Estructura del factor TFIIIA y su interaccin con el DNA.
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III. EXPRESIN GNICA
Web 18.5. Diferentes promotores y factores de transcripcin usados por la RNApol-III.
Cabe resaltar que en la iniciacin por las 3 RNA polimerasas intervienen sendos factores de transcripcin
con varias subunidades (SL1, TFIID y TFIIIB) una de las cuales es la protena ligante de TATA, TBP. Las otras
subunidades son TAF especficos para cada tipo de promotor. Mientras que en los genes de tipo II TBP es el
factor inicial que reconoce la caja TATA (pg. 291), esta secuencia no existe en los otros casos (genes de tipo I
y III). En ellos, TBP no se une directamente al DNA reconociendo la secuencia promotora, sino que requiere
otros factores de transcripcin para asociarse. Parece que TBP desempea una funcin comn a los 3 tipos de
promotores: la interaccin con la polimerasa respectiva para situarla en el punto de inicio.
CAPTULO 19
Maduracin del RNA

o procesamiento postranscripcional
19.1 INTRODUCCIN
19.1.1 Matizaciones al concepto de gen
19.2 CARACTERSTICAS DIFERENCIALES
DE LA MADURACIN
19.3 PROCESAMIENTO DEL RNA MENSAJERO
19.3.1 Modificacin del extremo 5
19.3.1.1 Formacin de la caperuza 5
19.3.1.2 Metilacin de la caperuza 5
19.3.2.1 Formacin del extremo 3 y su relacin
con el final de la transcripcin
19.3.2.2 Poliadenilacin del extremo 3
19.3.3 Ayuste: eliminacin de intrones y empalme de exones
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298
298
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19.4
19.5
19.6
19.7
19.3.3.1 Magnitud de los intrones

19.3.3.2 Secuencias que delimitan el intrn
19.3.3.3 Formacin del ayustosoma
19.3.3.4 Mecanismo de la reaccin
19.3.3.5 Otros tipos de intrones
19.3.4 Riboedicin
PROCESAMIENTO DE LOS RNA RIBOSMICO
Y TRANSFERENTE
FORMACIN DE RNA INTERFERENTES
MADURACIN DEL RNA MITOCONDRIAL
REGULACIN POSTRANSCRIPCIONAL
DE LA EXPRESIN GNICA
19.7.1 Ayuste alternativo
303
303
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19.1 INTRODUCCIN
La transcripcin del DNA es un proceso que no difiere, en esencia, entre procariotas y eucariotas: las RNA
polimerasas se unen a secuencias promotoras especficas, y se realiza la sntesis en direccin 5 ! 3 a lo largo
del gen. Sin embargo, surgen importantes diferencias entre ambos tipos de clulas cuando se considera la
formacin del RNA funcional.
Se llama transcrito primario o precursor del RNA a la molcula de RNA que resulta directamente del proceso
de transcripcin. Todos los transcritos primarios poseen la misma secuencia que el fragmento correspondiente de
la hebra no transcrita (codificante, pg. 267) del DNA, salvo por la presencia de U en lugar de T. Para todos los
tipos de RNA eucaritico y para los tRNA y rRNA procariticos el transcrito primario es diferente de la
molcula funcional de RNA, que se genera a partir de l. En contraste, para el mRNA procaritico el transcrito
primario ya es la molcula funcional; esto permite su empleo inmediato para la traduccin (que ocurre incluso
antes de finalizar su sntesis por transcripcin, pues no existe compartimentacin subcelular, pgs. 262-263).
Los precursores de los diversos tipos de RNA formados en el ncleo eucaritico no pueden desempear
directamente su funcin (en el caso del mRNA, su utilizacin como molde para la traduccin), sino que han de
convertirse antes en RNA maduro, funcional, mediante un proceso que recibe el nombre de modificacin o
procesamiento postranscripcional o simplemente maduracin del RNA. sta tiene lugar en el ncleo, y slo
cuando se ha completado las molculas de RNA pueden transportarse al citoplasma, donde ejercen su funcin.
Este transporte tiene lugar mediante el paso de las molculas de RNA maduro a travs de los poros de la
membrana nuclear (poros nucleares).
El procesamiento postranscripcional consiste, de modo general, en una combinacin de las siguientes
reacciones (v. tambin pg. 307):
Modificacin covalente de nuclesidos.

Adicin de nucletidos a los extremos.
Escisin de nucletidos de los extremos.
Divisin de la molcula en varios fragmentos.
Proceso de ayuste, eliminacin de intrones, o corte de intrones y empalme de exones.
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III. EXPRESIN GNICA
Como se ver ms adelante, la maduracin confiere estabilidad al RNA, bsicamente por una mayor
resistencia frente a las nucleasas y por un plegamiento tridimensional compacto (salvo en el caso del mensajero). Asimismo, facilita su reconocimiento por otros componentes celulares, lo que mejora la funcionalidad
para la traduccin.
19.1.1 Matizaciones al concepto de gen

La maduracin postranscripcional es uno de los procesos que dan lugar a situaciones donde la definicin de gen
debe matizarse o forzarse ligeramente (pg. 265). En concreto, pueden citarse dos situaciones:
Un gen se transcribe dando un pre-RNA que se procesa por escisin generando varias molculas de RNA. En
este caso, el concepto de gen se puede aplicar al gen global de partida, puesto que es una unidad de
transcripcin, con sus regiones estructural y reguladora. Sin embargo, tambin es aplicable a cada una de las
regiones parciales de DNA que codifican uno de los RNA finales, pues son stos los productos gnicos
funcionales. Ejemplos de esta situacin los tenemos en los precursores de RNA ribosmico, tanto procariticos como eucariticos (pg. 308), cuyo gen global da lugar a varios rRNA maduros, y tambin en
el DNA mitocondrial, cada uno de cuyos transcritos primarios se procesa dando una combinacin de varios
rRNA, tRNA y mRNA (pg. 309).
El transcrito primario obtenido de una regin de DNA puede en ocasiones sufrir su maduracin por dos
rutas o variantes distintas, dando lugar por ello a dos productos gnicos diferentes. ste es el caso del ayuste
alternativo (pg. 310), donde se pueden emplear dos secuencias diferentes de corte y empalme para la
eliminacin de intrones (pg. 303) dependiendo, por ejemplo, del tejido en el que se exprese el gen o de la
llegada a la clula de diversas seales.
19.2 CARACTERSTICAS DIFERENCIALES DE LA MADURACIN

Las diferencias entre procariotas y eucariotas relativas a la maduracin del RNA se centran en el RNA
mensajero; los tRNA y rRNA sufren una maduracin similar en ambos tipos de organismos. Puesto que,
adems, afecta a la sntesis de protenas, nos centraremos especialmente en el anlisis de la maduracin del mRNA.
En un gen proteico procaritico todo el DNA es codificante (excluyendo la regin reguladora, que en este
captulo no nos interesa considerar, pues no se transcribe), de modo que al transcribirse origina un transcrito
primario que es ya el mRNA funcional, cuya secuencia corresponde exactamente a la del DNA. Es decir, el
mRNA de procariotas es el nico RNA que no requiere maduracin. Por el contrario, la transcripcin de un gen
proteico eucaritico genera un pre-mRNA que debe sufrir una intensa maduracin para transformarse en una
molcula funcional de mRNA. El conjunto de los diferentes pre-mRNA se llama RNA nuclear heterogneo
(hnRNA), porque se observa como una poblacin de molculas de tamao muy variado.
Dentro de las diferencias entre pre-mRNA y mRNA maduro, la ms llamativa es que la secuencia del mRNA
no corresponde por completo a la del pre-mRNA, ni a la del DNA del que se ha transcrito (se dice que se ha
perdido la colinealidad entre DNA y RNA). Esto se debe a que grandes segmentos internos del gen desaparecen durante la maduracin. Estas regiones del DNA que se eliminan del pre-mRNA en su maduracin se
denominan intrones. Aunque son DNA no codificante (pg. 110), deben contemplarse como parte del gen
(pg. 264) pues son esenciales para el desarrollo de su funcin.
Se pueden definir tambin los intrones como regiones no codificantes situadas en el interior de un gen, lo que
da lugar al sinnimo secuencias intercaladas (IVS, intervening sequences). No son intrones aquellas secuencias
que forman los extremos 5 y 3 del mRNA maduro, aunque se trate igualmente de DNA no codificante; por
ello, una tercera definicin de intrn como regin que se transcribe pero no se traduce no es estrictamente
correcta.
Aunque los intrones son caractersticos de los genes eucariticos que codifican protenas, tambin estn
presentes en algunos genes de tRNA y rRNA, en especial eucariticos. En stos el intrn se puede definir
nicamente como la regin de DNA (o de su producto transcripcional, el pre-RNA) que se elimina durante la
maduracin.
Finalmente, las regiones que flanquean a los intrones y que se conservan en el RNA maduro se denominan a
su vez exones. En general, son la parte codificante del gen, pero el primer exn y el ltimo tambin incluyen,
respectivamente, las regiones 5 y 3 no traducidas (5UTR y 3UTR), que no son codificantes.
19. Maduracin del RNA o procesamiento postranscripcional
19:1
Por tanto, el DNA de los genes procariticos de protenas se puede considerar (aunque no es terminologa
frecuente) formado por un exn nico, sin intrones, que al transcribirse origina un transcrito primario tambin
sin intrones. Por el contrario, casi todo el DNA gnico de eucariotas contiene varios intrones y exones, y se
transcribe a precursores de RNA con los mismos intrones y exones. Como parte del proceso de modificacin
postranscripcional se liberan los intrones y se unen los exones.
La formacin del mRNA eucaritico maduro a partir de su correspondiente pre-RNA constituye un modelo
ideal para el estudio del procesamiento postranscripcional, pues sufre todos los tipos de transformacin
implicados en dicho proceso: adicin de nucletidos al extremo 5, metilacin posterior, alargamiento de la
cadena en el extremo 3 y eliminacin de intrones con unin de exones (ayuste, o corte y empalme).
Una vez completada esta maduracin, tambin se produce el paso del mRNA maduro a travs de los poros de la
299
300
III. EXPRESIN GNICA
membrana nuclear hacia el citoplasma, lugar donde se emplear para la sntesis proteica. Se estudiar con
detenimiento cada uno de estos pasos.
19.3 PROCESAMIENTO DEL RNA MENSAJERO

La maduracin del mRNA puede describirse mediante tres tipos de modificaciones, que pueden transcurrir
de forma sucesiva o simultnea, todas ellas realizadas en el ncleo.

El extremo libre 5-PPP del mRNA eucaritico comienza a modificarse muy pronto, poco despus de iniciada la
transcripcin. Se trata de una modificacin covalente que, globalmente, implica tres tipos de enzimas (fosfatasa, guanililtransferasa y metilasas) y que conduce a la incorporacin singular de un nucletido protector
sobre el NTP de la posicin 5 terminal del RNA.
19.3.1.1 Formacin de la caperuza 5

Se realiza en dos etapas: una desfosforilacin previa y una guanililacin a costa de GTP.
19:2
Aunque en la segunda reaccin se transfiere un residuo guanililo, el resultado conjunto de las dos reacciones
es la incorporacin al mRNA de tan slo un residuo de guanosina, es decir, una guanosilacin; se dice que el
mRNA ha sido guanosilado en 5. La estructura terminal resultante se conoce como caperuza de guanina,
caperuza 5 o casquete 5 (del ingls cap). Se trata de una estructura singular, que no se encuentra en ninguna
otra parte de nucletidos ni cidos nucleicos, con respecto a los siguientes criterios:
Unin de dos nuclesidos a travs de un enlace trifosfato.
Un nuclesido (guanosina) unido en sentido opuesto al del resto de la cadena polinucleotdica (enlace trifosfato entre dos posiciones 5).
Esta caperuza ejerce un efecto protector para la molcula frente a las exonucleasas (pues stas slo actan
sobre enlaces 3-5-fosfodister), marca el pre-mRNA para su empleo posterior como sustrato en otras
reacciones de procesamiento en el ncleo y sirve como punto de unin del mRNA a los ribosomas para iniciar
la sntesis proteica.
19.3.1.2 Metilacin de la caperuza 5

Los tres primeros nucletidos de la estructura 5-guanosina-trifosfato-mRNA son entonces modificados por
metiltransferasas (metilasas), que emplean S-adenosil-L-metionina (pg. 19) como coenzima donadora del
grupo metilo (una reaccin similar a la de metilacin de citosinas como modificacin epigentica del DNA,
pg. 283).
La metilacin puede tener lugar sobre varias posiciones:
El nitrgeno 7 de la guanosina terminal, para dar la caperuza de tipo 0, o caperuza de 7-metilguanosinatrifosfato. La reaccin la cataliza la mRNA(guanina-N7-)-metiltransferasa, EC 2.1.1.56.
Adems del anterior, el 2-OH de la ribosa adyacente (primer nucletido original del pre-mRNA; segundo de
la secuencia actual), dando la caperuza de tipo 1. Esta reaccin la cataliza una metilasa diferente, la mRNA
(nuclesido-2-O-)-metiltransferasa, EC 2.1.1.57.
Adems de las dos anteriores, puede metilarse tambin el 2-OH de la ribosa siguiente (segundo nucletido
original; tercero de la secuencia actual), para dar la caperuza de tipo 2.
19:3
301
302
III. EXPRESIN GNICA
Se sabe que las metilasas y las guanililtransferasas se asocian gracias al factor de elongacin hSPT5 al
dominio CTD fosforilado de la RNApol-II (pg. 271) y llevan a cabo la reaccin de procesamiento del RNA
antes de que el transcrito haya alcanzado un tamao de unos 30 nucletidos. Parece, por tanto, posible que
la formacin de la caperuza participe en el cambio de iniciacin de la transcripcin a elongacin.

19.3.2.1 Formacin del extremo 3 y su relacin con el final de la transcripcin
Otra peculiaridad del mRNA eucaritico es que el extremo 3 del mRNA no corresponde a la posicin donde se
termina la transcripcin (que se produce gracias a la interaccin de las RNApol con protenas de pausa
o terminadoras, pg. 275), sino que deriva de la escisin de la molcula de pre-mRNA en una posicin cadena
arriba de su extremo 3. Como consecuencia, el mRNA es ms corto en su extremo 3 que su transcrito primario.
19:4
19.3.2.2 Poliadenilacin del extremo 3

Sobre el extremo 3-OH resultante del corte por la endonucleasa acta una RNA polimerasa especial, que no
usa molde y slo acepta como sustrato al ATP, denominada poli(A) polimerasa (EC 2.7.7.19). Como consecuencia, se aade al RNA un gran nmero de residuos de adenilato (AMP), formando una cola de poliadenilato o cola de poli(A), de longitud tpica entre 40 y 250 nt (como excepcin, los mRNA de histonas carecen
de esta cola). Esta estructura, que permanece intacta hasta la formacin final del mRNA, puede participar en
procesos de gran relevancia, como el transporte del mRNA al citoplasma y la determinacin, en parte, de la
estabilidad y vida media del mRNA (pg. 347).
La presencia de la cola de poli(A) nicamente en los mRNA eucariticos se aprovecha con fines experimentales, para la purificacin del conjunto de mRNA de una clula, empleando tcnicas de afinidad sobre
soportes que contienen cadenas oligonucleotdicas de poli(dT), poli(T) o poli(U), complementarias a la cola
de poli(A) (pg. 139).
19.3.3 Ayuste: eliminacin de intrones y empalme de exones

La etapa esencial de la maduracin postranscripcional del transcrito primario hasta dar el mRNA eucaritico
consiste en la eliminacin de los intrones y la unin o empalme de los exones. Este proceso se conoce como corte
y pegado, corte y empalme o ayuste (en ingls, splicing).
19.3.3.1 Magnitud de los intrones

Debe recordarse que los genes eucariticos, en especial en los vertebrados, se encuentran casi siempre interrumpidos por intrones, que separan las regiones codificantes o exones (pgs. 298-299). Como excepcin, las
histonas son uno de los escasos ejemplos de genes que carecen por completo de intrones. Lo ms frecuente es
que la longitud total de los intrones supere ampliamente a la suma de los exones, por lo que el tamao del gen
depende de forma notable del nmero y longitud de sus intrones. Aunque las cifras son variables, se habla de
hasta 40 intrones por gen y de una longitud de hasta 20 kb por intrn. Los exones son de tamao mucho ms
pequeo, habitualmente inferior a 1 kb.
19.3.3.2 Secuencias que delimitan el intrn

La eliminacin de un intrn est determinada por su secuencia, y no por su longitud. Slo intervienen tres
secuencias especficas: dos que definen los extremos del intrn y otra en su interior, conocidas en su conjunto
como sitios o centros de ayuste (centro 5, centro 3 y centro de ramificacin). Todos los sitios de ayuste parecen
ser equivalentes, mientras que la secuencia del resto del intrn no tiene trascendencia sobre el proceso.
19:5
Un cambio en el sitio de corte (por ejemplo, por mutacin de uno de los nucletidos consenso esenciales)
dara lugar a un ayuste errneo: se utilizara para el corte y empalme la siguiente secuencia consenso, si la
hubiera, con lo que el intrn o parte de l quedara incluido en el mRNA. Esto conducira a la sntesis de un
polipptido alterado, con una insercin grande en su secuencia de aminocidos, o incluso con cambio
de toda la secuencia a partir del punto de alteracin debido a un desplazamiento del marco de lectura
(pg. 391).
303
304
III. EXPRESIN GNICA
19.3.3.3 Formacin del ayustosoma

El corte de intrones y empalme de exones est mediado por una asociacin macromolecular denominada
ayustosoma (spliceosome; tambin, cuerpo o complejo de empalme). ste se forma por asociacin del
pre-mRNA (en la regin de los centros de ayuste) con varias ribonucleoprotenas nucleares pequeas
(snRNP, denominadas U1, U2, U4, U5 y U6), constituidas cada una de ellas a su vez por un RNA nuclear
pequeo (snRNA, del mismo nombre) y cerca de 10 protenas. El tamao del ayustosoma es de unos
3.000 kDa, con un coeficiente de sedimentacin de 60S, similar a la subunidad mayor del ribosoma
eucaritico.
Tipos, tamao y funcin de los RNA nucleares pequeos (snRNA)

Tamao (nt)*
Funcin de la snRNP respectiva

(U1, U2, U4, U5 y U6 participan en el ensamblado del ayustosoma
por interacciones mutuas)
U1
165
Ayuste: reconoce y se une al extremo 5 del intrn (por emparejamiento de bases)
U2
188
Ayuste: se une al centro de ramificacin (empareja sus bases, salvo la A esencial), lo acerca
al centro 5; forma parte del centro cataltico
U3
210
Procesamiento del pre-rRNA
U4
142
Ayuste: inicialmente asociado con U5 y U6, acerca U6 al sitio 5
U5
116
Ayuste: se asocia inicialmente con U4 y U6; se une a ambos extremos del intrn
U6
107
Ayuste: asociado inicialmente con U4 y U5; junto con U2 forma el centro cataltico
U7
65
Procesamiento del extremo 3 de los pre-mRNA de histonas
U11
131
Terminacin y poliadenilacin de los pre-mRNA
snRNA
Corresponden a los snRNA de mamferos; en levaduras son de 2 a 10 veces mayores
Este ayustosoma es necesario tanto para el reconocimiento de los puntos de escisin como para la catlisis.
19:6
19.3.3.4 Mecanismo de la reaccin

La reaccin de ayuste supone, aparentemente, la ruptura de dos enlaces fosfodister (los que separan el intrn
de ambos exones) y la formacin de un nuevo enlace fosfodister entre los dos exones. Sin embargo,
el mecanismo catalizado por el ayustosoma no transcurre de esa forma: no hay accin de nucleasas y ligasa,
sino dos reacciones de transesterificacin:
Web 19.1. Reaccin de ayuste del mRNA.
En primer lugar, se escinde el transcrito primario en el extremo 5 del intrn, mediante un ataque nuclefilo
del 2-OH del adenilato del centro de ramificacin. Quedan as unidos ambos por un enlace fosfodister
atpico 5-2, y se libera el exn 1 con un extremo libre 3-OH.
A continuacin, se escinde el centro de ayuste 3, por ataque nuclefilo del extremo 3-OH libre del exn 1,
con lo que quedan ya unidos los dos exones y el intrn se libera con su extremo 3-OH libre y su extremo 5
formando un lazo (en ingls lariat; curiosamente derivado de la palabra espaola la reata). En ste, la
adenosina del centro de ramificacin est enlazada de manera simultnea a 3 nuclesidos por sendos enlaces
fosfodister en sus posiciones 2, 3 y 5. El intrn en lazo se degrada luego rpidamente.
Como se puede observar, en ambas etapas se escinde un enlace fosfodister a la vez que se forma otro,
en sendas reacciones de transfosforilacin (un tipo de transesterificacin). Como consecuencia, las reacciones
transcurren sin gasto energtico apreciable, no hay consumo de ATP. Sin embargo, s que se requiere hidrlisis
de ATP para el ensamblado previo del ayustosoma y para la separacin de emparejamientos temporales tanto
dentro de las snRNP como entre los snRNA y el mRNA (gracias a actividades similares a helicasa).
Para finalizar, cabe destacar que el centro cataltico del ayustosoma est formado por los snRNA U2 y U6;
aunque se requiere la presencia de las protenas componentes de las snRNP, slo actan como soporte para
la adecuada conformacin del RNA y no intervienen en la catlisis directamente. Se trata, pues, de un ejemplo
ms de ribozima.
19.3.3.5 Otros tipos de intrones

La descripcin anterior corresponde al proceso de corte de los intrones de genes de mRNA eucariticos.
Existen, adems, otros tipos de intrones, en funcin de su ubicacin en distintos genes y de caractersticas
concretas del mecanismo de maduracin. Se clasifican en 4 tipos:
Grupo I: incluye los intrones de algunos genes que codifican rRNA (nucleares, mitocondriales y de cloroplastos), RNA de orgnulos, tRNA de bacterias y mRNA de bacterifagos. Su procesamiento requiere, como
cofactor externo, un nuclesido o nucletido de guanina (guanosina, GMP, GDP o GTP; su grupo 3-OH acta
como nuclefilo). El proceso de corte y empalme no utiliza ATP como fuente de energa.
Grupo II: aparecen en genes que codifican mRNA de orgnulos, y en algunos mRNA de bacterias y arqueas.
No requieren cofactor externo, sino que emplean el 2-OH de un residuo adenosina del propio intrn,
produciendo intermedios en lazo (pgs. 304-305). En este sentido, se asemejan ms al mecanismo de corte
y empalme recin estudiado, aunque difieren por no existir ayustosoma. Al igual que el grupo I, no se necesita
ATP como cofactor energtico, y experimentan autoayuste, catalizado por el propio RNA en lugar de por
enzimas proteicas clsicas. Estos RNA con funcin autocataltica constituyen uno de los casos de ribozimas
(pg. 72).
Grupo III: es el ms numeroso, incluye los intrones presentes en la mayora de los genes nucleares
eucariticos que codifican mRNA. Su proceso de ayuste, el que ya se ha estudiado (pgs. 303-305), sigue el
mismo mecanismo de formacin de lazo que los intrones del grupo II, pero catalizado por las
ribonucleoprotenas componentes del ayustosoma.
Grupo IV: se encuentran en ciertos genes de tRNA eucariticos y de arqueas. El corte y empalme requiere
ATP, a diferencia de los intrones de los grupos I y II, pues depende de endonucleasas y ligasas (no hay
transfosforilacin).
305
306
III. EXPRESIN GNICA
19.3.4 Riboedicin
En algunos casos, la secuencia de un RNA puede terminar presentando diferencias con respecto a la del DNA
del que procede, aun considerando el resultado de la maduracin de extremos y la eliminacin de los intrones.
Se trata del cambio de uno de los nucletidos por otro diferente; esta modificacin postranscripcional se conoce
como riboedicin o edicin del RNA.
El primer mecanismo que permite este fenmeno es la desaminacin especfica de una base: la citidina se
convierte en uridina, y la adenosina en inosina. Se introduce as un cambio en la secuencia de la protena
traducida a partir del mRNA editado (la inosina emparejar con C en el tRNA, aunque tambin puede hacerlo
con U o A gracias al balanceo, pg. 320).
19:7
Web 19.2. Detalle de las reacciones de desaminacin en la edicin del mRNA.
Existe un ejemplo paradigmtico de riboedicin en el ser humano: el gen de la apolipoprotena B. Como

consecuencia de una riboedicin especfica de tejido, en el hgado se sintetiza la protena completa, apoB100,
mientras que en el intestino se sintetiza la forma truncada, apoB48. Las funciones de ambas isoformas en el
transporte y metabolismo de lpidos son diferentes: apoB100 participa en el transporte del colesterol y los
triacilgliceroles de sntesis endgena, mientras que apoB48 interviene en la distribucin de los lpidos de la dieta
hacia los tejidos.
19:8
Otras formas de edicin incluyen la delecin o insercin de nucletidos (que altera el marco de lectura y, por
ello, cambia radicalmente la secuencia de la protena, pg. 391) y la incorporacin de uridinas transferidas
desde un pequeo RNA llamado RNA gua (gRNA; este mecanismo se ha observado en el genoma mitocondrial del tripanosoma).
19.4 PROCESAMIENTO DE LOS RNA RIBOSMICO Y TRANSFERENTE

Los rRNA y tRNA tambin sufren maduracin postranscripcional, tanto en procariotas como en eucariotas. A
pesar de su importancia, no se expondrn aqu con detalle sus caractersticas; como aproximacin didctica se
considera suficiente como modelo la maduracin del mRNA. Lo mismo puede decirse de la maduracin de
RNA pequeos, como los snRNA.
En procariotas, un solo transcrito primario da lugar, mediante varias reacciones de corte catalizadas por
endonucleasas (RNasas), a los tres rRNA y uno o varios tRNA, los cuales sufren modificaciones adicionales en
sus extremos 3 y 5 y en sus nuclesidos (v. la tabla) hasta dar las formas maduras, funcionales.
En eucariotas, el proceso es similar, con un transcrito primario de la RNApol-I que genera 3 de los 4 rRNA
y con transcritos primarios independientes para el otro rRNA y para cada tRNA (todos sintetizados por la
RNApol-III). Tambin en algunos casos hay eliminacin de intrones.
En el caso de tRNA se produce, adems de un recorte de los extremos 3 y 5, la adicin, a las molculas de
tRNA que no la posean, de la secuencia -CCA en el extremo 3-OH. Los tRNA, en especial, sufren numerosas
reacciones de modificacin qumica que determinan que en las molculas maduras abunden los nuclesidos
infrecuentes (pgs. 15, 19, 65 y 67), diferentes a los cuatro que participan en la sntesis del RNA (A, G, U, C).
Estas modificaciones contribuyen a hacer ms resistentes los tRNA a los procesos de degradacin celular,
aumentando, por tanto, su estabilidad metablica y su vida media.
19:9
307
308
19:10
III. EXPRESIN GNICA
19.5 FORMACIN DE RNA INTERFERENTES

Los microRNA (pg. 69) proceden de genes transcritos por la RNApol-II o la III, generando un transcrito
primario denominado microRNA primario, pri-miRNA. ste posee habitualmente una regin con emparejamiento intracatenario imperfecto, que forma una horquilla con bucle. A continuacin, an dentro del ncleo,
un complejo proteico que incluye Drosha, una endorribonucleasa de la familia de las RNasas III, elimina
la parte de la molcula ajena a la horquilla, generando el precursor de microRNA, pre-miRNA. ste se exporta
al citosol, donde contina su procesamiento a cargo de la enzima Dicer (del ingls dice, que significa cortar
en dados). Finalmente, el miRNA se integra en el complejo RISC para ejercer su funcin.
En cuanto a los siRNA, o RNA interferentes pequeos, se generan a partir de RNA bicatenarios, que pueden
ser propios de la clula (generados por copias duplicadas de genes), introducidos en ella por un virus (en clulas
vegetales) o introducidos en la clula con propsitos experimentales de silenciamiento gnico. La misma enzima
Dicer los fragmenta generando los siRNA, que se integran tambin en un complejo RISC.
Los detalles de estos procesos se describen ms adelante (pg. 348), como parte de la regulacin de la
traduccin.
19.6 MADURACIN DEL RNA MITOCONDRIAL

La transcripcin de la molcula de DNA mitocondrial humano (pg. 276) produce 3 RNA transcritos primarios de gran tamao, cuyo procesamiento da lugar a todos los mRNA, tRNA y rRNA de la mitocondria. Esta
maduracin tiene lugar principalmente por escisin del pre-RNA y, en el caso de los mRNA, tambin por
poliadenilacin (pero no hay adicin de caperuza 5).
19:11
19.7 REGULACIN POSTRANSCRIPCIONAL DE LA EXPRESIN GNICA

A pesar de que la mayor parte del control de la expresin gnica se ejerce previamente y durante el inicio de la
transcripcin, a travs de las seales epigenticas y de los factores de transcripcin (Captulo 18), existen
mecanismos de regulacin en todas las etapas de la expresin. En lo que respecta a los procesos posteriores a
la transcripcin, se conocen ejemplos de control tanto en la maduracin del RNA como en su transporte al
citoplasma y tambin a travs de la regulacin de la vida media del mRNA en el citoplasma (velocidad de su
degradacin). Se expone a continuacin el primero de ellos, dejando los otros dos puntos de control para
el apartado dedicado a la regulacin de la traduccin (Captulo 21).
Las distintas etapas de procesamiento de los pre-RNA, previamente estudiadas, son lgicamente susceptibles de regulacin, lo que afectar a la tasa de expresin de los genes correspondientes. Esa regulacin no slo
tiene lugar en cuanto a la velocidad o eficacia de las reacciones de maduracin, sino que en algunos casos un
mismo pre-RNA madura por vas distintas dependiendo de la clula considerada, formando mRNA adaptados
a las necesidades proteicas particulares de un tejido o de una situacin fisiolgica concreta. La implicacin
de este tipo de variabilidad en el control del producto final es enorme.
309
310
III. EXPRESIN GNICA
19:12
19.7.1 Ayuste alternativo

El ejemplo ms caracterstico de regulacin postranscripcional es el ayuste alternativo, que comnmente
desempea un papel en la diferenciacin celular y en el control del desarrollo (por ejemplo, en la
determinacin del sexo en Drosophila). Este proceso ha pasado de considerarse algo extico a convertirse
en un mecanismo relevante de control: se ha estimado que el 90% de los genes humanos experimentan ayuste
alternativo. Constituye uno ms de los retos para una definicin completa de gen (pg. 265) y contribuye a la
comprensin de cmo el nmero de genes en el genoma humano ha resultado ser muy inferior al que se
esperaba (pg. 6).
Este fenmeno consiste en que algunos genes pueden dar lugar a transcritos maduros diferentes, que
formarn protenas distintas, debido al empleo alternativo de seales de ayuste. Esta decisin est marcada
por secuencias en el mRNA que actan bien como potenciadores, bien como silenciadores, forzando el salto
de un intrn o el salto de un exn. Dichas secuencias son reconocidas por algunas de las protenas llamadas
hnRNP (ribonucleoprotenas nucleares heterogneas), que enmascaran la secuencia que no se ha de emplear en
el ayuste, o bien por protenas SR, que se unen al CTD de la polimerasa durante la iniciacin de la transcripcin
y actan potenciando uno de los ayustes alternativos.
19:13
311
CAPTULO 20
El cdigo gentico
20.1 ANTECEDENTES Y PROPIEDADES GENERALES

DEL CDIGO
20.1.1 Los codones del cdigo son tripletes
20.1.2 Los tripletes no se solapan
20.1.3 Existen tres marcos o pautas de lectura
20.1.4 Papel adaptador del tRNA
20.2 ASIGNACIN DE CODONES A AMINOCIDOS
CONCRETOS
20.2.1 Traduccin de polinucletidos sintticos
20.2.2 Evidencia in vivo del cdigo gentico
313
313
314
314
315
315
315
316
20.3 REPRESENTACIN DEL CDIGO GENTICO

20.4 CARACTERSTICAS ESPECFICAS
20.4.1 Codn de inicio
20.4.2 Codones de terminacin
20.4.3 Degeneracin
20.4.3.1 Hiptesis del balanceo
20.4.3.2 Nmero de RNA transferentes
necesarios
20.4.4 Universalidad
316
317
317
317
318
319
320
321
El cdigo gentico es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la informacin contenida en el mRNA
(y en definitiva en el DNA) para la sntesis de las protenas. Describe, tanto en procariotas como en eucariotas,
la correlacin entre dos lenguajes informativos: la secuencia de nucletidos en el mRNA (el lenguaje con cuatro
letras de los cidos nucleicos) y la secuencia de aminocidos en el polipptido (lenguaje con veinte letras de las
protenas). Ms concretamente, el cdigo gentico establece la correspondencia entre los 64 posibles tripletes
de bases del mRNA y los 20 aminocidos de las protenas. (Nota: Es frecuente, en especial en el cdigo gentico
y la traduccin, utilizar la palabra base donde realmente debera decirse nucletido, en lo relativo a la
secuencia del mRNA.)
20.1 ANTECEDENTES Y PROPIEDADES GENERALES DEL CDIGO

Hoy da es relativamente fcil conocer la correspondencia entre aminocidos de una protena y tripletes de
nucletidos del mRNA que los codifican, mediante simple comparacin de la secuencia de ambos. Sin embargo,
fueron muchas las aproximaciones experimentales realizadas, a partir de la dcada de 1950, que contribuyeron
a descifrar el cdigo gentico, a la vez que a entender la transcripcin y la traduccin. Considerados de forma
global, estos estudios han supuesto uno de los grandes retos en la historia de la bioqumica y la gentica.
La informacin previa en la que se basa el conocimiento del cdigo gentico es de dos tipos. Por un lado, lo
referente al tRNA (pg. 64) cuya intervencin, a pesar de no ser un elemento propiamente dicho del cdigo
gentico, es esencial para entender la correspondencia entre mRNA y protena. Por otro lado, el ribosoma
(pgs. 74-78), orgnulo citoplasmtico en el que se realiza la sntesis proteica, segn se demostr originalmente
empleando aminocidos marcados con istopos radiactivos.
Se describen a continuacin las caractersticas generales y particulares del cdigo gentico, basadas en
algunos de los experimentos ms representativos que contribuyeron a descifrar el cdigo gentico y su relacin
con la sntesis proteica.
20.1.1 Los codones del cdigo son tripletes

La hiptesis de los codones se demostr al observar que cambios en la secuencia de un mRNA conducan a
alteraciones en la secuencia de aminocidos de la protena sintetizada (en experimentos con el bacterifago T4).
313
314
III. EXPRESIN GNICA
El nmero mnimo de nucletidos necesario para codificar un aminocido dicho de otro modo, el tamao
de las unidades de codificacin o la relacin de codificacin se deduce por un simple clculo matemtico:
N. de combinaciones posibles
Unidad de informacin
1 nucletido
2 nucletidos
4 = 16
Insuficiente para codificar

20 aminocidos
3 nucletidos
43 = 64
Ms que suficiente
La unidad de codificacin es el triplete de nucletidos
Por tanto, para poder codificar los 20 aminocidos naturales se necesita que cada aminocido venga
especificado por una secuencia de 3 nucletidos, denominada triplete o codn. El triplete es la caracterstica
ms sobresaliente del cdigo. Obviamente, las 64 posibles combinaciones exceden las necesidades para 20
aminocidos; ms adelante se analizar cmo se acomoda ese exceso de informacin (pg. 318).
20.1.2 Los tripletes no se solapan

Una de las propuestas iniciales para la distribucin de los codones en el mRNA fue que tripletes contiguos
compartieran nucletidos.
20:1
En la hiptesis solapante, la secuencia del primer triplete restringe las posibles secuencias del segundo, stas
a su vez las del tercero, y as sucesivamente, por lo que la secuencia de aminocidos de las protenas estara
condicionada, no podra ser cualquiera. Bajo esta hiptesis, la alteracin de una base afecta a varios codones, lo
que producira alteraciones en ms de un aminocido. Puesto que estas previsiones no se cumplen en la
realidad, se pudo demostrar que la hiptesis solapante es incorrecta, los tripletes nunca comparten nucletidos, no se solapan. Esto es as para el cdigo gentico de todos los seres vivos.
20.1.3 Existen tres marcos o pautas de lectura

El hecho de que los codones contiguos no se solapen no implica que exista una seal de separacin entre ellos (es
decir, no existen comas, puntos o interrupciones; tal separacin slo se hace notar sobre el papel, para
facilitar la lectura e interpretacin de la secuencia). Como consecuencia, en principio la lectura de un mRNA en
la traduccin se podra iniciar en cualquier nucletido, lo que definira a ste como el primer nucletido del
codn de inicio de la traduccin. Esto significa la existencia potencial de tres mensajes en cualquier mRNA,
dependiendo de en qu nucletido se inicie la lectura de los codones; se habla de tres marcos o pautas de lectura.
La traduccin del mRNA siguiendo cada uno de ellos formara tres polipptidos distintos.
20. El cdigo gentico
20:2
Sin embargo, en la traduccin (tanto in vivo como in vitro) no se manifiesta esta aparente ambigedad (por
ejemplo, al traducir el mRNA correspondiente a un gen). Una vez iniciada la traduccin segn un marco de
lectura, se puede decir que los otros dos carecen de informacin. Sin embargo, uno de los otros marcos puede
representar un mensaje vlido para otro gen distinto, caso de los genes solapantes (pg. 266).
El marco de lectura puede cambiar debido al desplazamiento en 1 o 2 posiciones del punto de inicio o,
durante la traduccin, por salto accidental de un nucletido mientras el mRNA es recorrido por el ribosoma. La
consecuencia del cambio de marco es que a partir de ese punto la secuencia de la protena nueva es distinta a la
original. ste es el mecanismo empleado a veces para formar dos o ms protenas a partir de un mismo
transcrito. De modo relevante, tambin es el resultado de algunas mutaciones puntuales, aquellas en las que
se insertan o eliminan nucletidos en nmero no mltiplo de 3 (pg. 391).
20.1.4 Papel adaptador del tRNA

Debe recordarse que la lectura de la secuencia de codones est protagonizada por los tRNA (pg. 64), que
ejercen el papel de adaptadores entre la informacin gentica y la secuencia de las protenas. Intervienen para ello
como molculas activas especializadas (formando los aminoacil-tRNA), que dirigen los aminocidos hacia el
ribosoma situado sobre el mRNA. En el ribosoma tiene lugar la interaccin del triplete de bases del aminoaciltRNA (anticodn) con el triplete de bases del mRNA (codn) determinando, durante la traduccin, la incorporacin del aminocido especfico frente a cada posicin del mRNA. Por tanto, en la expresin habitual se dice
simplemente que un codn codifica un aminocido.
20:3
20.2 ASIGNACIN DE CODONES A AMINOCIDOS CONCRETOS

20.2.1 Traduccin de polinucletidos sintticos
El descifrado del cdigo se pudo realizar principalmente mediante experimentos de traduccin in vitro a partir
de cadenas de polinucletido sintticas con secuencias muy simples y repetitivas. El conocimiento de la
secuencia suministrada al sistema permiti interpretar los resultados e ir asignando un aminocido concreto
a cada triplete de nucletidos.
Web 20.1. Experimentos de determinacin del cdigo.
315
316
III. EXPRESIN GNICA
20.2.2 Evidencia in vivo del cdigo gentico

Son varios los experimentos in vivo que confirmaron las conclusiones alcanzadas in vitro; en especial, los que
analizaban el efecto de las mutaciones sobre la secuencia peptdica (tanto inducidas como espontneas,
pg. 384). Como ejemplos ilustrativos se pueden adelantar aqu algunos correspondientes al gen de la subunidad a de la hemoglobina. En ambos casos, la sustitucin de una sola base en el gen normal modifica un codn,
conduciendo a la aparicin de un aminocido distinto en la secuencia peptdica.
20:4
20.3 REPRESENTACIN DEL CDIGO GENTICO

Se han elaborado diversos modelos (tablas, esquemas, etc.) para representar de forma clara y sencilla la
correlacin existente entre codones del mRNA y aminocidos del polipptido traducido. En todos ellos,
la secuencia del triplete se refiere al codn del mRNA (de ah la presencia de U y no de T), nunca se indica
como triplete del DNA ni como triplete anticodn del tRNA (aunque se pueden y deben hacer referencias
cruzadas entre las secuencias correspondientes). Las bases de cada codn se numeran, como siempre, en la
direccin 5 ! 3, la misma en la que se sintetiza el mRNA; as, la primera posicin es el extremo 5 del codn
y la tercera posicin es su extremo 3.
Web 20.2. Representaciones rectangulares del cdigo gentico.
Aunque an es de uso muy comn la representacin rectangular en forma de tabla, es ms recomendable,

por su sencillez de empleo, la representacin circular. Se utilizan crculos concntricos en los que se indican, del
centro hacia fuera, los 3 nucletidos del codn y el aminocido que codifica.
20:5
20.4 CARACTERSTICAS ESPECFICAS

Empleando la representacin anterior se pueden analizar con facilidad las caractersticas que definen al cdigo
gentico:
20.4.1 Codn de inicio

El codn AUG, el nico que codifica metionina, es responsable como cualquier otro codn de la incorporacin
del aminocido correspondiente al polipptido, pero al mismo tiempo posee la particularidad de actuar de forma
especfica como codn de inicio en la mayora de los casos (con mucha menos frecuencia se usan como inicio
otros codones, como ACG, CUG y GUG). Es decir, la sntesis de la mayora de las protenas comienza en un
codn AUG; ello explica que Met siempre ocupe la posicin 1 (inicial o N-terminal) de cualquier polipptido
recin sintetizado. Como se ver posteriormente (pg. 334), las protenas eucariticas poseen una metionina
N-terminal, mientras que en procariotas se incorpora como formil-metionina. Para que AUG acte como codn
de inicio en eucariotas se requiere que forme parte de una secuencia especfica (secuencia de Kozak, pg. 333).
20.4.2 Codones de terminacin

Se puede observar en las representaciones del cdigo gentico que los codones UAA, UAG y UGA no codifican
aminocido alguno, sino que causan la finalizacin de la sntesis proteica (pg. 340). Se denominan codones de
terminacin, de paro, codones stop, o tambin codones sin sentido (es decir, sin significado, sin mensaje).
La presencia de 3 codones de terminacin en un total de 64 indicara que, estadsticamente, la sntesis no se
alargara ms all de unos 20 aminocidos (3/64 = 1/21 = 4,7%). Sin embargo, la regin estructural de los
genes de protenas contiene una frecuencia de codones de terminacin muy inferior a la que le correspondera
de forma aleatoria.
317
318
III. EXPRESIN GNICA
La regin del DNA comprendida entre un codn de inicio y uno de terminacin se llama marco de lectura
abierto (open reading frame, ORF). Por ejemplo, para una protena de masa 60 kDa se requerira un marco de
lectura abierto con unos 545 codones (masa media de un residuo aminocido = 110 Da; 60.000 Da/110
Da = 545).
20.4.3 Degeneracin
sta es una de las caractersticas ms llamativas del cdigo. Se entiende por degeneracin el hecho de que un
aminocido est codificado por ms de un codn; los codones que codifican el mismo aminocido se denominan codones sinnimos. Aunque a primera vista pueda parecerlo, ello no supone indefinicin o ambigedad
alguna, pues una secuencia concreta de bases define inequvocamente los aminocidos que deben incorporarse;
s habra ambigedad si un mismo codn codificase varios aminocidos alternativos. La degeneracin es una
consecuencia directa del supervit de codones sobre aminocidos (debe recordarse que existen 64 tripletes
posibles y slo 20 aminocidos; pg. 314).
Esta degeneracin del cdigo, adems, no es uniforme, pues cada aminocido est codificado por un
nmero diferente de codones sinnimos, desde slo uno (Met, Trp) hasta un mximo de 6 (Arg, Leu, Ser).
20:6
Obsrvese que 17 aminocidos estn codificados por codones situados en una misma cuadrcula de la
representacin del cdigo, y slo 3 (Ser, Leu, Arg) lo estn por codones de dos cuadrculas distintas. Esto indica
que la asignacin de codones a un aminocido no es aleatoria, sino que entre los codones sinnimos existe una
cierta similitud. Una consecuencia importante de la degeneracin del cdigo es que disminuye la frecuencia con
que las mutaciones puntuales provocan la incorporacin de un aminocido distinto (pg. 389).
20.4.3.1 Hiptesis del balanceo

El triplete del anticodn de un tRNA (formando parte de un aminoacil-tRNA) puede interaccionar por complementariedad de bases con un codn del mRNA (pg. 315). Esta lectura o reconocimiento se realiza por emparejamiento antiparalelo de las bases 1, 2 y 3 del codn con las bases 3, 2 y 1 del anticodn, respectivamente.
20:7
Web 20.3. Estructura molecular de la interaccin entre codones y anticodones.
Si los tres emparejamientos tuviesen lugar de acuerdo con las reglas de Watson y Crick slo habra una
posibilidad de interaccin entre anticodn y codn, por lo que existira igual nmero de tRNA (anticodones)
que de codones, es decir, 61. Sin embargo, se sabe que en las clulas hay menos molculas diferentes de tRNA
(pgs. 15 y 19), lo que quiere decir que un mismo anticodn puede reconocer varios codones. Para poder
explicar este hecho se propuso la hiptesis del balanceo (tambin llamada fluctuacin, tambaleo o titubeo),
que se puede expresar en dos reglas:
1. Las bases tercera y segunda del anticodn forman puentes de hidrgeno cannicos (de tipo Watson y Crick,
bien definidos) con las bases primera y segunda del codn, determinando la especificidad de interaccin
codn/anticodn.
2. La primera base del anticodn (posicin 5 del tRNA) puede orientarse de formas ligeramente distintas (lo
que se ha llamado balanceo o fluctuacin) para interaccionar con bases alternativas en la posicin tercera
del codn. Este emparejamiento tiene lugar mediante enlaces de hidrgeno diferentes de los clsicos de
Watson y Crick. Debido a ello, la interaccin es ms dbil (coloquialmente, un emparejamiento suelto).
20:8
319
320
III. EXPRESIN GNICA
A esta flexibilidad de interaccin contribuyen no slo los emparejamientos atpicos entre bases normales,
sino tambin la presencia, en algunos anticodones, del nuclesido infrecuente inosina (abreviado como I, con la
base nitrogenada hipoxantina, pgs. 15 y 19), que es capaz de emparejarse tanto con A como con U o C. La
inosina se genera por la accin de una adenosina desaminasa sobre la A presente en el transcrito primario del
tRNA (reaccin en pgs. 306 y 395).
Los detalles de las interacciones de Watson y Crick (pg. 40) y las menos favorables (denominadas aqu
genricamente enlaces de Hoogsteen, pgs. 55 y 67) son los siguientes:
20:9
Resumiendo, los emparejamientos posibles mediante balanceo son los siguientes:
20:10
20.4.3.2 Nmero de RNA transferentes necesarios

Todo lo anterior determina que el anticodn de un tRNA puede leer uno, dos o tres codones de un mRNA, en
los cuales las 2 primeras bases son idnticas. Con este fundamento, puede calcularse el nmero de anticodones,
el nmero de molculas diferentes de tRNA necesarias para los 61 codones codificadores de los 20
aminocidos. Aunque en las clulas sta es una cifra imprecisa, desde un planteamiento terico, basado en
el aprovechamiento al mximo del balanceo, puede afirmarse que se necesitan al menos 31 tRNA para leer
todo el cdigo.
20:11
20:12
20.4.4 Universalidad
Los primeros estudios indicaron que la correspondencia entre codones y aminocidos era la misma independientemente del organismo observado, lo que condujo a la afirmacin de que el cdigo gentico es universal.
Hoy da se sabe que esto no es completamente cierto; se han encontrado excepciones, aunque escasas, en las
mitocondrias humanas y de otros mamferos, y en ciertas bacterias. Debe, pues, decirse que el cdigo gentico
es casi universal.
20:13
321
322
III. EXPRESIN GNICA
En consecuencia, comparten el mismo cdigo gentico los procariotas, los ncleos de todos los eucariotas y
las mitocondrias de plantas. Parece probable que todas las formas de vida hayan tenido un antepasado
evolutivo comn, con un solo cdigo gentico, que se ha conservado muy estrictamente a todo lo largo de la
evolucin biolgica. Las pocas diferencias existentes pueden haber surgido durante la evolucin por transferencia del genoma procaritico original, con el cdigo gentico universal, al genoma mitocondrial.
CAPTULO 21
Sntesis de protenas: traduccin
21.1 CARACTERSTICAS DE LA TRADUCCIN

21.1.1 Sentido de avance de la sntesis proteica
21.1.2 Carcter monocistrnico o policistrnico del mRNA
21.1.3 Fases de la traduccin
21.2 ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS
EN FORMA DE AMINOACIL-tRNA
21.2.1 Reacciones de aminoacilacin
21.2.2 Aminoacil-tRNA sintetasas
21.2.2.1 Tipos de sintetasas
21.2.2.2 Especificidad de las aminoacil-tRNA
sintetasas
21.2.2.3 Mecanismo de reconocimiento de
los aminocidos por las sintetasas
21.2.2.4 Mecanismo de reconocimiento de los
tRNA por las sintetasas
21.2.3 Correccin de errores cometidos por las sintetasas
21.2.4 Balance energtico de la activacin
21.3 INICIACIN
21.3.1 Especificidad del punto de inicio
21.3.2 Formacin del metionil-tRNA iniciador
21.3.3 Pasos sucesivos en la fase de inicio
21.3.3.1 Disociacin del ribosoma (paso 1)
21.3.3.2 Unin a la subunidad menor del ribosoma:
complejo de preiniciacin (paso 2)
21.3.3.3 Unin de la subunidad mayor:
complejo de iniciacin (paso 3)
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324
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21.4
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21.5
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333
333
334
334
335
335
336
21.6
21.7
21.8
21.3.3.4 Reutilizacin de los factores de iniciacin

21.3.3.5 Balance energtico de la iniciacin
ELONGACIN O ALARGAMIENTO
DE LA CADENA PEPTDICA
21.4.1 Ubicacin del aminoacil-tRNA en el sitio A (paso 4)
21.4.2 Transpeptidacin: formacin del enlace peptdico
(paso 5)
21.4.3 Translocacin: desplazamiento del ribosoma
en un codn (paso 6)
21.4.4 Repeticin del ciclo de elongacin (pasos 4, 5 y 6)
TERMINACIN
21.5.1 Unin del factor de liberacin (paso 7)
21.5.2 Hidrlisis del peptidil-tRNA (paso 8)
21.5.3 Disociacin (paso 9)
21.5.4 Reutilizacin del ribosoma
ENERGTICA DE LA SNTESIS DE PROTENAS
INHIBIDORES DE LA TRADUCCIN
REGULACIN DE LA SNTESIS PROTEICA
21.8.1 Control del transporte de mRNA
21.8.2 Vida media y degradacin del mRNA
21.8.3 Control de la traduccin
21.8.3.1 Ribointerruptores
21.8.3.2 Ribointerferencia
21.8.3.3 Control de la accesibilidad del mensajero
21.8.3.4 Control de la estabilidad del mensajero
21.8.3.5 Regulacin del complejo de iniciacin
336
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352
21.1 CARACTERSTICAS DE LA TRADUCCIN

La traduccin consiste en la sntesis de las protenas mediante la unin covalente de aminocidos segn el
orden establecido por la secuencia de nucletidos del mRNA y de acuerdo con el cdigo gentico. Se
completa as el dogma central de transmisin de la informacin gentica a partir del DNA genmico
original (pgs. 3 y 262).
Puesto que este proceso es esencialmente igual en todo tipo de organismos (salvo pequeas diferencias en
los mecanismos y componentes implicados), nuestro estudio se centra en eucariotas, aludiendo a procariotas
cuando lo requieran sus aspectos particulares en favor de una mejor comprensin del proceso en trminos moleculares. Se plantea en estrecha relacin con el cdigo gentico (Captulo 20) y se completar con
las modificaciones postraduccionales (Captulo 22), necesarias para el ejercicio de la funcin de las protenas;
finalmente, se analizarn los mecanismos de degradacin, de forma anloga al planteamiento tradicional para
otras biomolculas (glcidos y lpidos, principalmente). Con todo ello se completan las dos grandes reas
biosntesis y degradacin del metabolismo proteico. Este enfoque es imprescindible hoy da para conocer el
funcionamiento normal y patolgico de las protenas (base de las enfermedades moleculares, Captulo 25) y
para abordar en el futuro los avances en la naciente protemica (pg. 239) con vistas al diagnstico y a la
teraputica.
323
324
III. EXPRESIN GNICA
Desde un punto de vista bioqumico, la traduccin se caracteriza por la gran variedad de protenas
formadas, su elevado coste energtico (consume un 80-90% de la energa que emplea la clula en biosntesis) y la necesidad de una regulacin muy estrecha en respuesta a las necesidades celulares y al ritmo de
degradacin de las protenas. Es, posiblemente, el ms complejo de los procesos de sntesis, en el que participa un mayor nmero de macromolculas diferentes. De modo resumido, las principales son:
Met
en procariotas, tRNAiMet en eucariotas; pg. 334).
Un tRNA especial para la iniciacin (tRNAf
31 tipos de tRNA portadores de aminocidos, en forma de aminoacil-tRNA. En realidad, ste es el nmero
mnimo necesario tericamente (pgs. 320 y 330); en las clulas suele haber un nmero superior de tRNA
diferentes; por ejemplo, 40 es una cifra frecuente y se han encontrado hasta 84.
Ribosomas, formados por varias molculas de rRNA y numerosas protenas (pgs. 75-76).
Un mRNA, de secuencia distinta para cada polipptido sintetizado.
Factores proteicos de inicio, elongacin y terminacin de la traduccin.
En una clula existen millares de estos participantes: unos 20.000 ribosomas, 100.000 molculas de enzimas
y factores proteicos, 200.000 de tRNA, etc. Se requiere, adems, un acervo de, al menos, 20 aminocidos, ATP,
enzimas aminoacil-tRNA sintetasas para activar los aminocidos, GTP para varias etapas, grupos reductores,
iones (Mg+2 y K+), enzimas auxiliares, etc. Intervienen, directa o indirectamente, casi todas las estructuras
subcelulares (ncleo, citoplasma, orgnulos y membranas). A pesar de ello, el proceso es muy rpido: en
bacterias, la velocidad de traduccin alcanza 20 aminocidos por segundo, mientras que en eucariotas es ms
reducida, pero se incorporan entre 3 y 8 aminocidos por segundo.
21.1.1 Sentido de avance de la sntesis proteica

El primer aspecto bsico, el sentido en el que se realiza la sntesis, puede considerarse desde un doble punto de
vista: la secuencia de nucletidos del mRNA se lee de 5 a 3, mientras que la secuencia de aminocidos del
polipptido se construye desde el extremo amino hacia el carboxilo.
Web 21.1. Demostracin experimental del sentido de sntesis de las protenas.
21.1.2 Carcter monocistrnico o policistrnico del mRNA

Un aspecto importante en relacin con la traduccin es que un mRNA puede dar lugar a la sntesis de un
polipptido o de varios. Esta propiedad se define mediante el concepto de cistrn, que conviene distinguir del de
gen, aunque estn estrechamente relacionados y ambos pueden considerarse una unidad de funcionalidad
gentica.
Los mRNA monocistrnicos, presentes en procariotas y tpicos en eucariotas, codifican un solo polipptido.
Ello implica que la traduccin se inicia en un nico sitio del mRNA, el codn de inicio, para finalizar en otro
sitio, un codn de terminacin.
Los mRNA policistrnicos, que slo aparecen en procariotas y virus, codifican varios polipptidos, por lo
que la traduccin se inicia (simultneamente o no) en varios sitios, en varios codones de inicio, para finalizar
en sendos codones de terminacin.
21. Sntesis de protenas: traduccin
21:1
El concepto de gen (pg. 263) corresponde a una regin codificante del DNA genmico, responsable de
un producto gnico, sea ste RNA (por transcripcin y maduracin) o protena (por transcripcin,
maduracin, traduccin y modificacin postraduccional). En el caso de mRNA monocistrnicos, el
concepto de cistrn es prcticamente indistinguible del de gen. La diferencia importante surge en los
genes que se transcriben dando un mRNA policistrnico (y, por tanto, slo afecta a los organismos
procariticos).
El concepto de cistrn, en su forma genrica, se diferencia: a) por ser ms amplio que el de gen, al considerar
como regin codificante tanto al DNA como al RNA (ambos dan lugar a un producto gnico), y b) por ser al
mismo tiempo ms estricto, pues se define como la regin del genoma (DNA) o del mRNA que codifica un
producto gnico nico. Habitualmente se emplea slo para este ltimo caso, por lo que un cistrn es la
secuencia de mRNA que codifica una molcula de polipptido. Debe recordarse que la definicin ms amplia
de gen obligaba a incluir casos lmite como consecuencia de la maduracin postranscripcional (pg. 298); de
forma similar ocurre en el caso que nos ocupa, el mRNA policistrnico, con una unidad de transcripcin que
325
326
III. EXPRESIN GNICA
codifica varios productos (conocida tambin habitualmente como opern). Por lo tanto, en este caso se trata de
un gen policistrnico.
21.1.3 Fases de la traduccin

Dentro del proceso de traduccin se pueden distinguir varias etapas o fases: una previa o de activacin de
los aminocidos precursores y tres bien diferenciadas, iniciacin, elongacin y terminacin, bajo un criterio
anlogo al seguido para la replicacin y la transcripcin (Captulos 11 y 17). La maduracin postraduccional, considerada en ocasiones como una quinta fase, tiende a tratarse hoy da de modo independiente
(Captulo 22).
21:2
21.2 ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS EN FORMA DE AMINOACIL-tRNA

La unin a cada tRNA del aminocido correcto (el que, segn el cdigo gentico, est codificado por el codn
complementario del anticodn que posee ese tRNA) es posiblemente el paso ms crtico de la expresin gnica.
Si no tiene lugar de forma correcta, carece de sentido todo el cdigo gentico. Esa unin tiene lugar en el citosol
celular, como el resto del proceso de traduccin, y supone la activacin de los aminocidos (en forma de
aminoacil-tRNA) para poder formar enlaces peptdicos. De esta forma, la fase de activacin da significado al
papel conector del tRNA con los aminocidos en la traduccin.
21:3
21.2.1 Reacciones de aminoacilacin

La unin del aminocido con el tRNA se verifica mediante dos reacciones sucesivas, ambas catalizadas por una
misma enzima (en un centro activo nico o en dos centros prximos). Esta enzima es una de las aminoaciltRNA sintetasas (abreviadamente, sintetasas o aaRS).
21:4
327
328
III. EXPRESIN GNICA
El producto final de la doble reaccin es un aminoacil-tRNA, con un enlace ster entre el grupo OH 3
terminal del tRNA y el grupo carboxilo del aminocido (vase su nomenclatura en la pg. 64). En el caso de
las aminoacil-tRNA sintetasas de clase I (pg. 329), el ster se forma inicialmente sobre el grupo OH 2, pero
luego se convierte al ismero en 3.
21:5
329
21.2.2 Aminoacil-tRNA sintetasas

21.2.2.1 Tipos de sintetasas
Se han aislado multitud de aminoacil-tRNA sintetasas de bacterias, plantas y animales, cuya masa oscila entre
88 y 181 kDa. En algunos casos se han podido secuenciar y cristalizar para estudiar su estructura. Todas las
sintetasas catalizan de forma similar la reaccin de activacin del aminocido con AMP, pero presentan
diferencias en la segunda reaccin, la de unin al tRNA. Concretamente, algunas unen el aminocido al grupo
hidroxilo 2 y otras al 3, siempre del ltimo nucletido del tRNA (pg. 328). De acuerdo con esto, y tambin
con diferencias estructurales, se clasifican las sintetasas en dos grupos denominados, respectivamente, clase I y
clase II.
Tipo de aaRS
Grupo OH
del tRNA
Transesterificacin
posterior
Estructura
de la enzima
Aminocidos que reconocen
De clase I
Es necesaria
La mayora
monomricas
Arg Cys Gln Glu Ile Leu Met Trp Tyr Val
(10, los ms grandes y polares)
De clase II
No se requiere
La mayora
dimricas
Ala Asn Asp Gly His Lys Phe Pro Ser Thr
(10, los ms pequeos e hidrfobos)
21.2.2.2 Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas

Ya se ha explicado (pg. 319) cmo la hiptesis del balanceo permite que un mnimo de 31 tRNA reconozcan
los 61 codones que codifican los 20 aminocidos. Se deben formar, pues, 32 aminoacil-tRNA diferentes (debe
aadirse un tRNA especfico para la incorporacin de la metionina de iniciacin). Cada uno de stos
interaccionar, a travs de su anticodn, con el codn del mRNA que codifica el aminocido correspondiente.
En muchos casos, un mismo tRNA puede interaccionar con varios codones sinnimos, gracias al balanceo. Por
otra parte, para algunos aminocidos el grupo de codones (4 o 6) requiere ms de un tRNA; stos se llaman
tRNA sinnimos o isoaceptores (pg. 64).
Este papel adaptador de los tRNA entre la informacin gentica del mRNA (nucletidos) y la secuencia del
polipptido (aminocidos) slo puede desempearse gracias a la especificidad de las sintetasas por ambos
sustratos, el tRNA y el aminocido. Cada aminoacil-tRNA sintetasa reconoce un nico aminocido (del que
toma el nombre) y tambin todos los tRNA cuyos anticodones codifican ese mismo aminocido (codones
sinnimos en el cdigo gentico). De acuerdo con ello, existen en la clula 20 aaRS distintas. El papel de las
sintetasas es, por tanto, esencial para la fidelidad de la sntesis proteica y constituye la esencia del cdigo
gentico, el problema central de la traduccin; por ello, se suele considerar que las aaRS representan un segundo
cdigo gentico.
21.2.2.3 Mecanismo de reconocimiento de los aminocidos por las sintetasas
La interaccin especfica de un solo aminocido con cada sintetasa es anloga al reconocimiento de
cualquier otro sustrato por la enzima correspondiente. Cada aminocido encaja en un determinado lugar
del centro activo de la sintetasa, gracias a interacciones por puentes de hidrgeno, electrostticas, hidrfobas o de van der Waals. Slo se unirn aquellos aminocidos con un nmero suficiente de interacciones
favorables.
21.2.2.4 Mecanismo de reconocimiento de los tRNA por las sintetasas

La capacidad de una sintetasa, especfica para un nico aminocido, para reconocer varios tRNA, y al mismo
tiempo rechazar otros, depende del modo como stos interaccionan con el centro activo de la aaRS. Este
330
III. EXPRESIN GNICA
reconocimiento es complejo y diferente para cada pareja tRNA-sintetasa, e implica no slo las variaciones
estructurales particulares de cada enzima (en especial, segn que sean de clase I o II), sino tambin la interaccin
con diversas zonas de la molcula de tRNA.
21:6a
21:6b
Web 21.2. Estructura tridimensional y reconocimiento entre un tRNA y su aminoacil-tRNA sintetasa.
21.2.3 Correccin de errores cometidos por las sintetasas

La elevada especificidad de las sintetasas hace que los errores sean infrecuentes. A pesar de ello, se dispone de
mecanismos de correccin que actan de manera sucesiva, en el centro activo de la enzima, antes y despus
de cada etapa de la reaccin de sntesis, y reducen an ms la tasa de error.
21:7
Ejemplo del filtro n. 1. La enzima isoleucil-tRNA sintetasa (IleRS) no distingue bien entre Ile (su sustrato
especfico) y Val, aminocido de estructura similar, aunque de menor tamao por tener un grupo metileno
menos. La activacin preferente de Ile respecto a Val en la primera etapa de reaccin (formacin de Ile-AMP-E
frente a Val-AMP-E) est de acuerdo con la interaccin ms favorable del centro activo con Ile (energa de
331
332
III. EXPRESIN GNICA
fijacin superior en 3 kcal/mol a la de Val). A pesar de esta preferencia, dado que in vivo la concentracin de Val
es unas 5 veces mayor que la de Ile, Val debera incorporarse errneamente con gran frecuencia (en torno al
1%). El hecho de que la tasa de error observada sea muy inferior (0,01%) indica que existen mecanismos
adicionales de correccin.
21:8
Ejemplo del filtro n. 2. Con el mismo caso anterior, si se ha llegado a formar errneamente Val-AMP-E en el
sitio activo de IleRS, se percibe el error y se hidroliza el anhdrido entre Val y AMP. Es probable que esta
correccin de pruebas tenga lugar porque el sitio hidroltico de la enzima admite a Val-AMP (incorrecto), pero
excluye o rechaza, por impedimento estrico, a Ile-AMP (correcto, de mayor tamao).
Ejemplo del filtro n. 3. La enzima valil-tRNA sintetasa (ValRS) sirve para demostrar la capacidad de
corregir errores entre dos aminocidos cuyo tamao es casi idntico por tener cadenas laterales muy similares;
concretamente, Val y Thr. Sin embargo, ValRS rechaza a Thr por una combinacin de dos mecanismos. El
centro activo de transferencia es hidrfobo e interacciona de manera ms favorable con Val, de cadena lateral
ms hidrfoba. Por el contrario, el centro activo de hidrlisis es hidrfilo e interacciona mejor con Thr, ms
polar. Como resultado, la Thr unida por error a tRNAVal se hidrolizar preferentemente, mientras que Val
unida correctamente a tRNAVal se conserva.
21:9
A pesar de todos estos mecanismos de correccin, la tasa de error de la sntesis proteica es mucho mayor que
la de la replicacin (respectivamente, uno por cada 104 aminocidos y uno por cada 106108 nucletidos). Esto
es permisible puesto que el error en una protena desaparece al degradarse sta y no pasa a futuras generaciones,
y en la prctica supone un grado de fidelidad suficiente, sin implicar un gasto energtico excesivo.
21.2.4 Balance energtico de la activacin

El primer gasto energtico que se debe considerar en la traduccin es el necesario para la formacin de los
aminoacil-tRNA para todos los aminocidos que componen la protena. Como se ha descrito (pg. 327), en
cada reaccin de aminoacilacin se hidrolizan dos enlaces fosfato de alta energa (ATP ! AMP + PPi y
PPi ! 2 Pi) para formar el enlace ster entre aminocido y tRNA.
No se tendr en cuenta para el balance global, aunque evidentemente es significativo en la situacin real en
la clula, el gasto energtico desperdiciado cada vez que un aminocido se incorpora de manera incorrecta
(pg. 330); cada error supone dos enlaces fosfato, al haberse sintetizado un aa-tRNA intil, que se hidroliza
durante la correccin por la sintetasa.
21.3 INICIACIN
Esta etapa, previa a la formacin del primer enlace peptdico, es habitualmente la etapa limitante para la
velocidad global de la sntesis. Transcurre de forma semejante en procariotas y eucariotas, salvo por la
identidad de las protenas implicadas, por lo que la explicacin se centrar en los ltimos. Tanto en esta fase
como en las de elongacin y terminacin es caracterstica la intervencin de complejos formados por las
3 molculas principales los tRNA, el ribosoma (completo o una sola subunidad) y el mRNA, adems de
otros factores proteicos, coenzimas, iones, etc.
21.3.1 Especificidad del punto de inicio

La traduccin nunca comienza exactamente en el extremo 5 del mRNA (por ello, se ha venido representando
siempre una regin 5 no traducida (5UTR), por ejemplo en pg. 325). Casi siempre acta como punto de
inicio un codn AUG (pg. 317) situado internamente en la molcula, para lo cual necesita ser reconocido
como tal por el ribosoma y por el tRNAMet iniciador.
En procariotas, cada cistrn de un mRNA (pg. 325) posee una secuencia denominada de Shine-Dalgarno,
que interacciona especficamente con la subunidad pequea del ribosoma, definiendo la eleccin como
codn de inicio de un AUG situado unos 10 nt cadena abajo.
21:10
En eucariotas, el mRNA es casi siempre monocistrnico (pg. 325), por lo que tiene un solo codn de
inicio. No existe una seal especial que una el mRNA a la subunidad menor del ribosoma, sino que la
especificidad se establece a travs del tRNA iniciador. Para que ste se una al mRNA, en el entorno proporcionado por la subunidad menor del ribosoma, es preciso que el codn AUG forme parte de la secuencia de Kozak;
se forma as un complejo ternario mRNA:ribosoma:tRNAiMet (como se ver despus, el tRNA participa
realmente como metionil-tRNAiMet asociado al factor eIF-2 y a GTP).
333
334
III. EXPRESIN GNICA
21.3.2 Formacin del metionil-tRNA iniciador

Los codones AUG en los que se inicia la traduccin (codificando el residuo Met del extremo N-terminal del
polipptido) los reconoce un tRNA iniciador, llamado tRNAiMet (en procariotas suele denominarse tRNAfMet ,
pero se usar el primer nombre de forma genrica). Los codones AUG que corresponden a posiciones internas en
la cadena polipeptdica interaccionan con un tRNA distinto, que se llama simplemente tRNAMet . En ambos casos
el tRNA participa como metionil-tRNAMet (etapa previa de activacin del aminocido, pg. 326).
La incorporacin de metionina interna corresponde a la etapa de elongacin, y tiene lugar de la misma
forma que la de otros aminocidos; la de metionina N-terminal ocurre, sin embargo, durante la iniciacin, y de
forma algo diferente en procariotas y eucariotas:
En procariotas (y en mitocondrias y cloroplastos eucariticos) se forma Met-tRNAiMet, que luego se
modifica con un grupo formilo en el amino a de la metionina. Es decir, hay aminoacilacin y formilacin,
para incorporar N-formil-metionina (fMet) al inicio de la traduccin. Como consecuencia, todas las protenas
recin sintetizadas comienzan por formilmetionina. Debe resaltarse que no se utiliza fMet como sustrato. Esta
etapa supone un pequeo coste energtico adicional para la traduccin (que no se contemplar al hacer el
balance general, pg. 343): aunque la reaccin no consume energa directamente, s lo hace la regeneracin del
coenzima formiltetrahidrofolato.
21:11
En la traduccin citoplasmtica de eucariotas no hay participacin de formilmetionina, slo se requiere la
aminoacilacin para incorporar metionina al inicio de la sntesis. Por tanto, los polipptidos formados
contienen metionina en su extremo N-terminal.
21.3.3 Pasos sucesivos en la fase de inicio

En prcticamente todos estos pasos, as como en las fases de elongacin y terminacin, intervienen varias
protenas que reciben el nombre genrico de factores proteicos de iniciacin, elongacin o terminacin. Los
factores de iniciacin se nombran con la raz IF en procariotas, eIF en eucariotas. A partir de este momento, slo
se describe la traduccin en eucariotas; para facilitar su seguimiento, se establecer una divisin en 9 pasos
sucesivos: 3 en la iniciacin, 3 en la elongacin y 3 en la terminacin.
En resumen, el inicio de la traduccin requiere la unin del tRNA al codn de inicio AUG en el mRNA, en el
entorno del sitio P o peptidilo del ribosoma. No intervienen en esta fase el codn anejo (cadena abajo) al AUG ni
los sitios A o aminoacilo y E o de salida (exit) del ribosoma (pg. 337).
21.3.3.1 Disociacin del ribosoma (paso 1)

Debe indicarse que las dos subunidades del ribosoma (40S y 60S en eucariotas), sintetizadas en el ncleo y
exportadas a travs de los poros nucleares al citosol, se ensamblan en ste, de forma reversible, formando el
ribosoma 80S (vase pg. 76 para detalles de estructura y composicin). Para su intervencin en la traduccin,
el ribosoma debe disociarse en sus dos subunidades para permitir, en las subetapas siguientes, la unin de
tRNA y mRNA y el inicio de la sntesis.
21:12
21.3.3.2 Unin a la subunidad menor del ribosoma: complejo de preiniciacin (paso 2)

A continuacin se incorporan a la subunidad menor del ribosoma el aminoacil-tRNA y el mRNA, en uno u otro
orden. Se suele decir que se forma primero un complejo binario de preiniciacin y despus uno ternario.
En ambos casos intervienen nuevos factores de iniciacin.
El mRNA se une a la subunidad menor del ribosoma a travs de su caperuza 5, que es reconocida por uno de
los factores, eIF-4E, denominado tambin por ello CBP (cap-binding protein, o protena ligante de la caperuza).
En esta unin y en el posterior desplazamiento intervienen, adems, los factores eIF-4A y eIF-4B y se produce la
hidrlisis de ATP. La subunidad menor del ribosoma, con los factores asociados, se desplaza cadena abajo del
mRNA, hasta encontrar un codn AUG. ste suele ser el ms prximo al extremo 5, pero debe estar incluido
en una secuencia de Kozak; de no ser as, continuar el avance hasta encontrar otro. El codn de inicio AUG
queda ubicado en el sitio P de la subunidad menor. Los factores proteicos implicados en esta etapa posiblemente actan tambin desplegando la molcula de mRNA a su forma completamente extendida.
335
336
III. EXPRESIN GNICA
El metionil-tRNAiMet, por su parte, se incorpora despus de formar un complejo con el factor de iniciacin eIF-2
y GTP. Este factor reconoce exclusivamente al tRNA iniciador. (Ms adelante se ver que todos los aminoaciltRNA que participan en la elongacin lo hacen tambin asociados con un factor proteico que une GTP, pg. 337.)
21.3.3.3 Unin de la subunidad mayor: complejo de iniciacin (paso 3)

Para que pueda comenzar la sntesis de un polipptido, el complejo de preiniciacin 40S debe unirse con la
subunidad mayor del ribosoma, 60S.
En primer lugar, la asociacin de un nuevo factor eIF-5 activa la capacidad GTPasa de eIF-2. La forma
eIF-2:GDP resultante no retiene la afinidad por el Met-tRNA, con lo que se disocian todos los factores y queda
un complejo ternario de iniciacin 40S libre de factores proteicos. ste puede ya reasociarse con la subunidad mayor del ribosoma, liberada del factor eIF-6 que la mantena separada, formando el definitivo complejo
ternario de iniciacin 80S. Con esta asociacin de las dos subunidades del ribosoma, y la presencia del tRNA y
el mRNA correctamente ubicados, este complejo queda dispuesto para la elongacin.
21.3.3.4 Reutilizacin de los factores de iniciacin

De los factores eIF implicados en el proceso anterior, todos se recuperan intactos y pueden volver a participar en
el inicio de una nueva cadena polipeptdica, a excepcin del factor eIF-2, que comenz en su forma GTP y ha
terminado con GDP. La regeneracin de ese GTP, que evidentemente requiere la energa de hidrlisis de una
molcula de ATP, no se hace de forma directa, sino por un intercambio de nucletidos mediado a su vez por
otro factor proteico, eIF-2B. Por su accin y estructura, ste pertenece a la familia proteica de factores
intercambiadores de nucletidos de guanina (GEF, guanine exchange factors)
21:13
21.3.3.5 Balance energtico de la iniciacin

Como se acaba de ver, dos pasos de la fase de inicio requieren un consumo energtico. En primer lugar (paso 2),
el reconocimiento de la caperuza y el desplazamiento hasta encontrar el codn de inicio, y ms tarde (paso 3) la
regeneracin del GTP hidrolizado por eIF-2. Nos referiremos a stos como segundo y tercer gastos energticos
de la traduccin, de cara al balance global (pg. 343).
21.4 ELONGACIN O ALARGAMIENTO DE LA CADENA PEPTDICA

Esta fase incluye desde la adicin del segundo aminocido hasta el ltimo. Se trata de un proceso cclico que se
repite tantas veces como aminocidos se incorporen. Cada ciclo consta de 3 pasos: ubicacin del nuevo aatRNA en el sitio A del ribosoma, formacin del enlace peptdico y translocacin del peptidil-tRNA al sitio P. En
ellos intervienen tres factores proteicos citoplasmticos o factores de elongacin: eEF-1A, eEF-1B y eEF-2.
Debe resaltarse que la etapa de elongacin no posee la capacidad de diferenciar el aminocido que se
incorpora, sino que es especfica nicamente con respecto al anticodn del aa-tRNA; la incorporacin de un
aminocido correcto viene determinada por la actuacin previa de la aminoacil-tRNA sintetasa durante la
etapa de activacin.
Web 21.3. Estrategia experimental para discernir la especificidad entre codones, tRNA y aminocido.
21.4.1 Ubicacin del aminoacil-tRNA en el sitio A (paso 4)
21:14
Web 21.4. Asociacin de los tRNA en los sitios E, P y A de la estructura tridimensional del ribosoma.
Tras incorporarse el Met-tRNAi al sitio P del ribosoma en el complejo de iniciacin 80S, queda an vaco el
sitio A. En l se producir la incorporacin de cada nuevo aminocido (en la primera vuelta del ciclo de
elongacin ser el aminocido n. 2), por emparejamiento del anticodn de su aa-tRNA con el codn correspondiente del mRNA.
La entrada de todos los sucesivos aa-tRNA en el sitio A requiere que estn unidos al factor de elongacin
eEF-1A que, de forma similar a lo ya estudiado para el factor de iniciacin eIF-2, une GTP y tiene actividad GTPasa
latente. (La estructura de los factores eIF-2, eEF-1A y eEF-2 es similar entre s y a la de otras protenas G, lo que
sugiere su procedencia de una protena ancestral comn.) De hecho, la forma habitual in vivo de casi todos los aatRNA es como complejo ternario aa-tRNA:eEF-1A:GTP. La demanda de esta preparacin de los aminocidos
para la sntesis de todas las protenas de la clula puede ilustrarse comentando que en E. coli hay 10 veces ms
molculas de EF-Tu que ribosomas, con lo cual es la protena ms abundante en la clula (EF-Tu es el factor
bacteriano homlogo de eEF-1A; EF-Ts y EF-G son homlogos, respectivamente, de eEF-1B y eEF-2.)
Son los complejos aa-tRNA:eEF-1A:GTP los que difunden al sitio A vaco del ribosoma y reconocen en l
sitios de unin adecuados. Si el emparejamiento entre anticodn y codn es correcto, el aminoacil-tRNA se
ubica de forma estable en el ribosoma, lo que provoca cambios conformacionales que estimulan la actividad
GTPasa de eEF-1A. La forma eEF-1A:GDP no posee afinidad por el ribosoma, liberndose y quedando as el
aa-tRNA unido al sitio A, dispuesto para las etapas siguientes.
Web 21.5. Anlisis de los complejos portadores de los aminoacil-tRNA hacia el ribosoma y de su reutilizacin.
De forma anloga a lo que ocurre con el factor de iniciacin eIF-2 (pg. 336), se regenera la forma eEF-1A:
GTP por intercambio de nucletidos mediado por un nuevo factor intercambiador de nucletidos de guanina, el
factor de elongacin eEF-1B; se produce, pues, el cuarto gasto energtico de la traduccin (una molcula de ATP
por cada aminocido incorporado). eEF-1A queda as disponible para incorporar un nuevo aminocido.
Debe resaltarse que eEF-1A interacciona con cualquier aa-tRNA excepto con el iniciador, Met-tRNAiMet, que
se distingue de los restantes tRNA en la estructura secundaria del tallo aceptor. De este modo, durante la
elongacin, el tRNA iniciador no interviene en la incorporacin de residuos internos de metioninas. Esta
especificidad, junto con la ya descrita en la fase de inicio, mantiene la dualidad de los tRNA especficos para Met.
337
338
21:15
III. EXPRESIN GNICA
21.4.2 Transpeptidacin: formacin del enlace peptdico (paso 5)

Una vez situadas las molculas de aa-tRNA y Met-tRNAiMet (en ciclos sucesivos, peptidil-tRNA) en los sitios A
y P del ribosoma, respectivamente, se forma el enlace peptdico entre ambas. Esta reaccin la cataliza una
actividad enzimtica peptidiltransferasa (o transpeptidasa) localizada en el rRNA 28S, componente de la
subunidad grande 60S; se trata, pues, de una ribozima (pg. 74); aunque las protenas ribosmicas contribuyen
posiblemente a que sea activa, no participan en el centro cataltico.
21:16
21.4.3 Translocacin: desplazamiento del ribosoma en un codn (paso 6)

A partir de su ubicacin inicial sobre AUG el ribosoma completo se desplaza en sentido 5 ! 3 del mRNA
(cadena abajo), en una distancia de un solo codn cada vez. El responsable de este desplazamiento es el tercer
factor proteico de elongacin, eEF-2, conocido tambin como translocasa. Este factor interacciona principalmente con la subunidad mayor, originando cambios conformacionales en el ribosoma completo que tienen
como resultado el desplazamiento. Al mismo tiempo, impide la unin de un nuevo aa-tRNA en el sitio A,
evitando que se pase al siguiente ciclo antes de tiempo.
339
340
III. EXPRESIN GNICA
21:17
En esta etapa tiene lugar el quinto gasto energtico, pues la energa requerida para cada translocacin se
obtiene de la hidrlisis de GTP gracias a una actividad GTPasa que reside en el propio factor eEF-2. Tanto en
este caso como en los anteriores, la hidrlisis de GTP est acoplada a cambios conformacionales en la
maquinaria de traduccin, que conducen al desplazamiento del ribosoma y a la salida del factor eEF-2 (cuya
forma eEF-2:GTP deber regenerarse en un ciclo de intercambio de nucletidos de guanina, al igual que se ha
visto para eIF-2 y eEF-1A).
21.4.4 Repeticin del ciclo de elongacin (pasos 4, 5 y 6)

Al terminar la primera translocacin se ha completado la primera vuelta o ciclo de elongacin, llegando a una
situacin idntica a la existente al comienzo: sitio A libre y sitio P ocupado por un tRNA. La diferencia estriba
en que el Met-tRNAi del sitio P ha sido sustituido por un dipeptidil-tRNA. La elongacin contina de forma
cclica (figura en pg. 338) hasta que se aade el ltimo aminocido. La llegada sucesiva al sitio A (situado
sobre los codones 2, 3, 4, etc.) de otros aa-tRNA permite la unin de los siguientes aminocidos en sucesivos
ciclos de elongacin. Al acabar cada uno de ellos, el pptido en crecimiento siempre queda unido al tRNA del
ltimo aminocido incorporado. Los enlaces peptdicos se forman siempre sobre el grupo NH2 del ltimo
aminocido incorporado y, por tanto, la cadena polipeptdica crece desde su extremo amino-terminal hacia el
carboxilo-terminal.
21.5 TERMINACIN
Esta etapa comprende los pasos necesarios para liberar el polipptido ya completo de su unin al tRNA del sitio
P y, al mismo tiempo, disociar el ribosoma del mRNA. Esto slo puede ocurrir en respuesta a la presencia en el
sitio A de uno de los 3 codones de terminacin (UAA, UAG o UGA en el caso de mRNA codificado por DNA
nuclear, y UAA, UAG, AGA o AGG en el caso de mRNA codificado por DNA mitocondrial) (pg. 321).
En eucariotas interviene en el proceso un nico factor proteico de terminacin o de liberacin, eRF
(releasing factor), en contraste con procariotas donde existen tres (RF1, RF2 y RF3).
21.5.1 Unin del factor de liberacin (paso 7)

No existe ningn tRNA que reconozca los codones de paro, por lo que cuando el ribosoma se transloca sobre
uno de ellos no puede progresar la elongacin. En su lugar, el factor eRF se une al ribosoma en el sitio A, frente
al codn de terminacin.
21:18
Web 21.6. Estructura del factor de terminacin y analoga con la del tRNA.
21.5.2 Hidrlisis del peptidil-tRNA (paso 8)

La unin de eRF al ribosoma altera la actividad peptidiltransferasa de tal forma que sta emplea como agente
nuclefilo el agua, en lugar del grupo amino de un aminocido (pg. 339). Como consecuencia, se hidroliza
el enlace ster del peptidil-tRNA, liberando la cadena polipeptdica. En este proceso, adems, se hidroliza una
molcula de GTP asociada al factor eRF, lo que supone el sexto gasto energtico de la traduccin.
341
342
III. EXPRESIN GNICA
21.5.3 Disociacin (paso 9)

El tRNA no cargado sale del ribosoma. La forma eRF:GDP ya no posee afinidad por el ribosoma y tambin se
libera. Finalmente, se separan las dos subunidades ribosmicas (en eucariotas, 80S ! 40S + 60S), liberando el
mRNA. Todos los componentes quedan as disponibles para iniciar la sntesis de una nueva protena (excepto
el eRF, que debe recambiar su GDP por GTP, probablemente por un ciclo similar a los estudiados para eIF-2,
eEF-1A y eEF-2).
21.5.4 Reutilizacin del ribosoma

Para completar, debe sealarse que la utilizacin sucesiva del mismo mRNA para varias rondas de traduccin
no depende de una nueva asociacin ms o menos aleatoria del ribosoma y todos los factores sobre el codn
de inicio. Existen evidencias de que el mRNA forma una estructura circular, cerrada, por aproximacin de sus
extremos 5 y 3, de modo que es mucho ms fcil la reutilizacin de todos los componentes de la maquinaria de
traduccin al terminar en el extremo 3, reasocindose rpidamente sobre el extremo 5. Esto es posible gracias
a que hay protenas que se unen tanto a ambos extremos como entre s. Por ejemplo, eIF-4E reconoce la
caperuza (se la denomina tambin CBP, cap binding protein, protena ligante de la caperuza), mientras que una
protena PABI [poly(A)-binding protein, protena ligante de poli(A)] se une a la cola de poliadenilato. Ambas
protenas interaccionan con un factor eIF-4G, circularizando as el mRNA. Ello permite que las subunidades
ribosomales disociadas en 3 se reutilicen con eficacia, asocindose rpidamente de nuevo sobre el extremo 5.
Este mecanismo aumenta la tasa de traduccin, en tanto no intervenga alguna seal que conduzca, por ejemplo,
a la degradacin del mensajero.
21.6 ENERGTICA DE LA SNTESIS DE PROTENAS

La sntesis proteica es un proceso energticamente muy costoso, que utiliza una gran proporcin de todo el
equivalente en ATP disponible en la clula. Recapitulando todo lo detallado previamente en cada etapa y
teniendo en cuenta la repeticin cclica de la elongacin, puede calcularse el requerimiento energtico mnimo.
Posiblemente la formacin o disociacin de los numerosos complejos multimoleculares requiera algn aporte
energtico adicional, as como la correccin de pruebas y, en el caso de procariotas y orgnulos, la formilacin.
21:19
343
Paso
(pg.)
N. de enlaces
N. total de enlaces
fosfato por paso fosfato por polipptido
de N aminocidos
Gasto
Fase
N. 1
Activacin
(Aminoacilacin del tRNA)
333
2 por cada aa
2N
N. 2
Iniciacin
N. 2 (incorporacin del mRNA)
335
Indeterminado
Al menos 1
N. 3
Iniciacin
N. 3 (complejo de iniciacin)
336
1 por polipptido
N. 4
Elongacin
N. 4 (ubicacin del aa-tRNA)
337
1 por aa aadido
N-1
N. 5
Elongacin
N. 6 (translocacin)
340
1 por aa aadido
N-1
341
1 por polipptido 1
N. 6
Terminacin
N. 8 (hidrlisis)
Total:
4N + 1 (al menos)
Esta hidrlisis de cuatro enlaces fosfoanhdrido por cada aminocido representa un gran cambio en energa
libre. Concretamente, 30,5 4 = 122 kJ/mol de aminocido, muy superior a la energa del enlace
peptdico (energa libre estndar de hidrlisis de unos 21 kJ/mol). Aunque pueda parecerlo, esto no es un
despilfarro energtico, sino que la mayor parte de la energa extra (101 kJ/mol) sirve para compensar la
prdida de entropa que tiene lugar durante la sntesis proteica. Este descenso de entropa se debe principalmente al ordenamiento de los aminocidos en el polipptido. Tambin se pierde entropa cuando un
aminocido se une a un tRNA particular y cuando un aa-tRNA se asocia a un codn especfico. As, el aparente
exceso energtico se emplea en conseguir la casi perfecta fidelidad en la traduccin biolgica del mensaje
gentico del mRNA a la secuencia de aminocidos de las protenas.
21.7 INHIBIDORES DE LA TRADUCCIN

Numerosos y diversos compuestos actan impidiendo o dificultando la traduccin. Su estudio es interesante
por varios motivos:
Desde el punto de vista prctico, porque muchos de ellos se pueden emplear como antibiticos, en especial
cuando ejercen su efecto selectivamente sobre clulas procariticas (bacterias), afectando poco o nada a las
eucariticas. Precisamente el estudio de sus mecanismos de accin ha contribuido a lo largo de muchos aos al
esclarecimiento de los detalles moleculares del proceso de traduccin. A este respecto, debe mencionarse que el
uso indiscriminado (sin control mdico) de los antibiticos ha creado una resistencia bacteriana de gran
trascendencia tanto con respecto a la flora bacteriana intestinal como a la terapia de las infecciones; estos
aspectos deben abordarse de forma especializada, en tratados de microbiologa.
Desde un punto de vista terico, es interesante por el papel central de la traduccin en la vida celular. Son
muchos los antibiticos y toxinas que bloquean o interfieren en ciertos pasos de la sntesis proteica, de forma
ms o menos especfica, en procariotas o en eucariotas. Esta especificidad es la mejor prueba de la diferencia
entre la maquinaria de traduccin en ambos tipos de organismos.
El efecto inhibidor puede ejercerse en distintas etapas del proceso de traduccin:
Etapa afectada
Ejemplos
Efecto sobre
procariotas o eucariotas
Detalles de la accin
Activacin de los
aminocidos
Mupirocina
(o cido pseudomnico)
Inhibe competitivamente la Ile-tRNA sintetasa,

evitando la incorporacin de isoleucina y
deteniendo la sntesis proteica
Iniciacin
(paso 2, complejo
de preiniciacin)
Estreptomicina
(un aminoglicsido)
Se fija de modo irreversible a la subunidad

menor 30S, por interaccin con varias de sus
protenas y con el rRNA 16S. Distorsiona la
entrada de fMettRNA iniciador y tambin
produce errores de lectura del mRNA durante la
elongacin, al interferir en el emparejamiento
codn/anticodn
344
III. EXPRESIN GNICA
Etapa afectada
Ejemplos
Efecto sobre
procariotas o eucariotas
Detalles de la accin
Pactamicina
Impide la ubicacin del Met-tRNA iniciador

en la subunidad menor 40S
Showdomicina
Impide la formacin del complejo

Met-tRNAi:eIF-2:GTP
Interfern
Induce la expresin de una protena quinasa

que fosforila a eIF-2, inactivndolo
(de forma similar al HCI, pg. 352)
Iniciacin
(paso 3, complejo
de iniciacin)
Eritromicina
Se une a un sitio especfico en el rRNA 23S de la

subunidad mayor 50S. Impide la asociacin con
la subunidad menor; otra accin posible es
interfiriendo en la translocacin
Elongacin
(paso 4, ubicacin)
Tetraciclinas
P>E
Se unen a la subunidad menor, interfiriendo

en la fijacin del aa-tRNA al sitio A
Kirromicina
Bloquea la disociacin de GDP del factor EF-Tu

(homlogo bacteriano del eEF-1A eucaritico),
lo que evita su salida del ribosoma
Ricina
(glicoprotena de origen
vegetal; con 2 cadenas,
A y B; la primera es la
toxina, 66 kDa)
Se une a protenas de la subunidad mayor 60S,

bloqueando la unin de aa-tRNA:eEF-1A:GTP,
y posiblemente tambin de eEF-2
(transpeptidacin)
Cloranfenicol
P y mitocondrial
Se une selectivamente a una protena de

la subunidad mayor 50S, interfiriendo en la
interaccin del aa-tRNA con el centro activo
de la peptidiltransferasa, como inhibidor
competitivo
Cicloheximida
Similarmente al cloranfenicol, inhibe la

actividad peptidiltransferasa, pero slo en el
ribosoma eucaritico (subunidad mayor 60S)
Puromicina
PyE
Anlogo estructural del aa-tRNA, forma enlace

con el pptido provocando su terminacin
prematura
Aminoglicsidos distintos
de la estreptomicina
(por ejemplo: gentamicina,
kanamicina, neomicina)
La mayora interaccionan con el rRNA 16S de la

subunidad mayor 50S, impidiendo la fijacin del
factor de elongacin G (EF-G, homlogo
bacteriano del eEF-2 eucaritico). Los
mecanismos de accin son diversos
Iniciacin
(paso 2, complejo
de preiniciacin)
Elongacin
(paso 5,
transpeptidacin)
Elongacin
(paso 6,
translocacin)
Terminacin
Esparsomicina
Inhibe la translocacin
cido fusdico
PyE
Se une de forma muy estable al complejo

EF-G:GDP:ribosoma, impidiendo la liberacin
de EF-G (homlogo bacteriano del eEF-2).
Tambin inhibe a eEF-2
Toxina diftrica
(proenzima proteica de
62 kDa; la toxina es un
fragmento de 21 kDa)
Cataliza una reaccin que inactiva eEF-2 de

forma irreversible (ADP-ribosilacin a costa
de NAD, sobre un residuo His modificado de
eEF-2)
No se conoce ninguno
21:20
Web 21.7. Estructura tridimensional de antibiticos inhibidores de la traduccin y fundamento molecular de su

accin.
La selectividad de la mayora de antibiticos y toxinas sobre organismos procariticos o eucariticos es

posible gracias a las diferencias en sus ribosomas as como, en algunos casos (por ejemplo, tetraciclinas), a la
incapacidad de la molcula para atravesar la membrana celular de organismos superiores.
21.8 REGULACIN DE LA SNTESIS PROTEICA

La traduccin se regula en las clulas a travs de varios mecanismos. Su velocidad depende en cierto modo de la
secuencia del mRNA molde; por ejemplo, un mRNA con muchos codones raros se traduce ms lentamente (y,
por tanto, con menos frecuencia) que otro con codones ms comunes. Adems, la velocidad de comienzo vara
con la secuencia que rodea al codn de inicio. Se sabe que una unin fuerte del mRNA a su sitio en el ribosoma
produce un inicio ms eficiente (al menos en procariotas).
345
346
III. EXPRESIN GNICA
21:21
21.8.1 Control del transporte de mRNA

Las tres modificaciones esenciales que experimentan los transcritos primarios durante su maduracin
(formacin de la caperuza 5, poliadenilacin en 3 y reacciones de ajuste) parecen ser cruciales para que el
RNA pueda pasar al citoplasma e intervenir en la traduccin a protenas. Este transporte a travs de los poros
nucleares est perfectamente regulado, y puede afectar tambin al control de la expresin.
Es importante resaltar la relevancia (aunque el conocimiento de su mecanismo es an inicial) del transporte
del mRNA maduro desde el ncleo al citoplasma, necesario para que est disponible para la traduccin. Una
vez completado el procesamiento postranscripcional del transcrito primario (Captulo 19) el mRNA maduro se
transporta a travs de los poros nucleares e inicia la traduccin en el ribosoma citoplasmtico en un plazo de
entre 1 y 5 minutos.
Existen mecanismos celulares de control de la traduccin en respuesta a las necesidades bajo diferentes
condiciones ambientales. Surge as el trmino regulacin traduccional para referirse a estos casos de modulacin de la frecuencia de traduccin por factores extrnsecos. El estudio de este control tiene un inters especial en relacin con el desarrollo animal; en este sentido se ha estudiado intensamente, por ejemplo, en
Drosophila.
Desde un punto de vista bsico, slo es preciso referirse a una situacin general, la de la clula de un
individuo adulto. Entre las protenas especficas que se unen al mRNA recin sintetizado y ayudan a su
transporte fuera del ncleo se encuentra un factor proteico multimrico, que incluye al eIF-4E o protena
ligante de la caperuza (CBP), ya estudiada por su papel en el inicio de la traduccin (pg. 335).
21.8.2 Vida media y degradacin del mRNA

Cada molcula de mRNA se emplea muchas veces como molde para la traduccin, dando lugar a numerosas
copias del polipptido que codifica. Como consecuencia, el tiempo de permanencia de una molcula de mRNA
en la clula es esencial para determinar la cantidad de protena producida. Ese tiempo, o vida media de la
molcula, depende tanto de la velocidad con que se sintetiza, madura y sale al citoplasma el mRNA, como de la
rapidez con que se degrada en este compartimento subcelular.
La degradacin intracelular del mRNA es un proceso que tiene lugar continuamente, a mayor o menor
velocidad, como consecuencia de la actividad de ribonucleasas especficas (v. web 15.1). stas pueden ser tanto
endonucleasas como exonucleasas. Frente a estas ltimas es importante la accin protectora de la
poliadenilacin, pues debe digerirse por completo la cola de poli(A) antes de que se alcancen las secuencias
codificantes del mRNA. De hecho, las molculas de mRNA tienen una vida media tanto ms prolongada
cuanto mayor es la longitud de su cola. De igual manera, la caperuza 5 ejerce un efecto protector esencial,
gracias a su estructura singular con enlace 5-5-trifosfodister (pg. 300). En eucariotas, la vida media del
mRNA es unas 10 veces mayor que en procariotas, lo que se debe probablemente al procesamiento postranscripcional, que retarda su degradacin; esto es esencial dada la necesidad de que se transporte desde el ncleo al
citoplasma (pg. 263) antes de que pueda comenzar a utilizarse en la traduccin.
Como consecuencia de estas variables, existen aparentes contrastes entre la abundancia de los distintos tipos
de RNA en una clula y la velocidad con la que se sintetizan. As, por ejemplo, el rRNA es mayoritario y el
mRNA minoritario, sin embargo la velocidad de sntesis es superior para el mRNA (y adems variable).
Como datos representativos del significado de este control pueden mencionarse los correspondientes, a
grandes rasgos, a la diferente estabilidad de las molculas de RNA (expresada por su vida media). Existe, en
general, una relacin directa entre este parmetro y el grado de maduracin sufrido. La estabilidad tambin
aumenta con el contenido de estructuras secundaria y terciaria de la molcula de RNA.
Los tRNA y rRNA de eucariotas y procariotas son extremadamente estables (horas o das), pues sufren un
gran procesamiento postranscripcional y presentan abundante emparejamiento de bases y plegamiento de la
cadena. Los rRNA estn, adems, fuertemente protegidos por su asociacin con las protenas ribosmicas.
Los mRNA de eucariotas tienen una estabilidad intermedia (horas), porque experimentan una extensa
maduracin pero casi no presentan estructura secundaria. Como casos extremos, pueden citarse el
mRNA de c-fos, con una vida de 10 a 30 min, y los de globina y ovoalbmina, que alcanzan 24 h.
Los mRNA de procariotas son los menos estables (minutos), ya que no sufren maduracin alguna y apenas
tienen estructura secundaria. Los mRNA de E. coli se degradan rpidamente una vez formados (se calcula
que las nucleasas degradan en 3 min la mitad del mRNA sintetizado en ese tiempo).
Existen tambin mecanismos de control de la vida media que dependen de protenas que se unen al mRNA,
protegindolo de la degradacin, y otros a cargo de complejos ribonucleoproteicos que degradan especficamente un mRNA determinado (ribointerferencia). Estos mecanismos se comentan en el apartado siguiente.
347
348
III. EXPRESIN GNICA
21.8.3 Control de la traduccin

Una vez que el mRNA ha alcanzado el citoplasma, el control de su traduccin se ejerce esencialmente en la
iniciacin, haciendo de sta la etapa limitante. Principalmente se regula la formacin del complejo de
preiniciacin 80S y la actividad de los factores de inicio eIF-2 y eIF-4E; tambin a travs de la influencia
de estructuras secundarias en el mRNA, por ejemplo regiones intramoleculares bicatenarias, que pueden
enmascarar los sitios de unin del ribosoma y el codn de inicio. Se estudian a continuacin con cierto
detalle algunos mecanismos de regulacin de la capacidad y frecuencia de utilizacin de los mensajeros
para la traduccin.
21.8.3.1 Ribointerruptores
Se ha denominado ribointerruptor o riborregulador (en ingls, riboswitch; pg. 69) una parte de ciertas
molculas de RNA mensajero que regula su propia expresin, bien en el final de su transcripcin o bien en
su maduracin postranscripcional o en su traduccin. Una caracterstica clave de su accin es que reconoce y
une especficamente una molcula pequea, por ejemplo un metabolito. El cambio conformacional inducido
en el RNA al unrsele el ligando desencadena una accin sobre la expresin gnica de ese mismo RNA. Acta as
como un sensor que sirve a la clula para adaptarse a circunstancias del entorno. La mayora de ribointerruptores se han detectado en bacterias, pero hay al menos uno que acta en eucariotas (algunos hongos y plantas).
Cabe destacar que esta regulacin, a diferencia de las dems estudiadas, no est ejercida por protenas. A
continuacin se estudia otro mecanismo de regulacin de la expresin tambin mediado por molculas de
RNA, la ribointerferencia.
21.8.3.2 Ribointerferencia
Los miRNA y los siRNA (pg. 69) se descubrieron por separado, en diferentes organismos y con funciones
aparentemente distintas, pero cada vez hay ms pruebas de que ambos tipos de RNA pequeo pueden actuar en
muchas especies y conducir a acciones similares. Todas ellas se engloban bajo el trmino ribointerferencia (o
interferencia por RNA), que incluye tanto la accin biolgica de regulacin como la tcnica experimental que
aprovecha estos procesos. De forma breve, la funcin de los RNA interferentes se manifiesta en dos tipos de
resultado: el bloqueo de la traduccin de RNA mensajeros especficos o bien la degradacin selectiva de dichos
mensajeros. Ambos casos se pueden denominar tambin silenciamiento gnico postranscripcional. Es importante resaltar que, detalles aparte, la especificidad de su accin sobre la expresin de un nico producto gnico
siempre se basa en el emparejamiento de secuencias complementarias entre el RNA interferente y alguna regin
del mensajero.
La ruta ms comn en la que participan los miRNA es su generacin endgena por transcripcin de un
gen propio de la clula, seguida de su maduracin en ncleo y citosol (pg. 309) y su integracin en el
complejo RISC. Se han identificado un gran nmero de genes de miRNA, tanto en el ser humano como en
otras especies, que estn implicados como un mecanismo ms en la regulacin de la expresin gnica. En
cuanto a los siRNA, stos proceden de RNA bicatenarios, que, dicho de forma simplificada, la clula
percibe como peligrosos (introducidos por un virus, transposones, genes sobreexpresados, etc.). Tambin
se pueden generar siRNA a partir de molculas exgenas de RNA bicatenario introducidas en la clula con
propsitos experimentales, para conseguir el silenciamiento de un gen (tcnica de ribointerferencia).
La accin del complejo RISC, segn los casos, puede ser la represin de la traduccin o la degradacin
del mRNA, pero siempre de forma especfica sobre un mensajero que posea secuencia complementaria a la del
miRNA o siRNA. La definicin de cul de los dos mecanismos se desencadena es una cuestin an no del todo
resuelta. Uno de los determinantes es el grado de complementariedad del miRNA o siRNA con el mRNA diana:
si el emparejamiento es perfecto, es ms probable la degradacin, mientras que si es parcial se produce con ms
probabilidad el bloqueo de la traduccin.
La represin de la traduccin tiene lugar mediante la fijacin de RISC sobre la regin 3 no traducida (es
decir, posterior al codn de paro) del mRNA complementario. Dicho de otro modo, esa regin 3UTR contiene
la secuencia complementaria al miRNA o siRNA. El resultado, a pesar de que se una en la zona final del
mensajero, es el bloqueo de la maquinaria de traduccin (ribosoma y factores proteicos asociados), quedando
el RNA secuestrado y no disponible para ms rondas de traduccin.
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350
III. EXPRESIN GNICA
En el caso de la degradacin del mRNA slo si es complementario al RNA pequeo integrado en el

complejo RISC, la responsable de la hidrlisis del mensajero es la enzima Slicer (del ingls slice, que significa
cortar en rebanadas o rodajas), uno de los componentes proteicos de RISC. Obviamente, mientras este mecanismo est activo cualquier molcula de ese mRNA concreto que se sintetice ser degradada y sus posibilidades de traducirse quedarn reducidas.
Un tercer mecanismo que parece actuar en algunos casos (en este caso, dentro del ncleo) es la interaccin
del RNA pequeo con la regin promotora de un gen, reclutando en esa zona a protenas que remodelan la
cromatina y, en consecuencia, reprimiendo la transcripcin.
21.8.3.3 Control de la accesibilidad del mensajero

Este ejemplo demuestra un mecanismo de control para la sntesis de ferritina ejercido mediante bloqueo del
acceso de la maquinaria de traduccin a su mRNA. sta es una protena cuya funcin es almacenar hierro,
como reserva para la biosntesis de hemoglobina, mioglobina, citocromos y otras muchas protenas, y al mismo
tiempo como proteccin contra la toxicidad de los iones hierro libres. Su sntesis se controla a travs de las
protenas IRP, que se unen a la regin 5 no traducida (5UTR) del mRNA impidiendo el inicio de la traduccin.
Las IRP o protenas reguladoras del hierro (iron-regulatory proteins) poseen la capacidad de unirse al
mRNA, con distinta afinidad en funcin de la concentracin intracelular de ese metal. Por ejemplo, una de ellas,
la IRP-1, cuando el hierro es abundante lo incorpora en un complejo hierro-azufre Fe4S4 y no interacciona con
el mRNA. Por el contrario, cuando el hierro es escaso en la clula la IRP-1 no presenta el complejo Fe-S y
adopta una conformacin que le permite unirse con elevada afinidad a una horquilla de RNA con bucle
(pg. 54). sta se conoce como motivo IRE o elemento de respuesta al hierro (iron-response element), por lo
que las IRP se llaman tambin protenas ligantes de IRE (IRE-BP, IRE-binding proteins). Existe un motivo IRE
en la regin 5 no traducida (pg. 264) del mRNA de ferritina, al que se unen las IRP impidiendo el inicio de
la traduccin y reduciendo as la concentracin intracelular de ferritina. La clula se adapta de esta forma a la
escasez de hierro, evitando la sntesis de una protena que no es necesaria. Por el contrario, en condiciones de
exceso de hierro, se sintetiza libremente la ferritina, para poder fijarlo.
21:23
Web 21.8. Estructura tridimensional: reconocimiento del motivo IRE en el RNA por la protena IRP.
21.8.3.4 Control de la estabilidad del mensajero

Existe un ejemplo muy similar de regulacin, coordinada con la anterior, pero en este caso controlando la vida
media del mRNA y, por tanto, su disponibilidad para la traduccin. Se trata del receptor de transferrina, una
protena de membrana necesaria para que las clulas capten el hierro. En condiciones de escasez de hierro la
protena IRP se une tambin a este mRNA, que posee 5 motivos IRE, pero al estar stos en su regin 3 no
traducida (3UTR) el efecto es de proteccin del mRNA frente a la degradacin. En consecuencia, se sintetizan
ms molculas del receptor de transferrina a partir de un mismo mRNA, capacitando a la clula para captar
hierro con ms eficacia. En la situacin contraria (abundancia de hierro) IRP no es activa para unirse al mRNA,
que se degrada ms rpidamente, reduciendo la sntesis del receptor, ya no tan necesario. Ambos mecanismos
de regulacin, la traduccin del mRNA de ferritina y la degradacin del mRNA del receptor de transferrina,
actan al unsono con un mismo objetivo, la adaptacin de la clula a la disponibilidad de hierro.
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III. EXPRESIN GNICA
21.8.3.5 Regulacin del complejo de iniciacin

La sntesis de hemoglobina requiere cantidades estequiomtricas de hemo y de globinas. La sntesis de las
globinas tiene lugar en precursores eritroideos y en reticulocitos (precursores inmediatos de los eritrocitos),
donde se expresan de forma activa los genes correspondientes. La velocidad de traduccin del mRNA de
globina est regulada en funcin de la concentracin de hemo en la clula, de modo que si sta desciende,
disminuye la sntesis. La clula evita as la produccin intil de la protena para la que no hay grupo prosttico
(hemo) disponible. La regulacin tiene lugar por inhibicin del inicio de la traduccin, interfiriendo en la
reutilizacin del factor eIF-2 (pg. 336).
21:25
Debe destacarse que resulta inhibida toda nueva incorporacin de una Met inicial; puede continuar la
sntesis de las cadenas ya iniciadas, pero no puede iniciarse una nueva. Por otra parte, a diferencia de los
ejemplos anteriores (ferritina y receptor de transferrina), el control no afecta de manera especfica al mRNA de
una protena, sino a la traduccin de todos los mRNA de la clula. Este aparente perjuicio potencial para la
clula est justificado porque se trata de clulas muy especializadas, que sintetizan casi exclusivamente globina.
CAPTULO 22
Modificaciones postraduccionales:
distribucin, maduracin, plegamiento
y degradacin de protenas
22.1 INTRODUCCIN
22.2 DISTRIBUCIN DE LAS PROTENAS
A SU DESTINO
22.2.1 Compartimentos implicados
22.2.2 Trnsito de protenas en el citosol y entre orgnulos
22.2.3 Distribucin de protenas secretadas
22.2.3.1 Caractersticas del pptido seal
22.2.3.2 Mecanismo de entrada al retculo
endoplsmico
22.3 MADURACIN O PROCESAMIENTO
DEL POLIPPTIDO NACIENTE
22.3.1 Maduracin por modificacin de aminocidos
22.3.1.1 Unin de sustituyentes a los aminocidos
a) Acetilacin
b) Carboxilacin
c) Fosforilacin
d) Hidroxilacin
e) Metilacin
22.3.1.2 Modificacin con lpidos
a) Acilacin (cidos grasos)
b) Prenilacin (terpenos)
22.3.1.3 Incorporacin de glcidos: glicosilacin
a) Caractersticas de las glicoprotenas
b) Tipos de glicosilacin
c) Biosntesis de las glicoprotenas
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22.3.1.4 Formacin de puentes disulfuro

22.3.1.5 Otras modificaciones
22.3.2 Maduracin por escisin proteoltica
22.3.2.1 Activacin proteoltica de enzimas
22.3.2.2 Activacin proteoltica de hormonas
22.3.3 Ayuste de protenas
22.4 PLEGAMIENTO DE PROTENAS
22.4.1 Mecanismo del plegamiento de las protenas
22.4.2 Protenas implicadas en el plegamiento: carabinas
moleculares
22.4.2.1 Tipos de carabinas
a) Carabinas Hsp70 y Hsp40
b) Carabinas Hsp60 y Hsp10
c) Otras carabinas
22.4.2.2 Funcin de las carabinas
22.5 DEGRADACIN DE LAS PROTENAS
22.5.1 Degradacin lisosmica
22.5.2 Degradacin citoslica
22.5.2.1 Ubicuitina
22.5.2.2 Seales desencadenantes
de la ubicuitinacin
a) Residuo amino-terminal
b) Secuencias PEST
22.5.2.3 Degradacin por proteasas
y proteasoma
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22.1 INTRODUCCIN
La sntesis proteica no termina cuando el polipptido completado se separa del complejo de traduccin, sino
que en todos los organismos se requieren procesos adicionales para que el mensaje lineal o unidimensional del
polipptido (secuencia de aminocidos, determinada por la secuencia de nucletidos del mRNA) se transforme
en un mensaje tridimensional, la estructura nativa de la protena, responsable de su funcin. Estos procesos,
recogidos de forma conjunta bajo el trmino maduracin o modificacin postraduccional, constituyen el
colofn de la sntesis proteica, que a veces se considera la quinta fase de la traduccin, despus de activacin del aminocido, iniciacin, elongacin y terminacin.
La maduracin postraduccional es esencial para la funcionalidad y estabilidad de las protenas, y ms en la
clula eucaritica. Cada compartimento subcelular requiere protenas diferentes, que no se sintetizan en l,
para sus variadas funciones: actividad cataltica en todas las vas metablicas, papel estructural en la membrana
celular, transporte o almacn de molculas e iones, funcin motora muscular, transmisin de seales intra- e
intercelular, regulacin de la expresin gnica, etc. Incluso las mitocondrias y los cloroplastos, que poseen un
genoma propio, necesitan multitud de protenas que estn codificadas en el genoma nuclear, por lo que una vez
sintetizadas en el citosol deben llegar hasta estos orgnulos.
353
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III. EXPRESIN GNICA
Para una descripcin representativa de la modificacin postraduccional se seguir un esquema relativamente comn, dividido en los siguientes apartados. (Esta separacin, sin embargo, es puramente formal y
didctica, pues muchos de estos procesos tienen lugar de forma simultnea en la clula.)
1. Distribucin de las protenas hacia diferentes localizaciones, subcelulares o extracelulares, para el ejercicio
de su funcin.
2. Maduracin o procesamiento del polipptido. Comprende principalmente modificaciones qumicas de los
residuos de aminocido y eliminacin de fragmentos del polipptido.
3. Plegamiento correcto del polipptido hasta alcanzar su conformacin nativa. Requiere, en muchos casos,
una maduracin previa por modificacin qumica, con lo que plegamiento y maduracin estn ntimamente
ligados.
4. Una vez que la protena ha llegado a su destino y cumplido su misin, debe tambin describirse su
catabolismo, su degradacin hasta aminocidos.
Con todos estos procesos se cierra de manera definitiva el ciclo biolgico de la protena, es decir:
22:1
22.2 DISTRIBUCIN DE LAS PROTENAS A SU DESTINO

Se conoce como trfico, trnsito, destino, localizacin, topognesis e incluso clasificacin de protenas la
ruta que siguen estas molculas en la clula eucaritica hasta alcanzar su localizacin final (intracelular o
extracelular), donde pueden ejercer su funcin, y los mecanismos moleculares responsables de que sigan esa
ruta. Este proceso de distribucin se desarrolla de forma estrechamente conectada con la maduracin y con el
plegamiento del polipptido.
22.2.1 Compartimentos implicados

El trnsito de protenas tiene lugar con referencia al citosol, a la membrana plasmtica y a los compartimentos
cerrados presentes en aqul: los orgnulos delimitados por membranas, constituyentes del denominado sistema endomembranoso:
Retculo endoplsmico (RE). Es un sistema intracelular muy ramificado, replegado e interconectado, de
estructura variada (canales, esferas, tubos, cisternas aplanadas), que delimita un espacio interior (luz o
lumen) aislado del citosol. En su mayor parte, el RE posee ribosomas asociados a su cara citoslica
(formando el RE rugoso), donde se realiza la sntesis de las protenas integrales de membrana (celular,
del RE, del Golgi y de lisosomas), de las destinadas al lumen de RE, Golgi o lisosomas y de las destinadas
a secrecin. Las protenas con destino y funcin en el citosol, el ncleo u otros orgnulos (mitocondrias,
cloroplastos, peroxisomas, etc.) se sintetizan en ribosomas no asociados al RE. Las protenas que se
sintetizan en el RE se incorporan al lumen de ste de forma cotraduccional (es decir, simultneamente
con su sntesis), para all sufrir los primeros pasos de la maduracin. La salida posterior del RE se hace
bajo la forma de pequeas vesculas, que se dirigen al complejo de Golgi, a lisosomas o a la membrana
externa.
22. Modificaciones postraduccionales: distribucin, maduracin, plegamiento y degradacin de protenas
22:2
Complejo de Golgi (o aparato de Golgi). Se trata de un compartimento situado entre el RE y la membrana
plasmtica en una disposicin (cara cis frente al RE y cara trans frente a la membrana) que facilita la
recepcin de las vesculas procedentes del RE cargadas de protenas. Est formado por un apilamiento de
sacos o bolsas aplanadas, con forma de disco (dictiosomas), no interconectadas entre s. Los polipptidos
sufren aqu nuevos procesamientos hasta generar la protena madura, ya dotada de las seales moleculares
necesarias para definir su destino final. Las protenas se reenvan al citosol dentro de nuevas vesculas que se
dirigen bien hacia otros orgnulos, bien hacia la membrana externa; (durante este transporte muchas
protenas sufren tambin su procesamiento por escisin proteoltica limitada. En el caso de las protenas
que la clula secreta al exterior, se habla de vesculas de secrecin, que finalmente se funden con la membrana
celular liberando su contenido al exterior por exocitosis. Adems de esta funcin, el complejo de Golgi
tambin genera los lisosomas, cargados de enzimas hidrolticas que no slo degradan molculas intracelulares, sino tambin partculas extracelulares incorporadas por endocitosis (mediante la fusin de endosomas
con lisosomas).
Mitocondrias. En ellas tiene lugar especficamente la fosforilacin oxidativa, con produccin de ATP para
todas las necesidades de energa de la clula. Slo unas pocas de las protenas necesarias estn codificadas en
el genoma mitocondrial y se sintetizan en ribosomas mitocondriales, por lo que se requiere la entrada a travs
de la doble membrana mitocondrial de gran cantidad de protenas sintetizadas en el citosol.
Peroxisomas. Son orgnulos de tamao pequeo delimitados por una membrana nica, ricos en enzimas que
intervienen en reacciones de oxidacin de molculas txicas.
Otros compartimentos. Quiz con menor trascendencia en lo que respecta a la distribucin y la maduracin,
pero obviamente con importancia funcional y que tambin son destino especfico de sus protenas respectivas, deben citarse los cloroplastos, lisosomas, etc.
355
356
III. EXPRESIN GNICA
22.2.2 Trnsito de protenas en el citosol y entre orgnulos

Todas las protenas comienzan su sntesis en el citosol (excepto las codificadas en los genomas mitocondrial y
cloroplstico). La clave del proceso por el que las protenas se dirigen a su localizacin son seales de
clasificacin o secuencias seal que forman parte de la protena naciente y dirigen la distribucin de la
molcula hacia distintos compartimentos de la clula. Las protenas que no presentan secuencia seal permanecen en el citosol. Estas seales suelen ser regiones continuas de la secuencia de aminocidos, entre 15 y 60
residuos, con frecuencia ubicadas cerca de los extremos de la cadena y casi siempre eliminadas por escisin
proteoltica (pg. 369-370) una vez han cumplido su funcin. En otros casos, sin embargo, la seal es una
regin seal, una disposicin tridimensional especfica, dependiente del plegamiento de la protena, a la que
contribuyen residuos aminocidos no contiguos en la estructura primaria.
22:3
El aspecto ms destacable de la distribucin intracelular y el ms comnmente estudiado es el que
corresponde a las protenas secretadas. sta tiene lugar a travs de las membranas del RE y del complejo de
Golgi. Este sistema de transporte implica la introduccin de la cadena polipeptdica (sintetizada en la superficie
del RE rugoso) hacia el lumen, a travs de la membrana, la salida de la protena completada en vesculas hacia el
complejo de Golgi y, finalmente, su transporte en vesculas de secrecin hasta la membrana plasmtica y su
secrecin al exterior. ste ser el nico ejemplo que se estudie en detalle, a continuacin; no se abordarn otros
aspectos concretos, de gran inters pero que escapan al carcter generalista de esta obra. Entre stos, pueden
citarse la integracin de protenas en la membrana de cualquier orgnulo, la distribucin a orgnulos especiales
como mitocondria, cloroplasto y peroxisomas, el transporte mediante vesculas desde el RE al complejo de
Golgi y de ste a la membrana plasmtica, la liberacin final de su contenido por exocitosis al exterior celular o
la importacin de protenas del medio circundante mediante endocitosis facilitada por receptor.
Como ejemplo de otro tipo de destino, cabe mencionar el transporte de protenas desde el citosol hacia
el ncleo para su incorporacin a la cromatina o para su intervencin en los procesos de replicacin,
transcripcin y maduracin postranscripcional. Estas protenas deben pasar a travs de los poros nucleares (estructuras muy complejas, formadas por hasta 100 protenas diferentes, que atraviesan la membrana
doble o envoltura nuclear). A travs de los poros tiene lugar, asimismo, la distribucin, en sentido
inverso, de las molculas de RNA y las subunidades ribosomales, respectivamente sintetizadas y ensambladas en el ncleo. Aunque el paso puede realizarse por libre difusin, parece existir una difusin
selectiva, sin que se despliegue la estructura tridimensional (a diferencia de los otros tipos de trnsito
a travs de membranas). Las protenas que se han de transportar al ncleo parecen poseer una secuencia
seal (secuencia de localizacin nuclear) mediante la cual se unen a otras protenas, receptores de
importacin nuclear, que dirigen la entrada a travs de los poros, a costa de la energa liberada por
la hidrlisis del GTP.
22.2.3 Distribucin de protenas secretadas

22.2.3.1 Caractersticas del pptido seal
La seal de localizacin para las protenas que deben secretarse es habitualmente una secuencia peptdica corta
en el extremo N-terminal del polipptido recin sintetizado, que se denomina secuencia seal o de etiquetado,
etiqueta, pptido seal o secuencia lder (por su posicin al comienzo de la cadena). Consta de uno o ms residuos con carga positiva (Lys o Arg), seguidos de entre 5 y 15 aminocidos hidrfobos y de unos pocos residuos relativamente polares y de cadena corta, en especial Gly y Ala.
22:4
Como se ver a continuacin, es frecuente que el pptido seal se elimine, por la accin de una proteasa de la
seal (o proteasa seal). En estos casos, las protenas recin sintetizadas, cuya secuencia seal an no se ha
eliminado, se denominan formas pre-protena, para diferenciarlas de la molcula que ya ha sufrido la
protelisis del pptido seal; en algunos casos sta a su vez es una forma inactiva que precisa un procesamiento
adicional por protelisis, por lo que recibe el nombre de pro-protena, y su precursor inicial es, pues, una prepro-protena (pg. 370).
22.2.3.2 Mecanismo de entrada al retculo endoplsmico

Como se ha indicado, todas las protenas cuyo destino es la membrana celular, la membrana de RE o Golgi, el
interior de estos orgnulos o la secrecin al exterior se sintetizan en ribosomas asociados al RE. Adems, a poco
de comenzar su sntesis la cadena polipeptdica se introduce al interior del RE, se transloca al lumen. La
condicin nica e imprescindible para esta translocacin es la presencia en la cadena polipeptdica de la
secuencia seal. A continuacin se estudia con detalle este proceso, concretndolo para el caso de protenas secretadas.
Web 22.1. Entrada de la protena al lumen del RE.
1. Primer proceso de unin: la secuencia seal se sintetiza pronto tras el comienzo de la traduccin, por estar
situada en el extremo amino del polipptido naciente, y emerge del ribosoma cuando el polipptido alcanza
unos 70 aminocidos de longitud. Entonces rpidamente la reconoce un complejo proteico citoslico
llamado partcula de reconocimiento de la seal (SRP, con una masa de 325 kDa).
La SRP es una ribonucleoprotena formada por 6 polipptidos y una molcula de RNA. Es sta, llamada
RNA 7SL, la responsable directa del reconocimiento de la secuencia seal. Pertenece al grupo de los RNA
citoplsmicos pequeos (scRNA) y su secuencia est relacionada con la familia Alu de DNA repetitivo
(pg. 118).
2. Segundo proceso de unin: la unin de la SRP provoca una detencin temporal de la elongacin del
polipptido en el ribosoma, hasta que el complejo anterior (mRNA:ribosoma:aa-tRNA:polipptido
naciente:SRP) contacta con la superficie citoslica del RE, donde la SRP es reconocida y se une a una
protena integral de la membrana del RE, denominada protena receptora de SRP (SRP-R) o protena de
anclaje. Como resultado, todo el complejo queda fijado fuertemente al RE.
El receptor de SRP es una protena heterodimrica con la capacidad de unir GTP y de catalizar su hidrlisis
(actividad GTPasa). La forma con GTP unido es la que interacciona con la SRP, mientras que al hidrolizarlo
a GDP pierde afinidad y se libera la SRP.
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III. EXPRESIN GNICA
3. Tercer proceso de unin: el complejo ha quedado dispuesto sobre el RE de tal forma que se favorece su
interaccin con otra protena integral de la membrana, situada en una posicin vecinal a SRP-R. Esta
nueva protena recibe el nombre de protena receptora del ribosoma o riboforina porque su misin es,
precisamente, la de reconocer la subunidad mayor del ribosoma que forma parte del gran complejo y
conducir el polipptido naciente al interior del RE. Como consecuencia de este anclaje ocurre lo
siguiente:
a) La subunidad a de SRP-R hidroliza el GTP unido, rindiendo GDP y Pi (gasto energtico de un GTP por
polipptido).
b) Se disocia la SRP, quedando disponible en el citosol para volverse a emplear (ciclo de la SRP).
c) Al liberarse la SRP se elimina la inhibicin de la traduccin, es decir, se reanuda la sntesis proteica,
ahora ya dirigida hacia el lumen del RE.
d) En la riboforina se abre un canal de translocacin que permite la entrada en el lumen de la cadena
polipeptdica creciente. De ah los nombres alternativos de translocasa para la riboforina y de complejo
de translocacin para el complejo que se form.
4. En la cara luminal del RE, asociada a la porcin interior de las riboforinas del poro, se encuentra una nueva
protena integral de membrana llamada peptidasa de la seal, pues escinde el pptido seal, separndolo del
resto del polipptido. Una vez liberado, aqul se degrada hasta aminocidos.
5. La finalizacin de la sntesis en el lumen del RE, con liberacin de la protena, tendr lugar cuando el
extremo carboxilo del polipptido haya pasado a travs de la membrana del RE. El ribosoma se disocia
entonces del RE y se desorganiza todo el complejo de traduccin para volver a reciclarse (ciclo del
ribosoma).
22.3 MADURACIN O PROCESAMIENTO DEL POLIPPTIDO NACIENTE

Conceptualmente, ste es el componente ms sencillo de la modificacin postraduccional. Puede tener lugar
tras haber finalizado la sntesis, una vez liberado el polipptido del ribosoma o, ms comnmente, de forma
simultnea con la traduccin, es decir, la regin de la molcula que se ha sintetizado antes (Nterminal) va
siendo modificada mientras an se est elongando el polipptido por una regin ms prxima al extremo C
terminal. Esta segunda posibilidad recibe el nombre de modificacin cotraduccional, aunque los procesos
sufridos son los mismos en ambos casos. Se utilizan enzimas y cofactores especficos para una multitud de
reacciones de modificacin.
Web 22.2. Modificaciones cotraduccionales.
La maduracin implica dos grandes tipos de modificaciones del polipptido: la transformacin de las
cadenas laterales de algunos aminocidos y la escisin proteoltica.
22.3.1 Maduracin por modificacin de aminocidos

Diversos aminocidos del polipptido, siempre en posiciones especficas, sufren reacciones de modificacin
qumica, aunque catalizada enzimticamente. Se describen a continuacin algunas de las ms comunes.
22.3.1.1 Unin de sustituyentes a los aminocidos

Es frecuente la adicin de determinados grupos (como acetilo, carboxilo, fosfato, hidroxilo o metilo) a la
cadena lateral de aminocidos o a los extremos amino- o carboxi-terminales. Se han descrito ms de un
centenar de modificaciones en residuos aminocidos; veamos algunos de los ejemplos ms comunes.
a) Acetilacin
La adicin de grupos acetilo tiene lugar en un 50% de las protenas eucariticas. Una posicin frecuente es el
grupo amino terminal, previa eliminacin del residuo de metionina N-terminal (pg. 369). Uno de los efectos
de esta modificacin es una mayor resistencia a la degradacin, al proteger el grupo amino. Tambin se acetila
el grupo amino en la cadena lateral de residuos de lisina en las histonas; esta modificacin, que es reversible,
contribuye a la regulacin de la condensacin de la cromatina (pg. 284).
22:5
b) Carboxilacin
En algunas protenas se aade un grupo carboxilo a la cadena lateral de un aminocido; en concreto, en los
factores de coagulacin y en protenas estructurales del hueso se carboxilan residuos de glutamato produciendo
g-carboxiglutamato (Gla). Tambin sufre carboxilacin el aspartato dando b-carboxiaspartato (Asa), encontrado en protenas ribosomales de E. coli.
22:6
Web 22.3. Carboxilacin del glutamato mediada por la vitamina K.
c) Fosforilacin
Es quiz la modificacin ms frecuente, y acta casi siempre de forma reversible (fosforilacin y desfosforilacin) (v. web 22.4). Ambas reacciones constituyen un mecanismo para la regulacin de la actividad
de multitud de protenas, en particular las implicadas en rutas de transduccin de seal y algunas enzimas
(v. por ejemplo, pg. 464). Pertenece este mecanismo a la categora de regulacin por modificacin covalente.
En ambos casos, se trata de una modificacin estrictamente postraduccional, que tiene lugar en el citosol
despus de que se han completado la sntesis y el plegamiento de la protena.
La modificacin afecta a los aminocidos alcoholes, serina, treonina y tirosina, en su grupo -OH, y est
catalizada por protena quinasas, que hidrolizan el ATP transfiriendo su grupo fosfato g al residuo aminocido.
Una de las consecuencias es un incremento de carga negativa en la protena. La reaccin opuesta, de desfosforilacin, la catalizan protena fosfatasas.
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III. EXPRESIN GNICA
22:7
Web 22.4. Quinasas y fosfatasas de protenas.
d) Hidroxilacin
Varias hidroxilasas presentes en el RE catalizan la incorporacin de grupos -OH a algunas protenas. Esta
modificacin se observa, por ejemplo, en residuos de prolina y lisina del colgeno, y resulta esencial para las
correctas propiedades de esta protena fibrosa.
22:8
e) Metilacin
Consiste en la incorporacin de metilo al grupo e-amino de la cadena lateral de lisina, o bien al grupo
g-carboxilo del glutamato. La metilacin de lisinas en las histonas es un importante mecanismo de
regulacin de la expresin gnica, una de las marcas epigenticas (pg. 285).
22:9
22.3.1.2 Modificacin con lpidos

a) Acilacin (cidos grasos)
La acilacin es una modificacin relevante en algunas protenas, que en general aumenta su hidrofobia. Ms
concretamente, el lpido supone a menudo un punto de anclaje a la membrana (comnmente en la cara interna).
Puede afectar a las cadenas laterales o a los extremos del polipptido. En general esta reaccin tiene lugar sobre
protenas citoslicas solubles, sintetizadas en ribosomas libres, y es cotraduccional.
Acilacin de cadenas laterales de serina y treonina (enlace ster con el grupo OH) o de cistena (enlace tioster
con el SH), con cidos grasos de 14C (miristato), 16C (palmitato) y 18C (estearato y oleato).
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III. EXPRESIN GNICA
Acilacin de los extremos. El grupo amino terminal puede formar enlace amida con miristato (14C) o
palmitato (16C), lo que tiene lugar cotraduccionalmente (antes de completar la sntesis del polipptido). La
reaccin parte de miristoil-coenzima A, catalizada por una miristoil-CoA:protena N-miristoiltransferasa.
22:11
b) Prenilacin (terpenos)
Principalmente se unen tres tipos de radical terpenoide (formados por unidades de isopreno, de ah el nombre
prenilacin): geranilo (10C), farnesilo (15C) y geranilgeranilo (20C); los dos primeros son metabolitos
intermediarios de la ruta biosinttica del colesterol. Al igual que la acilacin, sufren esta modificacin protenas
sintetizadas en ribosomas citoslicos.
22:12
Entre las protenas modificadas con farnesilo se encuentran la protena Ras, protenas G y protenas de la
matriz nuclear. La oncoprotena Ras utiliza el farnesilo para anclarse a la superficie interna de la membrana
plasmtica y poder activar las seales intracelulares que desembocan en el fenotipo canceroso. El bloqueo de la
prenilacin conlleva la prdida de la actividad transformante (carcinognica), por lo que se han desarrollado
frmacos anticancerosos basados en la inhibicin de la farnesiltransferasa.
22.3.1.3 Incorporacin de glcidos: glicosilacin

Se llama glicosilacin a la unin covalente de cadenas de oligosacridos (o glicanos) a la cadena lateral de
algunos aminocidos en las protenas (preferimos el prefijo glico- al alternativo gluco-, que queda reservado
para lo especfico de glucosa). Esta modificacin es muy frecuente en protenas de membrana y en las secretadas
al exterior (entre las que se incluyen las protenas del plasma sanguneo), y menos comn en protenas intracelulares. Por otra parte, es caracterstica de eucariotas y virus, pero inexistente en procariotas.
a) Caractersticas de las glicoprotenas
Las glicoprotenas en su conjunto no tienen una funcin comn definida por la glicosilacin. Sin embargo, la
adicin de azcares posee un papel esencial en la estructura y en la funcin de cada una de ellas. Por ejemplo,
la glicosilacin:
Contribuye a establecer la conformacin de la protena.
Aumenta su estabilidad (por ejemplo frente al calentamiento) y su resistencia a la digestin por proteasas.
Como consecuencia, aumenta la vida media en plasma (disminuye el aclaramiento).
Hace las protenas ms hidrfilas, aumentando su solubilidad y, por tanto, facilitando su interaccin con las
clulas del entorno.
Aporta estructuras individualizadas que median la interaccin con receptores especficos y actan como
determinantes antignicos.
Son innumerables las protenas que estn glicosiladas (ms que las no glicosiladas), as como sus funciones,
y no se discutirn en este texto. Como meros ejemplos, que no representan el conjunto de funciones, cabe citar
su papel como base de los distintos tipos de grupos sanguneos, entre ellos el grupo AB0 (pg. 410), cuyos
antgenos A, B y 0 son oligosacridos constituyentes de glicoprotenas y glicolpidos presentes en la superficie
de los eritrocitos y de otras clulas, y en glicoprotenas secretadas. Por otro lado, un mtodo rutinario de
vigilancia de la diabetes es la medida de hemoglobina glucosilada, cuya concentracin depende de la de glucosa
en sangre (la hemoglobina une covalentemente la glucosa que atraviesa de forma libre la membrana eritrocitaria). Asimismo, existen abundantes ejemplos de patologas provocadas por la alteracin del patrn de
glicosilacin.
La unin de los oligosacridos, que tiene lugar tanto de forma cotraduccional como postraduccional, da lugar
a una gran variedad de glicoprotenas en las que la parte glucdica representa una proporcin tambin variable
de la masa total. La clasificacin de los compuestos cuya molcula posee tanto glcidos como polipptidos no es
sencilla, debido a la gran diversidad existente. En cualquier caso, existen diferencias tanto en lo relativo a la
proporcin de las partes glucdica y peptdica como al tipo de azcares que participan y a la forma como se unen
entre s. A partir de aqu, la descripcin se limitar a lo referente a las glicoprotenas propiamente dichas.
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III. EXPRESIN GNICA
b) Tipos de glicosilacin
Las cadenas glucdicas de las glicoprotenas se clasifican en dos grandes familias, en funcin de cul sea el enlace
entre el oligosacrido y el polipptido. Esta clasificacin puede aplicarse en cierta medida a las propias
glicoprotenas, pero algunas presentan de forma simultnea azcares unidos mediante ambos tipos de enlace,
en puntos distintos de su molcula.
22:14
Oligosacridos unidos por oxgeno (O-glicoprotenas): el azcar se une al tomo de oxgeno de cadenas
laterales de serina o treonina. En general, los O-glicanos u oligosacridos unidos por O son estructuras sencillas,
aunque variadas. Los ms frecuentes tienen como ncleo un residuo de N-acetilgalactosamina unido a la serina
o treonina, pero existen tambin uniones xilosa-serina, galactosa-hidroxilisina, arabinosa-hidroxiprolina,
N-acetilglucosamina-serina/treonina e incluso galactosa-cistena (con un enlace S-glicosdico).
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Monosacrido:
Abreviatura:
Monosacrido:
Abreviatura:
a-D-glucosa
N-acetil-b-D-glucosamina
a-D-manosa (o b)
a-D-fucosa
(6-desoxi-D-Gal)
Glc
GlcNAc
Man
Fuc
b-D-galactosa
N-acetil-a-D-galactosamina
cido silico (N-acetilneuramnico)
Gal
GalNAc
Sia (NeuNAc)
Nota: Estrictamente, las abreviaturas slo estn recomendadas (IUPAC) para usarse cuando estos monosacridos estn formando parte de
oligosacridos o polisacridos
Oligosacridos unidos por nitrgeno (N-glicoprotenas): el azcar se une al tomo de nitrgeno amdico de
la cadena lateral de Asn. sta debe formar parte de la secuencia Asn-X-Ser-Y, donde la posicin de Ser puede
estar ocupada tambin por Thr o Cys, y X e Y son cualquier aminocido excepto Pro. Las estructuras de los
N-glicanos u oligosacridos unidos por N son mucho ms complejas y diversas. El tipo de monosacridos
constituyentes es generalmente diferente del de los O-glicanos.
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III. EXPRESIN GNICA
Alrededor de una estructura central comn se unen monosacridos muy diversos (cido silico, galactosa,
Nvacetilglucosamina, etc.), formando cadenas con distintas disposiciones. De acuerdo con stas, los
N-glicanos se clasifican en 3 grupos: ricos en manosa, complejos e hbridos.
22:17
Anclaje GPI (glicosilfosfatidilinositol): este tercer tipo de glicosilacin posee importantes diferencias con los
anteriores. Se trata de una estructura particular que permite a ciertas protenas fijarse sobre una membrana
(habitualmente, en la cara extracelular), a travs de un lpido que se inserta en sta. La unin de la protena al
lpido no es directa (como lo son la acilacin y la prenilacin presentadas anteriormente), sino mediante un
oligosacrido conector. Se puede contemplar como una protena modificada por unin de un glicolpido.
22:18
Web 22.5. Estructura tridimensional de algunos oligosacridos de glicoprotenas.
c) Biosntesis de las glicoprotenas

La incorporacin de las cadenas oligosacardicas al polipptido es uno de los principales procesos metablicos
que tienen lugar en el lumen del RE y del complejo de Golgi. Las protenas, por tanto, se mantienen aisladas del
citoplasma durante su glicosilacin, que tiene lugar mientras la protena va viajando a lo largo de la ruta RE !
vesculas de transferencia ! complejo de Golgi ! vesculas ! secrecin u otro destino final de la glicoprotena.
Web 22.6. Rutas de procesamiento y distribucin de las glicoprotenas.
Los O-glicanos y N-glicanos se sintetizan por rutas metablicas claramente diferentes, pero en todos los
casos la unin de los monosacridos est catalizada por glicosiltransferasas, especficas no slo para reconocer
el monosacrido que se incorpora y la cadena oligosacardica que acta de aceptor, sino tambin para formar el
enlace en posiciones muy definidas del anillo de cada uno de los azcares. Estas enzimas se encuentran en la
cara interior de las membranas del RE y del complejo de Golgi. Para poderse emplear como sustratos, los
monosacridos deben estar activados, siempre por unin a un nucletido; en concreto, en forma de UDP-Glc,
UDP-GlcNAc, UDP-Gal, UDP-GalNAc, GDP-Man, GDP-Fuc y CMP-Sia. En otros casos, el precursor es el
azcar unido a una molcula de dolicol (un lpido terpenoide).
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III. EXPRESIN GNICA
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La adicin de los O-glicanos al residuo de Ser o Thr se realiza de manera directa, por unin sucesiva de los
monosacridos, catalizada por las respectivas glicosiltransferasas. Todas las etapas tienen lugar en el complejo
de Golgi, de forma postraduccional (pues la sntesis de la cadena polipeptdica se ha completado en el RE).
22:20
La sntesis de N-glicoprotenas es un proceso ms complejo, que comienza por la sntesis de un oligosacrido
precursor unido al dolicol, seguida de la transferencia en bloque de ese glicano al residuo de asparragina del
polipptido y, finalmente, de nuevas reacciones de adicin de monosacridos y tambin de eliminacin de
algunos de los previamente incorporados. El proceso se desarrolla de manera secuencial, parte en el RE
(cotraduccional) y parte en el complejo de Golgi (postraduccional).
Web 22.7. Biosntesis de N-glicanos para las glicoprotenas.
22.3.1.4 Formacin de puentes disulfuro

Son numerosas las protenas que forman entrecruzamientos covalentes mediante puentes disulfuro entre
residuos de cistena de la misma o de distinta cadena (intracatenarios o intercatenarios, respectivamente).
Los enlaces disulfuro son ms frecuentes en las protenas secretadas que en las protenas intracelulares, lo cual
est relacionado con el ambiente ms reductor en el citosol. Estos enlaces participan en la estabilizacin del
plegamiento correcto (pg. 372) y protegen la conformacin nativa de la protena frente a la desnaturalizacin
en un ambiente extracelular que puede ser ms agresivo. La formacin de enlaces disulfuro (una reaccin
redox) est asistida por la enzima protena-disulfuro isomerasa y por molculas pequeas con grupos SH (tiol),
la principal de las cuales es el glutatin (g-glutamilcisteinilglicina).
22:21
Web 22.8. Estructura del glutatin.
22.3.1.5 Otras modificaciones

Para ejercer su actividad muchas protenas procariticas y eucariticas emplean grupos prostticos, algunos
de ellos unidos covalentemente una vez que el polipptido ha abandonado el ribosoma. Entre estos grupos
pueden citarse la biotina en la acetil-CoA carboxilasa y el grupo hemo en el citocromo c.
La actividad de algunas enzimas se regula aadiendo mononucletidos. Por ejemplo, la glutamina sintetasa
(del sistema fijador de nitrgeno en bacterias) en su forma inactiva est sustituida con un grupo adenililo
sobre un residuo de tirosina. El grado de adenililacin lo controla una protena reguladora.
La ADP-ribosilacin es otra reaccin de modificacin que acta de forma reversible regulando la funcin de
protenas citoplsmicas y nucleares. Transferasas especficas actan sobre His, Arg, Asn, Lys o Glu,
empleando como cosustrato el NAD+. La misma actividad la ejercen las toxinas diftrica, colrica y
pertsica, perturbando la regulacin fisiolgica.
En algunas protenas se produce la sulfatacin de tirosina con 3-fosfoadenosina-5-fosfosulfato; esta
reaccin tiene lugar en el complejo de Golgi.
La ubicuitinacin es la unin de la ubicuitina (una protena pequea, con 76 aminocidos) a residuos de
lisina. Es una seal o etiqueta para la degradacin de aquellas protenas que se han ubicuitinado varias veces
(pg. 377-378). La sumoilacin es la unin tambin sobre la cadena lateral de lisina de una molcula de
SUMO, otra protena pequea. Como resultado, se puede modular la interaccin con otras protenas, alterar
la localizacin en la clula o neutralizar el efecto de la ubicuitina.
22.3.2 Maduracin por escisin proteoltica

Este segundo tipo de maduracin proteica consiste en la ruptura especfica del polipptido (protelisis) en
polipptidos ms pequeos, cada uno con distinta actividad, o en la eliminacin de una porcin sin funcin (en
general pequea) para dar un solo polipptido activo. En cualquier caso, se trata de un proceso de activacin,
de precursores inactivos a protenas activas. Se conoce como procesamiento proteoltico o protelisis limitada.
Es una hidrlisis absolutamente especfica y de accin limitada a ciertos enlaces peptdicos, y no debe confundirse con la responsable de la degradacin proteica (pg. 377).
Adems de los procesos de activacin por protelisis, que se describen a continuacin, se deben considerar
dentro de este apartado la eliminacin de residuos amino y carboxi-terminales esencialmente la liberacin
enzimtica de la metionina N-terminal (previa desformilacin en protenas procariticas) y la eliminacin del
pptido o secuencia seal (responsable de la distribucin de las protenas maduras hacia su destino, pg. 357).
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III. EXPRESIN GNICA
22.3.2.1 Activacin proteoltica de enzimas

Las proteasas digestivas tripsina y quimotripsina se sintetizan en forma inactiva, como precursores o pro
protenas, denominadas proenzimas o zimgenos. De ese modo se protegen las clulas donde se sintetizan y se
reserva la actuacin para el tubo digestivo. (En realidad, recin sintetizadas son pre-pro-protenas, pues poseen
un pptido seal que las marca como protenas que deben secretarse y luego se elimina.) Una situacin similar
afecta a la mayora de factores de coagulacin, que son inactivos hasta que una protelisis limitada los activa
como proteasas, fenmeno responsable de la cascada de eventos que desencadena la coagulacin.
La tripsina, producida en el pncreas exocrino, se activa mediante la eliminacin de su octapptido
Nterminal, por accin de la enteroquinasa producida por las clulas de la pared del intestino delgado:
22:22
La tripsina acta, a su vez, activando otras proenzimas o zimgenos, entre ellos el quimotripsingeno,
precursor de otra enzima digestiva pancretica, la quimotripsina; esta activacin es algo ms compleja:
22:23
Web 22.9. Activacin proteoltica de protenas.
22.3.2.2 Activacin proteoltica de hormonas

Como ejemplo caracterstico, veamos la sntesis de la insulina. Adems de demostrar la maduracin por
escisin proteoltica, constituye un ejemplo tpico de modificacin qumica por formacin de enlaces disulfuro
(pg. 369).
1. La insulina se sintetiza en las clulas B (o b) de los islotes de Langerhans del pncreas endocrino bajo la
forma de preproinsulina, un precursor polipeptdico inactivo. La presencia en su extremo amino de una
secuencia seal determina, como en toda protena destinada a la secrecin, el posterior transporte de esta
molcula mediante vesculas hacia el exterior celular.
22:24
Web 22.10. Estructura tridimensional de proinsulina e insulina.
2. En el RE se elimina la secuencia seal dando la proinsulina, el verdadero precursor an inactivo. ste se pliega
en una conformacin tridimensional especfica, estable, que facilita la formacin de tres enlaces disulfuro.
3. La proinsulina se transporta hasta el complejo de Golgi, donde comienza su conversin en insulina activa
mediante protelisis. Las molculas se acumulan en vesculas denominadas grnulos de secrecin, en los que
se completa su protelisis y se almacenan hasta que la clula recibe las seales que determinan la secrecin de
la insulina al medio extracelular, e inmediatamente su paso al los capilares sanguneos.
22.3.3 Ayuste de protenas

En algunos casos, el polipptido sintetizado pierde de forma especfica un fragmento interno y los dos
segmentos que lo flanquean se unen para formar la protena funcional. Este proceso es formalmente
anlogo al de ayuste del mRNA (corte de intrones y empalme de exones, pg. 303), por lo que se denomina
ayuste de protenas. El segmento de polipptido eliminado recibe el nombre de intena y los dos segmentos que
se unen y forman parte de la protena final, extenas. El proceso est catalizado por la propia intena. Se ha
encontrado este fenmeno en diversas bacterias, arqueas y eucariotas unicelulares.
22:25
El proceso est estrictamente definido y depende de la presencia de ciertos aminocidos en las fronteras de la
intena (regin de ayuste del lado amino y regin de ayuste del lado carboxilo). En concreto, en la mayora de
los casos la intena comienza con un residuo de cistena o serina y termina con asparragina o glutamina,
mientras que la extena del lado C comienza por cistena, serina o treonina. Gracias a esos residuos en particular
se produce una serie de reorganizaciones de enlaces que terminan en la escisin de la intena y la conexin de
ambas extenas mediante un enlace peptdico completamente normal.
Web 22.11. Detalles del mecanismo de ayuste de protenas.
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III. EXPRESIN GNICA
La capacidad de las intenas para catalizar su propia eliminacin conectando los dos polipptidos adyacentes se
ha aprovechado en el laboratorio para conectar protenas no relacionadas o unir protenas a etiquetas marcadoras.
22.4 PLEGAMIENTO DE PROTENAS

Uno de los problemas importantes en biologa molecular es comprender cmo la informacin contenida en la
secuencia de aminocidos de una protena da lugar a su estructura tridimensional distintiva, responsable de su
funcin o actividad biolgica. Este plegamiento de la cadena polipeptdica, que tiene lugar en unos segundos, se
realiza de forma simultnea a la distribucin o trnsito y a una parte de la maduracin del polipptido, por lo
que maduracin y plegamiento estn ntimamente ligados.
Los defectos en las rutas de plegamiento y distribucin de las protenas son la causa molecular de varias
enfermedades.
La fibrosis qustica se origina por una mutacin en el gen de la protena transportadora de cloruro, que
suprime uno de sus aminocidos (pg. 392). Este cambio impide la separacin del complejo protena
carabina (pg. 373), lo que a su vez impide que la protena salga del RE y contine su maduracin y
trnsito hacia la membrana citoplasmtica.
La enfermedad de Alzheimer, que afecta al 10% de las personas mayores de 65 aos, se origina en parte por
la acumulacin de agregados de un pptido derivado de la protena b-amiloide; esos agregados parecen estar
causados por un defecto en el plegamiento.
Una forma hereditaria de enfisema (enfermedad pulmonar degenerativa) se produce por mutaciones en el
gen de la antitripsina a1 (pg. 414) que conducen a la agregacin de la protena, impidiendo su secrecin; la
deficiencia de la protena en plasma produce susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad.
Por ltimo, la conocida enfermedad de las vacas locas, el scrapie en ovejas y la enfermedad de Creutzfeld-Jacob
en los seres humanos las causa una protena con plegamiento anmalo, la protena prinica PrP. Aunque la
descripcin de este problema supera las posibilidades de este libro, baste decir que una molcula de protena
plegada de forma anmala induce el mismo plegamiento en otras molculas de la misma protena, conduciendo as, por un lado, al desarrollo de la enfermedad y, por otro, a su transmisin a otros individuos.
22.4.1 Mecanismo del plegamiento de las protenas

Algunos polipptidos, en especial los ms pequeos, pueden adoptar su conformacin tridimensional nativa de
forma espontnea, pero en la mayor parte de los casos el plegamiento correcto requiere la ayuda de protenas
especiales (distintas de las que se estn plegando); la traduccin del trmino ingls chaperones ha llevado a
llamarlas chaperonas, chaperoninas, celadoras o carabinas; emplearemos este ltimo nombre, ms fiel al
significado original (persona de edad acompaante de una joven, que evita interacciones incorrectas).
Estas carabinas no slo estn implicadas en el plegamiento, sino tambin en la translocacin a travs de
membranas subcelulares y en la degradacin de las protenas.
Adems de las carabinas, en las clulas contribuyen al plegamiento dos tipos de isomerasas que, al catalizar
ruptura y reconstruccin de enlaces covalentes, aceleran el plegamiento sin afectar a su resultado final. Entre
ellas cabe citar la protena-disulfuro isomerasa, que intercambia enlaces disulfuro entre dos molculas
(pg. 369), y otras enzimas que catalizan la interconversin de las conformaciones cis y trans de la prolina
formando enlace peptdico, contribuyendo ambas a que la cadena polipeptdica adopte distintas conformaciones en la bsqueda de la de mnima energa.
El conocimiento de los mecanismos e interacciones que estabilizan la estructura tridimensional surge de
experimentos pioneros de desnaturalizacin y renaturalizacin proteica (con la ribonucleasa A, de pequeo
tamao y un solo dominio) y posteriormente de la aplicacin de mtodos biofsicos de anlisis y tecnologa del
DNA para producir polipptidos alterados. Dada la variedad de protenas y la complejidad de los mecanismos
implicados, no se conocen an las reglas que rigen el plegamiento in vivo: an no somos capaces de predecir la
estructura tridimensional de una protena a partir de su secuencia. Se estn haciendo importantes avances, no
obstante, mediante el uso de tcnicas computacionales que simulan el proceso de plegamiento a partir de los
parmetros fisicoqumicos de las interacciones entre tomos.
Sin embargo, est claro que es la propia secuencia de aminocidos la que determina por s misma la
estructura tridimensional activa. La estructura primaria o secuencia lineal resultante de la asociacin de los
aminocidos mediante enlaces peptdicos (determinada a su vez por la secuencia lineal de bases del DNA a
travs del mRNA) define la disposicin de la cadena polipeptdica para formar puentes de hidrgeno, la
capacidad de sus residuos hidrfobos para acomodarse en el interior de la molcula y los requerimientos
estricos que definen las posiciones ms idneas de la conformacin nativa. Este punto tiene implicaciones de
ndole prctica, biotecnolgica, porque cualquier modificacin de la secuencia altera la estructura final de la
protena.
Las etapas del proceso de plegamiento pueden analizarse, de forma aproximada, siguiendo los niveles de
organizacin de las protenas globulares. En general, el plegamiento viene determinado por consideraciones
energticas correspondientes a las estructuras secundaria y terciaria, las que permiten el mximo nmero de
puentes de hidrgeno e interacciones de Van der Waals, inicas e hidrfobas, es decir, la conformacin
de menor energa (termodinmicamente, la ms estable).
Muchas protenas se pliegan a travs de estados globulares intermedios, conocidos como de glbulo
fundido (molten globule), estructuras compactas, aunque ms abiertas y flexibles que la conformacin nativa,
con un contenido considerable de estructura secundaria, ms o menos similar a la de aqulla, pero que carecen
an de su estructura terciaria definida. Las cadenas laterales de los aminocidos en el glbulo fundido no han
establecido todava sus interacciones mutuas, presentan libertad de movimiento e interaccin con el disolvente,
incluso las hidrfobas. Este primer plegamiento sera como un armazn o esqueleto sobre el que se elaborara la
estructura tridimensional definitiva, algo as como un pliegue de la estructura final por etapas.
El principio bsico del plegamiento, en su conjunto, es la presencia de residuos hidrfobos de la cadena en
un ambiente acuoso altamente polar: el efecto hidrfobo, el mismo que determina la asociacin de los lpidos
en las membranas celulares, es la principal fuente de estabilidad de la conformacin plegada de una protena.
22.4.2 Protenas implicadas en el plegamiento: carabinas moleculares

Los polipptidos en estado de glbulo fundido, los que estn plegados parcial o incorrectamente y en especial
los que an estn saliendo del ribosoma (cadenas nacientes) exponen en su superficie residuos hidrfobos que
en la protena nativa estarn siempre dispuestos en el interior de la molcula (escondidos o enterrados por
la envoltura de residuos hidrfilos que forma la superficie de la protena). Estas regiones hidrfobas, para evitar la
interaccin con el medio acuoso polar, tienden a asociarse entre s, conduciendo a la formacin de agregados de
varias molculas (que en algunos casos constituyen los denominados cuerpos de inclusin). El plegamiento
correcto, por tanto, requiere una proteccin frente a esta posibilidad, hasta que la protena tenga la ocasin de
encontrar su conformacin nativa, la ms estable; ste es uno de los papeles de las carabinas moleculares.
22:26
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III. EXPRESIN GNICA
22.4.2.1 Tipos de carabinas

Las primeras protenas identificadas como accesorias, auxiliares o catalizadoras del plegamiento se llamaron
protenas de choque trmico (Hsp, por heat shock protein), porque su sntesis se estimula al someter clulas en
cultivo a una elevacin transitoria de la temperatura. Esto es as porque en esas condiciones aumenta la
cantidad de molculas de protena parcialmente desplegadas, que es necesario replegar. Hoy da, el grupo
de carabinas incluye otras muchas protenas, no relacionadas entre s, importantes para la viabilidad celular a
todas las temperaturas y bajo todas las circunstancias. De acuerdo con su modo de actuacin, se pueden
distinguir dos grandes grupos de carabinas moleculares:
a) Carabinas Hsp70 y Hsp40
La familia Hsp70 (cuyo nombre procede de su masa molecular de 70 kDa) comprende protenas que se asocian
a segmentos peptdicos cortos, en conformacin extendida o desplegada y ricos en aminocidos hidrfobos.
Por ello, reconocen las cadenas polipeptdicas nacientes segn estn saliendo del ribosoma. Su accin principal
es evitar que se agreguen por interacciones hidrfobas intermoleculares (recordando la metfora de la joven
acompaada). Existen carabinas de esta familia en procariotas, eucariotas, mitocondrias, cloroplastos y en el
interior del RE. Su unin y separacin, reversibles, con la protena desplegada dependen de la hidrlisis de ATP
por parte de una actividad ATPasa propia de la Hsp70. Todo el proceso est modulado por otro tipo de
protenas, la familia Hsp40, que posee capacidad activadora de la Hsp70 (co-carabinas) y tambin de carabinas
moleculares por s mismas.
22:27
Las carabinas Hsp70 estabilizan, por tanto, las cadenas polipeptdicas nacientes, protegindolas de la
agregacin, y mediante los ciclos controlados de unin y separacin proporcionan un entorno seguro para
que la protena pueda plegarse de manera adecuada. Sin embargo, no contribuyen a definir el resultado del
plegamiento, que slo depende de la secuencia del polipptido.
b) Carabinas Hsp60 y Hsp10

Estas protenas forman una estructura multimrica muy caracterstica, en forma de caja cilndrica, en cuyo
interior se alojan los polipptidos y donde experimentan su plegamiento, aislados del entorno y de nuevo
evitando la interaccin con otras molculas desplegadas o parcialmente plegadas. El ejemplo mejor conocido es
la protena GroEL de E. coli, cuya estructura se ha determinado por cristalografa de rayos X a alta resolucin.
Con la colaboracin de GroES, protena de la familia Hsp10, canaliza el plegamiento del polipptido. Si ste no
se pliega por completo en un ciclo, puede volver a entrar en la cavidad para continuar plegndose, hasta
alcanzar la estructura nativa.
22:28
Web 22.12. Estructura tridimensional de las carabinas GroEL y GroES.
Se han encontrado homlogos del sistema GroEL-GroES en mitocondrias y cloroplastos, y protenas menos
estrechamente relacionadas en el citosol eucaritico. Las Hsp60/Hsp10 del grupo I, en las mitocondrias,
captan los polipptidos semiplegados cedidos por Hsp70:ADP una vez que han atravesado la membrana
mitocondrial. Las del grupo II, en el citosol, reciben tambin los polipptidos desde Hsp70:ADP. La
prefoldina (homloga a Hsp10) acta de co-carabina transfiriendo el polipptido hacia TRiC/CCT, anloga
a Hsp60.
c) Otras carabinas
La Hsp70:ADP puede ceder el polipptido que protege a otro grupo de carabinas, las Hsp90; stas son menos
abundantes que las anteriores, pero esenciales para que el plegamiento de algunas protenas se complete
correctamente.
375
376
III. EXPRESIN GNICA
22:29
Se han encontrado tambin unas carabinas Hsp pequeas, que forman complejos oligomricos. Entre
ellas se encuentran las Hsp26, que se activan cuando la clula se ve expuesta a alta temperatura, y las Hsp27,
que se activan en respuesta a seales mediante quinasas de protenas. La activacin disocia sus oligmeros en
dmeros que pueden asociarse al polipptido desplegado, evitando su agregacin hasta que sufra un plegamiento correcto o bien sea degradado.
En general, se ha comprobado que las protenas van pasando de uno a otro tipo de carabinas de forma
ordenada, no se liberan para encontrar al azar la siguiente carabina necesaria.
22.4.2.2 Funcin de las carabinas

Las carabinas moleculares desempean un papel esencial en varias circunstancias:
En el citosol celular, dada la gran densidad de macromolculas, la variedad y elevada concentracin de
protenas all presentes en fase de plegamiento aumenta la probabilidad de interacciones hidrfobas y de
agregacin de las protenas que, como se ha comentado, evitan las carabinas.
En la mitocondria y el cloroplasto intervienen en el desplegamiento necesario para el trnsito de protenas de
origen citoslico a travs de las membranas externa e interna del orgnulo, as como en el plegamiento en su
interior, para adquirir su funcionalidad.
En el lumen del RE interaccionan con las protenas plegadas de forma incorrecta (o las protenas dimricas o
multimricas no ensambladas de forma adecuada), con lo que stas quedan retenidas en el RE hasta que tiene
lugar el plegamiento correcto. Slo entonces (al igual que las protenas bien plegadas desde el principio)
se transportan en vesculas hacia el complejo de Golgi. En caso contrario, las protenas no plegadas se
degradan.
22.5 DEGRADACIN DE LAS PROTENAS

En paralelo con el desempeo de su funcin, las protenas se degradan constantemente en la clula. Este proceso
continuo, unido a la biosntesis, constituye el llamado recambio proteico (en ingls, turnover), que tiene lugar a
lo largo de toda la vida celular y es necesario para mantener en todo momento un nivel adecuado de protenas
(estado estacionario), indispensable para la actividad celular, para impedir la acumulacin de protenas
anmalas o no necesarias y para facilitar el reciclado de los aminocidos. De forma genrica, se puede decir
que en una clula una protena sobrevive en promedio unos dos das antes de degradarse, lo que ofrece una
idea de la intensa actividad de los procesos de biosntesis y de degradacin.
Existen protenas que se sintetizan y degradan (se recambian) de forma muy rpida respecto a la vida media
de la clula en la que se hallan. Entre ellas se encuentran las protenas defectuosas, por ejemplo por haber
incorporado aminocidos incorrectos en la sntesis, las que no desempean de manera correcta su funcin; a
veces un simple cambio qumico convierte a una protena en blanco de una accin proteoltica. Por el contrario,
otras protenas, las necesarias en todo momento, son muy estables y por ello no requieren una sntesis continua
a elevada velocidad. As ocurre, por ejemplo, con la hemoglobina, que puede durar todo el tiempo de vida
media del eritrocito (120 das en humanos).
En eucariotas existen dos sistemas principales de degradacin de las protenas, uno mediante los lisosomas y
el otro en el citosol.
22.5.1 Degradacin lisosmica

El primer sistema de degradacin descrito se realiza en los lisosomas, liberados inicialmente por gemacin a
partir del complejo de Golgi (lisosomas primarios) y que despus reciben enzimas hidrolticas mediante
vesculas procedentes tambin del Golgi. Estos orgnulos delimitados por una membrana sencilla acumulan
ms de 50 enzimas hidrolticas diversas, capaces de actuar sobre protenas, cidos nucleicos, lpidos, etc., con
una gran actividad al pH cido caracterstico del lisosoma (alrededor de 5). Las enzimas lisosomales que
hidrolizan protenas (proteasas) se denominan catepsinas.
Las enzimas hidrolticas concretas presentes en los lisosomas dependen de cada tipo de clula; como
ejemplo, las clulas pancreticas contienen lisosomas con enzimas capaces de intervenir en las siguientes rutas
de degradacin:
Para la exocitosis, o transporte de su contenido enzimtico al exterior de la clula (secrecin).
Para la degradacin de orgnulos por autofagia, stos se incorporan en una vescula que luego se fusiona con
un lisosoma.
Para hidrolizar nutrientes o destruir agentes patgenos procedentes del exterior de la clula: la vacuola
fagoctica o fagosoma se fusiona con un lisosoma formando un fagolisosoma, donde se degrada el material.
En ocasiones, para romper intracelularmente los lisosomas y liberar sus enzimas, conduciendo a la autlisis
de la clula (una de las formas de muerte celular programada, que interviene, por ejemplo, en el desarrollo
embrionario).
22.5.2 Degradacin citoslica

La mayora de las protenas presentes en forma libre en el citosol se pueden degradar por esta ruta. El proceso es
muy selectivo, est bajo un estricto control y es la ruta de degradacin que requiere mayor gasto de ATP. Al
igual que en la distribucin de protenas, intervienen como mediadores en la degradacin seales moleculares
especficas, en concreto aminocidos N-terminales y la protena ubicuitina.
22.5.2.1 Ubicuitina
La ubicuitina es una protena pequea, de 76 aminocidos, llamada as por encontrarse en todas las clulas
eucariticas (es ubicua). Es posiblemente una de las protenas ms conservadas entre especies (las de levadura y
humanos slo se diferencian en tres aminocidos). De carcter globular, rgida y muy estable, interviene como
marcador selectivo para la degradacin de otras protenas, al unirse covalentemente a ellas, de forma que las
protenas ubicuitinadas quedan dispuestas para ser digeridas por los sistemas proteolticos.
La ubicuitinacin o unin de la ubicuitina a cualquier protena destinada a la destruccin se realiza en un
proceso de tres reacciones, catalizadas por 3 enzimas diferentes:
377
378
III. EXPRESIN GNICA
22:30
El enlace amida de la ubicuitina con la protena (denominado isopeptdico porque no tiene lugar con el
amino a, sino con el e de la cadena lateral de Lys) constituye la seal para la destruccin, el marcaje para la
protelisis (se le ha llamado el beso de la muerte). La especificidad de qu protenas deben marcarse para su
degradacin corre a cargo de las ubicuitina protena ligasas (E3), pues en cada clula hay cientos de variantes.
La unin de una sola molcula de ubicuitina no es suficiente para la degradacin; sin embargo, puede marcar
para otros procesos. A partir de 4 molculas de ubicuitina encadenadas ya se produce una degradacin eficaz de
la protena marcada (se han encontrado hasta 50 ubicuitinas unidas en cadena sobre una misma protena). Las
ubicuitinas que ejercen de seal se reciclan despus, una vez liberadas en el proteasoma.
La degradacin no es la nica funcin desempeada por las etiquetas de ubicuitina. Tanto la longitud de las
cadenas de poliubicuitina como la posicin de los enlaces entre ellas suponen marcas diferentes para procesos
diversos. Por ejemplo, la monoubicuitinacin de las histonas es una seal reguladora de la transcripcin
(pg. 286). Otros procesos regulados mediante la unin de ubicuitina incluyen procesamiento de protenas.
activacin de una quinasa, compactacin de la cromatina, interacciones intermoleculares entre protenas, y
control del transporte de protenas hacia dentro o hacia fuera de la clula.
Web 22.13. Estructura de las cadenas de poliubicuitina.
22.5.2.2 Seales desencadenantes de la ubicuitinacin

a) Residuo amino-terminal
La identidad del aminocido N-terminal parece determinar que una protena resulte marcada con ubicuitina
con mayor o menor facilidad. Debe recordarse que en eucariotas este residuo resulta de la eliminacin de Met y
de cualquier otro proceso de maduracin de dicho extremo; las seales amino-terminales parecen haberse
conservado durante miles de millones de aos en la evolucin.
Aminocido en posicin N-terminal
Grupo I, bsicos:
Grupo II, hidrfobos voluminosos:
Grupo III, neutros:
Vida media de la protena
Arg, Lys, His
Prolongada
Leu, Ile, Trp, Phe, Tyr
Prolongada
Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Cys, Met, Pro
Corta
b) Secuencias PEST
Por otra parte, tambin se asocia una vida media corta con la presencia en la protena de regiones de 12 a 60
aminocidos, ricas en Pro, Glu, Ser y Thr (P, E, S, T, con la abreviatura de una letra). Estas regiones actuaran a
modo de seal de reconocimiento para los sistemas enzimticos que degradan las protenas de vida corta.
22.5.2.3 Degradacin por proteasas y proteasoma

La protelisis de las protenas marcadas con ubicuitina pueden ejercerla distintos sistemas de proteasas. Se han
descrito calpanas, proteasas que requieren calcio para su actuacin, pero el sistema ms importante es
probablemente el del proteasoma.
Se ha denominado proteasoma a un gran complejo proteico (2.000 kDa) que aparece en muchas clulas
eucariticas, formado por distintas subunidades proteolticas. El conjunto, proteasoma 26S o complejo proteinasa multicataltico, contiene dos componentes asociados entre s:
Una partcula central 20S, formada por 28 subunidades en una disposicin cilndrica, que es el ncleo
cataltico responsable de la protelisis secuencial, con liberacin de fragmentos peptdicos. (En cierto modo,
recuerda a la estructura de las carabinas Hsp60, una caja cilndrica.) La cara interior posee 6 centros activos
con actividad proteasa.
Uno o dos componentes que se unen a los extremos del cilindro: partcula reguladora 19S, a su vez
compuesta por una base 6 molculas con actividad ATPasa formando un anillo y una tapa. Esta
partcula 19S posee, adems, la capacidad de reconocer especficamente los conjugados protena-poliubicuitina y es responsable (gracias a una actividad isopeptidasa) de la separacin de las ubicuitinas intactas,
que pueden as reutilizarse.
22:31
Web 22.14. Estructura del proteasoma.
379
Seccin IV
Aspectos aplicados
CAPTULO 23
Bases moleculares de la mutacin

y la reparacin del DNA
23.1 CONCEPTO DE MUTACIN

383
23.2 CLASIFICACIN DE LAS MUTACIONES
384
23.3 TIPO DE CLULA QUE SUFRE LA MUTACIN
384
23.3.1 Mutacin en clulas de la lnea germinal
384
23.3.2 Mutacin en clulas somticas
385
23.4 MUTACIONES A PEQUEA ESCALA O PUNTUALES 386
23.4.1 Cambios en la secuencia del DNA
387
23.4.1.1 Sustitucin
387
a) Transiciones
388
b) Transversiones
388
23.4.1.2 Delecin, prdida o eliminacin
388
23.4.1.3 Insercin
389
23.4.2 Efecto sobre la secuencia de la protena sintetizada 389
23.4.2.1 Mutaciones silenciosas
389
23.4.2.2 Mutaciones no silenciosas
390
a) Mutaciones de aminocido
390
b) Mutaciones que cambian el marco
de lectura
391
c) Mutaciones que no cambian el marco 392
d) Mutaciones con terminacin prematura
de la protena
392
e) Mutaciones con terminacin retrasada 394
23.5 CAUSAS Y MECANISMOS BSICOS
DE LAS MUTACIONES
394
23.5.1 Mutaciones endgenas
394
23.5.1.1 Incorporacin de nucletidos errneos
durante la replicacin
394
23.5.1.2 Otras mutaciones espontneas

a) Sustituciones por desaminacin
oxidativa
b) Prdida de bases por inestabilidad
del enlace N-glicosdico
c) Modificacin de las bases por
mutgenos endgenos
23.5.2 Mutaciones inducidas o exgenas: mutagnesis
23.5.2.1 Lesiones y mutaciones inducidas
por agentes qumicos
23.5.2.2 Lesiones y mutaciones inducidas
por agentes fsicos
23.6 REPARACIN DEL DNA
23.6.1 Eliminacin de agentes mutgenos
23.6.2 Reversin directa de la lesin
23.6.2.1 Reparacin de fotodmeros
23.6.2.2 Reversin de bases modificadas
con grupos alquilo
23.6.3 Reparacin por escisin
23.6.3.1 Mecanismo general de reparacin
por escisin de nucletidos
23.6.3.2 Mecanismos especficos de reparacin
por escisin de bases
23.6.4 Reparacin de emparejamientos
incorrectos
23.7 ENFERMEDADES HUMANAS ASOCIADAS
A LA REPARACIN
394
394
395
396
396
396
398
398
399
399
399
400
400
400
402
403
404
23.1 CONCEPTO DE MUTACIN

Clsicamente, se define la mutacin como una alteracin en la secuencia del DNA de un individuo que se
transmite por herencia a sus descendientes. La forma inalterada del DNA, llamada tipo silvestre (en ingls, wild
type), se convierte as en otra forma, portadora de la mutacin o tipo mutante. Las mutaciones se producen por
errores en la replicacin, por la alteracin espontnea de nucletidos o debido a la accin de agentes fsicos o
qumicos (mutgenos).
El carcter hereditario incluido en la definicin supone que la mutacin debe presentarse de modo estable en
las clulas germinales. Ahora bien, ello no es estrictamente as. Aunque con frecuencia se asume que la mutacin slo corresponde a secuencias codificantes (genes), siendo las alteraciones en los productos gnicos (generalmente protenas) las responsables de las enfermedades hereditarias, el concepto de mutacin es hoy
da ms amplio.
Las mutaciones tienen lugar en todo el genoma, incluyendo las secuencias codificantes o no, del genoma
nuclear o mitocondrial, en clulas germinales (heredable) o somticas (no heredable). Por tanto, la mutacin es,
junto con la recombinacin meitica (pg. 108), la principal fuente de variabilidad gentica en todo tipo de
organismos, y su estudio tiene inters bsico y aplicado por su relacin con procesos aparentemente tan
alejados como la evolucin de las especies, la identidad gentica de un individuo, las alteraciones patolgicas de
383
384
I V. A S P E C T O S A P L I C A D O S
su genoma responsables de enfermedades, el diagnstico prenatal o el tratamiento de enfermedades tanto

somticas (por ejemplo, el cncer) como de clulas germinales.
Aunque muchas mutaciones se generan al azar, y existe la misma susceptibilidad de mutacin en todas las
regiones del genoma, las que ocurren sobre el DNA codificante tienen peores consecuencias. Dentro de esta
mutacin gnica se debe distinguir entre la que afecta a la regin del gen directamente responsable de la
informacin (regin estructural), que altera el RNA o la protena sintetizados, y la que ocurre en las secuencias
no codificantes del gen implicadas en el control de la expresin (regin reguladora), que no altera la protena
sino su sntesis (aumento o descenso en concentracin).
23.2 CLASIFICACIN DE LAS MUTACIONES

Dada la variedad de factores implicados, existen diversos planteamientos para clasificar las mutaciones. Se
estudiarn bajo tres criterios: tipo de clula, magnitud de la mutacin y mecanismos causantes de la mutacin.
23:1
23.3 TIPO DE CLULA QUE SUFRE LA MUTACIN

23.3.1 Mutacin en clulas de la lnea germinal
Esta alteracin se origina en alguna de las divisiones mitticas o meiticas de la gametognesis (pg. 102),
a partir de clulas progenitoras diploides de las gnadas. La mutacin puede no influir en el fenotipo de la clula
o individuo que la sufre, ni en la capacidad reproductora de ste, pero, puesto que el genoma se transmite
a la descendencia, la mutacin se hereda, transmitindose a todas las clulas del organismo hijo y generando,
en su caso, la alteracin o enfermedad hereditaria. Obviamente, dicha transmisin depende de que en la
fecundacin participe un gameto portador de la mutacin. A su vez, las clulas germinales del hijo tambin
la poseern (al igual que todas sus clulas somticas), por lo que se volver a transmitir a la siguiente generacin. En consecuencia, la mutacin se comporta como una variacin heredable, que estar sujeta a la seleccin natural; se puede decir que son la materia prima para los cambios evolutivos.
La importancia de estas mutaciones depende directamente de cul sea la funcin afectada: si sta es esencial,
se originan organismos inviables (abortos tempranos, a veces no detectados), mientras que si la funcin no es
esencial, pero s importante, se origina una enfermedad congnita o hereditaria, o una subnormalidad. Sin
embargo, no debe olvidarse que algunas mutaciones resultan beneficiosas y son la base de la evolucin.
Las mutaciones en la lnea germinal son habitualmente acontecimientos espordicos, minoritarios y relativamente infrecuentes en la poblacin humana. Su tasa es de unas 106 mutaciones por locus y divisin celular. A
este respecto, se puede calcular, como ejemplo, el nmero de mutaciones que tienen lugar durante las divisiones
23. Bases moleculares de la mutacin y la reparacin del DNA
mitticas y meiticas de la espermatognesis. En la formacin de un espermatozoide humano aparecen alrededor

de 100 mutaciones debidas a errores en la replicacin, lo que, teniendo en cuenta el tamao de su genoma
haploide, supone una mutacin por cada 32 Mb. La mayora de ellas son recesivas o, por el contrario, tan letales
que no son fenotpicamente evidentes, pues no alcanzan la concepcin o el nacimiento. De ah que la tasa de
mutaciones de la lnea germinal con consecuencias patolgicas sea muy pequea.
23.3.2 Mutacin en clulas somticas

A diferencia de las anteriores, las mutaciones somticas (en clulas no reproductoras) slo se transmiten a las
clulas hijas (en la mitosis), y no a un organismo completo. Pueden afectar a cualquiera de los 46 cromosomas
de cualquier clula somtica, diploide, en cualquier rgano, tejido o clula aislada, durante el desarrollo precoz
o final del organismo, o en su fase adulta. Estas mutaciones determinan las caractersticas normales o patolgicas del individuo, pero los cambios nunca son heredables.
stas son mutaciones mayoritarias porque las clulas somticas son las que ms se dividen (unas 1013
divisiones en humanos desde el cigoto hasta el individuo adulto). La tasa de mutacin, del orden de 1010 por
pb y divisin celular, es inferior a la de clulas germinales. Sin embargo, se incrementa como consecuencia de la
exposicin a agentes mutgenos (algunos de ellos cancergenos), de la edad y de la alteracin de los mecanismos
de reparacin del DNA, llegando a provocar miles de nuevas mutaciones durante la vida de un adulto,
prcticamente en cada posicin en el genoma y en cualquier parte del organismo.
El individuo portador de una mutacin somtica que se ha producido despus del cigoto, pero antes de
alcanzar su desarrollo completo, puede considerarse un mosaico, trmino gentico que define la presencia de
dos o ms lneas celulares genticamente distintas derivadas de un mismo cigoto. A travs de la mitosis, las
clulas somticas del individuo adulto pertenecern a dos lneas o clones, la propia o normal y la anmala,
derivada de la clula que sufri la mutacin. Los individuos con una rplica fiel y completa de ambos tipos de
clulas muestran mosaicismo somtico. Este fenmeno se puede observar, por ejemplo, en ciertos trastornos
citogenticos con alteracin en el nmero de cromosomas (pg. 447), como la trisoma 21. Lgicamente,
cuanto ms temprano tiene lugar la mutacin en el desarrollo del organismo, mayor ser la abundancia de
clulas de la lnea anmala sobre las de la lnea normal.
23:2
385
386
Las mutaciones que sean compatibles con la vida de la clula pueden, sin embargo, afectar a su crecimiento.
El efecto de la mutacin sobre la clula somtica depende en parte de su compatibilidad con el ciclo de divisin
celular, pues la clula afectada se divide de forma activa y conducir a la proliferacin de la mutacin, pudiendo
ocasionar problemas clnicos. As ocurre, por ejemplo, en procesos de envejecimiento celular y transformacin
neoplsica. El cncer se puede iniciar por la mutacin de genes que controlan la divisin celular (Captulo 26).
23.4 MUTACIONES A PEQUEA ESCALA O PUNTUALES

El estudio de las mutaciones en funcin de su magnitud, longitud o grado de la lesin permite clasificarlas en
pequea y gran escala (y, a veces, mediana). Las anomalas a gran escala ocurren por duplicaciones, prdidas o
reagrupamientos que alteran una regin de millones de pares de bases y se reflejan en la estructura del cromosoma. Se llaman tambin mutaciones cromosmicas o voluminosas. Su estudio se reserva para el Captulo 25, como anomalas cromosmicas. En ste nos limitaremos a las mutaciones a pequea escala.
Las mutaciones a pequea escala, sencillas, puntuales, mnimas o micromodificaciones implican habitualmente a un solo nucletido (y, como consecuencia, a su complementario en la otra hebra del DNA). Sin
embargo, tambin se incluyen aqu aquellas otras lesiones a pequea o mediana escala que afectan a varios
pares de bases. Nuestro estudio pretende cubrir, esencialmente, los tipos de mutacin puntual en cuanto a la
modificacin en la secuencia del DNA, como punto de partida para su influencia sobre la estructura y funcin
proteicas.
Clases y tipos de mutaciones puntuales y medianas, y su grado de incidencia

Clase
Tipo
Sustitucin
Insercin
Eliminacin
o delecin
Incidencia
Tipo de mutacin comparativamente comn en DNA
codificante y no codificante
Transiciones
y transversiones
Ms comunes las transiciones que las transversiones,

sobre todo en DNA mitocondrial
Sustituciones sinnimas
y no sinnimas
Las sinnimas son mucho ms comunes que las no

sinnimas en DNA codificante; las conservadoras son
ms comunes que las no conservadoras
Sustitucin de mltiples
bases
Es infrecuente, excepto en ciertos loci repetidos en tndem

o repeticiones agrupadas
De uno o unos pocos

nucletidos
Muy comn en DNA no codificante pero infrecuente

en DNA codificante
Expansiones repetidas
de tripletes
Infrecuente, pero puede contribuir a varios trastornos,

especialmente neurolgicos
Otras inserciones
grandes
Infrecuente; produce ocasionalmente duplicaciones

en tndem e insercin de elementos transponibles
De uno o unos pocos

nucletidos
Muy comn en DNA no codificante pero infrecuente

en DNA codificante
Grandes deleciones
Infrecuente; ocurre a menudo en regiones que contienen

repeticiones en tndem o entre repeticiones dispersas
Las mutaciones puntuales son tan representativas que, a veces, se asumen como el nico tipo de mutacin
existente. Es importante resaltar que es la estabilidad del cambio lo que hace que la mutacin se perpete en la
progenie celular, al pasar por replicacin a cada nueva copia y permanecer en las secuencias de DNA de cada
individuo. Estas variaciones genticas heredadas contribuyen a las diferencias entre individuos dentro de una
poblacin. En algunos casos, cuando la modificacin se produce en una regin gnica (estructural o reguladora) puede ser suficiente para alterar su mensaje, afectando a la funcionalidad de su producto gnico y
conduciendo a una enfermedad hereditaria. Al depender de la alteracin de un nico gen, estas enfermedades
se denominan monognicas, y se caracterizan por transmitirse a la descendencia segn las leyes de Mendel.
Como excepcin, las mutaciones en el genoma mitocondrial se transmiten por herencia materna exclusivamente, debido a que el nmero de mitocondrias que aporta el espermatozoide en la formacin del cigoto es muy
inferior al procedente del vulo.
23.4.1 Cambios en la secuencia del DNA

La descripcin de los distintos tipos de mutaciones se har atendiendo a su causa molecular en el DNA:
mutaciones por sustitucin, por insercin y por delecin.
23:3
Este estudio se acompaa, en cada uno de sus apartados, de ejemplos especficos indicativos de las consecuencias patolgicas de la mutacin.
23:4
23.4.1.1 Sustitucin
Como su nombre indica, esta mutacin consiste en un cambio de un nucletido por otro. Es relativamente
comn en el DNA, tanto codificante como no codificante. En casos raros, pueden reemplazarse de forma
simultnea varias bases agrupadas.
Segn la naturaleza purnica o pirimidnica de las dos bases implicadas, se distingue entre transicin y
transversin.
23:5
387
388
a) Transiciones
Son sustituciones de una pirimidina por otra (C ! T; T ! C) o de una purina por otra (A ! G o G ! A).
Existen, pues, 4 posibilidades, una para cada base original:
23:6
b) Transversiones
Son sustituciones de una purina por una pirimidina (A o G ! T o C), o viceversa (T o C ! A o G). Existen
8 posibilidades, dos por cada base original:
23:7
Tericamente, si la sustitucin de las bases fuera aleatoria, la frecuencia de una transversin en el genoma
debera ser mayor que la de una transicin, pues hay doble posibilidad de que ocurra. Sin embargo, se observa
en diferentes procesos mutagnicos que las transiciones son ms comunes que las transversiones, en especial en
el DNA no funcional.
Como ejemplo especfico puede citarse la transicin de una base (G ! A) en la regin 5 no traducida del
gen del factor IX de la coagulacin (regin que contiene islotes CpG, pgs. 167 y 282). El cambio de
secuencia en esa regin reguladora impide la unin de un factor de transcripcin clave que, en condiciones
normales, activa el promotor del gen. Como consecuencia, disminuye la expresin del gen y se sintetiza menos
factor IX, lo que produce hemofilia de tipo B, un trastorno de la coagulacin con una actividad coagulante
disminuida en dos tercios.
23.4.1.2 Delecin, prdida o eliminacin

Consiste en la prdida de uno o ms nucletidos de una secuencia. Es muy comn en el DNA no codificante,
pero infrecuente en el DNA codificante. Suelen ser mutaciones pequeas, y slo en raras ocasiones afectan a
zonas lo suficientemente grandes como para ser visibles a escala citogentica (en regiones con repeticiones en
tndem o entre repeticiones dispersas). Si se dan en una regin codificante, normalmente producen un cambio
en el marco de lectura (pg. 391), razn por la cual se comprende que sean tan infrecuentes: el efecto sobre la
protena es dramtico.
389
23.4.1.3 Insercin
Se trata de la situacin contraria a la anterior, la aparicin de uno o varios nucletidos adicionales en una
secuencia. Es muy comn en el DNA no codificante, pero rara en el DNA codificante (en el que, al igual que la
delecin, introduce un cambio de marco de lectura). Un ejemplo es la repeticin de trinucletidos o expansin de tripletes, un aumento en el nmero de copias de un triplete de nucletidos observado en un gen
o en sus proximidades.
23.4.2 Efecto sobre la secuencia de la protena sintetizada

El cambio de secuencia del DNA generado por la mutacin puede tener distintos efectos sobre la secuencia de
aminocidos codificada y, en consecuencia, sobre la protena que se sintetice y su funcin. Se distingue por ello
entre mutaciones silenciosas y no silenciosas.
Tipo de mutacin
Mutaciones silenciosas
Mutaciones no silenciosas
De aminocido
Conservadoras
No conservadoras
Causa posible
Sustitucin
p
Delecin
Insercin
Desplazamiento del marco

Sin desplazamiento del marco
Terminacin prematura
Terminacin retrasada
p
p
p
(triple)
p
p
(triple)
p
p
(Cuando no se indica lo contrario, el cambio afecta a una sola base)
23.4.2.1 Mutaciones silenciosas

Se denominan tambin sinnimas, neutrales o asintomticas (trmino no recomendable: mutaciones con
sentido, calco del ingls sense mutations), y son muy numerosas (23-25% de todas las mutaciones en DNA
codificante). Se caracterizan porque, a pesar de haber un cambio en la secuencia del DNA, no se altera la
secuencia de su producto proteico. Esto es posible debido a la degeneracin del cdigo gentico (varios tripletes
o codones codifican un mismo aminocido, pg. 318). Habitualmente, la mutacin es silenciosa porque
afecta a la tercera base de un codn de tal forma que el nuevo triplete es sinnimo del original, es decir,
codifica el mismo aminocido.
23:8
Igual ocurre si la sustitucin de la base ocurre en la primera posicin de determinados tripletes; concretamente, CUA , UUA y CUG , UUG, que codifican Leu (vase el cdigo), y AGA , CGA y AGG , CGG,
para Arg.
390
Obviamente, las mutaciones silenciosas pasan inadvertidas, pues no se detectan en el fenotipo ni confieren
ventaja o desventaja alguna al organismo en cuyo genoma surgen. En consecuencia, no estn sometidas a la
presin de seleccin evolutiva ni influyen en la susceptibilidad frente a enfermedades. Sin embargo, pueden
originar una enorme diversidad gentica en una poblacin, conocida como polimorfismo gentico, en este caso
no gnico (Captulo 24).
23:9
23.4.2.2 Mutaciones no silenciosas

En este caso, la alteracin en la secuencia de nucletidos afecta a la secuencia proteica, pues codifica uno o
varios aminocidos diferentes de la secuencia original. Dependiendo del efecto que tenga la alteracin de la
secuencia proteica sobre su funcin, se puede distinguir entre mutaciones con efecto beneficioso y con efecto
perjudicial. Aunque unas pocas mutaciones (menos del 1%) pueden tener un efecto beneficioso o positivo, por
ejemplo, favoreciendo la funcin de la protena codificada o la interaccin entre genes, son tan poco frecuentes
que, en la prctica, es comn que no se consideren. En cualquier caso, los mecanismos que las generan son los
mismos que si el efecto es perjudicial. Por el contrario, interesa estudiar con todo detalle las mutaciones no
silenciosas que se manifiestan con efecto negativo o deletreo.
A continuacin, se comentan los efectos ms frecuentes de las mutaciones no silenciosas sobre los codones y,
en consecuencia, sobre la secuencia del producto proteico.
a) Mutaciones de aminocido
Contrariamente a las mutaciones silenciosas, en las que la sustitucin de una base origina un nuevo triplete que
codifica el mismo aminocido, es ms comn que dicho cambio produzca un codn nuevo que codifica un
aminocido diferente. Por ello se llaman mutaciones de aminocido o no sinnimas (trminos no recomendables: de sentido equivocado, falso o alterado, por calco del ingls missense mutation). La mayora de las
mutaciones en regiones codificantes son de este tipo (73%), por lo que son causa de muchos trastornos
observados. Adems, la formacin de ms de una versin proteica supone que el polimorfismo gnico generado
por estas mutaciones da lugar tambin a un polimorfismo proteico (Captulo 24).
Lgicamente, estas mutaciones son particularmente relevantes cuando tienen lugar en regiones gnicas
estructurales. Por ejemplo, son de este tipo la mayora de las mutaciones que producen hemoglobinopatas.
23:10
Dentro de las mutaciones de aminocido se distinguen dos subtipos:
Sustitucin conservadora. El aminocido se reemplaza por otro con una cadena lateral qumicamente
similar, por lo que el efecto sobre la estructura y funcin de la protena puede ser mnimo. Esta situacin
se aproxima, pues, a las mutaciones silenciosas. En cierto modo, parece que el cdigo gentico se ha
adaptado para reducir el efecto de las mutaciones pues, adems de la degeneracin, los codones que
especifican aminocidos similares son a su vez parecidos. Por ejemplo, los codones para Asp (GAC,
GAU) y Glu (GAA, GAG) son muy parecidos, de modo que el cambio de la tercera base en un codn
GAN (donde N es cualquier nucletido) o bien es silencioso o tiene un efecto mnimo, el cambio de un
aminocido cido por el otro. Tambin pueden ser conservadores algunos cambios en la primera posicin
del codn, por ejemplo, CUN (Leu) , GUN (Val), donde N representa cualquier nucletido.
Sustitucin no conservadora. El aminocido se sustituye por otro no similar, diferente en carga, polaridad,
tamao de la cadena lateral, etc. Son no conservadoras casi todas las sustituciones en la primera o segunda
posicin de un codn; por ejemplo, CGN (Arg) ) GGN (Gly), CCN (Pro), CUN (Leu) o CAN (Gln/His), etc.
b) Mutaciones que cambian el marco de lectura
ste es un concepto importante, por la frecuencia con la que afecta a la secuencia del producto proteico. El
desplazamiento, desfase o cambio del marco de lectura (frameshift mutation) consiste en que la insercin o
delecin de nucletidos, aun sin afectar en gran medida a la secuencia de bases, cambia la forma como se leen
los tripletes (pg. 315), por lo que produce una alteracin radical en la secuencia de la protena.
Se produce un cambio de marco cuando hay inserciones o deleciones de uno o ms pares de bases, en
nmero no mltiplo de 3 (es decir, un nmero no entero de codones). El cambio en la secuencia de aminocidos
se produce a partir de la primera insercin o delecin, hasta el extremo carboxilo-terminal de la protena. Por
ello, en general la protena resulta muy alterada en su estructura.
23:11
Como ejemplo especfico puede citarse la mutacin ms comn encontrada en judos asquenazes (es
decir, con antepasados de Europa central u oriental) que padecen la enfermedad de Tay-Sachs, un
trastorno autosmico recesivo con acumulacin de ganglisidos en los lisosomas neuronales. El gen
afectado es el que codifica la subunidad a de la enzima lisosmica hexosaminidasa A (o isoenzima A de
la b-N-acetilhexosaminidasa). La deficiencia enzimtica total es responsable del fenotipo grave observado
clsicamente en la forma infantil de la enfermedad.
391
392
23:12
c) Mutaciones que no cambian el marco

La insercin o delecin de 3 pb en el DNA (o mltiplos de tres), aunque aade o elimina algn aminocido a la
protena, no cambia el marco de lectura, por lo que el resto de la secuencia de aminocidos es normal. El efecto
de estas mutaciones es, por tanto, mucho menor y puede no afectar a la funcin de la protena.
Como ejemplo especfico, en el 70% de todos los alelos asociados con la mucoviscidosis, o fibrosis qustica,
se observa una delecin triple, en el cromosoma 7q. La mutacin afecta al gen de una protena de membrana,
transportadora de aniones cloruro. La protena mutada se pliega de manera incorrecta, por lo que durante su
procesamiento postraduccional queda retenida en el lumen del retculo endoplsmico, unida a protenas
carabina (pgs. 372-373); se impide as su llegada a la membrana plasmtica, con consecuencias que afectan
a varios tejidos y glndulas endocrinas (insuficiencia pancretica y afecciones respiratorias). La enfermedad se
diagnostica por un exceso de cloruro en el sudor.
23:13
d) Mutaciones con terminacin prematura de la protena

Algunas mutaciones no afectan a la secuencia de aminocidos codificados, sino que la sustitucin, la insercin o
la delecin de uno o varios nucletidos tiene como efecto la aparicin de un codn de terminacin o de paro
(UAA, UAG o UGA en el mRNA citoplsmico de eucariotas superiores, pg. 317). Como consecuencia, se
provoca el cese prematuro de la traduccin del mRNA y se obtiene una protena acortada, truncada (con
carencia de un segmento C-terminal).
Este tipo de mutaciones terminadoras o finalizadoras es poco frecuente; por ejemplo, suponen cerca del 4%
de las sustituciones en el DNA codificante. (No es recomendable el trmino mutacin sin sentido, calco de
nonsense mutation, pues s hay un significado: la terminacin de la elongacin.) El acortamiento de la protena

es a menudo considerable, por lo que se ven afectadas dramticamente su estructura tridimensional, su
estabilidad y su funcin. Con frecuencia esta alteracin acelera la degradacin intracelular de la protena no
funcional, ocasionando generalmente un efecto fenotpico.
23:14
Como ejemplo especfico cabe citar la mutacin causante de la neurofibromatosis de tipo 1 (NF1) o
enfermedad de Recklinghausen, un trastorno autosmico dominante (pg. 437) localizado en el cromosoma 17q.
23:15
La mutacin puede producir de manera directa la aparicin del codn de terminacin, como en los ejemplos
mostrados, pero tambin puede hacerlo de forma indirecta, mediante un cambio en el marco de lectura (vase,
como ejemplo, el polimorfismo de grupo sanguneo AB0, pg. 411).
Otro ejemplo similar, aunque no se trata de una mutacin sino del resultado de un mecanismo biolgico
regulado, es la edicin del mRNA de la apolipoprotena B (pg. 306), que tiene como consecuencia la conversin
de un codn CAA en uno UAA y la formacin de la protena truncada apoB48 en lugar de la apoB100.
393
394
e) Mutaciones con terminacin retrasada

De la misma forma que una mutacin puntual puede provocar la aparicin de un codn de terminacin,
tambin puede eliminar uno existente, sustituyndolo por otro que codifique un aminocido. En ese caso, la
traduccin del mRNA contina ms all del extremo 3 codificante original, hasta que se alcance un nuevo
codn de terminacin. Por tanto, se sintetiza una protena de mayor longitud, cuya secuencia de aminocidos
en la regin C-terminal no tiene significado estructural ni funcional. Las consecuencias fenotpicas son, en
general, similares a las de la terminacin prematura.
23.5 CAUSAS Y MECANISMOS BSICOS DE LAS MUTACIONES

El DNA est sometido a daos, lesiones y modificaciones de diversos tipos, provocados por distintas causas.
stas pueden ser fortuitas o endgenas y provocadas, inducidas o exgenas.
23.5.1 Mutaciones endgenas

Las mutaciones ms frecuentes se generan debido a situaciones o agentes propios del ambiente intracelular;
bajo condiciones normales. Pueden originarse por errores en la replicacin, o bien por reacciones que ocurren
de forma espontnea sobre la molcula de DNA, o por la accin de subproductos del metabolismo celular
(mutgenos endgenos).
23.5.1.1 Incorporacin de nucletidos errneos durante la replicacin

La replicacin por la DNA polimerasa, movindose a lo largo del DNA, combina la incorporacin de
nucletidos a la hebra nueva con la correccin de pruebas, de forma que duplica la doble hlice con una gran
fidelidad. Ms del 99,9% de los errores de replicacin se corrigen rpidamente mediante enzimas reparadoras
que reconocen el nucletido incorrecto en la hebra que se est sintetizando y lo reemplazan por uno correcto,
complementario al de la hebra molde. Como consecuencia, slo se introduce una variacin por cada 109 a 1011 nucletidos incorporados en cada ciclo de divisin celular, lo que equivale a una mutacin cada 10.000 Mb.
Puesto que el genoma diploide humano tiene 6.400 Mb, esto se traduce en menos de una nueva mutacin por
cada divisin celular. A pesar de ello, el gran nmero de divisiones celulares durante la vida de un individuo
hace que el nmero de mutaciones sea significativo.
Una de las causas de incorporacin errnea de nucletidos se encuentra en la tautomera de las bases
nitrogenadas (pg. 16); las formas tautomricas menos abundantes (imina y lactima) establecen puentes de
hidrgeno diferentes, lo que permite el emparejamiento de un nucletido incorrecto en la hebra de nueva sntesis. Adems de los errores en la identidad del nucletido incorporado, durante la replicacin tambin se introducen mutaciones debido a deslizamientos de la DNApol sobre la hebra molde, que producen deleciones o inserciones por repeticin de una pequea secuencia.
Web 23.1. Mutaciones en la secuencia del DNA inducidas por alteraciones de las bases.
23.5.1.2 Otras mutaciones espontneas

Las bases en el DNA pueden experimentar espontneamente reacciones (sin intervencin de enzima alguna)
que transforman su identidad, de modo que si no son corregidas por los sistemas de reparacin se convierten en
una mutacin.
a) Sustituciones por desaminacin oxidativa
Consisten en la prdida de un grupo amino exocclico, con aparicin de un grupo carbonilo. Ello da lugar a que
se altere la formacin de puentes de hidrgeno entre las bases. (La desaminacin interviene tambin en la
riboedicin, pero en ese caso est catalizada enzimticamente y cumple una funcin, pg. 306.)
23:16
Las transformaciones C ! U y 5-metil-C ! T se producen lentamente, pero unas 100 veces ms
rpidamente que las A ! H y G ! X. Por ejemplo, habr una desaminacin de citosina al da por cada
107 C en el DNA de una clula tpica de mamfero (lo que equivale a unas 100 mutaciones por da).
Debe observarse que la nica base habitual (A,G,C,T) que se transforma por desaminacin en otra base
igualmente habitual es la citosina (v. web 23.1). Sin embargo, su producto (U) puede reconocerse como ajeno al
DNA y corregirse la mutacin. sta es una ventaja de la presencia en el DNA de T: si el DNA contuviese uracilo,
no se podran distinguir los residuos de uracilo correctos de los generados por la desaminacin de citosina, y
el mensaje gentico sera por ello menos estable.
b) Prdida de bases por inestabilidad del enlace N-glicosdico
Como ejemplo, pueden citarse las despurinaciones espontneas, en las que se pierde una purina por hidrlisis
del enlace N-glicosdico, dando lugar a un sitio apurnico (v. web 23.1). Anlogamente, pueden generarse sitios
apirimidnicos, aunque con menos frecuencia. En la posicin afectada, el nuclesido queda reducido
nicamente al esqueleto, es decir, un residuo de desoxirribosa unido por ambos enlaces fosfodister.
395
396
23:17
c) Modificacin de las bases por mutgenos endgenos

El propio metabolismo de la clula puede generar compuestos qumicos que reaccionan con las bases, o en
general con los nuclesidos, modificndolos. El caso ms frecuente son las especies reactivas de oxgeno,
radicales libres producidos por el metabolismo oxidativo de la clula, en especial en la mitocondria. Las
principales son el anin superxido y el radical hidroxilo, que daan el DNA rompiendo una hebra u oxidando
las bases nitrogenadas.
23:18
23.5.2 Mutaciones inducidas o exgenas: mutagnesis

Adems de las transformaciones espontneas de nucletidos y de los errores de replicacin, se producen
tambin mutaciones debidas a agentes fisicoqumicos ajenos a la clula, denominados mutgenos exgenos.
23.5.2.1 Lesiones y mutaciones inducidas por agentes qumicos

A diferencia de la inestabilidad del DNA ya discutida, producida por cambios qumicos espontneos en los
nucletidos (esencialmente por desaminacin o despurinacin), tambin pueden modificarse qumicamente las
bases por la accin directa de diversas sustancias qumicas del ambiente (naturales o no). La lista de estos
agentes mutgenos es muy amplia, y los mecanismos y efectos que producen muy diversos. Muchos de ellos se
identificaron hace ms de dos siglos como responsables de cnceres en obreros en contacto con el humo y
holln. Algunos actan como mutgenos directos y otros requieren activarse a carcingenos activos mediante la
accin de ciertas enzimas.
Agentes qumicos alquilantes

Transfieren grupos, generalmente metilo o etilo, a un tomo nuclefilo (O o N) de las bases nitrogenadas.
Entre los mejor estudiados se encuentran:
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Agentes intercalantes
Estos compuestos, con estructura plana e hidrfoba (pg. 141), se insertan entre los pares de bases apilados
del DNA y distorsionan su estructura helicoidal. Algunos provocan el desplazamiento del marco de lectura.
Naranja de acridina, proflavina, etc.
Benzo[a]pireno, uno de los productos que se encuentran en el humo.
Otros hidrocarburos aromticos policclicos: 2-acetamidofluoreno, N-metil-4-antraceno.
Compuestos naturales: actinomicina D, aflatoxina.
Agentes entrecruzantes
Reaccionan con el DNA y establecen enlaces cruzados entre bases de la misma hebra o de ambas hebras.
Compuestos de cisplatino
23:21
Otros agentes qumicos
5-bromouracilo: se incorpora en lugar de T durante la replicacin, gracias a su analoga estructural
(v. web 10.9). BrU adopta con mayor facilidad que T la forma tautomrica enol (pg. 16), que empareja
con G en lugar de A; como consecuencia, la incorporacin de BrU provoca mutaciones de par T=A a par
C G (v. web 23.1).
cido nitroso (HNO2): acelera la desaminacin oxidativa C ! U.
Compuestos que pueden metabolizarse a cido nitroso, como nitritos o nitratos.
Aminas aromticas: N-metil-4-aminoazobenceno (MAB).
Varios frmacos: ciclofosfamida, dietilestilbestrol.
Compuestos inorgnicos: arsnico, asbestos, berilio, cadmio, cromo.
23.5.2.2 Lesiones y mutaciones inducidas por agentes fsicos

Son varios los agentes que originan lesiones por exposicin, con efectos mutgenos o cancergenos.
La radiacin ultravioleta, componente de la luz solar, provoca la reaccin entre dos residuos de timidina
adyacentes en la misma hebra, formando a partir de sus dobles enlaces anulares un sistema tricclico con un
anillo de ciclobutano, que se conoce como dmero de timina. Esta asociacin covalente de dos T impide que
puedan emparejarse con sus A complementarias y origina una estructura tridimensional localmente incompatible con el giro de la doble hlice, que fuerza una flexin o codo en la molcula de DNA. Adems, se
paraliza la replicacin, pues la DNA polimerasa no puede reconocer los dmeros y se detiene. La irradiacin UV
tambin origina otra reaccin entre T adyacentes, con formacin de dmeros diferentes llamados fotoproductos, en los que el enlace aparece entre el C-6 de una T y el C-4 de la adyacente.
Web 23.2. Estructura de los dmeros de timina.
Las radiaciones ionizantes (rayos X y rayos g) pueden provocar apertura de los anillos, fragmentacin de las
bases, as como rotura del esqueleto covalente del DNA. Tambin generan (por fotlisis del agua) radicales
hidroxilo, que producen 8-hidroxiguanina, entre otros. Debido a su mayor poder de penetracin, estas
radiaciones afectan a todo tipo de tejidos, a diferencia de la luz UV, que provoca lesiones solamente en la piel.
23.6 REPARACIN DEL DNA

La capacidad de una clula para detectar y reparar daos en el DNA es esencial para el mantenimiento de la
integridad de su genoma. Existen, con este objeto, diversos sistemas enzimticos in vivo, que pueden llegar a ser
tan complejos como el propio aparato de replicacin, lo que pone de manifiesto su gran importancia para la
supervivencia celular. De hecho, la velocidad de mutacin refleja el balance entre el nmero de errores
ocurridos y los que se corrigen: una baja tasa de mutacin indica una gran eficiencia de los sistemas de
reparacin, mientras que un fallo de stos conduce a un aumento del nmero de mutaciones.
399
En general, no puede establecerse una estrategia nica de reparacin por parte de la clula, sino que existen
distintas vas.
Tipo de reparacin
Eliminacin de mutgenos
(destoxificacin)
Ejemplo
Tipo de lesin reparada
Superxido dismutasa
Se evita la formacin de la lesin oxidativa
Fotoliasa
Fotodmeros de pirimidina
Reversin directa
Escisin de nucletidos
(general)
Escisin de bases (especfica)
Alquiltransferasas
Derivados alquilo de las bases
Sistema de la escinucleasa
Las que causan distorsin en la doble hlice

(fotoproductos y sustituyentes voluminosos)
N-glicosilasas del DNA

y endonucleasas AP
Bases desaminadas, modificadas, oxidadas,

etc., y sitios absicos
Reparacin de
emparejamientos incorrectos
Nucletidos mal emparejados por errores

en la replicacin o bases modificadas
23.6.1 Eliminacin de agentes mutgenos

El primer mecanismo para reducir el dao al DNA no es propiamente una va de reparacin, sino que consiste
en evitar las lesiones antes de que se produzcan, mediante la neutralizacin de compuestos mutgenos. Uno de
tales mecanismos de destoxificacin lo ejerce la superxido dismutasa, que evita la acumulacin de radicales
superxido, agentes causantes de lesiones oxidativas en el DNA.
23:22
23.6.2 Reversin directa de la lesin

La forma ms inmediata de reparar una mutacin es la regeneracin de la base daada revirtiendo la
transformacin qumica que ha sufrido. Este mecanismo no es factible en la mayora de los casos, a excepcin de los ejemplos siguientes.
23.6.2.1 Reparacin de fotodmeros

Ya se ha explicado que la luz ultravioleta provoca la formacin de anillos de ciclobutano entre dos pirimidinas
adyacentes (pg. 398), lo que supone una distorsin estructural que impide fsicamente la replicacin y la
transcripcin. El mecanismo de reparacin se basa en el reconocimiento del fotodmero por la enzima fotoliasa,
que lo escinde, mediante una reaccin de transferencia electrnica iniciada por absorcin de luz visible,
regenerando sus dos bases originales. La fotoliasa tiene como coenzimas FADH2 y un cromforo que absorbe
la luz e inicia la transferencia de electrones. Este requerimiento de luz (azul o violeta) hace que tambin reciba el
nombre de enzima fotorreactivadora. En condiciones de oscuridad se requieren otros sistemas para reparar
estas lesiones. Este sistema se ha encontrado en algunas especies, pero est ausente en otras; as, existe en
bacterias, hongos, la levadura Saccharomyces cerevisiae, peces, reptiles, anfibios y mamferos marsupiales,
pero no aparece en la levadura Schizosaccharomyces pombe ni en mamferos placentarios, incluyendo a los
humanos. En algunos organismos, incluida Drosophila, se ha detectado otra fotoliasa que repara los fotoproductos 6-4, ausente a su vez en E. coli, levaduras y humanos.
400
23:23
23.6.2.2 Reversin de bases modificadas con grupos alquilo

El caso ms conocido, muy bien caracterizado en E. coli e igualmente presente en todas las especies estudiadas
(incluida la humana), es la reparacin de O6-metilguanina y O6-etilguanina, productos de la modificacin del
DNA por agentes mutgenos alquilantes como nitrosoguanidinas, metilnitrosourea y etilmetanosulfonato
(pg. 397).
El grupo alquilo de la base lo elimina una alquiltransferasa, que lo transfiere a un residuo cistena de su
propio centro activo. ste no puede regenerarse, por lo que la catlisis inactiva la propia enzima (con lo
que estrictamente no es enzima ni catalizador, pues no se cumple la condicin de que no se altere como
consecuencia de la reaccin que acelera). Dada esta inactivacin, la clula debe sintetizar nuevas molculas
de alquiltransferasa para mantener el proceso reparador, por lo cual el sistema enzimtico de reparacin puede
saturarse si existe un nmero excesivo de mutaciones alquilantes.
23:24
23.6.3 Reparacin por escisin

Se conoce bajo este nombre genrico a la reparacin de lesiones basada en la eliminacin de la base nitrogenada, nucletido o segmento de DNA defectuosos y su reemplazo por otro nuevo, con secuencia correcta. A
diferencia de la reparacin por reversin, ste es un proceso complejo, que tiene lugar en varias fases, que utiliza
varias protenas (slo algunas especficamente reparadoras) y que conlleva siempre la sntesis de un fragmento
de DNA (lo que se denomina sntesis fuera de programa). El proceso se inicia a travs del reconocimiento
molecular de la lesin (base alterada o cambio en la estructura tridimensional del DNA).
De forma global, en el mecanismo de reparacin se pueden distinguir 3 etapas, la primera distinta para los
mecanismos general y especfico, y las dos restantes comunes.
Web 23.3. Reparacin por escisin.
23.6.3.1 Mecanismo general de reparacin por escisin de nucletidos

En este mecanismo (NER, nucleotide excision repair) intervienen protenas que reconocen distintos tipos de
alteraciones que causan distorsin en la doble hlice, como los dmeros de timina o una base con un sustituyente
voluminoso (psoraleno, cisplatino, acetamidofluoreno, etc.). En humanos, es el sistema de defensa ms importante contra el dao al DNA causado por el humo del tabaco, agente responsable de ms del 30% de las muertes
por cncer en el mundo. El sistema NER acta no slo en la reparacin global del genoma, sino tambin en una
actividad de reparacin acoplada a la transcripcin, que revisa el DNA justo antes de ser transcrito.
401
Web 23.4. Reparacin por escisin de nucletidos.
El proceso comienza con el reconocimiento de la lesin por unin de protenas componentes del complejo de
reparacin, con gasto de ATP.
En la fase de escisin un complejo proteico que incluye endonucleasas hidroliza sendos enlaces fosfodister
de la hebra lesionada a ambos lados del punto de mutacin (pero no junto a l; concretamente, a 22 y +6 en
humanos). La peculiaridad de cortar slo una de las hebras y en dos puntos separados la distingue de otras
nucleasas, por lo que se denomina escinucleasa. A continuacin, una helicasa favorece la separacin del
oligonucletido liberado (de 12 o 13 nt en procariotas y unos 28 nt en eucariotas). Algunas de las subunidades de la escinucleasa permanecen unidas al tramo monocatenario hasta que sean desplazadas por la
maquinaria de replicacin.
A continuacin, en la fase de sntesis reparadora, una DNA polimerasa rellena el hueco dejado por la
escinucleasa, mediante la elongacin del extremo 3-OH formado en el corte anterior. El uso de la otra hebra
como molde asegura que se introduce la secuencia correcta. En eucariotas, realizan esta sntesis las polimerasas d y e, junto con sus factores accesorios PCNA y RFC (web 11.8).
Finalmente, una vez que la polimerasa ha rellenado todo el hueco y slo queda una mella, una DNA ligasa
une el extremo 3-OH recin sintetizado con el extremo 5-P formado en el corte de la hebra original,
cerrando la mella (fase de sellado o ligamiento).
Este mecanismo de reparacin posee la particularidad de estar relacionado con la transcripcin, gracias a
que participan protenas comunes (principalmente, el factor de transcripcin TFIIH, pg. 304). La RNApol II
detenida en el punto de lesin puede actuar de seal para el complejo de reparacin, y adems se observa una
reparacin preferente de las regiones de DNA que se transcriben y, dentro de ellas, de la hebra molde.
La escinucleasa humana es un gran complejo proteico (cerca de 1.000 kDa en total) que se puede considerar
formado por 6 subunidades funcionales que se van asociando y separando durante el proceso, constituidas por
un total de 16 cadenas polipeptdicas. Si se suman las protenas responsables de la replicacin y sellado, en total
participan en la reparacin por escisin de nucletidos unos 30 polipptidos diferentes.
N. de cadenas
polipeptdicas
Funcin
XPA
Reconoce la lesin en el DNA y se une a l.

Posee un dedo de zinc del tipo C4 (pg. 58).
XPC+HHR23B
Reconocen la lesin en el DNA y se unen a l.
RPA
Reconoce la lesin en el DNA y se une a l. Es la misma protena ligante de DNA

monocatenario que interviene en la replicacin.
TFIIH
Es el mismo factor de transcripcin general de los genes de clase II. Acta mediante su
actividad helicasa (TFIIH), separando las hebras del DNA en la regin a reparar. Su
actividad protena quinasa (TFIIK) no es necesaria aqu.
Subunidad
Helicasa:
XPB
Helicasa 3 ! 5
XPD
Helicasa 5 ! 3
p62
p44
Protena quinasa:
p41
Quinasa dependiente de ciclinas CDK7
p38
Ciclina H
p34
XPG
Endonucleasa que corta el extremo 3 de la regin escindida. Presenta homologa de

secuencia con la endonucleasa FEN1 (web 11.9).
XPF+ERCC1
Endonucleasa que corta el extremo 5 de la regin escindida.
Nota: los nombres XPA-XPG proceden de xerodermia pigmentosa (pg. 404).
402
23:25
23.6.3.2 Mecanismos especficos de reparacin por escisin de bases

Este sistema (BER, base excision repair) se encarga de reparar bases especficas; por tanto, reconoce y acta en
sitios concretos, reparando lesiones que son demasiado sutiles para distorsionar gravemente el DNA, es decir,
que no reconoce por el sistema general de escisin de nucletidos. Por ejemplo, puede corregir daos por
hidrlisis (desaminacin o prdida de base), oxidacin por radicales libres de oxgeno, alquilacin, y derivados
no voluminosos como timina glicol, N3-metiladenina y 8-hidroxiguanina.
Web 23.5. Reparacin por escisin de bases.
La fase de escisin se diferencia de la reparacin general porque, en primer lugar, se elimina la base alterada o
incorrecta y no su nucletido completo. Una N-glicosilasa de DNA reconoce un solo tipo de base, anmala
o emparejada de manera incorrecta, e hidroliza su enlace N-glicosdico con la desoxirribosa, dando lugar a
un sitio absico (apirimidnico o apurnico, segn sea el caso).
En todas las clulas existen varias N-glicosilasas, especficas para bases distintas y que, por tanto, reparan
lesiones diferentes.
Una vez generado el sitio absico, en una segunda subetapa de la fase de escisin se produce el corte de la
hebra de DNA junto a esa desoxirribosa que no est unida a una base nitrogenada.
Entran en juego para ello las endonucleasas AP (de apurnico y apirimidnico), que hidrolizan un enlace
fosfodister, originando una mella; en eucariotas (levaduras y mamferos) cortan siempre al lado 5 del sitio
absico, generando un extremo nucletido-3-OH y otro 5-fosfodesoxirribosa.
A partir de este momento, la reparacin contina de forma similar al mecanismo general, gracias a la
intervencin de una DNA polimerasa que elonga sustituyendo el nucletido absico y, en ocasiones, varios
ms (e introduce la secuencia correcta por complementariedad con la otra hebra). En eucariotas se han
encontrado dos mecanismos:
Reparacin de un solo nucletido, mediante la DNApol b, que posee dos actividades enzimticas:
desoxirribofosfodiesterasa, que elimina el nucletido absico, y polimerasa, que lo sustituye por uno
completo. Finalmente, una ligasa completa la reparacin cerrando la mella.
Reparacin de un tramo ms largo, realizada por las polimerasas d o e, junto con sus factores accesorios
PCNA y RFC, y la endonucleasa FEN1 (web 11.8 y web 11.9). Finaliza, igualmente, con el sellado de la
mella por una ligasa.
Como ejemplo de N-glicosilasa, la uracilo-DNA glicosilasa es una enzima muy especfica que no acta
sobre residuos U del RNA, pero que recorre el DNA reconociendo como extrao el uracilo (que slo se
diferencia de la timina en la carencia de grupo metilo). En las clulas se reduce la posibilidad de que U se
403
incorpore en la sntesis del DNA gracias a una dUTP pirofosfatasa que elimina el nucletido precursor (UTP
! UMP + PPi). Sin embargo, en el DNA ya sintetizado se forma U con gran frecuencia por la desaminacin
espontnea de C (pg. 394). Si el DNA estuviese formado por U (en lugar de T) sera imposible diferenciar
los residuos U formados a partir de C, y la mutacin U ! C no podra repararse. Gracias a que el componente
del DNA es T, y no U, es posible la reparacin de la mutacin frecuente U ! C y el mantenimiento del par AT.
Este mecanismo se considera una de las ventajas por las que el DNA (con A, G, T, C) ha podido evolucionar
como un mejor depositario de la informacin gentica. Sin embargo, no ocurre lo mismo con las citosinas
metiladas, relativamente comunes en el DNA eucaritico (pg. 282), cuya desaminacin oxidativa produce T,
que no puede ser distinguida de las T propias del DNA.
Otras glicosilasas de DNA reparan de forma anloga diversas bases modificadas:
Enzima
Uracilo-DNA glicosilasa
3-metiladenina-DNA glicosilasas
Acta sobre
Lesin que repara
Desaminacin de C
2
3-Me-A, 3-Me-G, 7-Me-G, O -Me-C,

O2-Me-T, hipoxantina
Metilacin de A, G, C o T,
Desaminacin de A
Formamidopirimidina-DNA
glicosilasa
8-hidroxiguanina,
formamidopirimidinas
Oxidacin de G
Hidrato de pirimidina-DNA
glicosilasa
timina glicol, pirimidinas oxidadas

o fragmentadas
Oxidacin de pirimidinas
(*) Me = metil.
Finalmente, debe mencionarse que el reconocimiento de los sitios AP es vital no slo para completar la
accin previa de las N-glicosilasas, sino tambin para corregir la despurinacin espontnea, que es un suceso
relativamente frecuente (pg. 395).
23.6.4 Reparacin de emparejamientos incorrectos

Habitualmente, los mecanismos de reparacin anteriores actan al poco tiempo de que se ha producido la
mutacin, antes de que sta se perpete debido a la replicacin. Sin embargo, existen adems otros
procesos, denominados de reparacin posreplicacin, que corrigen errores cometidos en la replicacin o
errores que la impiden (actan, por tanto, una vez por cada divisin celular). Entre ellos se encuentran la
reparacin por recombinacin y la reparacin de emparejamientos incorrectos. Comentaremos solamente
esta ltima.
Los emparejamientos incorrectos se producen por errores de la replicacin o como consecuencia de
recombinacin; el mismo sistema es tambin capaz de corregir pequeas inserciones de 1 a 4 nucletidos en
una de las hebras. Normalmente, la mayora de los errores cometidos inicialmente por la DNA polimerasa se
rectifican gracias a su propia actividad correctora de pruebas (exonucleasa 3, pg. 150), pero unos pocos
pueden permanecer sin corregir. Es entonces cuando entra en juego este mecanismo, formado por protenas que
reconocen la presencia de un par de bases incorrectamente emparejadas y eliminan la base errnea o bien un
tramo de la hebra de DNA que la contiene. stas son luego repuestas por los mecanismos de reparacin ya
estudiados, con intervencin de las DNA polimerasas d y e y sus cofactores RFC y PCNA. En humanos se han
podido identificar 5 genes que codifican protenas de este sistema de reparacin, llamados hMSH2, hMLH1,
hPMS1, hPMS2 y GTBP/hMSH6.
La cuestin importante que surge es: cmo determina la maquinaria de reparacin cul de las dos bases de
un par incorrecto es la errnea, la que hay que eliminar? Parecen existir varios mecanismos para esto, pero uno
de ellos se basa en la metilacin del DNA (pg. 282). Las enzimas encargadas de la metilacin de bases
tardan un tiempo en actuar, por lo que en el DNA bicatenario recin replicado la hebra nueva an no est
metilada, mientras que la hebra progenitora s lo est. Esto permite a las protenas reparadoras diferenciar la
hebra nueva, que ha de ser la que contiene la mutacin, y corregir sta. Este mecanismo se conoce bien en
E. coli, y posiblemente acte bajo principios similares en eucariotas.
404
23:26
23.7 ENFERMEDADES HUMANAS ASOCIADAS A LA REPARACIN

Se conocen varias enfermedades atribuidas a defectos en genes que codifican protenas de reparacin del DNA.
Estos defectos conducen con frecuencia a una mayor incidencia del cncer, pues se produce una acumulacin de
mutaciones no corregidas.
El cncer de piel denominado xerodermia pigmentosa, o pigmentaria (XP; tambin, xerodermia de Kaposi o
melanosis lenticular progresiva) es una enfermedad hereditaria causada por una deficiencia en alguno de los
genes responsables de la reparacin por escisin de nucletidos, conduciendo principalmente a la acumulacin
de dmeros de timina. La piel de estos enfermos es extremadamente sensible a la exposicin a los rayos
ultravioleta de la luz solar, ocasionndoles cnceres de piel con una frecuencia 1.000 o 2.000 veces superior
a la de personas normales. Tambin sufren una incidencia entre 10 y 20 veces mayor de cnceres en rganos
internos, y sntomas neurolgicos como retraso mental, ataxia progresiva y sordera. Se han identificado
defectos causantes de XP en 7 genes del sistema de reparacin, que codifican componentes de la escinucleasa:
XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, ERCC1 y XPG (pgs. 401-402).
El sndrome de Cockayne (CS), caracterizado por enanismo, retraso mental y sntomas neurolgicos
progresivos causados por desmielinizacin, tambin con una sensibilidad moderada a la radiacin ultravioleta,
se origina por mutaciones en los genes CSA o CSB, relacionados con la reparacin acoplada a la transcripcin.
Algunas mutaciones de XPB, XPD y XPG dan lugar a sndromes solapantes XP/CS.
Otra enfermedad gentica relacionada con la reparacin del DNA es la tricotiodistrofia (TTD), debida a
mutaciones en los genes TTD-A, XPB o XPD. Se trata ms bien de un defecto de la transcripcin, que se puede
corregir in vitro mediante microinyeccin de TFIIH a las clulas. Sus sntomas (en los dos ltimos casos, solapantes
con XP) incluyen caries dental, ictiosis, anomalas esquelticas y retraso mental progresivo por desmielinizacin.
El cncer colorrectal hereditario no asociado a poliposis (HNPCC, hereditary nonpolyposis colorectal
cancer, o sndrome de Lynch), uno de los cnceres hereditarios ms comunes, est causado por defectos en
los genes hMSH2 o hMLH1, ambos responsables de la reparacin de emparejamientos incorrectos. Se pueden
detectar mediante VNTR, pues el sistema de reparacin defectuoso no elimina pequeos bucles monocatenarios de DNA, lo que conduce a una mayor longitud de algunos microsatlites de DNA (pg. 421).
Otras enfermedades relacionadas con defectos en los sistemas de reparacin son la ataxia-telangiectasia,
asociada con una mayor sensibilidad al dao del DNA por rayos X, y la anemia de Falconi, que parece deberse a
un defecto en la reparacin del entrecruzamiento qumico de bases.
CAPTULO 24
Diversidad del genoma: polimorfismos
24.1 INTRODUCCIN
24.2 DIVERSIDAD GENTICA DENTRO DE UNA ESPECIE
24.3 MECANISMOS IMPLICADOS
EN LA VARIABILIDAD GENTICA
24.3.1 Duplicacin del material gentico
24.3.2 Transposicin
24.4 CONSECUENCIAS FUNCIONALES
DEL POLIMORFISMO
24.4.1 Polimorfismo en regiones codificantes,
o polimorfismo gnico
24.4.1.1 Sin efecto fenotpico
24.4.1.2 Con alteracin del fenotipo
24.4.2 Ejemplos representativos de polimorfismo gnico
24.4.2.1 Polimorfismo de grupo sanguneo AB0
24.4.2.2 Polimorfismo en el locus de la galactosemia
24.4.2.3 Polimorfismo de la antitripsina a1
24.4.3 Polimorfismo en regiones gnicas no codificantes
24.4.4 Polimorfismo en regiones no gnicas
24.4.5 Polimorfismo en el genoma mitocondrial
24.5 ANLISIS DE GENES
24.5.1 Bsqueda de genes por anlisis de ligamiento
24.5.2 Empleo de mtodos fsicos para la
identificacin de genes
24.5.3 Identificacin de genes por secuenciacin
24.5.4 Clonacin funcional
24.5.5 Identificacin de genes y bioinformtica
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24.6 DETECCIN DEL POLIMORFISMO

DE SECUENCIA DE DNA
24.6.1. Polimorfismo de un solo nucletido
24.6.1.1 RFLP: deteccin de polimorfismo en la
longitud de los fragmentos de restriccin
24.6.1.2 Otras formas de detectar
polimorfismo SNP
24.6.2. Polimorfismo de repeticin
24.6.2.1 VNTR: deteccin de polimorfismo
en el nmero de repeticiones en tndem
a) Deteccin por hibridacin
b) Deteccin por PCR
24.6.2.2 Polimorfismo STR
24.7 APLICACIONES DEL POLIMORFISMO GENTICO
24.7.1 Mapa de polimorfismos SNP
24.7.2 Anlisis del DNA en estudios familiares
24.7.3 Identificacin de individuos: huella dactilar de DNA
24.7.4 Anlisis de polimorfismos con fines diagnsticos
24.7.4.1 Diagnstico de errores congnitos del
metabolismo
a) Valoraciones preliminares
b) Ensayos genticos
c) Incidencia de las
enfermedades congnitas
24.7.4.2 Diagnstico de enfermedades polignicas
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24.1 INTRODUCCIN
El DNA genmico nuclear es una entidad extremadamente variable, no slo entre especies diferentes, sino tambin
entre individuos de una misma especie. Esta diversidad es responsable de fenmenos biolgicos de tanta trascendencia como la evolucin de las especies y, dentro de cada especie, de la presencia de caractersticas diferenciales en
cada individuo, nicas e irrepetibles. La diversidad o variabilidad gentica se debe a variaciones en la secuencia del
genoma; por tanto, en un sentido amplio el concepto de diversidad se hace sinnimo de polimorfismo (en su
significado literal, muchas formas) o, ms concretamente, polimorfismo gentico, de secuencia o de DNA. Los
proyectos de secuenciacin del genoma ya tienen en cuenta esta diversidad; una de las iniciativas recientes del
proyecto genoma humano es precisamente la secuenciacin del genoma de individuos concretos, de distinto origen
tnico (pg. 258) para realizar un anlisis comparativo de los puntos de variabilidad del genoma.
El polimorfismo afecta tanto a regiones codificantes del genoma (polimorfismo gnico) como a las no
codificantes (polimorfismo gentico en general). En ambos casos puede consistir en la variacin de un solo par
de bases del DNA o, menos frecuentemente, de millones de pb (macromutacin). El primer caso se conoce como
polimorfismo de un solo nucletido o SNP (acrnimo ingls de single nucleotide polymorphism; coloquialmente, snip). Cualquier variacin puede tener lugar en clulas germinales o reproductoras, con lo que se
transmite a la descendencia (polimorfismo hereditario, por ejemplo en las enfermedades congnitas), o bien en
clulas somticas, no reproductoras, en cuyo caso no se transmite (polimorfismo no hereditario, por ejemplo
en la mayora de los cnceres).
405
406
En un principio, la definicin de polimorfismo se refera a las protenas, y ms tarde a sus genes. Hoy da
debe definirse como la existencia simultnea en una poblacin de genomas con distintos alelos para un locus
determinado, sea ste gnico o no. Los alelos son variaciones de la secuencia de DNA presente en un locus o
posicin definida en un cromosoma (pg. 97); en consecuencia, en una clula diploide cada locus
autosmico est ocupado por dos alelos, uno de origen paterno y otro materno, situados en sendos cromosomas homlogos. El grado de polimorfismo de una poblacin es tanto mayor cuantos ms individuos contenga,
viene determinado por el nmero de alelos distintos existentes para un locus concreto y se refleja en el grado de
heterocigosis, o proporcin de individuos heterocigticos en el total de la poblacin (pg. 99).
24:1
Lgicamente, la causa ltima de la existencia de polimorfismo es la mutacin del DNA. La distincin entre el
uso de los trminos mutacin y polimorfismo no es clara ni unnime, pero en general se asocia el primero con
situaciones excepcionales, en especial si son patolgicas, mientras que se habla de polimorfismo cuando la
presencia de la variacin gentica es razonablemente comn en la poblacin y, por tanto, estable y nada o poco
perjudicial. Como consecuencia, el polimorfismo ha de ser heredado, mientras que la mutacin puede o no
serlo. Por convenio, se dice que un locus es polimrfico cuando la variabilidad afecta a ms del 1% de la poblacin. Dicho de otro modo, el segundo alelo ms frecuente se presenta con frecuencias superiores a 0,01.
Ejemplos hipotticos de la frecuencia de alelos en 5 loci de una poblacin

Alelo
Locus A
Locus B
Locus C
Locus D
Locus E
99,5% normal
98% polimrfico
99,5% normal
93,5% polimrfico
95,7% polimrfico
0,5% mutado
2% polimrfico
0,3% mutado
5% polimrfico
4% polimrfico
0,2% mutado
1,5% polimrfico
0,3% mutado
Todo polimorfismo es, pues, reflejo del genotipo de los individuos (constitucin allica para un locus
determinado o para un conjunto de ellos). Surge, por tanto, el concepto de individualidad gentica, entendida
como la presencia en cada individuo de un genoma con una secuencia caracterstica, nica para ese individuo.
Se presentan, en primer lugar, los fundamentos moleculares del polimorfismo y sus consecuencias funcionales, para continuar con la descripcin de las tcnicas empleadas para su deteccin.
24.2 DIVERSIDAD GENTICA DENTRO DE UNA ESPECIE

Nuestro objetivo es estudiar la individualidad gentica en especies con reproduccin sexual, caso de los
animales superiores, incluyendo los seres humanos, en los que el polimorfismo se presenta en dos versiones.
Polimorfismo fisiolgico o normal, de inters en estudios familiares, en la identificacin de individuos
(indicios criminales o investigacin de la paternidad), expresin de protenas (describiendo, por ejemplo,
el color de los ojos o la capacidad atltica), anlisis de ligamiento que conduce a la cartografa gentica, etc.
Polimorfismo patolgico, de inters en el diagnstico presintomtico y prenatal de enfermedades genticas, en la
deteccin de individuos portadores, la determinacin de compatibilidad para trasplantes, etc. Asimismo, puede
definir el riesgo para padecer enfermedades (Alzheimer, diabetes, etc.) y condicionar la respuesta a frmacos
(existe un gran nmero de personas con graves problemas de salud debido a reacciones adversas a frmacos).
24. Diversidad del genoma: polimorfismos
Curiosamente, los primeros indicios de la variabilidad gentica en humanos surgieron, a principios del siglo XX, a partir de la observacin de protenas distintas de las normales en patologas como la alcaptonuria.
Hoy sabemos que esta diversidad proteica es el resultado de que distintos individuos poseen alelos diferentes
en el locus del gen que codifica la protena (polimorfismo gnico).
24.3 MECANISMOS IMPLICADOS EN LA VARIABILIDAD GENTICA

Son varios los mecanismos que actuando en combinacin dan cuenta de la variabilidad gentica durante el
complejo proceso de la morfognesis (desde el cigoto a las primeras capas de tejidos embrionarios y su
transformacin en rganos) y a todo lo largo de la vida del individuo adulto. De estos mecanismos se han
considerado ya la recombinacin homloga (pg. 108), la segregacin de cromosomas (pg. 106) y la
mutacin (captulo 23). Se comentarn a continuacin los efectos de la duplicacin y la transposicin.
24.3.1 Duplicacin del material gentico

Se habla de duplicacin a gran escala cuando afecta a grandes porciones de un cromosoma. Sin entrar a
describir los aspectos concretos del proceso (propios de una gentica molecular), debe indicarse que ha actuado
progresivamente durante la evolucin, mediante diversos mecanismos complejos.
La duplicacin a pequea escala es de inters cuando tiene lugar en regiones codificantes del genoma,
afectando a genes especficos, por lo que tambin se denomina duplicacin gnica. La aparicin de mltiples
copias del gen, inicialmente idnticas, suele evolucionar posteriormente hacia la formacin de copias
ligeramente diferentes. De esta forma, una copia ancestral de un gen puede originar todos los miembros
de una familia multignica (genes que codifican polipptidos con secuencias relacionadas, pg. 113). Estas
familias codifican diversas protenas tpicas de eucariotas; por ejemplo, globinas (protenas de transporte
y almacn de oxgeno en sangre y msculo), actinas (parte del aparato contrctil en clulas musculares y
del citoesqueleto en clulas no musculares), opsinas (que detectan la luz a diferentes longitudes de onda en
clulas de la retina), colgeno (en diferentes tipos de tejido conjuntivo y seo), albminas e inmunoglobulinas (en plasma sanguneo), etc.
El principal mecanismo responsable de la duplicacin de genes completos a lo largo de la evolucin y, en
definitiva, de la generacin de tan gran variedad y cantidad de DNA repetitivo en las regiones no codificantes y
codificantes del genoma eucaritico, es la recombinacin no homloga o desigual. sta ocurre durante la
meiosis, entre cromosomas homlogos alineados de manera incorrecta, en los que no coinciden las regiones
equivalentes (como s ocurre en la recombinacin homloga), pero s se enfrentan regiones con similitud de
secuencia. Como consecuencia del sobrecruzamiento de cromtidas (pg. 108), un homlogo puede recibir
mayor cantidad de material gentico que el otro (lo que supone en ambos, respectivamente, una insercin o
duplicacin y una delecin).
Web 24.1. Duplicacin gnica resultante de la recombinacin desigual.
Tambin han surgido por duplicacin gnica los genes que codifican, en tejidos diferentes, las isoformas
(formas alternativas de una protena) o, en su caso, las isoenzimas o isozimas (formas alternativas de una
enzima). Sirve como ejemplo la fosfatasa alcalina, codificada por al menos 4 genes diferentes, que se expresan
de forma diferencial en cada tejido. Tres de ellos estn agrupados cerca del telmero del cromosoma 2q: ALPI
de intestino, ALPP de placenta (con un 87% de similitud entre s) y ALPPL, similar a la de placenta. El gen de la
cuarta isozima, ALPL, de hgado, hueso, rin y otros tejidos, est localizado cerca del telmero de 1p y
muestra una similitud de secuencia de 57% con ALPI y 55% con ALPP. Tan elevada homologa indica que estas
formas especficas de la misma protena enzimtica se originaron por una duplicacin gnica ancestral.
24.3.2 Transposicin
Otra fuente importante de variabilidad gentica es el proceso de transposicin, bien caracterizado en bacterias
pero tambin presente en el genoma eucaritico. Consiste en el desplazamiento, de un sitio a otro del cromosoma, de fragmentos de DNA llamados elementos mviles, elementos transponibles o transposones; su
407
408
longitud es variada, desde unos cuantos cientos de nucletidos hasta decenas de miles. La transposicin es
responsable en eucariotas de una gran proporcin del DNA repetitivo no codificante, destacando las secuencias
Alu y LINE-1 (pg. 118), que por s solas suponen el 10% del genoma humano.
Existen dos mecanismos de transposicin en eucariotas:
En el mecanismo de corte y pegado el transposn se escinde del DNA donador y se inserta en el DNA diana.
En algunos casos, la enzima responsable, transposasa, est codificada por una parte de la propia secuencia del
transposn.
24:2
Mediante el mecanismo de retrotransposicin se sintetiza un cDNA (pgs. 206 y 222-223) a partir del
transcrito del transposn, y finalmente se inserta aqul en el DNA diana. El nombre se debe a la similitud con
el mecanismo de replicacin en retrovirus. Algunos retrotransposones codifican en su propia secuencia la
transcriptasa inversa necesaria para su propagacin (por ejemplo, LINE-1).
24.4 CONSECUENCIAS FUNCIONALES DEL POLIMORFISMO

El polimorfismo puede tener distinta trascendencia desde el punto de vista funcional, dependiendo de si afecta a
regiones no codificantes, reguladoras o codificantes del genoma y tambin del modo como afecte al mensaje
gentico de estas ltimas.
24.4.1 Polimorfismo en regiones codificantes, o polimorfismo gnico

De la parte codificante del genoma humano se cree que unas tres cuartas partes son monomorfos, genes nicos
compartidos sin variacin por todos los individuos. stos constituyen la parte del genoma comn o de referencia, que define la especie y determina sus caractersticas morfolgicas. Dichos genes son casi idnticos a los homlogos en las especies ms cercanas (en nuestro caso, el gorila). El resto, una cuarta parte del total, son polimorfos; sus variaciones, en muchos casos mnimas, determinan el polimorfismo gnico.
Dentro del polimorfismo gnico se pueden distinguir dos situaciones de acuerdo con su trascendencia
funcional, es decir, su efecto sobre el fenotipo.
24.4.1.1 Sin efecto fenotpico

Aun estando la variabilidad localizada en una secuencia codificante, el polimorfismo puede no tener consecuencias sobre el fenotipo (es decir, sobre el producto gnico), principalmente por dos motivos: que no se altere
la secuencia proteica codificada (como consecuencia de la degeneracin del cdigo gentico, caso de las
mutaciones silenciosas, pg. 389) o que la variacin ocurra en una regin de la protena que no es esencial
para su funcin (entre otras, las mutaciones conservadoras, pg. 391). Podran incluirse tambin en este
ltimo caso los polimorfismos que afectan a los intrones, regiones gnicas pero no codificantes (que, por tanto,
pueden considerarse tambin polimorfismos no gnicos, pg. 415).
El polimorfismo sin efecto fenotpico es el ms comn, responsable de una diversidad gentica enteramente
normal. Las protenas formadas por los distintos alelos de un locus de este tipo son variantes relativamente
comunes, con secuencias y estructuras idnticas o similares y manteniendo una funcionalidad similar. Como
ejemplos pueden citarse protenas plasmticas como inmunoglobulinas, antitripsina a1, haptoglobina, transferrina y ceruloplasmina, as como otras protenas tanto intracelulares como extracelulares. Durante aos, estas
formas mltiples o variantes de protenas fueron el principal producto apreciable del polimorfismo, gracias a la
posibilidad de separarlas, sobre todo mediante electroforesis.
24.4.1.2 Con alteracin del fenotipo

En otros casos, la variacin en la secuencia del gen modifica la secuencia de la protena de tal forma que afecta a
su funcionalidad. Aunque esta modificacin puede ser beneficiosa (base de la evolucin), lo ms comn es
encontrar un polimorfismo patolgico o deletreo (perjudicial). La alteracin puede modificar las caractersticas bioqumicas, fisiolgicas o incluso morfolgicas de la clula, y puede llegar a producir patologas, dependiendo de la gravedad de dicho efecto fenotpico. Se puede distinguir entre:
Variaciones fenotpicas que no influyen en la susceptibilidad a enfermedades, caso de los polimorfismos
responsables de la estatura, el color de pelo, el grupo sanguneo, etc.
Variaciones fenotpicas que influyen de forma leve o mnima en la susceptibilidad a ciertas patologas, tales
como los polimorfismos responsables de rasgos morfolgicos complejos.
Variaciones fenotpicas que desempean un papel relevante en la aparicin de una patologa. Esto es lo que
ocurre, por ejemplo, con las hemoglobinas anormales, que se manifiestan en forma de enfermedades
genticas. Precisamente, el concepto de enfermedad gentica constituye la manifestacin ms obvia y a
veces ms extrema de un cambio gentico.
24.4.2 Ejemplos representativos de polimorfismo gnico

A continuacin se van a desarrollar en detalle tres ejemplos de polimorfismo gnico en regiones codificantes y,
en consecuencia, polimorfismo proteico bien conocidos, dos de ellos con implicaciones patolgicas.
409
410
24.4.2.1 Polimorfismo de grupo sanguneo AB0

La existencia de los grupos sanguneos humanos del sistema AB0 fue el primer caso descrito (1990) de
diversidad proteica determinada genticamente. La existencia de tres alelos determina cuatro fenotipos en la
sangre humana, denominados grupos sanguneos 0, A, B y AB.
Web 24.2. Identidad de los grupos sanguneos y aspectos clnicos.
Desde el punto de vista de la biologa molecular, es de sumo inters considerar las implicaciones genticas y
bioqumicas de un sistema polimrfico tan representativo como el de los grupos sanguneos AB0. ste consiste
en un polimorfismo de oligosacridos (carbohidratos), que es el resultado de un polimorfismo proteico en las
glicosiltransferasas responsables de la sntesis de esos oligosacridos. ste se origina, a su vez, en un polimorfismo gnico, la existencia de 3 alelos para el gen que codifica la glicosiltransferasa. Por otra parte, la expresin
de los antgenos A y B est condicionada, adems, por la de otro gen polimrfico, el gen H, cuyo producto
proteico es otra glicosiltransferasa que sintetiza el carbohidrato precursor (antgeno H) sobre el que actan las
transferasas codificadas por el gen AB0. Los aspectos particulares de todo el sistema se muestran comparativamente a continuacin.
24:3
Para una mejor comprensin de las diferencias causantes del polimorfismo, se detallan los puntos
polimrficos (en los exones 6 y 7) de las secuencias de mRNA y protena sintetizados por cada alelo,
considerando el A como referencia y el B y 0 como mutaciones de aqul.
24:4
En cuanto al aspecto bioqumico de este polimorfismo, los antgenos A y B se sintetizan mediante la accin
enzimtica de dos glicosiltransferasas distintas, codificadas por los alelos A y B. Ambas actan sobre el
antgeno H, un oligosacrido componente de glicoprotenas y glicolpidos que, a su vez, se genera previamente
mediante otra glicosiltransferasa codificada por el gen independiente del locus H. La especificidad antignica de
A, B y H, que define el grupo sanguneo y determina la produccin de los anticuerpos, viene definida por los
azcares terminales de los oligosacridos.
411
412
24:5
Los aspectos considerados se pueden resumir mostrando las relaciones entre los dos loci gnicos, sus alelos,
los productos gnicos de stos y los antgenos resultantes de la accin de esas enzimas:
Alelo
Producto gnico (protena, glicosiltransferasa)

(se indican varios nombres y su nmero de
clasificacin EC)
Antgeno (oligosacrido)
generado por la
glicosiltransferasa
Hh
2 alelos:
H dominante, h recesivo
Fucosiltransferasa
Galactsido 2-L-fucosiltransferasa
EC 2.4.1.69
No funcional
Ninguno
AB0
3 alelos:
A y B codominantes,
0 recesivo
Galactosaminiltransferasa
Transferasa del grupo histo-sanguneo A
Glicoprotena-fucosilgalactsido
a-N-acetilgalactosaminiltransferasa
EC 2.4.1.40
Galactosiltransferasa
Transferasa del grupo histo-sanguneo B
Glicoprotena-fucosilgalactsido
a-galactosiltransferasa
EC 2.4.1.37
No funcional
Ninguno
Gen (o locus)
El gen AB0 constituye un ejemplo clsico de multialelismo: los alelos A y B son codominantes, mientras que
0 es recesivo, por lo que los 6 genotipos posibles determinan 4 fenotipos. En cuanto al gen H, posee slo dos
alelos, uno dominante (H) y el otro recesivo (h), que producen 3 genotipos y 2 fenotipos.
413
Grupos sanguneos: genotipo, fenotipo, antgenos y anticuerpos presentes

Genotipo
HH o Hh
Fenotipo
Glicosiltransferasas sintetizadas
Antgenos presentes
Anticuerpos en el plasma
Grupo A
HyA
H (poco) y A
Anti-B
Grupo B
HyB
H (poco) y B
Anti-A
AB
Grupo AB
H, A y B
H (poco), A y B
Ninguno
00
Grupo 0
Slo H (mucho)
Anti-A y anti-B
AA
Grupo 0
Ninguno
Anti-H, anti-A y anti-B
Grupo 0
Ninguno
AA
A0
BB
B0
(*)
hh
A0
BB
B0
AB
Grupo 0
AyB
Ninguno
00
Grupo 0
Ninguna
Ninguno
(*)
En el caso de genotipo hh no se sintetiza el antgeno H por lo que no se pueden sintetizar los antgenos A ni B, aunque existan
glicosiltransferasas de tipo A o B. Por tanto, el grupo sanguneo es aparentemente 0; se le llama fenotipo 0h Bombay.
24.4.2.2 Polimorfismo en el locus de la galactosemia

La galactosemia es una enfermedad autosmica recesiva causada por la imposibilidad de metabolizar la
galactosa, que como consecuencia se acumula en sangre, sntoma que da nombre a la enfermedad. En teora
(v. web 24.4) la galactosemia puede deberse a mutaciones en distintas enzimas; de hecho, as se ha demostrado,
aunque con escasa incidencia. En la prctica, la causa ms frecuente son mutaciones en el gen que codifica la
enzima galactosa-1-fosfato uridililtransferasa o GALT.
Web 24.3. Descripcin y bioqumica de la galactosemia.
Los recin nacidos con galactosemia son homocigticos para un alelo mutante en el locus GALT. Se han
encontrado al menos 150 alelos diferentes en este locus (situado en la banda cromosmica 9p13), con
influencia variable sobre la actividad enzimtica y, en consecuencia, sobre la posibilidad de desarrollar la
enfermedad. Las frecuencias de estos alelos varan mucho dependiendo de la poblacin que se considere, como
suele ocurrir con todos los polimorfismos. Los alelos ms frecuentes, N (normal), G (galactosemia clsica),
D (Duarte o Duarte-2) y LA (Los ngeles o Duarte-1) dan lugar a las siguientes situaciones:
Genotipo
Actividad enzimtica
Fenotipo bioqumico
NN
100%
Normal
GG
< 5%
Galactosemia clsica
DD
50%
Normal, Duarte (actividad reducida, sin trascendencia)(*)
LA LA
140%
Normal, Los ngeles (actividad excesiva, sin trascendencia)(*)
NG
50%
Normal (actividad reducida, sin trascendencia)
ND
75%
N LA
120%
Normal (actividad excesiva, sin trascendencia)
GD
25%
Situacin lmite
G LA
70%
D LA
95%
Normal
(*)
El fenotipo bioqumico Duarte se identifica porque la enzima GALT se presenta en una isoforma ms cida (coherente con la
mutacin de asparragina a asprtico que se explica despus), de punto isoelctrico menor, que avanza ms rpidamente en
electroforesis y en isoelectroenfoque se sita ms cerca del nodo. Las variantes Duarte 1 y 2 se diferencian en su actividad
enzimtica.
414
Todos los fenotipos resumidos anteriormente son a su vez polimrficos. La reduccin de la actividad
enzimtica vara en distinto grado segn la combinacin de alelos que presente el individuo.
24:6
24.4.2.3 Polimorfismo de la antitripsina a1

La antitripsina a1 (a1-AT o A1AT) es una protena plasmtica que inhibe la actividad de varias proteasas,
como tripsina, quimotripsina y elastasa. Acta principalmente regulando la elastasa leucocitaria, para evitar
que sta destruya la elastina y otras protenas del tejido conjuntivo pulmonar y se dae la pared alveolar. La
deficiencia en a1-AT se asocia con enfisema (enfermedad pulmonar degenerativa) y con enfermedades
hepticas (cirrosis y cncer). Se ha podido determinar que dicha deficiencia y sus sntomas clnicos corresponden a la presencia de algunos de los mltiples alelos existentes para el locus de la a1-AT, denominado locus PI
(de inhibidor de proteasas) y situado en la banda cromosmica 14q32.1. Estos alelos (se han identificado ms
de 75) codifican variantes o isoformas de la protena, algunas de las cuales se pueden distinguir por su migracin en electroforesis o isoelectroenfoque.
415
Alelos ms comunes
101
Posicin en la secuencia proteica

160 213(*) 264
342
376
Fenotipo (protena)
M1A (el ms antiguo evolutivamente)
Arg
Tyr
Ala
Glu
Glu
Glu
Isoformas ligeramente
diferentes, pero todas
funcionalmente normales
M1V (el ms frecuente en la actualidad)
Arg
Tyr
Val
Glu
Glu
Glu
M2
His
Tyr
Val
Glu
Glu
Asp
M3
Arg
Tyr
Val
Glu
Glu
Asp
M4
His
Tyr
Val
Glu
Glu
Glu
Z (el ms frecuente de los patolgicos)
Arg
Tyr
Ala
Glu
Lys
Glu
Concentracin en plasma
reducida (<15%)
Arg
Tyr
Val
Val
Glu
Glu
Casi normal
Nulo (variante Granite Falls)
Arg
stop
Forma truncada,
no funcional
(*)
Las variantes M1A y Z pueden distinguirse del resto por RFLP (pg. 418), pues la mutacin GCG (Ala) ! GTG (Val) hace
aparecer una diana para Bst EII.
Se ha podido establecer la base molecular de la alteracin funcional que sufre la isoforma Z. En la estructura
tridimensional de la protena normal, el residuo Glu-342 (con carga negativa) se sita prximo al Lys-290 (con
carga positiva) y ambos forman un puente salino. La mutacin Glu(342) ! Lys, caracterstica del alelo Z,
impide este puente salino, provocando la agregacin de la protena dentro de la clula, lo que impide su
secrecin al plasma, disminuyendo la actividad y provocando la susceptibilidad a la enfermedad. El efecto se
manifiesta especialmente, como es lgico, en los homocigticos ZZ.
24.4.3 Polimorfismo en regiones gnicas no codificantes

Teniendo en cuenta la definicin ms completa de gen, la que se establece bajo un criterio funcional
(pg. 263), existen regiones del DNA que forman parte del gen, pero no codifican su producto gnico.
Tal es el caso de las regiones reguladoras (promotores), los intrones y las regiones 5UTR y 3UTR que, aunque
se conservan en el mRNA, no se traducen. Por ello se debe considerar la posibilidad de polimorfismos en estas
regiones gnicas no codificantes. Evidentemente, aunque tal polimorfismo no afectar a la secuencia de la
protena, puede afectar a su expresin, dependiendo de la funcin que ejerza la secuencia no codificante que lo
sufre. Muchos polimorfismos en los intrones no tendrn efecto alguno, y sern equivalentes al polimorfismo en
regiones no gnicas, estudiado a continuacin. Otros podrn afectar al ayuste (pg. 303), lo que da como
resultado un polimorfismo proteico. Las variaciones en secuencias promotoras probablemente perturben la
expresin del gen. Por tanto, el polimorfismo en regiones gnicas no codificantes puede manifestarse o no en un
efecto fenotpico.
No parece conveniente complicar la exposicin profundizando en este aspecto, pero no debe dejarse de tener
en cuenta. Como ejemplo similar, se ha mencionado una mutacin en secuencias reguladoras del gen del factor
IX de la coagulacin, causante de hemofilia B (pg. 388); aunque por su baja frecuencia no entra en la
categora de polimorfismo, como ya se ha indicado la mutacin y el polimorfismo comparten el mismo
principio molecular.
24.4.4 Polimorfismo en regiones no gnicas

La mayor parte de las mutaciones del genoma ocurren en regiones del DNA que no codifican ningn producto,
debido a su mayor abundancia en el genoma humano y de otros eucariotas (Captulo 9). Por tanto, los cambios
de bases en este DNA no tienen efecto fenotpico alguno: no se altera la secuencia, la estructura o la funcin
proteicas, de ah que tampoco tengan un inters patolgico directo. Son, sin embargo, polimorfismos de gran
inters aplicado; principalmente, para la cartografa del genoma, la bsqueda de genes relacionados con
enfermedades y la identificacin gentica de individuos.
416
La elevada cantidad de loci polimrficos que se encuentran en DNA no codificante, junto a la falta de
trascendencia funcional de sus alteraciones (que permite que se perpeten libremente en sucesivas generaciones),
hacen que sea ste el DNA que ms difiere de unos a otros individuos. Como consecuencia, una de las propiedades
ms notables del genoma de un individuo es la exclusividad de su perfil gentico (salvo para los hermanos gemelos
univitelinos, individuos clnicos que tendrn los mismos alelos en cada uno de sus loci, aunque incluso en este caso
pueden existir diferencias debidas a mutaciones somticas). Se puede, por tanto, utilizar el anlisis de estos
polimorfismos para la identificacin de una persona, con una fiabilidad igual o superior a la de las huellas
dactilares, lo que ha dado lugar al trmino huella gentica o huella dactilar gentica (pg. 425). Con este objeto
se emplean principalmente los polimorfismos en las regiones de DNA minisatlite y microsatlite (pgs. 117 y
243). Por otra parte, puesto que las secuencias no codificantes no proporcionan informacin sobre caractersticas individuales de las personas (posibles enfermedades, cualidades fsicas o psquicas, etc.), el anlisis
basado en polimorfismos de regiones no codificantes posee la ventaja de evitar cualquier conflicto tico.
24.4.5 Polimorfismo en el genoma mitocondrial

En el genoma mitocondrial pueden darse tambin mutaciones que generen un polimorfismo. Su DNA experimenta mayor proporcin de mutaciones que el nuclear, debido a la exposicin a especies reactivas de oxgeno,
resultantes del metabolismo oxidativo mitocondrial, a encontrarse ms desprotegido por carecer de histonas y
a la menor eficacia de los sistemas de reparacin mitocondriales. De esas mutaciones, las que afectan a regiones
codificantes (ms del 93% de la molcula de mtDNA) suelen tener consecuencias perjudiciales para la
funcionalidad de las protenas que codifican y para la vida de la clula. En contraste, las mutaciones en la
regin no codificante se conservan con ms facilidad, al no poseer efecto fenotpico. Las mutaciones que no son
perjudiciales dan lugar a polimorfismos genticos; cada vez parece ms claro que stos tampoco son completamente inocuos para las diferentes funciones celulares. Por ejemplo, una combinacin particular de alelos en
varios loci polimrficos del cromosoma mitocondrial humano (poco frecuente y denominada haplogrupo T)
da lugar a espermatozoides con motilidad reducida.
Como consecuencia, los polimorfismos ms comunes son los que afectan a la nica regin no codificante del
DNA mitocondrial, conocida como bucle D (pg. 161). En este corto tramo de DNA (1.112 pb en humanos,
menos del 7% del mtDNA total) se acumulan mutaciones con una frecuencia cinco veces superior a la del resto
del DNA mitocondrial. En particular, la tasa de polimorfismos es mxima en dos pequeas porciones del bucle D,
denominadas por ello regiones hipervariables.
24:7
El anlisis de polimorfismos en las regiones hipervariables mitocondriales encuentra gran aplicacin en
estudios familiares, antropolgicos evolutivos y tambin de identificacin. A este xito contribuye la conveniencia de obtencin y manejo de muestras mitocondriales, gracias a la existencia de un mayor nmero de
copias (cientos de mitocondrias por clula, cada una con decenas de copias de mtDNA), lo que disminuye la
probabilidad de que todas estn destruidas o daadas, y se traduce, en definitiva, en una mayor estabilidad del
DNA. Por otro lado, al ser las regiones hipervariables mucho ms cortas en el mtDNA es improbable su
degradacin en todas las copias de DNA de la muestra.
24.5 ANLISIS DE GENES

Son muchos los aspectos de inters en el estudio del DNA gnico, tanto desde el punto de vista bsico
(informacin sobre el propio gen) como, especialmente, para su aplicacin al estudio de la enfermedad
molecular con fines diagnsticos y teraputicos. Aunque el conocimiento del factor gentico no basta para
resolver de manera definitiva la enfermedad, s que es obligado conocer el aspecto molecular del gen o genes
disfuncionales responsables (mutacin o mutaciones) para poder identificarla. El nmero de enfermedades
para las que ya se dispone de informacin gnica es muy amplio; se pueden citar, por ejemplo, anemia
drepanoctica, cncer de mama y de colon hereditarios, corea de Huntington, distrofias musculares, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Tay-Sachs, fibrosis qustica, neurofibromatosis, poliquistosis renal, sndrome de Marfan, sndrome del cromosoma X frgil, sordera hereditaria, etc.
El objetivo de la genmica estructural (pg. 239) es identificar la secuencia del genoma completo y, sobre
todo, localizar los genes responsables de enfermedades. Aunque el nmero de genes localizados ha crecido
exponencialmente desde la dcada de 1970 hasta el presente, an quedan muchos por localizar y caracterizar.
Entre los aspectos estudiados cabe citar la localizacin de genes en los cromosomas, la identificacin de la
funcin de sus productos gnicos en la clula, la bsqueda y deteccin de genes anmalos responsables de
enfermedades conocidas o nuevas, la identificacin de mutaciones responsables de las anomalas, el estudio del
polimorfismo de secuencia, el anlisis de las protenas que resultan alteradas, las pruebas genticas en el
diagnstico clnico de enfermedades monognicas y multifactoriales, etc. El conocimiento de stos y de otros
aspectos no cesa de incrementarse con los avances en el conocimiento del genoma humano.
Bajo una expresin tan genrica como la de anlisis de genes se estudian en este captulo algunos de los
planteamientos y herramientas bsicas sobre las que se asienta la nueva medicina molecular o medicina
genmica y en los que se apoya la industria farmacutica en su intento por desarrollar frmacos que acten
sobre genes anmalos, con estrategias para sustituirlos o corregir su funcin. Nuestro enfoque, inevitablemente
restringido, no se dirige al estudio de enfermedades concretas, ms propio de tratados especializados (clnicos,
metodolgicos, etc.), sino a la descripcin de algunos aspectos aplicados en el diagnstico y la teraputica,
partiendo de la informacin aportada en los captulos precedentes y siguiendo como objetivo los puntos
incluidos en los captulos siguientes.
24.5.1 Bsqueda de genes por anlisis de ligamiento

Un primer paso en la bsqueda de genes es la determinacin aproximada de su ubicacin en los cromosomas. El
anlisis de ligamiento clsico, ya estudiado para la cartografa del genoma (pgs. 241-243), permite averiguar la
proximidad entre dos genes a partir de la frecuencia con que stos aparecen recombinados en la descendencia.
Se consigue una localizacin ms precisa si el anlisis del gen buscado se hace no con respecto a otro gen, sino a
marcadores genticos, en especial los polimrficos (pg. 243).
24.5.2 Empleo de mtodos fsicos para la identificacin de genes

stos proporcionan una localizacin ms precisa de los genes, ya que se describen en distancias absolutas de pb
(pg. 244). Se hace uso de mtodos basados en algunas caractersticas de los genes, ausentes en las regiones
no codificantes.
Islotes CpG. Se conoce la presencia de islotes CpG hipometilados (pgs. 283-284) en la regin promotora de
genes de vertebrados que se transcriben de manera activa; ms del 50% de los genes humanos presentan
dichos islotes. Es posible utilizar las genotecas (pg. 236) para buscar este tipo de secuencias y as
identificar genes potenciales, an no caracterizados.
Marcos de lectura abiertos. Puesto que la regin codificante de todo gen ha de empezar por un codn de
inicio y finalizar en uno de terminacin, la bsqueda en las genotecas de segmentos de DNA comprendidos
entre estos tripletes, segmentos denominados marcos de lectura abiertos (ORF, de open reading frame;
pg. 318), es otro mtodo para encontrar genes potenciales.
Genotecas de cDNA. Evidentemente, un gen que se expresa en un tipo celular determinado ha de estar
representado por el mRNA transcrito a partir de l. El anlisis de genotecas de cDNA (pg. 238) es, por
tanto, otra fuente para la bsqueda de genes nuevos.
417
418
24.5.3 Identificacin de genes por secuenciacin

La secuenciacin sera la forma ms directa y sencilla de analizar un gen, de detectar un polimorfismo o una
mutacin. Sin embargo, en la prctica, este objetivo no es fcil dado el tamao y complejidad del genoma
humano y la especializacin tcnica que comporta la secuenciacin a gran escala. Es preferible seleccionar o
cribar, por alguno de los mtodos anteriores, los fragmentos candidatos antes de secuenciarlos.
24.5.4 Clonacin funcional

Esta aproximacin se plantea en los casos en los que se ha caracterizado el producto gnico antes de conocer la
alteracin del gen. Por ejemplo, la protena responsable de una enfermedad (como la globina bS en la anemia de
clulas falciformes). El objetivo es, entonces, identificar la secuencia del gen alterado a partir de la secuencia
de la protena anmala, proceso conocido como clonacin funcional. A partir de la secuencia de aminocidos
se deduce la secuencia de nucletidos del gen y se disea una sonda (pg. 184) que permita localizar por
hibridacin el alelo mutante asociado a la enfermedad.
24.5.5 Identificacin de genes y bioinformtica

La bioinformtica o conjunto de tecnologas de la informacin aplicadas al estudio de los fenmenos biolgicos ha
alcanzando su cenit con ocasin del Proyecto Genoma Humano. Ha sido espectacular la tecnologa desarrollada
para dilucidar el ordenamiento de los tramos que se van secuenciando. Se habla ya de la bioinformtica como una
ciencia que recoge informacin de reas de conocimiento antes tan separadas entre s como la bioqumica, la
biologa molecular, la estadstica, la farmacologa, la fsica, la fisiologa, la gentica, la qumica fsica, etc., en
colaboracin con el desarrollo de las nuevas generaciones de ordenadores, internet, la robtica, etc.
A fin de identificar las secuencias que definen los genes, se han elaborado los llamados programas predictores de genes; se basan en distintas aproximaciones y combinan el empleo de sistemas de reglas, redes
neuronales, inteligencia artificial, modelos estadsticos y mtodos de anlisis lingstico.
24.6 DETECCIN DEL POLIMORFISMO DE SECUENCIA DE DNA

Para detectar las variaciones (polimorfismo) en la secuencia del genoma de distintos individuos se acude a
estrategias diversas. En principio, la forma ms directa de detectar un polimorfismo es la secuenciacin del
DNA, pero por su laboriosidad se suele acudir a otras tcnicas, basadas en la hibridacin de Southern (pg. 171)
o en la PCR (captulo 14).
24.6.1 Polimorfismo de un solo nucletido

El caso conceptualmente ms simple es aquel en el que el polimorfismo se manifiesta en forma de nucletidos
alternativos en una cierta posicin del genoma; se habla de polimorfismos de un solo nucletido o SNP
(acrnimo ingls de single nucleotide polymorphism; coloquialmente, snip).
24.6.1.1 RFLP: deteccin de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin

ste es uno de los primeros mtodos desarrollados para la deteccin de polimorfismos, y el que ms se ha empleado
durante muchos aos. Se basa en la deteccin de aquellas variaciones de la secuencia del DNA (codificante o no)
que tienen como consecuencia un cambio en una diana de restriccin. Casi siempre la variacin afecta a un solo
nucletido. Por tanto, los fragmentos de restriccin que se obtienen son diferentes dependiendo de qu alelo est
presente en la muestra; de ah su nombre (restriction fragment length polymorphism).
Cada muestra de DNA generar mltiples fragmentos, de longitud diferente en funcin de los sitios de
restriccin presentes. Puesto que muchos de ellos no corresponden a la regin que se pretende estudiar,
generalmente se utiliza una sonda que hibrida en posicin cercana al sitio polimrfico y se analizan los
fragmentos por el mtodo de Southern (pg. 171). Con el fin de poder utilizar el mtodo sobre cantidades
pequeas de muestra, es comn realizar una amplificacin previa por PCR; ello exige disponer de un par de
cebadores especficos para secuencias que flanqueen la regin polimrfica. En ese caso, puede ser innecesario el
uso de la hibridacin, pues la cantidad de DNA es suficiente para detectarlo en el gel con un mtodo de tincin,
y se podr observar la diferencia en el patrn de fragmentacin.
24:8a
24:8b
24:8c
419
420
Web 24.4. Ejemplo: polimorfismo en la globina b, causante de la anemia de clulas falciformes.
Los perfiles de RFLP obtenidos sobre muestras de distintos individuos, dentro de una cierta similitud propia
de la especie, reflejan la diversidad del genoma en la poblacin. Al disponerse de centenares de enzimas de
restriccin y de la posibilidad de sintetizar sondas con cualquier secuencia, son enormes las posibilidades de
combinacin para el anlisis gentico; se han detectado as muchos sitios RFLP en el genoma humano. Por ello,
adquieren el carcter de marcadores genticos (pg. 240), con mltiples aplicaciones (pg. 424). Por
convenio, como ya se ha indicado (pg. 406), esta variacin slo se califica estrictamente como polimorfismo si aparece en ms del 1% de la poblacin.
La tcnica RFLP se ha visto desplazada en gran medida por otras, pero fue el primer mtodo asequible para
establecer perfiles de DNA, con aplicacin en cartografa del genoma, ubicacin de genes responsables de
enfermedades, determinacin del riesgo de enfermedades y ensayos de paternidad, entre otros.
24.6.1.2 Otras formas de detectar polimorfismo SNP

Se han desarrollado infinidad de tcnicas para el genotipado de polimorfismos SNP. Ms que intentar una
descripcin exhaustiva, procede exponer los principios generales en los que se basan; los detalles experimentales son una cuestin especializada y en continua evolucin.
El mtodo ltimo para detectar polimorfismos sera la secuenciacin del DNA genmico pero, obviamente,
esto es demasiado costoso en tiempo y dinero para usarse como mtodo de rutina. Por ello, slo se utiliza para
la caracterizacin inicial del polimorfismo. Una vez conocido el nucletido variable y la secuencia en la que est
inmerso, se acude a otras tcnicas para discernir cul es la variante presente en una muestra.
La mayor parte de los mtodos que no dependen de la alteracin de dianas de restriccin si no todos se
basan en tcnicas de hibridacin o de PCR especficas de alelo. Se trata de disear oligonucletidos
complementarios a cada uno de los alelos (denominados oligonucletidos especficos de alelo o ASO, allelespecific oligonucleotides). stos pueden emplearse como sondas de hibridacin o bien como cebadores de PCR.
La discriminacin entre alelos, basada en una sola diferencia puntual de la secuencia, hace uso de diversos
diseos experimentales.
Hibridacin especfica de alelo. La deteccin directa de la hibridacin requiere, evidentemente, el uso de
condiciones de elevado rigor (pg. 168), de modo que el oligonucletido no se empareje con la muestra si no
hay complementariedad de bases perfecta en el punto polimrfico. Habitualmente, deben ensayarse en
paralelo los oligonucletidos con secuencia complementaria a cada uno de los alelos, pero puede ser factible
su examen simultneo si se emplean marcadores o etiquetas diferentes en cada uno (por ejemplo, fluorocromos distintos). Para la deteccin de la sonda marcada e hibridada se utilizan estrategias experimentales
anlogas a las descritas para la PCR en tiempo real (pg. 205).
24:9
Extensin del cebador. Si se disea un cebador cuyo extremo 3 coincide con el punto polimrfico, la DNA
polimerasa en la PCR no lo elonga si su ltimo nucletido no empareja con el molde. En otras aproximaciones el cebador puede hibridar con una regin comn a ambos alelos y luego, empleando etiquetas
marcadoras o incluso espectrometra de masas, se detecta qu nucletidos se incorporan cuando se elonga
el cebador sobre la secuencia polimrfica.
Enzimas sensibles al desemparejamiento parcial. En algunas tcnicas se tolera la hibridacin imperfecta pero
se aprovecha la selectividad de enzimas. Aparte de la propia DNA polimerasa, ya mencionada, se han
utilizado ligasas para unir dos oligonucletidos hibridados en posicin contigua, slo si estn completamente
emparejados, o tambin la endonucleasa FEN1 (web 11.9), que es muy sensible a las bases desemparejadas.
Propiedades del DNA bicatenario. Tanto la hibridacin de una sonda como la elongacin de cebadores
mediante PCR generan molculas bicatenarias. Se pueden detectar stas por la incorporacin de intercalantes fluorescentes (anlogo a lo descrito en pgs. 205-206). Otras tcnicas aprovechan las diferentes
propiedades derivadas del emparejamiento perfecto o imperfecto de las cadenas. Por ejemplo, en la SSCP
(single strand conformation polymorphism, polimorfismo de conformacin de molculas monocatenarias)
los productos de PCR se desnaturalizan con alta temperatura y formaldehdo, y luego se permite que
renaturalicen mientras avanzan por un gel de electroforesis. El emparejamiento intracatenario que se genera
es diferente como consecuencia de la mutacin y conduce a conformaciones alternativas que se separan en el
gel. La tcnica TGGE (temperature gradient gel electrophoresis, electroforesis en gel con gradiente de temperatura) aprovecha, asimismo, las diferencias de movilidad, en este caso resultantes de la desnaturalizacin
gradual al avanzar por un gel cuya temperatura va aumentando. Las diferencias de secuencia entre alelos
afectan a la temperatura de fusin del DNA (pg. 167), lo que se traduce en una movilidad diferente de las
molculas en el gel.
24.6.2 Polimorfismo de repeticin

Este tipo de polimorfismo surge de la existencia en el genoma eucaritico de abundantes regiones de DNA repetitivo, en su mayor parte no codificante. Ms concretamente, se trata de repeticiones en tndem (DNA
satlite, minisatlite y microsatlite, pgs. 116-118).
24.6.2.1 VNTR: deteccin de polimorfismo en el nmero de repeticiones en tndem

Este polimorfismo, entre individuos y entre los dos alelos de un mismo individuo, surge porque el nmero de
unidades de repeticin que forman cada bloque no es siempre el mismo; de ah el nombre, polimorfismo de nmero variable de repeticiones en tndem, o simplemente VNTR (variable number of tandem repeats). La razn
de que vare con tanta facilidad el nmero de repeticiones se encuentra en la posibilidad de recombinacin entre ellas con sobrecruzamientos desiguales (pg. 407).
a) Deteccin por hibridacin
La aproximacin tradicional, al igual que en el caso de la tcnica RFLP, se apoya en el uso de sondas de
hibridacin para detectar ciertos fragmentos de restriccin y en el anlisis del tamao de stos mediante
electroforesis.
24:10a
421
422
24:10b
24:10c
Los polimorfismos VNTR que se emplean en la prctica corresponden a bloques moderadamente grandes
con unidades de entre 5 y 64 pb, correspondientes a los minisatlites hipervariables. Otros tipos no suelen
recibir ese nombre, como el polimorfismo de repeticiones sencillas en tndem (unidad de repeticin de 1 a 4 pb,
es decir, DNA microsatlite) y el polimorfismo de repeticiones en tndem asociado con grandes bloques de
DNA satlite. Los loci hipervariables reciben este nombre por tener de forma caracterstica muchos alelos. Los
marcadores ms informativos tienen decenas de alelos, por lo que es poco probable que dos individuos no
emparentados compartan los mismos. Estos marcadores VNTR proporcionan mucha informacin para el
anlisis de ligamiento gentico (mapas genticos, pg. 239) y para la identificacin de individuos (pruebas
forenses y de paternidad, pgs. 425-426).
b) Deteccin por PCR
Como alternativa al mtodo de Southern, para detectar el polimorfismo VNTR puede aplicarse una
amplificacin por PCR (captulo 14). En lugar de una sonda, se precisan entonces sendos cebadores que
hibriden a ambos lados del bloque de repeticiones. Puesto que as slo se amplifica la regin que contiene el
locus polimrfico, no es necesario purificar el DNA, ni digerirlo con enzimas de restriccin, y en la electroforesis slo se observarn (sin hibridacin, basta la tincin normal de DNA, pg. 141) las bandas de los
fragmentos que incluyen el bloque de repeticiones, de tamaos distintos segn el alelo presente. Debido a estas
ventajas, cada vez ms se ha venido utilizando la PCR para la deteccin de los VNTR, con preferencia sobre la
hibridacin de Southern.
24:11
24.6.2.2 Polimorfismo STR

La eleccin de marcadores repetitivos ms convenientes para el uso cotidiano ha ido modificndose a lo largo
de los aos, particularmente para una de sus aplicaciones ms extendidas: las pruebas de identificacin de
individuos. Como resultado, los VNTR clsicos han ido dando paso a otras secuencias repetitivas polimrficas.
El FBI (Federal Bureau of Investigation, Oficina Federal de Investigacin de los Estados Unidos) ha liderado el
desarrollo de las tcnicas de tipificacin de DNA para su uso en la identificacin de autores de delitos violentos.
En 1997 se seleccionaron 13 loci STR que forman el ncleo central de la base de datos nacional de los EE.UU.,
llamada CODIS (Combined DNA Index System). En Europa se utilizan sistemas similares que comparten
varios de los marcadores STR como, por ejemplo, el grupo de loci ESS (European Standard Set) definido por el
European Network of Forensic Science Institutes.
Los STR (short tandem repeats, repeticiones cortas en tndem) son secuencias repetitivas de 2 a 7 pb que se
localizan en posiciones concretas de los cromosomas, formando bloques de no ms de 500 pb. Se clasifican,
pues, dentro de la categora de microsatlites (pg. 118). Entre las ventajas que los han hecho populares destaca
su elevada variabilidad en la poblacin, con un gran nmero de alelos que se diferencian en el nmero de
repeticiones (entre 7 y 38 unidades). Adems, el pequeo tamao de los STR permite analizarlos en muestras
de DNA que hayan experimentado degradacin parcial, reduce las posibilidades de que sufran mutacin y facilita su identificacin independientemente de otros loci cromosmicos. En la prctica habitual, la deteccin se
realiza mediante PCR empleando cebadores diseados especficamente para la regin cromosmica que contiene cada uno de los loci. Mediante una combinacin inteligente de la posicin de los cebadores (que define el tamao de los fragmentos amplificados) con el uso de cebadores etiquetados con varios fluorocromos, se
hace posible la amplificacin simultnea de todos los STR (tcnica llamada de PCR mltiplex) y su anlisis mediante electroforesis capilar. Por lo dems, el fundamento de la tcnica es comn con el de los VNTR descritos en la seccin precedente.
Web 24.5. Ejemplo: deteccin de polimorfismo STR.
Los loci STR habituales (como los de CODIS) estn repartidos por los autosomas y se heredan, por tanto,
segn las leyes clsicas mendelianas. Recientemente los resultados ofrecidos por estos marcadores se suplementan o se sustituyen, dependiendo de las aplicaciones con el empleo de marcadores ligados al sexo, con
una herencia an ms sencilla de interpretar.
423
424
Se han desarrollado marcadores STR del cromosoma Y, que permiten investigar la lnea de transmisin
exclusivamente paterna. Poseen inters en la identificacin de individuos cuando se dispone de muestras de
referencia familiares a travs de varias generaciones, as como en la identificacin de restos celulares de varones
mezclados con muestras de mujer (por ejemplo, vestigios de semen en agresiones sexuales).
Tambin es posible investigar de manera selectiva la lnea hereditaria materna mediante marcadores de
DNA mitocondrial, secuencias polimrficas ubicadas en las regiones hipervariables del DNA mitocondrial
(pg. 416).
24.7 APLICACIONES DEL POLIMORFISMO GENTICO

El anlisis del polimorfismo gentico da pie a numerosas aplicaciones, tanto en investigacin bsica como en
clnica, que se basan en los tipos de polimorfismos antes descritos.
Los polimorfismos del DNA que no tienen efecto fenotpico se utilizan para la comprobacin de la identidad
(huella dactilar gentica). Por ejemplo:
Diagnstico de la paternidad biolgica y seguimiento de rboles genealgicos.
Identificacin de sospechosos en investigacin policial y procedimientos penales, por comparacin con el
DNA procedente de diversos restos biolgicos (sangre, semen, saliva, races de cabello, tejidos corporales
diversos, piezas dentales, etc.).
Identificacin post mrtem de individuos, en casos judiciales o catstrofes.
Otras aplicaciones de inters diverso. Por ejemplo, es posible aplicar estas metodologas a muestras
clnicas con el fin de comprobar identidad de las biopsias, posibilidades de trasplante, inestabilidad
gentica caracterstica de ciertos tumores, etc.
El estudio de los polimorfismos que tienen una contribucin a la susceptibilidad frente a ciertos procesos
patolgicos posee inters mdico, especialmente en la prevencin de enfermedades complejas.
Los polimorfismos que desempean un papel directo en la aparicin de un fenotipo patolgico son,
evidentemente, aplicables para el diagnstico, as como para el estudio de los mecanismos moleculares de
la enfermedad (patologa molecular).
24.7.1 Mapa de polimorfismos SNP

Los polimorfismos SNP o de un solo nucletido (pgs. 418 y 420) constituyen alrededor del 90% de la diversidad
del genoma humano. En promedio, existe un SNP por cada 200 pb en el genoma. Aunque la mayora de ellos no
originan directamente enfermedades, en ocasiones pueden localizarse muy cerca de mutaciones o polimorfismos involucrados en procesos patolgicos, lo que los hace tiles como marcadores genticos (pg. 243). Al
irse caracterizando cada vez un nmero mayor de estos polimorfismos, se ha hecho posible la construccin de
un mapa de SNP, lo que se aade a la utilidad propia de algunos como determinantes de enfermedades. Existen
ya millones de polimorfismos SNP bien caracterizados, repartidos por el conjunto completo de los 24 cromosomas humanos (22 autosomas y 2 cromosomas sexuales).
24.7.2 Anlisis del DNA en estudios familiares

El anlisis de unos cuantos polimorfismos permite realizar un seguimiento de la herencia de los alelos respectivos y as obtener conclusiones sobre las relaciones familiares entre varias personas. De igual manera, se
pueden realizar estudios evolutivos y antropolgicos, tales como el seguimiento de las migraciones humanas
desde tiempos prehistricos y las relaciones entre los antecesores de la raza humana.
Se ilustra el fundamento de estos estudios con un ejemplo muy simplificado.
24:12
Una de las principales aplicaciones de estos estudios familiares ha sido relacionar la presencia de una
enfermedad gentica, causada por un defecto en un gen an desconocido, con la de un polimorfismo determinado. Mediante un estudio amplio del rbol familiar, basado en la transmisin mendeliana del gen patolgico y
de los marcadores polimrficos, se puede llegar a encontrar un alelo polimrfico que est ligado a la enfermedad (por la proximidad de sus loci respectivos en el genoma, pgs. 241 y 244). Esto permite, en primer lugar,
identificar de forma aproximada la posicin del gen patolgico y as facilitar su bsqueda y, por otro lado, el
diagnstico preventivo de la enfermedad mediante la deteccin del alelo polimrfico asociado. Este procedimiento se ha aplicado con algunas enfermedades humanas, como la fibrosis qustica y la corea de Huntington.
En una aplicacin ms simple, el anlisis familiar de marcadores polimrficos de DNA se utiliza ya
rutinariamente para la realizacin de pruebas de paternidad. En este caso, la necesidad de asegurar los
resultados con un grado elevado de certeza requiere que la probabilidad de una coincidencia de la
distribucin de alelos por puro azar se reduzca a valores suficientemente bajos. Esto se consigue eligiendo
marcadores que sean altamente polimrficos en la poblacin y aumentando el nmero de ellos que se analizan
de forma simultnea (vase apartado siguiente).
24.7.3 Identificacin de individuos: huella dactilar de DNA

Como se ha visto hasta ahora, los polimorfismos se localizan con una sonda o un par de cebadores particulares,
para examinar un locus nico. Sin embargo, muchas secuencias estudiadas en los polimorfismos de repeticin
aparecen en mltiples zonas del genoma (recurdese que los minisatlites y microsatlites son DNA moderadamente repetitivo y disperso, organizado en bloques dispersos de repeticiones en tndem, pg. 117). Las
unidades de repeticin presentes en puntos distintos del genoma pueden ser idnticas o bien lo suficientemente
similares como para permitir su deteccin simultnea en todos esos loci. Si se disea una sonda con una
secuencia que hibride con todos los loci de una familia de DNA minisatlite o microsatlite, se puede observar
de manera simultnea el patrn polimrfico de todos ellos que, dada la combinacin de gran nmero de
variaciones individuales, es prcticamente nico para cada individuo. Por ello, el patrn resultante se denomina
huella dactilar de DNA (DNA fingerprint). Slo los gemelos idnticos presentan huellas indistinguibles.
Una situacin similar se alcanza al estudiar marcadores polimrficos, como los STR, que estn localizados
en una nica ubicacin del genoma, si se analizan simultneamente varios de ellos. Por ejemplo, analizando los
13 marcadores STR del CODIS (pg. 423) se observan entre 13 y 26 bandas de DNA (dependiendo de si el
individuo es homocigtico o heterocigtico para cada locus). Se ha calculado que la probabilidad de que dos
personas de raza blanca no emparentadas tengan una combinacin idntica de alelos en los 13 marcadores es de
425
426
uno en 5,75 1014. Por muy baja que parezca esta cifra, significa que en una poblacin de 100 millones de
personas habr 8 o 9 casos de dos personas que coinciden en los 13 loci.
La huella gentica puede utilizarse en estudios familiares, pruebas de paternidad, identificacin de recin
nacidos, criminologa, pruebas forenses, etc. Otra de sus aplicaciones es la deteccin rpida de cambios somticos del genoma, por ejemplo, al comparar DNA de tejidos normal y neoplsico. En una alta proporcin de tumores malignos, la huella gentica sufre cambios, que consisten en la aparicin o en la prdida
de bandas.
24:13
24.7.4 Anlisis de polimorfismos con fines diagnsticos

El anlisis de polimorfismos es tambin un mtodo ptimo para el diagnstico, en especial por la posibilidad de
detectar la enfermedad antes de que se desarrolle, o de evaluar la predisposicin gentica para ciertas enfermedades cuya causa no es nica. Es de enorme inters, por ejemplo, el diagnstico prenatal de enfermedades
congnitas, es decir de toda anomala del desarrollo morfolgico, estructural, funcional o molecular presente
al nacer (aunque pueda manifestarse ms tarde), externa o interna, familiar o espordica, hereditaria o no,
nica o mltiple (definicin de la OMS).
24:14
Una vez realizada la exploracin mdica del paciente, es decir, delineado el fenotipo clnico, la contribucin
del laboratorio al diagnstico puede hacerse a tres niveles: expresin y herencia de los genes (nivel gnico o
genoma), efecto sobre el producto gnico anormal resultante (proteoma), y va metablica o desequilibrio
qumico afectado (nivel bioqumico). Cualquiera de estas situaciones constituye un objetivo y debe ser estudiada en patologa molecular, una materia hoy da multidisciplinar.
El conocimiento de la causa de las enfermedades genticas en familias se ha acelerado gracias al anlisis de
marcadores genticos. El diagnstico evoluciona hacia el conocimiento de un catlogo de variaciones genticas
mediante una aplicacin tecnificada, en conjuncin con la bioinformtica. Se trata de buscar un perfil gentico
que permita identificar las enfermedades a las que podemos estar predispuestos, desde el punto de vista de las
mutaciones. En definitiva, supone un gran paso hacia la medicina predictiva, que permite tomar medidas
teraputicas precoces para eliminar el riesgo de enfermedad.
24.7.4.1 Diagnstico de errores congnitos del metabolismo

Los errores congnitos se pueden considerar como paradigma de los trastornos bioqumicos determinados
genticamente en la estructura y funcin de molculas proteicas. La enfermedad es simplemente la ilustracin
ms evidente de una variacin gentica que afecta a la salud.
A diferencia de los adultos, en quienes se suelen utilizar muestras de frotis bucales, sangre u otros tejidos, en
el diagnstico prenatal se emplean dos tipos de tcnicas: no invasivas, que incluyen ultrasonidos y radiografa, e
invasivas, como amniocentesis, biopsia de vellosidades corinicas, cordocentesis o biopsias de hgado fetal
(pg. 122). Si el contenido de DNA en la muestra no es suficiente, puede amplificarse la regin de inters
mediante PCR (Captulo 14).
a) Valoraciones preliminares
Entre los parmetros de carcter bsico o preliminar para la monitorizacin fetal y el diagnstico prenatal se
emplean la gonadotropina corinica (hCG), una glicoprotena producida por el embrin en desarrollo, que
se detecta como indicador de embarazo desde los primeros das de la concepcin, el lactgeno placentario (hPL)
sintetizado por la placenta, que aumenta en sangre materna hasta el trmino del embarazo, y el estriol, un
esteroide sintetizado por el feto y la placenta. Estos ensayos han sido superados por la investigacin ultrasnica
y cardiotocogrfica. Para establecer riesgos de malformacin fetal se mide la fetoprotena a (AFP), sintetizada
en saco vitelino e hgado fetal, que debido a su pequeo tamao pasa del plasma a la orina fetal y, por tanto, al
fluido amnitico y sangre materna. Un aumento por encima de lo normal es ndice de anomalas congnitas,
especialmente defectos del cierre del tubo neural (espina bfida, anencefalia, etc.). Adems de estos parmetros,
pueden tambin medirse, con distintos fines diagnsticos, los niveles de bilirrubina y la concentracin de
fosfolpidos en lquido amnitico, el pH, gases sanguneos y concentracin de lactato en sangre fetal, etc.
427
428
b) Ensayos genticos
El ensayo gentico detecta la patologa buscando, como ya se ha descrito, el alelo asociado a la enfermedad, si se
conoce su gen, o mediante otro polimorfismo cuyo locus muestre ligamiento con el locus patolgico desconocido. Se aplican los mtodos ya descritos, basados en el ligamiento de genes, polimorfismos, reaccin de la
PCR, etc. Como ejemplos cabe citar:
Medida de un sitio de restriccin alterado por la mutacin, como en el polimorfismo RFLP con Mst II en la
anemia de clulas falciformes (web 24.4).
Empleo de oligonucletidos sintticos como sondas para la secuencia alterada, cuando el trastorno gentico
se debe a un cambio de un nucletido especfico. Un ejemplo es la deficiencia en antitripsina a1, que conduce
a una mayor probabilidad de desarrollar enfisema pulmonar, debida a un cambio en un solo nucletido
(pgs. 414-415). Un anlisis de Southern con una sonda sinttica permite determinar si el DNA contiene la
secuencia normal o la mutada.
Ensayos por PCR. Puesto que esta tcnica permite amplificar la regin de DNA potencialmente defectuosa,
puede emplearse para el diagnstico prenatal de enfermedades siempre que se conozca el sitio exacto de la
mutacin.
c) Incidencia de las enfermedades congnitas
Se estima que hay ms de 10.000 enfermedades monognicas, con una prevalencia global de 1% en el
nacimiento. En centenares de estas enfermedades, tanto las comunes como las ms infrecuentes, se ha reconocido el defecto bioqumico bsico y, en muchos casos, se ha aislado y clonado el gen responsable. Esto quiere
decir que existe informacin de algunos o varios de los tres niveles antes descritos, para multitud de trastornos
con herencia mendeliana.
Es precisamente esta elevada incidencia de errores congnitos del metabolismo lo que ha motivado la
aparicin de programas de cribado neonatal (newborn screening) en todos los pases desarrollados. Su objetivo
es diagnosticar lo ms precozmente posible la alteracin metablica, antes de que se manifieste en lesiones
irreversibles. Esta deteccin supone iniciar un tratamiento precoz y ms eficaz, tratando de favorecer el
desarrollo de una vida normal. Incluso en casos, como la fibrosis qustica, en los que la enfermedad no se
puede evitar, no slo se puede conocer anticipadamente sino que tambin es posible prevenir las infecciones o
tratar la insuficiencia pancretica.
24.7.4.2 Diagnstico de enfermedades polignicas

Cuando no basta con examinar la secuencia de una nica regin del genoma la mutacin en un solo gen
responsable de la enfermedad, sino que sta es el resultado de la confluencia de numerosas variaciones en
distintos genes que, adems, no determinan inequvocamente la situacin patolgica sino que contribuyen parcialmente o predisponen (factores de riesgo), el diagnstico gentico resulta, obviamente, ms
complejo. En estas situaciones, uno de los principales avances deriva de la aparicin de la tecnologa de
matrices, micromatrices y chips de DNA (pg. 172). La posibilidad de analizar una muestra del DNA genmico del paciente, o bien de los mRNA expresados en sus clulas (respectivamente, genoma y transcriptoma) en un nico ensayo contra todas las variantes gnicas (SNP o de otro tipo) cuya relacin
con la enfermedad ya se conoce supone un aporte de informacin impensable con los abordajes anteriores.
Como modelo de metodologas que permiten este tipo de planteamiento pueden citarse:
La sntesis, mediante qumica combinatoria sobre un chip de DNA, de colecciones de molculas de
oligonucletido con todas las secuencias posibles permite descubrir, sin informacin previa, secuencias
asociadas a enfermedades. Dichas secuencias pueden entonces buscarse en las bases de datos del genoma
para identificar su ubicacin y, posiblemente, el gen al que pertenecen.
La extraccin de mRNA de personas sanas y enfermas permite, mediante su anlisis comparado, encontrar
los genes que se expresan de forma diferente en la situacin patolgica, y utilizarlos despus para incluirlos
en matrices de DNA que permitan diagnosticar a pacientes potenciales.
Se han desarrollado ya varias micromatrices o chips de DNA para su uso en diagnstico, si no rutinario, al
menos regular. Por ejemplo:
Un chip para el diagnstico de la hipercolesterolemia familiar, que permite detectar ms de 250 mutaciones
que afectan a los genes del receptor de lipoprotenas LDL, de la apolipoprotena B y de la protena PCSK9,
que interviene en la homeostasis del colesterol.
Un chip para ayudar en la prediccin de la respuesta individual a frmacos, detectando variantes en ms de
30 genes y 90 polimorfismos SNP relacionados con enzimas que metabolizan los frmacos (enzimas de fase I,
como la familia del citocromo P450, y enzimas de fase II, implicadas en reacciones de conjugacin) o con
transportadores, receptores, etc.
Oncochips que incluyen fragmentos de entre 6.000 y 9.000 genes, seleccionados por su funcin directamente relacionada con procesos tumorales, por la alteracin de su expresin en las clulas cancerosas o por
su localizacin en regiones cromosmicas en las que se detectan alteraciones frecuentes. Estos chips son tiles
no slo para la deteccin temprana del cncer, sino particularmente para discriminar entre tipos y subtipos
de cncer cuya evolucin (por ejemplo, su potencial metasttico), pronstico clnico o respuesta a terapias
son diferentes.
Aunque en este caso no hay enfermedad, tambin existe un chip para el genotipado de grupos sanguneos de
cara a definir la compatibilidad entre donante y receptor (no slo de sangre, sino tambin para trasplante
de rganos). Se caracterizan en l 128 polimorfismos relacionados con 10 sistemas de grupos sanguneos,
lo que incluye para los que no se dispone de antisueros, y antgenos plaquetarios.
429
CAPTULO 25
Enfermedades moleculares
25.1 CONCEPTO Y CLASIFICACIN

25.2 ENFERMEDADES EXGENAS
25.3 ENFERMEDADES GENTICAS
25.3.1 Extensin y frecuencia de las
enfermedades genticas
25.3.2 Clasificacin de las enfermedades genticas
25.3.2.1 Tipo de clula que sufre la
alteracin
25.3.2.2 Producto gnico defectuoso que da lugar
al trastorno
25.3.2.3 Extensin de la alteracin
25.3.2.4 Tipo de cromosoma afectado
25.4 ENFERMEDADES MONOGNICAS
25.4.1 Ejemplos de enfermedades monognicas
25.4.2 Transmisin en familias
25.4.3 Clasificacin de los trastornos monognicos
25.4.3.1 Enfermedades autosmicas
dominantes
25.4.3.2 Enfermedades autosmicas recesivas
25.4.3.3 Enfermedades dominantes ligadas
al cromosoma X
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25.4.3.4 Enfermedades recesivas ligadas

al cromosoma X
25.4.3.5 Enfermedades ligadas al cromosoma Y
25.4.4 Enfermedades mitocondriales
25.5 ENFERMEDADES POLIGNICAS
O MULTIFACTORIALES
25.6 ENFERMEDADES CROMOSMICAS
O CITOGENTICAS
25.6.1 Introduccin
25.6.2 Clasificacin y nomenclatura
25.6.3 Cromosomopatas numricas
25.6.3.1 Euploida
a) Triploida
b) Tetraploida
25.6.3.2 Aneuploida
a) Mecanismo de generacin
de la aneuploida
b) Monosoma
c) Trisoma
25.6.3.3 Mixoploida
25.6.4 Cromosomopatas estructurales
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447
25.1 CONCEPTO Y CLASIFICACIN

Se admite hoy da que prcticamente todas las enfermedades tienen una causa molecular. Cualquier enfermedad, incluyendo las conocidas tradicionalmente, cursa en mayor o menor medida con alteraciones en la
estructura, propiedades, metabolismo o funcin de las biomolculas. Entre las causas que inducen la enfermedad se encuentran agentes fsicos, ambientales o no; agentes biolgicos como virus, bacterias, parsitos, etc., y
trastornos genticos, hormonales, inmunolgicos, nutricionales, etc. Todos ellos se traducen en disfunciones
celulares y tisulares, temporales o permanentes, cambios en el medio interno, variaciones en la funcin de
rganos y sistemas, y se reflejan, en ltimo trmino, en forma de enfermedad. Incluso las debidas a agentes
externos (traumatismos por accidentes, catstrofes, etc.), que obviamente se consideran de causa no molecular,
se convierten una vez iniciadas en enfermedades moleculares. De ah que un estudio moderno de la enfermedad
requiera la consideracin de los aspectos moleculares que acompaan a las observaciones clnicas y se
consideren vlidos, complementarios y no excluyentes los dos tipos de clasificacin de la enfermedad:
Las clasificaciones clnicas se basan en el diagnstico a partir de la observacin mdica (exploracin) con el
apoyo de los datos de laboratorio (magnitudes biolgicas, istopos, radiologa, etc.). Desde el punto de vista
gentico, se apoyan en un criterio fenotpico, la manifestacin bajo la forma de sndrome clnico. Este tipo de
estudio es exclusivo de los profesionales clnicos.
Las clasificaciones moleculares, o estudio de la enfermedad bajo un enfoque molecular, se basan exclusivamente en criterios genotpicos. Dependiendo de las causas que alteran la constitucin o la expresin del
genoma se distinguen tres tipos: exgenas, genticas o mixtas. Al no conocerse todava con precisin la causa
molecular de muchas enfermedades, estas clasificaciones son an imperfectas. Este tipo de estudio lo pueden
realizar hoy da diversos profesionales especializados en el rea de la biomedicina.
431
432
El objetivo de la patologa molecular es precisamente el conocimiento de la enfermedad desde el punto de

vista de su alteracin molecular, para contribuir al diagnstico y a la terapia. Empieza a observarse a comienzos
del siglo XX, al establecerse el trmino errores congnitos del metabolismo para describir las alteraciones
hereditarias, perennes durante toda la vida del paciente, que afectan a rutas especficas del metabolismo por
deberse a la ausencia o inactivacin de enzimas especficas (entre otras, albinismo, alcaptonuria, cistinuria y
galactosemia). El inicio real y sistemtico de la patologa molecular, que tiene lugar en las dcadas de 1940
y 1950, se desarrolla con las tcnicas de estudio de los cromosomas humanos y su papel en el desarrollo sexual y
en las anomalas cromosmicas relacionadas; en Espaa, la patologa molecular se introduce en la clnica en la
dcada de 1960. El rastreo de determinadas enfermedades en recin nacidos y la ayuda de nuevas tcnicas de
manipulacin y anlisis del DNA, a partir de la dcada de 1970, transform la gentica mdica. Al final de la
dcada de 1980 se haban recopilado ya varios miles de alteraciones genticas hereditarias distintas, casi
siempre con aumento o disminucin de la actividad de una enzima especfica. Bajo el trmino genmica se
incluye hoy da no slo el estudio del genoma, sino tambin la aplicacin de exmenes genticos para identificar
las alteraciones responsables de una enfermedad, detectar en una poblacin las personas con riesgo y as
contribuir al tratamiento de la enfermedad. De forma anloga, la protemica est reafirmando el papel que
desempearon las protenas, en solitario, en el inicio de la patologa molecular.
25:1
25.2 ENFERMEDADES EXGENAS

Se denominan as las enfermedades causadas por agentes externos al individuo, de cualquier tipo: intoxicaciones por productos qumicos, drogas o medicamentos, parsitos unicelulares o pluricelulares, toxinas
biolgicas, agentes infecciosos como bacterias y virus, etc. Tambin se incluyen las debidas a alteraciones
nutricionales (generalmente carenciales) y las causadas por priones (protenas de plegamiento anmalo capaces
de inducir el mismo en otras molculas de protena normal y por ello consideradas protenas infecciosas).
Ninguna de ellas se trata de forma especfica en esta obra.
25.3 ENFERMEDADES GENTICAS

Constituyen el grupo de enfermedades moleculares por excelencia. Para su inclusin en este grupo, la enfermedad ha de cumplir las siguientes caractersticas:
Debe estar determinada genticamente, es decir, deberse a mutaciones que alteran la secuencia, la
organizacin o la expresin del genoma codificante.
25. Enfermedades moleculares
Debe afectar a molculas en cantidad, estructura, actividad o funcin. En especial, se alteran las protenas, en
cantidad o en actividad.
La alteracin bioqumica causante de la enfermedad debe ser el resultado de las alteraciones en las molculas,
que afectan a estructuras celulares o vas metablicas en las que se encuentran implicadas.
25.3.1 Extensin y frecuencia de las enfermedades genticas

En cuanto a la extensin de la enfermedad, debe diferenciarse entre individuos portadores de defectos genticos,
en los que no se hace evidente la enfermedad por la existencia de un alelo sano que suple la funcin del gen
alterado, y enfermos o afectados por el trastorno gentico. Este ltimo caso corresponde a las enfermedades
genticas propiamente dichas, de gran relevancia globalmente a pesar de la baja frecuencia de cada una.
La frecuencia con la que aparece una enfermedad se expresa mediante dos magnitudes epidemiolgicas:
incidencia y prevalencia. La incidencia es la fraccin del nmero de casos respecto al nmero de individuos
nacidos vivos; puede resultar difcil de estimar si la enfermedad no se observa fsicamente o no se diagnostica en
el momento del nacimiento. La prevalencia, o frecuencia de casos en una poblacin de individuos vivos, es an
ms difcil de estimar, sobre todo cuando la poblacin es amplia y la enfermedad, infrecuente.
25.3.2 Clasificacin de las enfermedades genticas

Se pueden seguir varios criterios paralelos:
25.3.2.1 Tipo de clula que sufre la alteracin

Las enfermedades que se transmiten de generacin en generacin son de carcter hereditario debido a que se
originan por una alteracin en las clulas germinales (pg. 384). La alteracin de las clulas somticas no es
hereditaria ni afecta a todo el organismo, y da lugar a pocas enfermedades. Entre stas debe citarse el cncer
(Captulo 26), que se estudiar como ejemplo de enfermedad somtica, a la vez que de carcter mixto o
multifactorial.
25:2
433
434
25.3.2.2 Producto gnico defectuoso que da lugar al trastorno

Este criterio ha permitido estudiar numerosas enfermedades genticas y establecer las clasificaciones propias de
la patologa molecular tradicional, con muchas variantes segn el tipo de protena alterada.
La enfermedad se denomina disenzimia cuando se altera una enzima. Constituye el caso ms frecuente de
estudio de una va metablica alterada. Se modifican sus caractersticas cinticas o su regulacin (sensibilidad a activadores e inhibidores). Si disminuye la actividad, puede desaparecer el producto de la reaccin
catalizada y, como consecuencia, el producto final de la va metablica a la que pertenece la enzima, y
tambin puede acumularse el sustrato correspondiente o un precursor.
La anomala puede afectar a una protena implicada en procesos de transporte de molculas por el organismo (citosol, medio extracelular o sangre) o a travs de membranas (plasmtica o intracelulares).
Alteraciones de la biosntesis o la degradacin de otras protenas, a travs de mecanismos estructurales o
procesos metablicos, tales como transcripcin, procesamiento postranscripcional, traduccin, plegamiento, modificacin postraduccional, distribucin, agrupacin de subunidades, formacin de complejos
multiproteicos, etc.
Alteracin de protenas estructurales; por ejemplo, componentes de las fibras musculares o del tejido
conectivo.
Alteraciones de protenas implicadas en procesos de transmisin y transduccin de seales (hormonas,
factores de crecimiento, neurotransmisores y neuromoduladores, receptores de membrana o intracelulares,
etc.), en la homeostasis o en la defensa (inmunidad).
25.3.2.3 Extensin de la alteracin

Aunque el tamao de la alteracin no conduce a una clasificacin estricta este criterio, ya utilizado para
describir las mutaciones (pg. 384), es una simplificacin adecuada a efectos didcticos. Se distinguen tres
categoras de alteraciones genticas, y dentro de cada una se pueden considerar otros factores, como origen de
la alteracin, consecuencias funcionales, mecanismo patognico, producto gnico alterado y regin gnica
afectada.
La alteracin puntual, debida a la mutacin de un solo nucletido, da lugar a las enfermedades monognicas,
que se describen a continuacin.
Una alteracin mediana tiene lugar normalmente en secuencias repetidas, pero no se discutirn por ser poco
conocidas.
Las alteraciones a gran escala, cromosmicas o citogenticas afectan a cromosomas completos o a grandes
fragmentos cromosmicos. Su incidencia se ha estimado en un 0,65%. Se distingue entre anomalas numricas, es decir, en el nmero de cromosomas existentes en la clula debidas a segregacin cromosmica errnea (mutacin genmica) y anomalas estructurales o cromosomopatas debidas a reordenamientos cromosmicos. Se describirn ms adelante en este captulo.
25.3.2.4 Tipo de cromosoma afectado

Las enfermedades moleculares pueden afectar al genoma nuclear, caso ms frecuente por su mayor tamao, o
al genoma mitocondrial. Dentro de las nucleares, el defecto gentico puede estar localizado en los cromosomas
sexuales (1 par) o en los cromosomas autosmicos (22 pares). Esta distincin, combinada con el carcter
dominante o recesivo con el que se expresa la enfermedad, es la clasificacin ms sencilla, la empleada ms
comnmente en gentica, y se utilizar para describir la transmisin por herencia de las enfermedades
monognicas (pg. 436).
25:3
25.4 ENFERMEDADES MONOGNICAS

Se pueden considerar como modelo de enfermedades genticas, al ser las que se han estudiado mejor y con mayor
rigor a escala molecular. Se deben a una mutacin puntual que afecta a un nico gen, originando un alelo anormal.
La discusin se centrar en las alteraciones localizadas en el genoma nuclear, dejando el caso de las mitocondriales
para un apartado especfico. Si el alelo anormal aparece en los dos cromosomas homlogos, el individuo es
homocigtico para dicho alelo; si aparece slo en uno, con el alelo normal en el otro, el individuo es heterocigtico.
25.4.1 Ejemplos de enfermedades monognicas

Las alteraciones monognicas generan numerosas enfermedades. A ttulo meramente informativo pueden
citarse acondroplasia, albinismo, anemia de clulas falciformes (anemia drepanoctica o drepanocitemia),
daltonismo (discromatopsia, ceguera para algunos colores), deficiencias enzimticas de adenosina desaminasa,
antitripsina a1 (pg. 414), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, galactoquinasa, galactosa-1-fosfato uridililtransferasa (o UTP-hexosa-1-fosfato-uridililtransferasa, causante de la galactosemia, pg. 413) y fenilalanina-4-monoxigenasa (o fenilhidroxilasa, responsable de la fenilcetonuria), distrofia miotnica, distrofia
muscular de Duchenne, corea de Huntington, enfermedades de Charcot-Marie-Tooth, de Tay-Sachs, de
Von Gierke y de Wilson, mucoviscidosis (o fibrosis qustica, pg. 392), hemofilias, hipercolesterolemia familiar, neurofibromatosis de tipo I (pgs. 393 y 438), osteognesis imperfecta, retinoblastoma (pg. 470),
sndromes de Hunter y Hurler (mucopolisacaridosis II y I), sndrome del cromosoma X frgil, tumor de
Wilms, etc. La informacin actualizada y ms completa sobre caracteres mendelianos humanos (fisiolgicos
y patolgicos) se encuentra en el catlogo de McKusick (Mendelian Inheritance in Man), publicado cada 2
aos, y se centraliza en la base de datos en internet OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man); en ambos se
le asigna a cada gen un cdigo numrico de 6 dgitos.
25.4.2 Transmisin en familias

Puesto que los trastornos monognicos dependen del genotipo en un solo locus, sus patrones de herencia
familiar son muy sencillos; se llaman patrones mendelianos porque se ajustan a lo descrito por la primera ley de
Mendel (ley de la segregacin). Los dos homlogos de cada par de cromosomas del gametocito primario (2n,
4C) se separan o segregan en la meiosis I (pg. 106), de forma que cada cromosoma homlogo aparece en un
gameto secundario (n, 2C). En la meiosis II se separan al azar las dos cromtidas para formar los gametos (n, C).
Globalmente ha tenido lugar una distribucin independiente, aleatoria (pg. 107), de los cromosomas paternos y maternos y de sus cromtidas, con lo que cualquier individuo hereda de cada progenitor (y transmite
435
436
luego a cada descendiente) un cromosoma de cada par autosmico y un cromosoma sexual. Por tanto, slo se
transmite uno de los dos alelos del gen presente en cada locus.
Para establecer los patrones de herencia de estos trastornos se acude a la informacin facilitada por los
antecedentes familiares del paciente, que se resumen en forma de rbol genealgico. En ste se emplean una
nomenclatura y smbolos particulares:
Web 25.1. Simbologa empleada en los rboles genealgicos.
25.4.3 Clasificacin de los trastornos monognicos

Como se ha comentado (pg. 434), es comn clasificar las enfermedades monognicas de acuerdo con el tipo de
cromosoma afectado (sexual o autosmico) y el carcter dominante o recesivo (pg. 98) de su expresin. Si el
locus patolgico est situado en un cromosoma sexual, se habla de enfermedad ligada al sexo; en caso
contrario, de enfermedad autosmica.
Los caracteres autosmicos y los ligados al cromosoma X se pueden manifestar de forma dominante o
recesiva, mientras que los ligados al cromosoma Y no tienen esa doble posibilidad, pues slo existe un alelo en
cada individuo, que ha de manifestarse por s mismo, sin interaccin con un homlogo.
25:4
A continuacin se presentan los 5 tipos posibles de enfermedad monognica, de acuerdo con su patrn de
transmisin hereditaria.
25:5
437
25.4.3.1 Enfermedades autosmicas dominantes

El gen responsable, localizado en uno de los autosomas, posee un alelo patolgico (P) que es dominante sobre el
normal (n).
25:6
Estos trastornos constituyen cerca del 45% de las enfermedades monognicas. Aunque muchos son poco
comunes individualmente, son tan numerosos que su incidencia en conjunto es apreciable, y en ocasiones
especialmente alta en reas geogrficas especficas.
Ejemplos de enfermedades autosmicas dominantes

Enfermedad
Hipercolesterolemia familiar de tipo IIA
Protena afectada
Locus del gen
Receptor de lipoprotenas LDL
19p13.2
Corea de Huntington
Huntingtina
4p16.3
Neurofibromatosis de tipo I
Neurofibromina
17q11.2
Fibrilina1
15q21.1
Sndrome de Marfan
Descripcin
pg. 393
438
25.4.3.2 Enfermedades autosmicas recesivas

En este caso, el gen responsable, localizado en uno de los autosomas, posee un alelo patolgico (p) que es
recesivo con respecto al normal (N). En conjunto, este tipo de trastornos representa alrededor del 25% de las
enfermedades monognicas.
25:7
La anemia de clulas falciformes es un ejemplo tpico de trastorno autosmico recesivo que fue,
adems, la primera prueba experimental de una enfermedad causada por mutacin (en la dcada de
1950). El sndrome clnico es consecuencia de la alteracin de un nucletido en el gen de la globina b
(pg. 391), conduciendo a una protena bS. Los homocigotos para el gen de bS manifiestan el trastorno
(anemia), mientras que los heterocigotos bAbS se dice que muestran el rasgo falciforme: producen tanto
hemoglobina normal (A) como anmala (S), una parte de sus eritrocitos son falciformes y padecen una
anemia leve. Por tanto, la dominancia es incompleta. El diagnstico es sencillo, por ejemplo mediante
RFLP (pg. 418).
Ejemplos de enfermedades autosmicas recesivas

Enfermedad
Deficiencia de ADA
Protena afectada
Locus del gen
Adenosina-desaminasa
20q13.11
Descripcin
Antitripsina a1
14q32.1
pg. 414
Regulador de la conductancia
transmembranaria (CFTR)
7q31.2
pg. 392
Subunidad a de la isoenzima A de la
b-N-acetilhexosaminidasa
15q23-q24
pg. 391-392
Fenilalanina-4-monoxigenasa
12q24.1
Talasemia a
Globina a
16pter-p13.3
Talasemia b
Globina b
11p15.5
Enfisema hereditario
Mucoviscidosis (fibrosis qustica)
Enfermedad de Tay-Sachs
Fenilcetonuria
25.4.3.3 Enfermedades dominantes ligadas al cromosoma X

Las mujeres pueden ser homocigticas o heterocigticas para un gen que est situado en un locus del cromosoma X, pues tienen dos copias de este cromosoma sexual. Sin embargo los varones, al poseer un solo X,
no pueden ser homocigticos ni heterocigticos para ese gen o rasgo; se dice que el varn es hemicigtico.
Si el alelo patolgico (P) es dominante sobre el normal (n), las mujeres padecern la enfermedad tanto si
poseen uno como ambos alelos P, mientras que los varones la padecern si su nico alelo es P.
25:8
Para compensar la presencia de dos copias del gen en las mujeres (doble complemento), sus clulas slo
expresan los alelos de un cromosoma X (el otro est inactivado como heterocromatina, pgs. 88 y 285). En
consecuencia, las mujeres heterocigticas pueden estar o no afectadas, dependiendo de que se exprese el alelo
patolgico o el normal; en general, esta manifestacin es incluso diferente en unas clulas y otras, pues la
seleccin de cul de los cromosomas X resulta inactivado tiene lugar durante una etapa embrionaria temprana
pero multicelular y es aleatoria en cada una de sus clulas; una vez establecida la inactivacin, todas las clulas
descendientes posteriores mantienen la seleccin.
439
440
25.4.3.4 Enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X

Al ser en este caso dominante el alelo normal (N) sobre el patolgico (p), las mujeres padecen la enfermedad
slo cuando son homocigticas y, por tanto, con una frecuencia muy baja. Los varones la padecern, de forma
similar al caso anterior, cuando posean el alelo patolgico.
25:9
Como ejemplo caracterstico, la hemofilia A se debe a un defecto en el factor VIII de la coagulacin. El gen de
esta protena est situado en el cromosoma X (banda Xq28), por lo que la transmisin sigue el patrn ligado al
sexo. Se han identificado varias alteraciones distintas del gen que causan la enfermedad. Sus alelos se expresan de
forma recesiva con respecto al alelo normal del factor VIII, por lo que las mujeres sufren hemofilia con mucha
menor frecuencia que los varones (se suele decir que la hemofilia A slo la padecen los varones y no las mujeres,
pero esto no es exacto, como se discute a continuacin). La frecuencia de alelos patolgicos en la poblacin es de
alrededor de uno por cada 10.000 alelos normales, por lo que la incidencia en varones (hemicigticos para el gen)
es de 1/10.000. Las mujeres slo padecen la enfermedad cuando son homocigticas para alelos patolgicos, por lo
que la incidencia sera de 1/108; con una poblacin mundial de 7.000 millones, esto equivale a 35 casos vivos de
mujeres afectadas en todo el mundo, frente a 350.000 varones; de ah que se asuma que las mujeres no padecen la
enfermedad. En cualquier caso, s es relevante la frecuencia de mujeres portadoras, heterocigticas para el gen del
factor VIII, que pueden transmitir la enfermedad a sus hijos varones (1/10.000). Slo la descendencia de una
mujer portadora (XNXp) con un varn hemoflico (XpY) puede dar lugar a mujeres enfermas (XpXp).
Otros ejemplos de enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X son la distrofia muscular de Duchenne
(Xp21.2) y el daltonismo (Xq28).
25.4.3.5 Enfermedades ligadas al cromosoma Y

Se expone este caso por razones didcticas, a pesar de que apenas existen enfermedades ligadas a Y. (Algunas
variantes de retinitis pigmentaria se han asociado a la herencia del cromosoma Y. Ciertas patologas con
infertilidad estn ligadas a Y, pero ms que monognicas son anomalas cromosmicas de tamao mediano.)
La primera razn de su escasez es el pequeo tamao del cromosoma Y (en realidad, an menor, pues parte
del Y tiene regin homloga en el X y esos loci se comportan como los autosmicos); por ello, se conocen
escasos ejemplos de caracteres asociados a Y. La segunda razn es que para que exista una patologa debe haber
un gen cuya funcin sea importante y, teniendo en cuenta que las mujeres carecen de tales loci ligados al Y, no
podran desarrollar esa funcin.
Aparte de estas consideraciones, en el caso hipottico de una enfermedad o trastorno ligado al cromosoma Y,
las mujeres no padecern la enfermedad ni la transmitirn. Los varones la padecern siempre que tengan el
alelo patolgico (P) y la transmitirn a todos sus hijos varones. No tiene sentido el concepto de dominancia,
pues nunca coinciden dos alelos en la misma persona.
25:10
25.4.4 Enfermedades mitocondriales

Estrictamente, algunas enfermedades mitocondriales (es decir, donde se ve afectada la funcin de estos orgnulos)
estn causadas por defectos en la parte del genoma nuclear que codifica protenas mitocondriales. Sin embargo,
nos centraremos en aquellas cuya causa se encuentra en el genoma mitocondrial. La herencia mitocondrial es una
de las excepciones a los principios de transmisin mendeliana de las enfermedades monognicas. Esto se debe a dos
caractersticas peculiares: la herencia por lnea materna y la heterogeneidad gentica o heteroplasmia.
Herencia materna. Todos los individuos heredan el DNA mitocondrial (mtDNA) de su madre, ya que el
vulo es muy rico en mitocondrias (entre 100.000 y 300.000 por vulo), mientras que el espermatozoide tiene
muchas menos (unos cientos) y, adems, se degradan selectivamente tras la fertilizacin. Por tanto, una
mutacin patolgica en el genoma mitocondrial de una mujer se puede transmitir a toda su descendencia,
mientras que el varn en raras ocasiones transmite una mutacin anloga.
25:11
441
442
Heteroplasmia. Cada clula tiene varias mitocondrias, y cada una de stas, mltiples copias del mtDNA. Es
decir, en una clula hay muchas molculas independientes de mtDNA, que no siempre tienen exactamente la
misma secuencia, en especial debido a su elevada tasa de mutacin (pg. 416). Esta heterogeneidad del mtDNA
en cada clula, y tambin entre las distintas clulas de un individuo, se denomina heteroplasmia. Adems,
cuando la clula se divide por mitosis, sus mitocondrias se reparten de modo aleatorio entre las dos clulas hijas.
Como consecuencia de todo esto, la proporcin de genomas mitocondriales mutados respecto a los originales
es variable dentro de cada mitocondria, cada clula, cada tejido y cada individuo. Esto hace que la
manifestacin de la enfermedad asociada a la mutacin sea muy variable y complica los estudios clnico y
genealgico. Las enfermedades mitocondriales poseen sntomas muy variados, de gravedad diversa, y afectan a
distintos tejidos, incluso para una misma causa gentica.
Entre las enfermedades asociadas a mutaciones del DNA mitocondrial se pueden citar las siguientes:
Neuropata ptica hereditaria de Leber (LHON, NOHL). Fue la primera enfermedad en la que se demostr
la herencia por va materna de un defecto en el genoma mitocondrial.
Oftalmopleja externa progresiva crnica (CPEO).
Sndrome de Kearns-Sayre (KSS), una oftalmopleja externa con complicaciones varias.
Sndrome de epilepsia mioclnica asociada a fibras rojas rasgadas (MERRF).
Encefalomiopata mitocondrial con acidosis lctica e incidentes similares a apopleja (MELAS).
Adems, es probable la implicacin de mutaciones mitocondriales somticas o adquiridas como uno de los
factores que contribuyen al proceso de envejecimiento y a enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la
enfermedad de Alzheimer.
25.5 ENFERMEDADES POLIGNICAS O MULTIFACTORIALES

Muchas enfermedades genticas no estn causadas nicamente por el defecto de un gen y constituyen un grupo
de trastornos conocidos bajo nombres diferentes, de difcil delimitacin o caracterizados de forma incompleta:
enfermedades polignicas, multifactoriales, mixtas o complejas. A diferencia de las enfermedades monognicas,
la manifestacin clnica es un reflejo del efecto combinado o interaccin acumulativa de alteraciones producidas
por factores genticos (mltiples mutaciones, a veces simultneas en un nmero impreciso de genes), epigenticos
(modificaciones de la cromatina que varan la expresin gnica, pg. 282) y ambientales o exgenos (de todo
tipo: nutricional, agentes txicos, estrs, etc.). En cualquier caso, la complejidad del origen explica el conjunto de
efectos diversos producidos y los distintos nombres que reciben. Estas enfermedades multifactoriales no deben
confundirse con los trastornos cromosmicos (enfermedades genticas a gran escala, descritas ms adelante en
este captulo), aunque en ambas pueda tener lugar una alteracin compleja del genoma.
Al no ser trastornos de un gen nico, la herencia de estas alteraciones no sigue la gentica clsica mendeliana. A pesar de ello, s se observa una mayor transmisin de estas enfermedades dentro de una familia que
entre individuos no emparentados. Para que el sndrome se transmita a otro miembro de la misma familia es
necesario que se rena una combinacin de cambios gnicos.
Entre estas enfermedades pueden citarse varias malformaciones congnitas, como el labio leporino, las
cardiopatas congnitas y los defectos del tubo neural (anencefalia, espina bfida y otras), y ciertas enfermedades de la edad adulta, como algunos tipos de cncer y las enfermedades de las arterias coronarias, en las que
se ha observado una predisposicin gentica. De todas ellas slo se considerar aqu el cncer, la ms estudiada
desde el punto de vista molecular, adems de por su trascendencia clnica (Captulo 26).
25.6 ENFERMEDADES CROMOSMICAS O CITOGENTICAS

25.6.1 Introduccin
En los apartados siguientes se describirn las enfermedades cromosmicas, uno de los tipos de enfermedad
molecular (pg. 434). Como su nombre indica, se originan por la alteracin del nmero o la estructura de los
cromosomas; de ah que se denominen tambin alteraciones cromosmicas a gran escala, aberraciones,
trastornos o anomalas cromosmicas. Al poder observarse los cambios con el microscopio ptico, se las
considera tambin enfermedades citogenticas.
443
Son alteraciones espordicas y de baja frecuencia, que raramente se perpetan por ser casi incompatibles
con la supervivencia y la reproduccin. Sin embargo, cuando lo hacen muestran manifestaciones clnicas,
fsicas o psquicas muy graves, a veces dramticas, por lo que pueden considerarse las principales enfermedades
genticas. De hecho, son responsables de una gran proporcin de abortos espontneos, malformaciones
congnitas, retrasos mentales y tumores.
Como parte de las consecuencias de estas enfermedades, aparecen tambin alteraciones en el metabolismo y
en la sntesis o actividad de protenas. Estas variaciones bioqumicas pueden considerarse secundarias a la
enfermedad, a diferencia de las que aparecen en las enfermedades monognicas, pero son tambin objeto de
estudio de la patologa molecular.
Las alteraciones son mucho ms extensas que las producidas en los trastornos monognicos y polignicos, y
se caracterizan por grandes cambios en el nmero de nucletidos (miles o millones), en la estructura de los
cromosomas o en la reubicacin de genes por insercin o delecin, duplicacin, translocacin, inversin, etc.
Pueden afectar tanto a los autosomas como a los cromosomas sexuales; en ambos casos, pueden ser
constitutivas o adquiridas.
Son cromosomopatas constitutivas las que afectan a todas las clulas del organismo, por aparecer durante la
divisin meitica de las clulas germinales (gametognesis) o bien durante la primera divisin mittica del
cigoto. Como consecuencia, son las de mayor gravedad.
Las cromosomopatas adquiridas o somticas slo ocurren durante las mitosis poscigticas. Se inician, por
tanto, en clulas somticas, sin afectar a todas las clulas del organismo; de ah la menor gravedad (a veces
mnima) de sus consecuencias.
25.6.2 Clasificacin y nomenclatura
25:12
Entre los abortos por anomalas cromosmicas durante el primer trimestre de embarazo, el 96% se debe a
alteraciones numricas y el 4% a estructurales. De forma similar, en madres mayores de 35 aos, el 85% de los
abortos debidos a cromosomopatas corresponde a las anomalas numricas y el 15% a las estructurales.
En la descripcin de las anomalas cromosmicas, la nomenclatura utilizada se basa en la de la dotacin
cromosmica normal, que se expresa como 46,XY en clulas diploides del varn y 46,XX en la mujer. Se aaden
abreviaturas para expresar aspectos relativos a la morfologa del cromosoma o para indicar las causas de la
anormalidad. Los detalles de aplicacin de la nomenclatura se describen en cada anomala
46,XY
47,XXY
Clula masculina normal, diploide:

46 cromosomas, incluyendo un X y un Y
Un cromosoma X adicional
46,XX
69,XXX
Clula femenina normal, diploide:

46 cromosomas, incluyendo dos X
Clula femenina triploide
Brazo corto (pg. 89)
pat
Origen paterno
Brazo largo
mat
Origen materno
cen
Centrmero
dic
Cromosoma dicntrico
ter
Extremo (terminal, telmero)
der
Cromosoma derivado
del
Delecin
Isocromosoma
ins
Insercin
Cromosoma anular (ring)
dup
Duplicacin
mar
Cromosoma marcador
inv
Inversin
fra
Sitio frgil
Ganancia
Translocacin
rcp
Translocacin recproca
rob
Translocacin de Robertson
Rotura
Mosaicismo
::
Rotura y unin
Prdida
444
25.6.3 Cromosomopatas numricas

Tambin llamadas alteraciones genmicas, implican un cambio en el nmero de cromosomas, bien prdida o
ganancia, pero sin alteracin de la organizacin de los cromosomas. Son las anomalas ms frecuentes y se
originan en gran parte durante la divisin meitica (pg. 105), con lo que se transmiten tras la fecundacin a
todas las clulas del hijo o hija. En general son letales, e impiden que se supere el desarrollo embrionario, con
abortos espontneos tras la concepcin.
Las anomalas cromosmicas numricas se clasifican as:
Nombre de la anomala cromosmica
Euploida
(= x n)
Aneuploida
( x n)
Nuliploida
N. de
cromosomas
Ejemplos (humanos)
Eritrocitos y plaquetas
Haploida
(normal)
23,X
23,Y
Diploida
(normal)
2n
46,XY
46,XX
Poliploida
Triploida
3n
69,XXY
Tetraploida
4n
92,XXYY
xn
Nulisoma
Monosoma
Disoma
(normal, no es aneuploida)
2n-2
44,XY,21,21
2n-1
45,X
45,XX,18
47,XX,+21
2n
Trisoma
2n+1
47,XXY
Polisoma
2n+x
49,XXXXX
Mixoploida
Mezcla de dos poblaciones celulares con distinta

dotacin cromosmica
46,XX/47,XX,+8
Se habla de heteroploida en todas las situaciones en las que el nmero de cromosomas es diferente al normal.
25.6.3.1 Euploida
Recibe este nombre (del griego eu, bien, verdadero: ploida correcta o verdadera) la situacin en la que existe un
nmero entero de dotaciones cromosmicas haploides completas, es decir, el nmero de cromosomas es un
mltiplo de n. Para los casos con ms cromosomas de lo normal (2n) se habla de poliploida. En el extremo
opuesto se encuentran aquellas clulas diferenciadas como plaquetas y eritrocitos, que carecen de ncleo y se
dice que son nuliploides.
a) Triploida
Es la anomala en la que las clulas contienen 3 juegos cromosmicos (3n; en humanos, 3 23 = 69), que
incluyen 3 cromosomas sexuales. Es la poliploida ms comn, y llega a constituir el 2% de todas las
concepciones. Sin embargo, stas se suelen perder por aborto espontneo, por lo que la incidencia es muy baja.
25:13
b) Tetraploida
En este caso (4n, 4 23 = 92) la clula contiene dos dotaciones cromosmicas extras; son siempre 92,XXXX o
92,XXYY. Se origina usualmente por un fallo en la primera mitosis del cigoto: tras una replicacin normal del
DNA no se produce la divisin celular subsiguiente, la que debera formar las dos primeras clulas
embrionarias.
25:14
25.6.3.2 Aneuploida
Este nombre se aplica a las anomalas en las que se pierde el carcter euploide, es decir, el nmero de cromosomas
no es mltiplo del nmero haploide n. Ello se debe a la variacin del nmero de copias de un solo cromosoma, no
de juegos completos de cromosomas. En general, se presenta una copia de ms o de menos de un solo cromosoma,
especfico en cada alteracin, producindose, respectivamente, una trisoma (3 cromosomas homlogos) o una
monosoma (una sola copia, no hay homlogo). En consecuencia, la dotacin cromosmica total es de 2n + 1 o
2n 1 (respectivamente, 46 + 1 = 47 cromosomas en la trisoma humana y 46 1 = 45 cromosomas,
monosoma humana). El cromosoma extra se indica con un signo + y el ausente con un signo .
Son las anomalas numricas ms frecuentes y con relevancia clnica; aparecen en el 3-4% de los embarazos,
y se asocian con un desarrollo fsico o mental anmalos. En las clulas cancerosas tambin aparecen a menudo
aneuploidas extremas, con mltiples anormalidades cromosmicas. Cuando falta un par de homlogos, la
anomala es letal, y se denomina nulisoma; por ejemplo 44,XY,21,21 (varn) o 44,XX,21,21 (mujer).
a) Mecanismo de generacin de la aneuploida
La aneuploida se genera por una falta de disyuncin durante la meiosis, es decir, un fallo en la separacin
normal de un par de cromosomas o de cromtidas. Las consecuencias del proceso son diferentes dependiendo
de la divisin meitica (I o II) en la que se produzca el fallo.
La ausencia de disyuncin cromosmica durante la meiosis I hace que los dos homlogos del cromosoma
afectado pasen juntos a uno de los gametocitos secundarios, y el otro gametocito quede sin ese cromosoma.
Los 2(n 1) cromosomas restantes han sufrido la disyuncin normal y, por tanto, han separado sus
homlogos y cada gametocito secundario contiene n 1. En la subsiguiente meiosis II, con disyuncin
normal, se separan todas las parejas de cromtidas. Los gametos maduros tienen una cromtida (ahora
ya cromosoma hijo) de ms, o bien una de menos, siempre con los restantes n 1 cromosomas correctos.
La falta de disyuncin de las cromtidas del cromosoma afectado durante la meiosis II (tras una meiosis I
normal) hace que ambas pasen a un mismo gameto, que queda as con dos copias del cromosoma afectado,
mientras el otro no contiene ninguna; se forman tambin otros dos gametos normales. El resto de cromosomas (n 1) separan sus cromtidas correctamente.
445
446
25:15
b) Monosoma
Como se ha indicado, es la situacin en la que hay prdida de un solo homlogo de un par de cromosomas (en
total 2n 1, 45 en humanos). El ejemplo ms frecuente es el sndrome de Turner, una monosoma en
cromosomas sexuales, con cariotipo 45,X y, por tanto, fenotipo femenino. Se origina por la falta de
disyuncin de los cromosomas sexuales (casos nmero 4 y 7 en la figura; el cromosoma de color verde rayado
sera en este caso el X, procedente del gameto normal). Su incidencia es de 1 por cada 5.000 nias nacidas vivas
(la mayora de las concepciones se pierden antes del nacimiento). Otros casos con el mismo fenotipo son
mosaicos 45,X/46,XX o 45,X/46,XY (definidos a continuacin, pg. 447).
c) Trisoma
En este caso existe un homlogo adicional de uno de los cromosomas, es decir, 3 copias de dicho cromosoma
(en total 2n + 1, 47 en humanos). Puede afectar a cualquiera de los 23 pares. Existen varios ejemplos moderadamente frecuentes.
El sndrome de Down (originalmente denominado mongolismo) presenta en el 95% de los casos una copia
extra del cromosoma 21 (trisoma 21), por lo que existen tres homlogos de este cromosoma. La nomenclatura
es 47,XY, 21 para los varones y 47,XX, 21 para las mujeres. Se origina habitualmente por la falta de disyuncin
del cromosoma 21 (casos nmeros 3 y 6 en la figura; los cromosomas de color verde claro y oscuro seran los
homlogos 21). Es el tipo de trisoma ms comn. Presenta, entre otros sntomas, retraso mental moderado y
unos rasgos fsicos peculiares. No existe anomala alguna a nivel gnico. Una pequea parte de los casos de
sndrome de Down se originan por translocacin: si una parte del cromosoma 21 se fusiona con otro, en alguno
de los gametos existir un cromosoma 21 completo y una copia adicional de esa parte del 21.
Web 25.2. Mecanismos de generacin de trisoma 21.
El sndrome de Edwards es la trisoma 18, representada 47,XX,+18 (varn) y 47,XY,+18 (mujer), con una
incidencia de uno por cada 6.000 nacidos vivos.
El sndrome de Patau, o trisoma 13, tiene una incidencia de uno de cada 10.000 nacidos vivos. Pueden
sobrevivir a trmino, pero presentan malformaciones congnitas mltiples y graves. La nomenclatura es
47,XY,+13 (varn) y 47,XX,+13 (mujer).
El sndrome de Klinefelter, con una incidencia de uno por cada 1.000 nacidos vivos, es una trisoma en
cromosomas sexuales que produce varones 47,XXY. Con una incidencia parecida se encuentran tambin
trisomas 47,XXX (mujer) y 47,XYY (varn).
Se ha observado una clara correlacin entre la frecuencia de trisomas y la edad de la madre. Por ejemplo, el
sndrome de Down presenta una incidencia en promedio de uno por cada 800 nacidos vivos, pero la frecuencia
es de 1/400 en madres de 35 aos y 1/100 a los 40 aos. Las causas de esta correlacin no estn completamente
claras, pero debe recordarse (pg. 105) que cuando la mujer alcanza la pubertad todos sus oocitos primarios
estn ya formados y se mantienen detenidos en profase de la meiosis I hasta que llegan los estmulos hormonales
de la ovulacin; a mayor edad materna, ms tiempo han pasado los oocitos en ese estado latente y mayores son,
al parecer, las probabilidades de que la disyuncin de sus cromosomas se vea alterada.
25.6.3.3 Mixoploida
Recibe este nombre la situacin en la que el organismo contiene clulas con distinto nmero de cromosomas.
Aqullas constituyen dos (o ms) lneas celulares, cada una derivada de una clula troncal (o clula madre). Se
puede distinguir entre mosaico, cuando las dos lneas derivan de un solo cigoto, en general por mutacin en una
etapa inicial del embrin, y quimera, cuando el origen son dos clulas troncales independientes que se han
unido en un solo embrin. Como ejemplo, 46,XX/47,XX,+8 indica una mujer con dos poblaciones celulares,
una con cariotipo normal y otra con trisoma del cromosoma 8.
25.6.4 Cromosomopatas estructurales

Este segundo tipo de anomalas cromosmicas, menos frecuentes que las numricas, corresponde a cambios en
la estructura de uno o varios cromosomas, sin que se altere su nmero (46 en el ser humano). El cambio se debe
447
448
a la rotura del cromosoma, comnmente seguida de una reconstitucin de la molcula en una disposicin
diferente, anmala. Son particularmente frecuentes en la anemia de Falconi, la ataxia-telangiectasia y el
sndrome de Bloom.
La descripcin de los diferentes tipos de anomalas estructurales tiene en cuenta el nmero de puntos de
rotura del cromosoma y el carcter equilibrado (no hay prdida de material cromosmico) o bien desequilibrado (se pierde parte del cromosoma).
Web 25.3. Descripcin e ilustracin de las cromosomopatas estructurales.
CAPTULO 26
Bases moleculares del cncer
26.1 INTRODUCCIN
26.2 EL CNCER COMO ENFERMEDAD GENTICA
26.3 ETAPAS CARACTERSTICAS EN EL DESARROLLO
DEL CNCER
26.3.1 Tumor primario benigno
26.3.2 Cncer in situ
26.3.3 Tumor maligno o cncer propiamente dicho
26.3.3.1 Escape celular o invasividad
26.3.3.2 Vascularizacin o angiognesis
26.3.3.3 Formacin del tumor secundario
o metstasis
26.4 MECANISMOS DE TRANSFORMACIN
DE CLULA NORMAL EN TUMORAL
26.4.1 Equilibrio entre proliferacin y muerte celular
26.4.2 Genes responsables del cncer
26.4.2.1 Mutacin de protooncogenes:
oncogenes
a) Concepto
b) Tipos de protooncogenes
c) Caractersticas de la expresin
de los oncogenes
26.4.2.2 Mutacin de genes oncosupresores
a) Concepto
b) Tipos de genes oncosupresores
c) Caractersticas de la expresin
de los genes oncosupresores
26.5 CONTROL DE LA PROLIFERACIN
POR SEALES EXTRACELULARES
26.5.1 Tipos de seal
26.5.2 Transduccin de la seal extracelular al interior
26.6 REGULACIN DEL CICLO CELULAR
26.6.1 Puntos de control en el ciclo de divisin celular
26.6.2 Protenas que controlan el ciclo celular
26.6.2.1 Ciclinas
449
450
451
451
451
451
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26.6.3
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26.7
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456
26.8
26.9
458
458
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460
462
462
463
463
26.9.3
a) Ciclinas de la fase G1 o ciclinas

de inicio
b) Ciclinas mitticas o de la fase G2
26.6.2.2 Protena quinasas dependientes
de ciclinas (Cdk)
26.6.2.3 Actividad de los complejos Cdk-ciclina
Regulacin del ciclo celular por los complejos
Cdk-ciclina y alteraciones en el cncer
26.6.3.1 Estmulos de progresin por el ciclo celular
y oncogenes que los alteran
26.6.3.2 Estmulos de detencin del ciclo celular
26.6.3.3 El gen supresor del retinoblastoma (Rb)
26.6.3.4 El gen oncosupresor p53
APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA
26.7.1 Etapas y control del proceso de apoptosis
26.7.1.1 Induccin
26.7.1.2 Ejecucin
a) Proteasas: caspasas y su papel
en el control de la apoptosis
b) Nucleasas
26.7.1.3 Fase final de la apoptosis
26.7.2 Relacin entre ciclo celular y apoptosis: p53
como punto de enlace
HERENCIA DEL CNCER
MARCADORES TUMORALES
26.9.1 Alteraciones locales y generalizadas
26.9.2 Alteraciones tumorales y tisulares
26.9.2.1 Marcadores tumorales
a) Marcadores tumorales de secrecin
o marcadores ''clsicos''
b) Citocinas o mediadores solubles
de origen celular
26.9.2.2 Marcadores tisulares
Marcadores genotpicos o moleculares
463
464
464
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478
478
479
26.1 INTRODUCCIN
El cncer, neoplasia o tumor puede considerarse una enfermedad gentica (vase la clasificacin molecular de
las enfermedades en pg. 432) que se desarrolla en organismos superiores, en la mayora de los tejidos y en
todo tipo de clulas somticas (como excepcin, tambin en las clulas germinales en el caso de cnceres
hereditarios, pg. 475). Actualmente se considera que tambin existe en el cncer una contribucin importante
de alteraciones epigenticas (pg. 287).
Bajo el nombre genrico de cncer se engloba un conjunto de enfermedades que tienen en comn un
crecimiento celular desordenado (tumor) y una colonizacin tisular (metstasis), todo ello determinado por
la acumulacin de mutaciones en el genoma y por la alteracin de las marcas epigenticas. Cada cncer es una
situacin distinta con peculiaridades dependientes del tipo de clula donde se origina, sus causas (etiologa) y su
449
450
mecanismo, el grado de malignidad y otros factores. Por consiguiente, se diferencia claramente de otras
enfermedades genticas, en especial las monognicas y las anomalas cromosmicas (Captulo 25), y se
distingue de las enfermedades multifactoriales (pg. 442) por la necesidad de que en stas exista una confluencia de factores genticos y ambientales para iniciar la enfermedad. Al igual que todas las enfermedades
moleculares, el cncer se manifiesta en alteraciones bioqumicas diversas en las clulas y tejidos y, en particular,
por la aparicin de marcadores tumorales y tisulares (pg. 475).
Es, posiblemente, la enfermedad estudiada ms intensamente y desde ms puntos de vista diferentes, y se ha
pasado en los ltimos aos de un conocimiento casi nulo a un gran avance en numerosos aspectos moleculares,
desde los que explican la proliferacin excesiva y la prdida de clulas por apoptosis (muerte celular) hasta los
mecanismos por los que el cncer genera las metstasis. Nuestro objetivo es presentar una visin global e
integrada de todos esos aspectos, que ya han beneficiado a la biologa molecular bsica y son necesarios para
comprender las aplicaciones, presentes y futuras, en especial para configurar una creciente capacidad clnica en
cuanto a pronstico, diagnstico y tratamiento. Las primeras terapias desarrolladas, mediante frmacos para el
tratamiento del cncer por quimioterapia, se complementan ya y lo harn ms en el futuro con las que van
dirigidas a inhibir de manera especfica la angiognesis, la metstasis y la apoptosis, as como con la inhibicin
de enzimas responsables de las modificaciones epigenticas de la cromatina. Adems, sigue vigente la expectativa de desarrollar acciones ms especficas sobre los genes alterados utilizando la terapia gnica.
26.2 EL CNCER COMO ENFERMEDAD GENTICA

La participacin de los genes en la carcinognesis puede seguir dos tipos de mecanismo:
Muchos cnceres se deben a cambios genticos inducidos por mutaciones. La clula inicial afectada se divide
con mayor rapidez de lo normal y, si no existe un control de ese crecimiento, llega a formar un tumor
primario en el tejido circundante (neoplasia) o un tumor secundario (metstasis) en tejidos lejanos.
Por otro lado, tambin es frecuente la contribucin de los cambios epigenticos, que afectan a la expresin de
algunos genes y pueden no slo permanecer durante toda la vida de la clula, sino tambin transmitirse
cuando sta se divide e, incluso en el caso de las clulas germinales pasar a la descendencia (dado que, por
definicin, las marcas epigenticas son heredables, pg. 282).
Las mutaciones del genoma responsables de la enfermedad las producen agentes cancergenos, de muy
variadas naturaleza y caractersticas (pg. 396), as como errores espontneos o inducidos en la replicacin y
reparacin del DNA; por ello, el anlisis de la carcinogenia se hace a la luz del efecto mutgeno. Se conocen bien
como causa de cncer las mutaciones que afectan esencialmente a genes de dos tipos: los protooncogenes y los
genes oncosupresores (o genes supresores de tumores). Esto justifica una de las caractersticas del cncer, el ser
una enfermedad polignica, lo que no debe confundirse con su carcter monoclonal (pg. 451). Como
resultado de la mutacin, los genes expresan protenas alteradas, sobreexpresan las normales o no las expresan,
segn los casos; cualquiera de estos efectos modifica funciones de la clula tan bsicas como el control de su
divisin (pg. 462), lo que se manifiesta en una proliferacin excesiva y continua o en una reduccin de la
muerte celular programada o apoptosis (pg. 472). De forma alternativa o sinrgica, las alteraciones en
la regulacin epigentica de esos mismos genes har que, aunque no hayan sufrido mutaciones, se vea alterada
su expresin, conduciendo a resultados similares.
26:1
26. Bases moleculares del cncer
26.3 ETAPAS CARACTERSTICAS EN EL DESARROLLO DEL CNCER

El cncer, una vez originado, se manifiesta de forma variable segn las circunstancias, el tipo de cncer, la edad
del individuo, etc. A grandes rasgos, su desarrollo suele agruparse en tres fases, con posibles subetapas de difcil
delimitacin: la formacin del tumor primario benigno, su progresin in situ y la invasin y aparicin de
metstasis o tumor maligno.
26.3.1 Tumor primario benigno

Esta primera etapa del desarrollo del tumor, denominada tumorognesis, carcinognesis tumoral o
transformacin neoplsica, es la ms estudiada y la mejor conocida. Se inicia con la llamada clula progenitora del cncer, que surge en un determinado tejido por una mutacin en algn gen (pg. 450). Su
proliferacin da lugar a un clon (pg. 193) de clulas mutadas, un clon neoplsico. Este comienzo monoclonal
es la primera caracterstica del cncer, que lo diferencia de las enfermedades multifactoriales (pg. 442);
a pesar de ese origen comn, las clulas del clon inicial se hacen genticamente distintas por la acumulacin
de nuevas mutaciones. As, la mutacin iniciadora confiere a la clula la susceptibilidad tumoral, una
predisposicin selectiva para la proliferacin desmedida. La acumulacin en las clulas hijas de sucesivas
mutaciones en genes implicados en el control del ciclo celular o de la apoptosis, que favorezcan la proliferacin
o la inmortalidad, conduce de forma progresiva a las propiedades genticas anormales del cncer.
Web 26.1. Eventos en la generacin del cncer.
26.3.2 Cncer in situ

Corresponde a la situacin en la que las clulas del tumor primario no han escapado del tejido donde se
originaron. Puesto que el tumor carece de capacidad invasiva, el pronstico clnico es en general benigno y con
frecuencia puede corregirse por simple extirpacin quirrgica. Slo resulta grave si por su localizacin afecta a
vasos sanguneos, msculos o nervios crticos, en cuyo caso, aun sin ser formalmente un cncer, podra
considerarse como una neoplasia maligna.
26.3.3 Tumor maligno o cncer propiamente dicho

La etapa que define y caracteriza el cncer, responsable de la conversin de la clula neoplsica en cancerosa, es
su progresin o propagacin tumoral. Puede dividirse en varias subetapas, de difcil subordinacin.
26.3.3.1 Escape celular o invasividad

Las clulas constituyentes de tejidos normales se mantienen doblemente adheridas entre s gracias a uniones
intercelulares y a uniones de las clulas con el espacio o matriz extracelular. sta es una estructura formada por
fibrillas de protenas fibrosas (colgeno y elastina), secretadas por las propias clulas, que actan a modo de
soporte para empaquetar o separar las clulas o para proporcionar elasticidad o fuerza de sostn. En estas
interacciones intervienen protenas transmembranarias, llamadas integrinas, de varios tipos; entre ellas, la
mejor descrita es la fibronectina. Por su dominio intracelular, las integrinas se unen a los filamentos de actina
del citoesqueleto de cada clula, mientras que a travs de su dominio extracelular tienen afinidad por protenas
receptoras de las clulas vecinas (adhesin clula-clula) y por protenas fibrosas de la matriz extracelular
(adhesin clula-matriz).
Ambos tipos de adhesin se ven alterados en el cncer y, como consecuencia, la clula puede desprenderse
del tejido, convirtindose en una clula invasora de otros tejidos. La liberacin de las clulas es consecuencia
tambin de la accin de enzimas proteolticas o proteasas, especficas, que destruyen la matriz extracelular, y
permiten que sea atravesada por la clula despegada de sus vecinas. Entre ellas destacan las denominadas
metaloproteasas de matriz extracelular (MMP), que degradan casi todos los componentes de la matriz extracelular, por lo que intervienen en procesos fisiolgicos de remodelacin tisular, como desarrollo embrionario,
451
452
crecimiento seo y cicatrizacin de heridas. La actividad proteasa aumenta sobre todo en las neoplasias
malignas, posiblemente como consecuencia de un aumento de la biosntesis de estas enzimas. En consecuencia,
la inhibicin de las proteasas adquiere inters con fines teraputicos, para el tratamiento del cncer. Algunos de
estos inhibidores actan sobre la activacin de las proteasas a partir de sus precursores inactivos (proenzimas o
zimgenos, pg. 370), mientras que otros bloquean directamente la accin de la proteasa activa.
26.3.3.2 Vascularizacin o angiognesis

Este proceso consiste en la capacidad de un tejido para formar una red vascular propia mediante el desarrollo
de nuevos vasos sanguneos. Las clulas tumorales producen agentes angiognicos que actan sobre clulas
endoteliales vecinas para dar lugar a la formacin de una nueva red de venas, arterias y capilares. Ello permite
que el tumor crezca mucho y muy rpidamente, al asegurar la llegada de oxgeno y nutrientes; la
vascularizacin puede, asimismo, favorecer la migracin de algunas clulas cancerosas al torrente circulatorio
para difundirse a otros tejidos, donde generarn una metstasis. La angiognesis es una de las dianas de los
tratamientos contra el cncer, haciendo uso de la existencia de protenas que inhiben el proceso, como
endostatina y angiostatina.
26.3.3.3 Formacin del tumor secundario o metstasis

Mediante la invasin o diseminacin celular, las clulas del tumor primario pueden fijarse en tejidos normales,
para multiplicarse y diferenciarse en ellos, dando lugar al llamado tumor secundario o metstasis. Esta etapa es
de enorme gravedad clnica y constituye la nota distintiva letal, irreversible, del tumor maligno, porque supone
la destruccin del tejido sano que rodea a las clulas tumorales y la consiguiente dificultad de eliminacin por
intervencin quirrgica.
26.4 MECANISMOS DE TRANSFORMACIN DE CLULA NORMAL EN TUMORAL

26.4.1 Equilibrio entre proliferacin y muerte celular
La vida media de la clula, o perodo de tiempo transcurrido desde su formacin hasta su destruccin, es muy
variable (desde horas hasta aos). Las clulas mantienen controlada esta capacidad intrnseca de crecimiento
tanto en la embriognesis y el desarrollo como a lo largo de la vida del individuo adulto. Algunas, como las
precursoras hematopoyticas o las epiteliales, con vida media muy corta, experimentan una proliferacin
constante para dar lugar a otras muchas clulas; otras, como las neuronas, dejan de dividirse una vez diferenciadas. Salvo stas, todas las clulas se renuevan continuamente en un proceso de recambio celular. En
condiciones fisiolgicas se requiere una estricta regulacin gentica para mantener esta homeostasis o equilibrio
celular de forma adecuada a las necesidades de cada tejido, mediante la contraposicin de dos procesos:
La formacin por mitosis de nuevas clulas (parte del ciclo de divisin celular, Captulo 8) determina la tasa
de proliferacin. Se asocia a un proceso simultneo de diferenciacin celular, particular para cada tejido o
estado del desarrollo (aspecto que no se considera en esta obra). El control de la proliferacin comprende dos
grandes aspectos, relacionados pero generalmente no considerados de la forma global necesaria para
facilitar su comprensin: las seales extracelulares (pg. 458) y la regulacin del ciclo celular (pg. 461).
La apoptosis, muerte celular programada o suicidio celular es un mecanismo fisiolgico de eliminacin
de clulas al final de su vida activa, como parte del recambio celular necesario para contrarrestar la
formacin continua por divisin celular. Asimismo, interviene en la formacin de tejidos (por ejemplo,
clulas del cristalino y de la piel), en la morfognesis (por ejemplo, formacin de los dedos) y en la
eliminacin de clulas con dao gentico. Los detalles de la apoptosis se analizan posteriormente (pg. 472).
La alteracin del equilibrio en condiciones patolgicas (neoplasias) da lugar a un crecimiento incontrolado,
que puede deberse a una excesiva proliferacin o a una reducida muerte celular. Parece que habitualmente el
cncer se origina por una conjuncin de ambas causas.
26:2
453
454
26.4.2 Genes responsables del cncer

Las mutaciones, presentes en las clulas cancerosas, que provocan la aparicin de las caractersticas
tumorales afectan a genes cuyos productos proteicos regulan la proliferacin celular, la apoptosis o la
senescencia celular (envejecimiento). La proliferacin y la apoptosis se estudiarn progresivamente en este
captulo, en el que se describen tanto los mecanismos normales de regulacin como sus alteraciones conducentes al cncer.
En primer lugar, debe definirse la existencia de dos tipos de genes cuya alteracin se relaciona con el proceso
canceroso: oncogenes y genes oncosupresores (y sus productos respectivos, oncoprotenas y protenas oncosupresoras).
26.4.2.1 Mutacin de protooncogenes: oncogenes

a) Concepto
Recibe el nombre de oncogn la forma mutada de un gen normal o protooncogn que causa cncer como
consecuencia de una ganancia de funcin de la protena expresada por el gen. El protooncogn codifica una
protena normal, generalmente relacionada con la proliferacin celular o la apoptosis, que acta slo cuando
recibe seales reguladoras especficas. Por el contrario, la forma mutada u oncogn expresa una protena anormal
(oncoprotena) que se mantiene activa con independencia de las seales reguladoras, por lo que el resultado es una
ganancia de funcin de la protena. Se puede decir, en consecuencia, que los oncogenes son el resultado de
una mutacin activadora de la funcin normal de los protooncogenes. sta conduce, segn los casos, a una
proliferacin descontrolada o a una apoptosis reprimida y, en definitiva, a la aparicin del cncer.
26:3
b) Tipos de protooncogenes
Se han identificado protooncogenes que codifican protenas muy diversas:
Factores estimuladores del crecimiento celular. La mutacin oncognica origina una produccin excesiva del
factor proteico o una mayor actividad de ste.
Ejemplo: el protooncogn sis codifica la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).
Receptores de factores de crecimiento o de hormonas, presentes en la membrana o dentro de la clula. Para el
caso de un factor de crecimiento u hormona estimuladores de la proliferacin, la forma oncoproteica del
receptor puede ser aquella con una conformacin que la mantiene activa, aunque no se le una el ligando. Si se
trata del receptor de un factor u hormona inhibidores del crecimiento, la oncoprotena es la que no responde
a la unin del ligando.
Ejemplo: el protooncogn erbB codifica el receptor de membrana para el factor de crecimiento epidrmico
EGF.
Protenas
citoplasmticas que intervienen en los sistemas de transduccin de seales. La mutacin hace que el
oncogn exprese una protena que se mantiene activa sin necesidad de que le llegue la seal.
Ejemplo: el protooncogn ras codifica una protena G monomrica (pg. 460).
Factores de transcripcin (pg. 288) que controlen la expresin de genes que codifican a su vez protenas
implicadas en la sealizacin, el control del ciclo celular o la apoptosis.
Ejemplos: protooncogenes fos, jun y myc.
El protooncogn erbA codifica el receptor intracelular para hormonas tiroideas, que es un factor de
transcripcin.
Finalmente, protenas responsables de la activacin directa del ciclo celular (tales como las ciclinas o las
quinasas y fosfatasas activadoras de las Cdk, pgs. 463-464) o de la inhibicin de la apoptosis (pg. 474).
Los oncogenes respectivos expresan protenas en mayor cantidad o con funcin aumentada.
Ejemplos: el protooncogn bcl-1 codifica la ciclina D1.
El protooncogn cdk1 codifica la quinasa dependiente de ciclina Cdk1 (pg. 465).
El protooncogn mdm-2 codifica un antagonista de la protena p53 (pg. 471).
El protooncogn bcl-2 codifica una protena mitocondrial que bloquea la apoptosis al inhibir las caspasas
(pgs. 473-474).
26:4
455
456
c) Caractersticas de la expresin de los oncogenes

Puesto que existe ganancia de funcin en la oncoprotena, basta con que est mutado uno de los dos alelos del
protooncogn para que se exprese el efecto de la oncoprotena anormal. En consecuencia, los oncogenes se
expresan con carcter dominante (pgs. 100 y 437), y los individuos heterocigticos para un oncogn
(genotipo protooncogn-oncogn, o nP) sufren sus efectos de forma similar a los homocigticos (genotipo
oncogn-oncogn, o PP). La herencia del oncogn concordar con este carcter, pero slo si la mutacin del
protooncogn afecta a clulas germinales (pg. 475).
26.4.2.2 Mutacin de genes oncosupresores

a) Concepto
Al igual que los protooncogenes, se trata de genes que causan cncer como consecuencia de una mutacin
experimentada por la forma normal, denominada gen oncosupresor, gen supresor de tumores o antioncogn
(porque su accin es contraria a la de los oncogenes, aunque la ejercen por un mecanismo distinto). La forma
normal del gen (gen oncosupresor) codifica una protena normal (protena oncosupresora o antioncognica)
que acta deteniendo la proliferacin o bien induciendo la apoptosis. Cuando una mutacin del gen
conduce a la sntesis de una protena no funcional o impide esa sntesis (prdida de funcin), la proliferacin deja de estar controlada o la apoptosis nunca tiene lugar, por lo que aparece una proliferacin
excesiva, a menudo con acumulacin de daos genticos en las clulas. Dicho de otro modo, la versin
mutada de un gen oncosupresor pierde su funcin normal, reguladora de la proliferacin, y da lugar al
cncer.
26:5
b) Tipos de genes oncosupresores

Al igual que los protooncogenes, los genes oncosupresores codifican protenas que actan en distintos puntos
de las rutas de sealizacin, del control del ciclo celular y de la apoptosis:
Factores inhibidores del crecimiento celular. La mutacin del gen oncosupresor correspondiente anula la
funcionalidad de la protena sintetizada.
Ejemplo: el gen oncosupresor dcc codifica una protena de adhesin celular, ausente en el carcinoma de
colon.
Receptores de esos factores inhibidores o de hormonas que frenan el crecimiento celular. La forma mutada
del gen oncosupresor codifica un receptor insensible a su ligando o que no transmite la seal al interior de la
clula.
Ejemplo: el gen oncosupresor que codifica el receptor de membrana para el factor b de crecimiento
transformante, TGF-b.
Protenas
citoplasmticas que intervienen en los sistemas de transduccin de seales acoplados a los recep
tores anteriores. La situacin vara segn cul sea la funcin concreta de la protena.
Ejemplo: el gen oncosupresor nf1 codifica la neurofibromina, protena que estimula la actividad GTPasa
de Ras, en consecuencia inactivando sta (pg. 460). En la enfermedad de Recklinghausen, el gen nf1
est mutado (pg. 393), por lo que la neurofibromina es defectuosa, la protena Ras no libera el GTP y
queda en forma activa ms tiempo del normal, aumentando la proliferacin.
Factores de transcripcin que dirijan la expresin de genes cuyos productos proteicos frenan el ciclo celular o
producen apoptosis. La forma mutada del gen oncosupresor expresa una protena no funcional.
Ejemplos: los genes oncosupresores Rb y p53, que se estudian en detalle ms adelante (pgs. 470471).
Protenas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis. El gen mutado no expresa la protena o da lugar a
una forma no funcional.
26:6
457
458
c) Caractersticas de la expresin de los genes oncosupresores

A diferencia de los oncogenes, en los que un solo alelo mutante afecta al fenotipo de la clula, la prdida de la
funcin de un gen oncosupresor slo se produce cuando han mutado los dos alelos (individuos homocigticos,
genotipo oncosupresor mutado-oncosupresor mutado, o pp). Es decir, la forma mutada de un gen oncosupresor se expresa con carcter recesivo (pgs. 100 y 438). Esto es as puesto que la mutacin produce prdida
de funcin en la protena, pero las molculas de protena sintetizadas a partir del alelo normal pueden suplir esa
carencia, al menos parcialmente. Al igual que en el caso de los oncogenes, la herencia de los genes oncosupresores mutados es la correspondiente a su carcter recesivo, pero slo tiene lugar cuando la mutacin ha
afectado a clulas germinales (pg. 475).
La probabilidad de mutacin somtica en los dos alelos de una misma clula es baja, por lo que la
homocigosis generada de novo es muy infrecuente; sin embargo, los individuos heterocigticos en un gen
oncosupresor (que han heredado un alelo mutado) tienen predisposicin a la aparicin de cncer, ya que slo
necesitan una mutacin somtica en el otro alelo para perder totalmente la funcin de la protena oncosupresora.
26:7
Corresponde estudiar a continuacin con detalle las tres rutas que regulan la proliferacin celular y cuya
alteracin conduce a cncer:
1. La transduccin de seales extracelulares al interior celular hasta conectar con el ciclo celular.
2. La regulacin del ciclo celular (proceso estudiado previamente en el Captulo 8).
3. La apoptosis o muerte celular programada.
26.5 CONTROL DE LA PROLIFERACIN POR SEALES EXTRACELULARES

La sealizacin iniciada por molculas externas a la clula constituye, en general, el mecanismo de control de la
proliferacin celular, desencadenante de la regulacin del ciclo celular por otras molculas intracelulares. Los
mecanismos mediante los cuales las seales extracelulares dan lugar a una respuesta en el interior de la clula se
conocen genricamente como transduccin de la seal, constituyen un rea de gran significado en biologa
celular e intervienen no slo en el control de la proliferacin celular, sino tambin en la respuesta fisiolgica a
una gran cantidad de sustancias, como parte esencial de la funcin de los distintos tipos celulares. Se estudian
aqu, de forma sucinta, las seales procedentes del exterior que van a determinar las respuestas intracelulares
que regulan en ltimo extremo el ciclo celular y, con ello, la tasa de proliferacin. Aunque se conocen tambin
como seales mitgenas, debera reservarse este trmino para las sustancias que actan estrictamente sobre la
mitosis.
459
26.5.1 Tipos de seal

Las seales que favorecen la actividad del ciclo celular se conocen como positivas o estimuladoras. Existen
tambin seales extracelulares negativas o inhibidoras, que actan frenando la actividad del ciclo. En ambos
casos, son muy variados los tipos y caractersticas de las molculas que al incidir sobre su clula diana actan
como seal, a travs de su interaccin con receptores especficos.
Tipos de sealizacin
Por molculas secretadas
Sealizacin autocrina
La diana es la propia clula secretora
Sealizacin paracrina
La clula secretora y la clula diana son adyacentes
Sealizacin endocrina
(u hormonal)
La clula secretora y la clula diana estn alejadas; la molcula seal

(hormona) se transporta por la sangre
Sealizacin intracrina
La molcula seal interacciona con un receptor intracelular en la propia

clula
Sealizacin sinptica
La molcula seal (neurotransmisor) es secretada por una neurona e

interacciona con el receptor en otra neurona o en una clula muscular que
estn en estrecha proximidad (sinapsis)
Por molculas unidas a la

membrana (sealizacin
yuxtapuesta o yuxtacrina)
Interaccin directa de molculas de membrana con receptores de membrana

de la clula diana
Por uniones comunicantes
Conexiones directas entre el citoplasma de las dos clulas
Molculas seal
Factores de crecimiento
Ejemplos
Factor de crecimiento epidrmico (EGF) y factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF)
Hormonas
Pptidos y protenas
Esteroides
Derivados de aminocidos
Neurotransmisores
Otros
Hormonas pancreticas insulina y glucagn

Hormonas adrenales y sexuales
Hormonas tiroideas
Glutamato, g-aminobutirato (GABA), dopamina, serotonina, acetilcolina,
etc. (slo son relevantes en las neuronas)
Nucletidos, retinoides, derivados de cidos grasos, xido ntrico,
monxido de carbono, etc.
Tipos de receptor
Intracelulares
De superficie celular
Con actividad enzimtica
intrnseca
Asociados a canales inicos
Protenas situadas en citosol y ncleo, que unen molculas seal hidrfobas

Protenas integrales de membrana, que unen molculas seal hidrfilas
Ejemplo: tirosina quinasas, como el receptor de PDGF y el de insulina
Ejemplo: receptor de acetilcolina
Asociados a enzimas
Ejemplo: receptor de la hormona de crecimiento
Asociados a protenas
G trimricas
Ejemplos: receptores de adrenalina y de glucagn. Las protenas G estn

acopladas, a su vez, a canales inicos o a enzimas
460
26.5.2 Transduccin de la seal extracelular al interior

Aunque, como se ha indicado, existen muchas posibilidades de transmisin de la seal, por simplicidad la
descripcin se centrar en el mecanismo de activacin en el que interviene la protena Ras, causante de
numerosos procesos cancerosos. Su activacin es un paso esencial en la transduccin de seales producidas
por muchos factores de crecimiento.
26:8
1. La molcula seal acta como ligando al interaccionar con gran afinidad y de modo reversible con el dominio
extracelular de una protena receptora especfica, cuyo dominio transmembranario hidrfobo est insertado
en la bicapa lipdica. El nmero de receptores de un tipo concreto en cada clula es muy variable, desde
cientos a millones. En el caso de la ruta que activa a Ras, la seal procede de diversos receptores: para el factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidrmico (EGF), la insulina, etc.
2. Al unirse el ligando al receptor, ste se estimula. En el caso del receptor de PDGF, forma un dmero y se activa
una actividad intrnseca como quinasa de protenas, concretamente del tipo tirosina quinasa (pg. 360 y
web 22.4), con lo que fosforila, con gasto de ATP, el dominio intracelular propio o bien otras protenas.
3. El paso siguiente, que llamaremos primera cascada de transmisin de la seal, puede realizarse por varias
vas en las que, en general, se producen modificaciones en la conformacin de una protena que a su vez
permiten la interaccin con otras protenas adaptadoras o su fosforilacin.
4. La propagacin de la seal contina mediante la activacin de la protena Ras, una protena G monomrica
(tambin llamada p21Ras, por su masa de 21 kDa). Las protenas G actan en numerosos procesos
como interruptores moleculares, al poder pasar de su forma inactiva, unida a GDP, al estado activo,
unida a GTP (vanse, como ejemplo, algunos factores de traduccin: eIF-2, eEF-1A, eEF-2, eRF (pgs. 336,
338 y 341). En este caso, el complejo activo Ras:GTP transmite la seal mediante su interaccin con otras
quinasas de protenas citoplasmticas (protenas efectoras), activndolas, con lo que comienza una
segunda cascada de transmisin de la seal. La consiguiente hidrlisis del GTP por Ras devuelve a sta al
estado inactivo, interrumpiendo as la transmisin de seal hasta que haya un nuevo estmulo. Debe
aadirse que, aunque Ras fue la primera descubierta y es la ms importante, existen otras protenas
relacionadas que forman la familia Ras e intervienen en varios procesos celulares (como Rab, Rho y Arf).
26:9
Una alteracin frecuente en una proporcin elevada de tumores (en especial de colon y pncreas) es la
mutacin del gen ras, dando lugar a una protena Ras que es incapaz de hidrolizar el GTP, por lo que
permanece continuamente en su forma activa Ras:GTP, desencadenando una seal de proliferacin continua y no regulada, responsable de dichos cnceres.
26:10
5. Cada protena efectora activada por Ras produce a continuacin cambios de conformacin o fosforilaciones en sucesivas protenas componentes de la segunda cascada de seales, entre las que cabe citar Raf,
MEK y MAP quinasas.
6. Finalmente, algunas de estas quinasas de protenas de la segunda cascada fosforilan un factor de
transcripcin. Como consecuencia, ste cambia su conformacin, lo que le permite unirse al DNA y activar
o reprimir la transcripcin de genes especficos que codifican protenas que regulan el ciclo celular y la
apoptosis.
461
462
26.6 REGULACIN DEL CICLO CELULAR

Antes de describir los detalles de la regulacin, debe indicarse que la repeticin ordenada y controlada del ciclo
celular define su duracin caracterstica, es decir, determina el grado de proliferacin normal de las clulas en
cada tejido. Cuando la proliferacin celular es continua, excesiva y descontrolada se origina el cncer. Como se
ha indicado, esto puede ser consecuencia de la acumulacin sucesiva (a veces durante aos) de alteraciones o
mutaciones en algunos de los genes anteriormente descritos (por ejemplo, ras). Analizaremos previamente los
aspectos moleculares del proceso normal.
26.6.1 Puntos de control en el ciclo de divisin celular

La regulacin del ciclo se ejerce en tres puntos bien definidos, que dependen en su conjunto de las condiciones
ambientales ms favorables (nutrientes y temperatura, entre otras) y de la presencia de los factores de crecimiento celular necesarios. Los dos puntos de control principales se sitan en la interfase, en concreto en las
transiciones de G1 a S y de G2 a M. El tercer punto se localiza en plena mitosis. Gracias a este triple control, las
clulas slo inician una nueva fase de divisin cuando se han cumplido las condiciones necesarias en cada punto
y se ha finalizado la fase anterior. Utilizando un smil, cada punto de control acta a modo de freno de la
etapa previa. Cualquier circunstancia anormal en uno de ellos hace cesar la divisin y la consiguiente
proliferacin celular.
26:11
1. El primero se denomina punto de control en G1/S. Ocurre cerca del final de G1 (2n, 2C), antes de entrar en
fase S, y una vez superado se dispara la replicacin del DNA. Este punto se llama inicio en levaduras de
gemacin (como Saccharomyces cerevisiae) y punto R o de restriccin en mamferos, donde es el control
principal del ciclo. Al ser la fase G1 la ms prolongada del ciclo (entre 6 y 12 h), es en ella donde ms
intervienen las condiciones extracelulares (por ejemplo, del medio de cultivo), el nico punto donde el ciclo
responde a seales externas y progresa sin dependencia de estmulos mitticos. El paso por este punto lo
regulan las protenas intracelulares llamadas ciclinas de G1 (pg. 463).
2. El segundo, o punto de control en G2/M, ocurre al final de G2 (2n, 4C), antes del inicio de la mitosis M. Si la
clula no supera este punto, permanece con ese complemento doble de dotacin cromosmica. Su
desregulacin puede ser importante en la transformacin neoplsica. El paso por este punto lo regulan
las protenas intracelulares llamadas ciclinas de G2 o mitticas (pg. 464).
3. El tercer control, punto M, se ejerce durante la mitosis (2n, 4C ! 2n, 2C), entre la metafase (cromosomas
condensados dispuestos en el plano ecuatorial de la clula) y la anafase (separacin de las cromtidas
hermanas unidas al huso mittico hacia cada polo celular). Asegura que la clula no se divida si hay errores
en la formacin del huso acromtico o en la alineacin de los cromosomas en la placa ecuatorial. Es el punto
de control cuyo mecanismo se conoce menos y no se detallar en este texto, pero posiblemente depende
tambin de las ciclinas mitticas.
26:12
26.6.2 Protenas que controlan el ciclo celular

En los puntos de control G1/M y G2/S intervienen dos tipos caractersticos de protenas, las ciclinas y las
protena quinasas Cdk, que se asocian formando complejos Cdk-ciclina para controlar la actividad del ciclo
celular. Se estudiarn sucesivamente los dos tipos de protenas y la activacin del complejo formado por ambas,
para poder abordar despus la regulacin del ciclo celular por los complejos Cdk-ciclina.
26.6.2.1 Ciclinas
El nombre de este grupo de protenas se debe a que su concentracin en la clula flucta de acuerdo con la etapa
del ciclo celular, de modo que estn presentes en una etapa concreta y desaparecen durante el resto del ciclo.
Existen numerosas ciclinas; las principales en humanos son las ciclinas A, B, D y E. Algunas de ellas estn
relacionadas entre s; por ejemplo, las ciclinas B1 y B2, o las D1, D2, D3 y D4. La funcin exacta de otras ciclinas
(C, F, G, H e I) se conoce peor; la ciclina F parece estar implicada en el control de la transicin entre las fases S y G2.
a) Ciclinas de la fase G1 o ciclinas de inicio
Son las que intervienen regulando el punto de control G1/S. En humanos pertenecen a este grupo las ciclinas del
tipo D (D1, D2, D3 y D4) y la ciclina E. Ambas se sintetizan durante la fase G1 (por ejemplo, al entrar la clula
463
464
en el ciclo desde G0) y su concentracin celular se regula mediante transcripcin. Debido a su rpida
degradacin, tienen una vida media corta (unos 25 min para las D). El balance entre sntesis y degradacin
hace que aparezcan en la clula al final de G1 y desaparezcan durante la fase S o al acabar sta.
26:13
b) Ciclinas mitticas o de la fase G2

Este grupo, formado por las ciclinas A, B1 y B2, regula el punto de control G2/M. En este caso se sintetizan
durante las fases previas a la mitosis (S o G2) y se degradan rpida y especficamente durante la mitosis. La
ciclina A participa en el control de la replicacin del DNA y en la entrada en mitosis. La ciclina B, que slo
participa en la mitosis, se considera la ciclina por antonomasia, pues es la homloga en mamferos de la primera
ciclina descubierta cuando comenz el estudio del control del ciclo celular en los oocitos de la rana Xenopus
laevis, la que forma parte del factor promotor de la maduracin o de la fase M (MFP en ingls).
26.6.2.2 Protena quinasas dependientes de ciclinas (Cdk)

Constituyen una familia de protenas con una gran homologa de secuencia (superior al 50%), que fosforilan
residuos de serina y treonina en protenas sustrato especficas. Se trata, por tanto, de serina/treonina quinasas
(pg. 360 y web 22.4). Sin embargo, slo pueden ejercer esa actividad enzimtica cuando estn asociadas
con una ciclina; por ello, reciben el nombre de quinasas dependientes de ciclinas, Cdk o CDK (de cyclindependent kinases). De acuerdo con ello, se considera que en el complejo activo (Cdk-ciclina) la Cdk es la
subunidad cataltica y la ciclina la subunidad reguladora.
26:14
Una vez fosforiladas por las Cdk, las protenas sustrato pueden perder los grupos fosfato por accin de
fosfoprotena fosfatasas igualmente especficas. Esta reversibilidad de la fosforilacin es crucial para el control
del ciclo celular.
A diferencia de las ciclinas, la concentracin de las Cdk no vara de forma marcada durante el ciclo celular,
aunque puede estar regulada por ciertas seales estimuladoras o inhibidoras del crecimiento.
26:15
En algunos organismos (como las levaduras) existe una sola Cdk, que acta tanto en el punto de control G1/S
como en el G2/M (unindose a distintas ciclinas), mientras que en otros (mamferos) esas funciones se distribuyen entre varias Cdk. En el ser humano se han encontrado al menos 8 miembros de esta familia, denominados
Cdk1 a Cdk8, cada uno de los cuales forma complejos quinasa activos con ciclinas diferentes.
26:16
465
466
26.6.2.3 Actividad de los complejos Cdk-ciclina

La activacin de las Cdk como quinasas de protenas no consiste simplemente en su unin con una ciclina, sino
que su regulacin depende de otros mecanismos:
a) La posibilidad de que se forme el complejo Cdk-ciclina depende de la disponibilidad de ambas
protenas; puesto que las Cdk estn presentes de forma continua en la clula, son las ciclinas las que regulan.
a1) Tasa de sntesis de las ciclinas: como se ha indicado (pg. 464), la sntesis est controlada en
funcin de la etapa del ciclo, aumentando en ciertos puntos del mismo, diferentes para las ciclinas A y B
que para las D y E.
a2) Tasa de degradacin de las ciclinas: determina, junto con la sntesis, la concentracin disponible para
su unin a las Cdk.
b) Una vez formado el complejo Cdk-ciclina, su actividad como quinasa est sometida a regulacin por
otras protenas.
b1) Modificacin de la Cdk por fosforilacin y desfosforilacin: la actividad del complejo Cdk-ciclina
precisa la fosforilacin de ciertos residuos aminocidos de la Cdk y no de otros, lo cual est regulado por
distintas quinasas y fosfatasas que, a su vez, estn reguladas por la propia Cdk activa (vase figura en
pg. 467).
b2) Interaccin de las quinasas con protenas inhibidoras: el ltimo mecanismo regulador de la
actividad de los complejos Cdk-ciclina se basa en la existencia de muchas protenas que se unen a las
Cdk, inhibiendo directamente su actividad; se denominan inhibidores de los complejos Cdk-ciclina, o
CKI. Su efecto es, por tanto, bloquear el ciclo de divisin, por lo que funcionan como oncosupresoras
(pg. 456).
Los CKI se agrupan en dos familias, en funcin de su estructura (existe similitud de sus secuencias), modo de
accin y especificidad de sustrato:
Familia
KIP
INK4
Nombre de la
protena inhibidora
Otros nombres
p21
CIP1
p27
KIP1
p57
KIP2
p16
p15
Accin inhibidora
WAF1
Preferentemente sobre los

complejos de Cdk con ciclina
de G1 y S.
En menor medida, sobre
complejos de Cdk1 con ciclina
de G2
INK4a
MTS1
INK4b
MTS2
Especficamente sobre los

complejos de ciclinas de G1 con
Cdk4 o Cdk6, pues compiten
con las ciclinas D
p18
INK4c
p19
INK4d
ARF
26:17
26.6.3 Regulacin del ciclo celular por los complejos Cdk-ciclina y alteraciones en el cncer
El descubrimiento de la relacin entre diversos procesos neoplsicos y las alteraciones en algunos genes,
especialmente los que poseen un papel clave en el control del ciclo celular, ha permitido comprender la
trascendencia y los mecanismos de funcionamiento de este control. Distintas alteraciones en las protenas
que regulan el ciclo de divisin celular pueden tener como consecuencia la divisin celular excesiva o incontrolada, dando lugar a una proliferacin celular desmedida con acumulacin de anomalas genticas y fisiolgicas en las clulas, que pasan a constituir el tumor.
467
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26.6.3.1 Estmulos de progresin por el ciclo celular y oncogenes que los alteran
Como ya se ha descrito, el avance por el ciclo celular se impulsa a grandes rasgos en dos puntos: la sntesis y
degradacin de ciclinas de G1, seguida de la activacin de sus complejos Cdk-ciclina, y la etapa equivalente en
G2. La activacin de estos complejos conduce a respuestas variadas, mediadas por las protenas diana que
resultan fosforiladas por la actividad quinasa. Se muestra a continuacin una visin global de estos dos puntos
de activacin del ciclo.
26:18
469
Esta estimulacin normal de la progresin por el ciclo puede alterarse y conducir a un cncer. La mutacin
de protooncogenes que codifican estas protenas estimuladoras del ciclo los pueden transformar en oncogenes.
Esto ocurre cuando las oncoprotenas respectivas actan sin obedecer a la regulacin, provocando una
estimulacin continuada del ciclo que conduce a la proliferacin excesiva causante del cncer.
Ejemplo de protena reguladora del ciclo celular,
codificada por un protooncogn
Efecto oncognico resultante de la mutacin
Ciclina
Cdk
Sntesis excesiva
Sntesis no regulada de acuerdo con el ciclo
Sntesis excesiva
Actividad quinasa excesiva o independiente de la unin de la ciclina
Protena quinasa o protena fosfatasa

activadoras del complejo Cdk-ciclina
Sntesis o actividad excesivas
Protena quinasa o protena fosfatasa

inhibidoras del complejo Cdk-ciclina
Protena no funcional
26.6.3.2 Estmulos de detencin del ciclo celular

La regulacin normal del ciclo depende del balance entre los estmulos positivos que lo impulsan y los negativos o
frenos que detienen el ciclo en los tres puntos de control, G1/S, G2/M y M (pg. 462), para asegurar la correcta
preparacin de la clula para la fase siguiente (por ejemplo, que se haya completado la replicacin antes de que se
condense el genoma y se divida la clula). Los mecanismos de actuacin de estos estmulos negativos se conocen
con menos detalle molecular que aquellos por los que tiene lugar el control positivo; sin embargo, conceptualmente sus implicaciones en la regulacin normal y alterada en el cncer son similares en ambos casos.
26:19
470
La aparicin de cncer por alteracin del control negativo corresponde a genes oncosupresores, o
supresores de tumores, cuya funcin normal es frenar el ciclo y, al verse mutados, dejan de hacerlo
(pg. 456). Como consecuencia, la clula replica su DNA y se divide por mitosis sin atender a los
puntos de control y, en consecuencia, prolifera excesivamente y acumula defectos genticos (por ejemplo,
por una mitosis prematura antes de que se haya completado la replicacin). Entre los mltiples genes
supresores de tumores que se han descrito, los mejor estudiados son Rb y p53, cuyos productos proteicos
actan sobre la regulacin del ciclo. A continuacin se detallan su funcin normal y su implicacin en el
cncer.
26.6.3.3 El gen supresor del retinoblastoma (Rb)

El descubrimiento de una predisposicin hereditaria para sufrir retinoblastoma, un tipo infrecuente de cncer
que afecta a los ojos, permiti identificar un gen (denominado Rb) relevante en el control del ciclo celular. Su
producto gnico, la protena del retinoblastoma (Rb, pRb o p105-Rb, por su masa de 105 kDa), se encuentra
presente y acta en el control de todo tipo de clulas normales; de ah su importancia general, en contraste con el
carcter restringido de actuacin que pudiera deducirse de su nombre.
La protena Rb se caracteriza por experimentar cambios de fosforilacin a lo largo del ciclo celular, que
modulan su actividad como freno en el punto de control G1/S. Esta actividad se debe a la asociacin de Rb no
fosforilada con multitud de protenas necesarias para la proliferacin celular, en especial factores de
transcripcin inducibles (pg. 293) como Myc y E2F.
26:20
En una clula normal, la protena Rb est siempre presente, pero su estado de fosforilacin (y, por
consiguiente, su actividad) vara a lo largo de las etapas del ciclo. Los factores estimuladores del crecimiento
actan como seal que favorece la activacin de las protenas Cdk, con lo que stas pueden fosforilar Rb y
anulan as su efecto inhibidor sobre la progresin del ciclo en G1/S.
La prdida o mutacin de las dos copias (alelos) del gen Rb anula la funcin de la protena Rb, suprime el
control por Cdk y provoca un paso prematuro a fase S. Aunque la inactivacin del gen Rb es responsable de
cnceres en diversos tejidos, afecta en especial a las clulas de la retina inmadura, conduciendo en ella a una
proliferacin celular excesiva que causa el retinoblastoma. Los nios que heredan una copia defectuosa del gen
Rb poseen un nico alelo normal, por lo que es ms probable que una mutacin anule por completo la
funcionalidad de Rb y tienen mayor susceptibilidad al desarrollo de tumores en la retina.
Finalmente, la accin de la protena Rb normal se puede ver tambin impedida como consecuencia de ciertos
virus, que tienen por ello accin promotora del cncer independiente de la mutacin del genoma humano.
26:21
26.6.3.4 El gen oncosupresor p53

Aproximadamente el 50% de los tumores humanos presentan mutaciones en un gen relacionado con el control
del ciclo celular, denominado p53 por codificar una protena cuya masa molecular es de 53 kDa. Esto no quiere
decir que la protena p53 anormal sea la nica causa del 50% de los tumores, pues se acumulan mutaciones en
otros genes cuyo efecto combinado es la enfermedad. Sin embargo, las lesiones del gen p53 tienen un efecto
claro sobre la progresin neoplsica.
El carcter oncosupresor del gen p53 se debe a las funciones de la protena normal que codifica, que
consisten en inducir la apoptosis y actuar como freno en el punto de control G1/S. La concentracin de la
protena p53 en clulas normales es baja, por lo que slo adquiere relevancia en situaciones especiales. As, se ha
comprobado un importante aumento de p53 cuando existe dao en el DNA (por ejemplo, tras la exposicin a
radiaciones), cuando se altera la concentracin de nucletidos en la clula, en situaciones de hipoxia, bajo
estmulos oncognicos, etc. En esas condiciones, aumenta la concentracin de la protena p53 y se prolonga su
vida media (pasando de 5-10 minutos hasta 150 minutos). La presencia de daos en el DNA es detectada por
varias protenas, entre ellas una quinasa de protenas que fosforila a p53. La forma fosforilada de p53 es un
factor de transcripcin (pg. 288) que induce la expresin de algunos genes y reprime la de otros. Entre las
protenas cuya expresin aumenta destaca, en primer lugar, p21, que inhibe la actividad quinasa del complejo
Cdk2ciclina E, necesaria para superar G1/S. En segundo lugar, la protena GADD (growth arrest on DNA
damage, detencin del crecimiento por daos en el DNA) que, al igual que p21, secuestra el PCNA, factor de
procesividad de la DNApol d (v. Web 11.5), e impide, de este modo, la replicacin. En consecuencia, y de forma
similar a Rb, la funcin normal de p53 es frenar la progresin del ciclo, evitando que la clula replique ese DNA
daado. Ms an, es posible que la propia protena p53 estimule la reparacin del DNA o participe en ella.
Los defectos homocigticos en p53 conducen, por tanto, a una falta de control en el punto G1/S y una
reduccin de la entrada en apoptosis, lo que da como resultado una proliferacin celular descontrolada que
ocasiona tumores. En individuos heterocigticos producen el sndrome de Li-Fraumeni, caracterizado por una
predisposicin al desarrollo de tumores. Por ltimo, de manera anloga a lo que ocurre sobre Rb, diversas
471
472
protenas vricas generan tumores a travs del bloqueo de p53 (antgeno T de SV40, protena E6 de papilomavirus y protena E1B de adenovirus, por ejemplo).
26.7 APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA

La apoptosis es un proceso fisiolgico, controlado genticamente, que se da en todo tipo de clulas de
organismos multicelulares y por tanto en todos los rganos y sistemas, mediante el cual las clulas daadas
o no necesarias (que han cumplido su ciclo vital, pg. 452) activan mecanismos que conducen a su propia
destruccin de forma ordenada y regulada; de ah que se le haya llamado suicidio celular. ste es un proceso
muy diferente de la necrosis, causada por el efecto nocivo directo de agentes externos, de naturaleza mecnica
(rotura), biolgica (virus, bacterias), qumica (drogas, toxinas, venenos), etc., que conducen a prdida de la
capacidad de regulacin osmtica, hinchamiento, rotura de la membrana, liberacin del contenido celular y,
finalmente, fagocitosis de los residuos celulares.
Se observa una reduccin de la apoptosis en situaciones fisiolgicas caracterizadas por una gran
proliferacin celular (desarrollo embrionario y posnatal temprano, metamorfosis, mecanismo de accin
de hormonas y factores paracrinos, etc.), as como en situaciones patolgicas tan diversas como el cncer
(la ms representativa de una excesiva proliferacin), enfermedades autoinmunes e infecciones vricas. De
ah la importancia del estudio del proceso apopttico, su control y los fallos asociados a procesos
patolgicos.
El estudio de la apoptosis ha de hacerse en conexin con el de la proliferacin celular. Como ya se ha
indicado (pg. 452), la clula cancerosa se considera una clula con una proliferacin incontrolada debida
probablemente a la suma de una activacin de la proliferacin y un bloqueo de la apoptosis. De hecho, la propia
quimioterapia del cncer est imbuida de esta idea: el impacto ms bien modesto de los tratamientos antiproliferativos, posiblemente causado por una baja capacidad de proliferacin de muchos tumores, debe
complementarse con tratamientos que induzcan la apoptosis.
26.7.1 Etapas y control del proceso de apoptosis

Desde un punto de vista celular y molecular, los cambios en la apoptosis parecen transcurrir en tres etapas
relativamente definidas, denominadas induccin, ejecucin y fase final.
26.7.1.1 Induccin
Se da este nombre a la reaccin ante un estmulo o seal. Al igual que en la proliferacin celular, es importante
indicar que la induccin de la apoptosis requiere estmulos adecuados (seales positivas), tanto extracelulares
como procedentes de la propia clula. Existen tambin seales negativas que actan en sentido contrario,
frenando la apoptosis.
26.7.1.2 Ejecucin
Tras la induccin comienza el verdadero proceso de apoptosis, que consta de alteraciones diversas que
conducirn a la muerte de la clula: cambios morfolgicos y de la membrana con disminucin de la adhesin
a otras clulas y a la matriz extracelular, contraccin del citoplasma, condensacin de la cromatina, fragmentacin del DNA, disminucin del volumen nuclear seguida de su desintegracin, rotura de mitocondrias
con vertido de su contenido al citoplasma, aparicin de protuberancias en la membrana celular (fenmeno
conocido como zeiosis), etc. Estas alteraciones se deben a la activacin de varias proteasas y nucleasas, que
se convierten as en las principales molculas responsables de la apoptosis.
a) Proteasas: caspasas y su papel en el control de la apoptosis
26:22
Las caspasas son una familia de proteasas citoslicas (dentro de la clase EC 3.4.22, cistena endopeptidasas).
En humanos se han identificado 10, clasificadas en tres grupos de acuerdo con su especificidad de sustrato.
Producen la protelisis de protenas diana o sustrato, entre las cuales cabe citar una protena nuclear con
actividad de reparacin del DNA (PARP o poli(ADP-ribosa)polimerasa) y un factor de transcripcin (SREBP).
Las caspasas no slo actan degradando protenas sustrato, sino que tambin activan a otras caspasas por
protelisis limitada (pg. 369). Dependiendo de su posicin en la cascada de activacin, se distingue as entre
caspasas iniciadoras y ejecutoras.
26:23
La apoptosis se controla mediante protenas implicadas en varios niveles de sealizacin celular, codificadas
por protooncogenes y genes oncosupresores. Al igual que el ciclo celular, el control de la apoptosis puede
alterarse, generando situaciones patolgicas entre las que se incluye el cncer. Se conocen ya algunos genes que
codifican protenas reguladoras de la apoptosis y que resultan alterados por mutaciones.
El control positivo consiste en el inicio de la cascada de caspasas; una de las principales seales inductoras es
la liberacin al citoplasma de los componentes de las mitocondrias rotas, en especial el citocromo c (integrante
de la cadena respiratoria). ste se une a la protena Apaf (factor activador de las proteasas apoptticas)
formando un complejo que activa la procaspasa iniciadora. Algunas protenas, como Bax, estimulan estas
etapas de inicio; en ciertos cnceres Bax est inactiva, anulando su efecto de control positivo. Este control
positivo de la apoptosis es anlogo al ejercido en la proliferacin celular por la induccin en cascada de la
actividad protena quinasa de los complejos Cdk-ciclina (pg. 466).
473
474
El control negativo de la apoptosis, por freno de la activacin de las caspasas, viene determinado por
protenas como Bcl-2 y Bcl-x, que aseguran que el proceso apopttico permanezca bloqueado bajo condiciones
normales. En algunos cnceres se sobreexpresa Bcl-2, reduciendo an ms la apoptosis; en otros, se sobreexpresan protenas que bloquean las caspasas, como las denominadas survivinas. En general, este control es
similar al ejercido sobre el ciclo celular por la activacin de protenas que inhiben la actividad protena quinasa
de los complejos Cdk-ciclina.
b) Nucleasas
Se encargan de la rotura del DNA cromosmico, en general en sus posiciones ms accesibles, el DNA
espaciador o internucleosmico, de forma que se originan fragmentos cuyo tamao es mltiplo de 200 pb
(longitud aproximada del DNA de cada nucleosoma, pg. 88). Por ello, uno de los sntomas de apoptosis es
la observacin, al estudiar el DNA por electroforesis, de un patrn de bandas en escalera (v. web 7.3).
26.7.1.3 Fase final de la apoptosis

Las protuberancias externas de la clula, formadas durante la etapa de ejecucin, terminan por separarse
formando los llamados cuerpos apoptticos; stos son caractersticos del proceso y constituyen una de las
diferencias respecto a la necrosis celular. Los cuerpos apoptticos son reconocidos y fagocitados por otras
clulas, tanto vecinales o del propio tejido como especializadas (macrfagos), de forma que toda la clula
apopttica se destruye sin que se llegue a liberar material intracelular al medio y, en consecuencia, sin la
aparicin de una reaccin inflamatoria (a diferencia de la necrosis, en la que la clula revienta, libera su contenido
y provoca esa reaccin). Obviamente, todo este proceso va acompaado de otros cambios bioqumicos.
26:24
26.7.2 Relacin entre ciclo celular y apoptosis: p53 como punto de enlace
Como se ha indicado previamente, el gen oncosupresor p53 codifica la protena nuclear p53, reguladora de la
transcripcin de ciertos genes relacionados con la progresin del ciclo celular (pg. 471). Por otra parte, p53
tambin provoca la apoptosis, cuando las lesiones del DNA son imposibles de reparar, bien sea por su magnitud
o por defectos en los sistemas de reparacin. Se elimina as la posibilidad de que se transmita el DNA gravemente
alterado (con gran nmero de mutaciones, con reorganizaciones cromosmicas o con aneuploida, por ejemplo).
Los mecanismos por los cuales p53 produce esa activacin de la apoptosis son mltiples y se conocen an de
forma incompleta, pero incluyen tanto la activacin de la transcripcin de genes como otras actividades no
transcripcionales de la protena p53. La alteracin de estas funciones de p53, debido a la mutacin de su gen,
impide la entrada de la clula en apoptosis, lo que, unido a la desaparicin de la funcin de freno del ciclo celular,
tiene como consecuencia que las clulas continen proliferando aunque posean daos en el DNA o defectos
genticos, y ello aumenta la probabilidad de que stos se acumulen y favorece la aparicin de un cncer.
26.8 HERENCIA DEL CNCER

Las alteraciones inducidas en el cncer se transmiten en la mitosis de unas clulas a otras (clulas somticas),
pero no se transmiten por herencia de padres a hijos. Para ello habra de existir una predisposicin o
susceptibilidad a la mutacin en la lnea germinal, una susceptibilidad hereditaria. Existen, sin embargo, casos
de cncer hereditario, debidos a la mutacin de protooncogenes o genes oncosupresores en el vulo o el
espermatozoide de los padres. La causa y mecanismo moleculares del desarrollo del cncer hereditario son
los mismos que para el cncer somtico, slo difieren en el tipo de clula en la que se inicia (germinal y somtica,
respectivamente). Por otra parte, una vez heredado el cncer, el individuo afectado se convierte en portador y lo
transmitir a sus descendientes de acuerdo con las reglas de herencia mendeliana y dependiendo del carcter
dominante o recesivo del gen alterado causante del cncer (por lo comn, dominante si es un oncogn y recesivo
si se trata de un gen oncosupresor mutado, pgs. 456 y 458).
Uno de los cnceres hereditarios mejor conocidos y con especial trascendencia es el de mama, que tiene este
carcter en un 5 a 10% de los casos. Su causa principal es la mutacin de los genes oncosupresores BRCA1 del
cromosoma 17 o BRCA2 del 13 (de breast cancer, cncer de mama). El primero de estos genes se expresa en
mama y ovario, codificando un factor de transcripcin que posee un motivo dedo de zinc (pg. 62) en su
regin N-terminal. Al tratarse de un gen oncosupresor, la transmisin hereditaria se debe, en general, a un alelo
mutado, que slo se manifestar en la hija desarrollando un tumor si tambin sufre mutacin posteriormente el
otro alelo, heredado como forma normal (pg. 458). La presencia de BRCA1 anormal se asocia en mujeres a un
50-80% de probabilidad de padecer cncer de mama y a una predisposicin al cncer de ovario.
Existen otros defectos genticos hereditarios, en los que se transmite la predisposicin a desarrollar un tipo
especfico de cncer; entre ellos, xerodermia pigmentosa (pg. 404), enfermedad de Li-Fraumeni, cncer
cerebral, sarcoma, leucemia, ataxia-telangiectasia, linfoma no hodgkiniano y leucemia linfoctica aguda. En
general, la aparicin del cncer se demora bastante, pues es necesario que se acumulen mutaciones somticas
adicionales.
26.9 MARCADORES TUMORALES

Las alteraciones de las clulas tumorales pueden analizarse en diversas escalas. Lo tradicional y ms utilizado en
clnica son aquellas que, aun sin estar directamente implicadas o ser responsables del proceso neoplsico, son
consecuencia de la existencia del tumor o incluso de su evolucin o respuesta a una determinada terapia. Estas
alteraciones constituyen la base de los denominados marcadores tumorales y tisulares, establecidos con fines
clnicos y en especial relacionados con el grado de malignidad del tumor. Se pueden observar tanto in vitro (por
ejemplo en clulas en cultivo infectadas con virus oncognicos en el proceso llamado transformacin maligna)
como in vivo, en numerosos casos clnicos.
El uso de los marcadores tumorales slo es vlido si para su determinacin se cumplen ciertos requisitos
analticos. En cuanto a sus posibilidades de utilizacin clnica, es preciso exponer algunas consideraciones bsicas.
Por un lado, raramente se emplean los datos de marcadores para establecer un diagnstico, sino que ste ha de
basarse en datos clnicos, radiolgicos, biopsias, etc.; en general, los marcadores slo sirven para confirmar la
evidencia del cncer o como alerta temprana para iniciar un diagnstico ms detallado. En cuanto al pronstico
de una enfermedad, se exige una correlacin entre la concentracin del marcador y la masa del tumor. Son
adecuados para el seguimiento del cncer, en cuyo caso debe confirmarse la eficacia del tratamiento siguiendo
la concentracin del marcador a lo largo del tiempo, para averiguar, por ejemplo, si el aumento de un marcador
es indicio de recurrencia de la enfermedad y se requiere una terapia ms enrgica o un cambio de estrategia.
Las alteraciones de las clulas cancerosas son tan variadas que pueden estudiarse desde distintos puntos de
vista: locales y generalizadas, tumorales y tisulares y, finalmente, genotpicas o moleculares.
475
476
26.9.1 Alteraciones locales y generalizadas

El proceso canceroso ejerce una influencia directa sobre la propia clula y su vecindad (efecto local) o sobre la
totalidad del organismo (efecto generalizado o sistmico).
26:25
26.9.2 Alteraciones tumorales y tisulares
26:26
26.9.2.1 Marcadores tumorales

Se da este nombre a cualquier sustancia en lquidos biolgicos (en especial, plasma o suero) relacionada con la
existencia o ausencia de un tumor. Su naturaleza molecular es muy heterognea; las ms comunes tienen
funcin hormonal o enzimtica, o son antignicas. Su aparicin puede deberse a alteraciones de la morfologa
celular, del citoesqueleto (microtbulos, microfilamentos y filamentos intermedios), de la superficie de la
membrana (antgenos asociados, prdida de inhibicin del crecimiento por contacto, receptores), de diversos
parmetros bioqumicos o de la dotacin cromosmica (cariotipo anormal, Captulo 25). Son los marcadores
que ms se analizan desde un punto de vista general. Se pueden distinguir dos grupos de marcadores tumorales:
los de secrecin y las citocinas (o citoquinas).
a) Marcadores tumorales de secrecin o marcadores ''clsicos''
Pueden clasificarse en funcin de los factores (tisulares, metablicos, fisiolgicos, metodolgicos, etc.) que determinan su concentracin en lquidos biolgicos, principalmente en la sangre. La lista de marcadores de secrecin es
amplsima y, a efectos prcticos, tambin pueden clasificarse en funcin del material biolgico en el que se pueden
estudiar: marcadores sricos, urinarios, de lquido cefalorraqudeo y de metstasis seas, por ejemplo.
A continuacin se describen algunos de los marcadores de secrecin mejor caracterizados.
26:27a
477
478
26:27b
b) Citocinas o mediadores solubles de origen celular
De acuerdo con su accin especfica, tambin se subdividen en: linfocinas, monocinas, interferones, factores de
necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias y factores de crecimiento. La concentracin srica de varias
de ellas aumenta en determinadas situaciones clnicas, incluidos algunos cnceres.
26.9.2.2 Marcadores tisulares

Aunque son a veces indistinguibles de los marcadores tumorales, estn ms relacionados con la propia biologa
neoplsica y vienen dados por parmetros de definicin imprecisa, no referidos a alteraciones bioqumicas. Su
deteccin se basa, en general, en el empleo de anticuerpos monoclonales. Aunque tienden a usarse de forma
creciente, no se ha llegado a un reconocimiento generalizado de su utilidad clnica.
Ejemplos:
Oncogenes
(pg. 454)
Genes oncosupresores
(pg. 456)
Receptores de hormonas
esteroides
Los ms conocidos son los receptores citoslicos de estrgenos y de progesterona, que se

ven alterados en los tumores malignos de mama.
Protenas asociadas a los

receptores de esteroides
Algunas protenas de choque trmico (muchas de ellas carabinas moleculares que facilitan
el plegamiento adecuado de otras protenas, pg. 372).
Protena pS2, inducida por estrgenos.
Componentes del
citoesqueleto
Filamentos intermedios.
Queratinas de tipo 8 (antgeno polipeptdico tisular, TPA).
Queratinas de tipo 18 (antgeno polipeptdico especfico tisular, TPS).
Estn presentes en el citoesqueleto de clulas epiteliales, normales y malignas, pero se
determinan en lquidos biolgicos (suero). En general, no son especficas de ningn tipo
histolgico, pero son tiles como indicador de proliferacin y para el diagnstico y
seguimiento de muchos tumores.
Antgenos de membrana
Oligosacridos Lex, sialilLex, sialilLea, sialilTn y sialosilTn.

Glicoprotena P.
Factores de crecimiento
TGFa, FGFb, IGF-1 y TGF-b1
Receptores de los factores

de crecimiento
Molculas de adhesin
Proteasas y sus inhibidores
Integrinas, cadherinas y selectinas
26.9.3 Marcadores genotpicos o moleculares

En la bsqueda del marcador tumoral perfecto se ha planteado una clasificacin molecular de los tumores
basada en la deteccin directa de los cambios genotpicos responsables del cncer. En definitiva, ello supone un
anlisis molecular de las mutaciones en todo tipo de secuencias del genoma, tanto gnicas (oncogenes, genes
oncosupresores) como no gnicas (secuencias repetidas) e incluso en las regiones telomricas (pg. 96). Esto
ofrece un elevado potencial para el diagnstico (confirmacin y seguimiento del desarrollo del tumor), la
prevencin (aparicin precoz, cncer asintomtico, evaluacin del riesgo y la susceptibilidad hereditaria) y la
terapia (tratamiento farmacolgico y su seguimiento). En particular, este anlisis molecular de marcadores
tumorales genticos se ha hecho posible como consecuencia del desarrollo de los biochips (pg. 174).
Concretamente, se han desarrollado ya varias micromatrices (denominadas oncochips, pgs. 428-429) en
las que se fija una genoteca de cDNA cuyas secuencias se ha comprobado que guardan relacin con diversos
tipos de cncer. Por ejemplo, como consecuencia del anlisis de expresin diferencial (pg. 176) entre pacientes
sanos y pacientes con cncer, o entre muestras de dos subtipos diferentes de cncer con un pronstico clnico diferenciado.
479
ndice alfabtico
ERRNVPHGLFRVRUJ
Notas relativas a la ordenacin alfabtica de los trminos:
Se han ignorado letras griegas, nmeros y otros indicadores de posicin del sustituyente (tales como N- y O-).
Por ejemplo, 2-acetamidofluoreno y N-acetilglucosamina aparecen en la a.
Los cidos se citan en la posicin de su nombre, no en la a. Por ejemplo, fusdico (cido).
Las enfermedades especficas se citan por su nombre, no en la e. Por ejemplo, Alzheimer (enfermedad de).
Los nombres de enzimas se citan completos, no como subentradas de la primera palabra. Por ejemplo, DNA polimerasa no
forma parte de la entrada DNA. En general se emplea el nombre comn y sin guiones intermedios, siguiendo el uso
internacional en ingls y la recomendacin de 1994 de la Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular.
A1AT, 414. V. tambin antitripsina a1.

aaRS, 327. V. tambin aminoacil-tRNA sintetasa.
abrazadera deslizante, 152
absorcin ptica
variacin en la desnaturalizacin del DNA, 166
absortividad
de cidos nucleicos, 167
de bases nitrogenadas, 167
de nuclesidos y nucletidos, 167
ABTS, 189
acenocumarol, 359
acntrico, 448. V. tambin cromosoma.
2-acetamidofluoreno, 398, 400
acetilacin
de aminocidos, 359
de histonas, 285
y expresin gnica, 285
N-acetilgalactosamina, 364
N-acetilglucosamina, 364
N-acetilneuramnico (cido), 364
b-N-acetilhexosaminidasa. V. hexosaminidasa A.
acetiltransferasas
de histonas, 285
Na-acetiltransferasas, 359
aciclovir, 15
cidos, efecto sobre la desnaturalizacin, 165
acilacin
de aminocidos en protenas, 361
acortamiento de los extremos del DNA, 158, 159
acridina, 278, 398
naranja de, 132
actina
escisin por caspasas, 473
familia multignica, 115
actinomicina D, 277
activacin
de aminocidos
energtica, 328, 333

esquema global, 326
mecanismo, 328
reaccin, 327
de grupos funcionales, 182, 183
activadores, 290
actividad transcripcional, 94, 281
ADA, 438. V. tambin adenosina desaminasa.
adaptador, 209
adelantada (hebra), 156, 157
adenilato, 21
adenina fosforribosiltransferasa, 246. V. tambin APRT.
S-adenosilhomocistena, 214, 215, 283
S-adenosilmetionina, 19, 213, 214, 283, 301
adenosina, 18
como centro de ramificacin, 305
adenosina desaminasa, 306
deficiencia de, 438
adenovirus, 471, 472
adhesin
celular, 129
entre clula y matriz extracelular, 449, 451
alteracin en la apoptosis, 472
intercelular, 449, 451
alteracin en la apoptosis, 472
A-DNA, 48
geometra de los pares de bases, 49
modelos moleculares, 49
ADP-ribosilacin, 369
de histonas, 286
adriamicina, 278
afinidad
mtodos, 129
para extraccin de mRNA, 302
por la cola de poli(A), 302
aflatoxina, 398
AFP, 476
agar, 170
481
482
n d i c e a l f ab t i c o
agarosa, 141
aglutinacin, 410
aisladores, 290
alcohol isoamlico: en la extraccin del DNA, 136
aldolasa
alelos, 97, 99
coheredados, 241
ligados, 242
segregados, 241
y polimorfismo, 406
alfoide, 117
alquilacin, 397
reparacin, 402
alquilguanina, 400. V. tambin O-metilguanina.
alquiltransferasa
mecanismo de catlisis, 400
alquiltransferasas, 400
Alu, 118, 357
Alzheimer (enfermedad de)
relacin con el plegamiento, 372
a-amanitina, 270, 271
estructura, 277
aminas aromticas, 398
aminocidos
abreviaturas de 1 y 3 letras, 316
acetilacin, 359
acilacin, 361
activacin, 326
bsicos, 84
carboxilacin, 359
fosforilacin, 359
hidroxilacin, 360
metilacin, 361
modificacin en las protenas, 358
prenilacin, 362
unin por enlace peptdico, 339
aminocido-tRNA ligasa, 327. V. tambin
aminoacil-tRNA sintetasa.
aminoacil-20 -tRNA, 328
aminoacil-30 -tRNA, 328
aminoacilacin del tRNA, 327
aminoacil-AMP, 327, 328
verificacin, 330
aminoacil-tRNA, 315
ubicacin en el sitio A, 337
verificacin, 330
aminoacil-tRNA sintetasa, 327
caractersticas, 329
centros activos, 330
correccin de errores, 330
de clase I, 328, 329
de clase II, 328, 329
especificidad, 329
reconocimiento de aminocidos, 329, 330
reconocimiento de tRNA, 329
aminoglicsidos, 343, 344
aminopterina
en medio HAT, 246
amnios, 122
AMP cclico, 25
ampicilina
gen de resistencia, 227, 228, 234
amplificacin gentica, 191. V. tambin clonacin.
amplificadores, 290
ampr, 227, 228, 234
anafase, 101
anclaje
de protenas a membranas a travs de
lpidos, 361
andamiaje nuclear, 88. V. tambin esqueleto nuclear.
anemia de clulas falciformes
deteccin por RFLP, 420
herencia, 438
mutacin causante, 390
polimorfismo, 420
aneuploida, 444
mecanismo, 445, 447
anfitriona, 230. V. tambin clula.
angiognesis, 452
anomalas cromosmicas, 442
antibiticos, 271. V. tambin rifampicina.
de tipo I, 276
de tipo II, 277
de tipo III, 278
puromicina, 19
que inhiben la traduccin, 343
resistencia, 223, 271. V. tambin a-amanitina.
anticodn, 66, 315
emparejamiento con el codn, 319
nmero necesario, 320
relacin con el nmero de codones, 321
anticuerpos
anti-digoxigenina, 189
aplicacin en ensayo Western, 178
monoclonales, 129
que existen naturalmente, 410
antiflicos, 246
antgeno, 470
A, 411
asociado al carcinoma de clulas escamosas, 475
B, 411
carbohidrato 125, 475
carcinoembrionario, 475
celular de clulas en proliferacin, 152.
V. tambin PCNA.
H, 411
oncofetal, 475
prosttico especfico, 475
T del virus SV40, 471, 472
antioncogn, 393, 454, 456. V. tambin oncosupresores.
antiparalelismo, 42
antisentido, 74, 267
a1-antitripsina, 372
herencia, 438
isoforma Z, 415
mutaciones causantes, 414, 415
a1-AT, 414. V. tambin antitripsina a1.
antivirales, 15, 19
Apaf, 471
apilamiento, 44, 166
de bases, 16
483
ndice alfabtico
apirimidnico, 252
sitio, 395
apoB100, 306
apoB48, 306
apobec-1, 306
apolipoprotena B, 306
apoptosis, 452
concepto, 472
control
negativo, 454, 473
positivo, 456, 473
cuerpos apoptticos, 474
ejecucin, 472
etapas, 472, 474
fagocitosis, 474
fase final, 474
induccin, 472
iniciacin por citocromo c, 471, 473
papel de p53, 471
relacin con proliferacin, 472
seales
negativas, 472
positivas, 472
APRT, 246
apurnico, 252
sitio, 395
AraA o arabinosiladenina, 19
AraC o arabinosilcitosina, 19
rbol genealgico, 424
nomenclatura y smbolos, 436
Arf (protena), 461, 466
ARS. V. secuencia de replicacin autnoma.
ARS/CEN/TEL, 230
arsnico, 398
asa de desdoblamiento o de desplazamiento, 161.
V. tambin bucle D.
asbestos, 398
ascorbato, 360
ASO, 420. V. tambin oligonucletido especfico de alelo.
aspartato aminotransferasa, 476
ataxia telangiectasia, 448
ATP como cosustrato de la ligasa, 218
AttoPhos, 189
autoiniciadora, 269
automatizacin
de la PCR, 205
de la secuenciacin enzimtica de DNA, 255
de la sntesis de oligonucletidos, 183
autorradiografa, 170, 189
autosomas, 95
Avery, MacLeod y McCarty, 4
avidina, 129
ayuste
alternativo, 298, 310
autoayuste, 72
centros de, 303
de protenas, 371
mecanismo, 305
reconocimiento, 304
secuencias, 303
ayustosoma, 304
azcares
activados con nucletido, 367
componentes de cidos nucleicos, 14
configuracin anomrica, 17
azul de tripano, 131
B
BAC, 227, 230
bacterias
cpsula, 4
colonias, 170, 235
lisis in situ, 170
bacterifagos, 228
l, 228, 229
M13, 228
P1, 230
T2, 4
baculovirus, 228
balanceo, 321, 329
de guanina, 320
de inosina, 320
de uracilo, 319
bandas cromosmicas G, Q, R y T, 93, 94.
V. tambin cromosomas.
bandeo o bandeado, 93
de alta resolucin, 95
de cromosomas, 94
de profase, 95
de prometafase, 95
barrera, mtodos de, 125
basal, 289. V. tambin promotores.
bases, efecto sobre la desnaturalizacin, 165
bases nitrogenadas
absorcin en el ultravioleta, 16, 167
carcter cido-base, 16
complementariedad, 38
componentes de cidos nucleicos, 14
derivados metilados, 15, 65, 215, 282
desaminacin, 394
eliminacin selectiva, 252
estructura, 14
infrecuentes, 15
numeracin de los tomos, 14
propiedades
cido-base, 16
fisicoqumicas, 16
tautomera, 16
vas de sntesis, 246
Bax, 471
bcl-1 (gen), 453
bcl-2 (gen), 453
Bcl-2 (protena), 471
Bcl-x (protena), 471, 474
B-DNA, 38, 47
Bdp1, 295
benzo[a]pireno, 398
benzoiladenina, 183
benzoilcitosina, 183
BER. V. escisin de bases.
berilio, 398
484
biblioteca de DNA. V. genoteca.

bicatenario, 40
bidireccional
replicacin, 148
biochips, 479, 172
bioinformtica, 418
biolstica, 231, 232
biologa molecular, 3
biopsia, 120
biotina, 189, 369
bisfosfatos, 13, 25
blastocele, 121
blastocisto, 121, 194, 200
blastodermo, 121
blastmeros, 121
Bloom (sndrome de), 448
bloques de repeticin. V. DNA repetitivo.
bombardeo, 231
Bombay (fenotipo), 413
brazos
en la estructura del tRNA, 66
BRCA (genes), 473, 475
BrdUrd o bromodesoxiuridina, 134
BRE, 289
Brf1, 295
Brf2, 295
bromocloropropano, 137
bromodominio, 285
bromouracilo, 398
bromuro de etidioetidio, 141. V. tambin etidio.
bucle, 62
bucle D, 161, 276, 416
burbuja, 62
de transcripcin, 272, 273
desplazamiento, 274
bZIP (protenas), 59
C
C2H2, 58. V. dedo de zinc.
C4, 58. V. dedo de zinc.
CA 125, 475
CAAT (secuencia o caja), 289, 292
cabeza de martillo, 73
cadmio, 398
cafena, 15
caja
A (promotor), 295
B (promotor), 295
C (promotor), 295
CAK. V. quinasa activadora de Cdk.
calcio
cloruro, 231
fosfato, 231
calcitonina, 475
calmodulina, 361
calpanas, 379
cambio de a a d o e
cAMP. V. AMP cclico.
cncer
angiognesis, 450
como enfermedad gentica, 450
concepto, 449
de colon, 475
de hgado, 475
de la lnea germinal, 474, 475
de mama, 475
hereditario, 473, 475
de ovario, 473, 475
de prstata, 475
de tiroides, 475, 476
de tero, 475
diagnstico, 429
etapas, 451
germinal y somtico, 473, 475
heptico, causado por deficiencia de
antitripsina, 414
hereditario, 473
herencia, 475
in situ, 451
invasivo, 451
origen
monoclonal, 451
por mutacin, 451
vascularizacin, 452
y metilacin del DNA, 287
y telomerasa, 161
catropos, 136
CAP. V. protena receptora de AMP cclico.
caperuza
50 , 300
metilacin, 301
papel
en el inicio de la traduccin, 335
protector, 301
tipos 0, 1 y 2, 301
de guanina. V. caperuza 50 .
de guanosina. V. caperuza 50 .
cpsida, 4
cpsula bacteriana, 4
carabinas, 372, 373
actividad ATPasa, 374
funcin, 376
Hsp pequeas, 376
Hsp10, 375
Hsp26, 376
Hsp27, 376
Hsp40, 374
Hsp60, 375
Hsp70, 374
Hsp90, 375
multimricas, 375
tipos, 374
caracteres, 98
b-carboxiaspartato, 359
g-carboxiglutamato, 359
carboxilacin
de aminocidos, 359
carboxilasa, 359
cariograma, 92. V. tambin cariotipo.
de flujo, 247
cariotipo
anlisis, 92
485
ndice alfabtico
cariotipo (cont.)
molecular, 177
preparacin, 92
cartografa, 240. V. tambin mapa.
cascada
de caspasas, 473
de seales, 460
casena, fosforilacin, 359
caspasa
activacin en cascada, 473
ejecutora, 473
inhibicin, 474
iniciadora, 473
casquete. V. caperuza.
catepsinas, 377
CBP, 335, 347
Cdc25, 465, 467
Cdk, 462
activacin, 467
cclica, 464, 468
por quinasa, 465
actividad quinasa, 465467
complejo con ciclina, 463465, 467
especificidad de sustrato, 464
fosforilacin, 465, 467
de Rb, 471
inhibicin por quinasa, 465
inhibidores, 466
quinasa activadora de, 467
quinasa inhibidora de, 467
regulacin, 466, 467
del ciclo celular, 467
por fosforilacin, 464, 466
sntesis, 465
sustratos, 468
tipos, 465
unin con ciclinas, 464, 465, 467
cdk1 (gen), 455
Cdk1
como oncoprotena, 455
Cdk2, 469
inhibicin por p21, 471
cDNA, 174, 207, 263
como inserto, 222
genotecas de, 238
preparacin, 222
y EST, 248
CEA, 475
cebado al azar, 187
cebadores, 148, 156, 269. V. tambin primasa.
eliminacin, 158
empleo en PCR, 202
ceguera a los colores, 440
celadoras. V. carabinas.
clulas
competentes, 231
en cultivo, como muestras, 123
hbridos
monocromosmicos, 246
subcromosmicos, 246
mtodos de separacin, 124
recambio, 452
vida media. V. apoptosis.
clulas anfitrionas, 219
E. coli como prototipo de, 230
tipos, 230
clulas germinales, 99, 102, 196, 198, 200
ciclo celular, 104
primordiales, 104, 105
clulas hospedadoras. V. clula anfitriona.
clulas madre, 197. V. tambin clulas troncales.
clulas somticas, 99
ciclo celular, 104
hbridas muestras para preparar, 244
clulas troncales
de adulto, 198, 200
EG, 198, 200
embrionarias, 122, 196, 198, 200
ES, 198, 200
multipotentes, 198, 200
obtencin, 198
PG, 198
pluripotentes, 121, 196, 198, 200
totipotentes, 191, 198, 199
centimorgan, 243
centrifugacin
de equilibrio de sedimentacin, 126
de velocidad de sedimentacin, 126
diferencial, 125, 135
fundamento, 125
isopcnica, 81, 117, 125, 126, 140, 147
para elutriacin, 126
ultracentrifugacin, 139
zonal, 125, 126, 140
centro
de ayuste 30 y 50 , 303
de ramificacin, 303
centrmeros, 89, 90, 91, 95, 101
en vectores de clonacin, 230
y DNA satlite, 116
cesio, 81. V. tambin centrifugacin isopcnica.
CFTR. V. regulador de la conductancia transmembrana.
cGMP. V. GMP cclico.
Chambord (castillo de), 44
chaperonas. V. carabinas.
Chargaff (reglas de), 36, 41
chips de DNA. V. biochips.
choque trmico, 374
ciclinas, 464
A, 464
actividad quinasa, 466
B, 464
complejo con Cdk, 463, 464, 465, 467
D, 461, 463
D1, como oncoprotena, 455
de G1, 461, 463
de G2, 461, 463, 464
de inicio. V. ciclina de G1.
degradacin, 466, 468
E, 461, 463
F, 463
mittica. V. ciclina de G2.
486
ciclinas (cont.)
sntesis, 464, 468
tipos, 463
ciclo
de elongacin en la traduccin, 340
del factor eIF-2, 336
interferencia, 352
ciclo celular, 99
estmulos
de detencin, 469, 471
de progresin, 468
fases, 100, 104
freno por p53, 471
oncogenes relacionados, 469
puntos de control, 462
regulacin, 462
por Cdk, 467
y condensacin, 104
ciclofosfamida, 398
cicloheximida, 344
cigoto, 104, 105
cinetocoro, 95
CIP1, 464
CIP1 (protena), 466
ciprofloxacina, 278
circularizacin, 209, 226
cirrosis, 414
cis, 355. V. tambin Golgi.
elementos, 288
factores, 288
secuencias, 288
cisplatino, 398, 400
cistena, en centro activo de la alquiltransferasa, 400
cistena endopeptidasas, 473
cistrn, 324
citidilato, 21
citidina, 18
citidina desaminasa, 306
citocinas, 478, 476
citocinesis, 101
citocromo c, 361
como seal activadora de apoptosis, 471
citofluormetro, 127
citogentica, 90, 91, 95
citmetro de flujo, 127, 247
citoquinesis. V. citocinesis.
citosina
metilada, 282
CKI. V. Cdk, inhibidores.
clasificacin de protenas, 354.
V. tambin trfico.
clon
concepto, 191
neoplsico, 449
clonacin
introduccin general, 191
objetivos, 219
clonacin acelular. V. PCR.
clonacin celular, 193, 211
esquema general, 219
etapas, 219
para obtencin de sondas, 180

preparacin del inserto, 221
clonacin funcional, 418
clonacin teraputica, 197
clones, 235
biblioteca de, 236
cloranfenicol, 344
clorobioocina, 278
cloroformo: en la extraccin de DNA, 136
cloroplastos, 5, 355
cloruro clcico, 231
cloruro de cesio, 81, 116. V. tambin
centrifugacin isopcnica.
cM. V. centimorgan.
CMP-silico, 367
coactivadores, 294
cobalamina
50 -desoxiadenosil-, 19
cocarabinas, 374, 375
codificacin
relacin de, 314
unidad de, 314
codificante, 267
cdigo gentico, 313
degeneracin, 318
determinacin experimental, 315
diferencias, 321
mitocondrial humano, 321
representaciones
en tabla, 316
rectangulares, 316
segundo cdigo, 329
universalidad, 321
CODIS, 421
codominante, 98, 436
codn, 313, 315
AUG, 317, 333
de inicio, 317
de paro. V. codn de terminacin.
de terminacin, 317, 340
emparejamiento con el anticodn, 319
nmero
necesario, 314
por aminocido, 318
sin sentido. V. codn de terminacin.
sinnimos, 318
solapantes, 314
superpuestos, 314
tamao, 314
coeficiente de sedimentacin, 63, 76
coenzima A, 25
coenzimas
nucleosdicas, 19
nucleotdicas, 25
cofactores generales, 294
cohesivos
telmeros, 158
asociacin de extremos, 217
cohesivos (extremos), 215
cola de poli(A), 139, 222, 223, 302
efecto protector, 347
487
ndice alfabtico
colgeno, 451
hidroxilacin, 360
colgenos, 363
colchicina, 93
colonias, 233
azules, mtodo de, 235
colonias. V. bacterias y clones.
compactacin, 79. V. tambin condensacin.
del DNA, 79
compartimentos subcelulares, 354
compatibles, 216
competente, 231
complejidad del genoma, 111
complejo
abierto, 273
de empalme. V. ayustosoma.
de iniciacin 80S, 335, 336
de inicio de la transcripcin, 291
modelos, 291
de preiniciacin 40S, 335
de reparacin, 402
de translocacin, 358
hierro-azufre, 350
proteinasa multicataltico, 379
complementariedad, 38
imperfecta, 169
perfecta, 169
concepto, 454
condensacin, 83, 94, 101
del DNA, 79
en la apoptosis, 472
grado de, 85
niveles, 85, 104
relacin con la transcripcin, 268
y acetilacin de histonas, 285
y ciclo celular, 104
y regulacin de la transcripcin, 281
conformacin
anti y sin de los nuclesidos en el DNA, 50
C20 -endo y C30 -endo, 49, 62
de la desoxirribosa en A- y B-DNA, 49
no superenrollada. V. conformacin relajada.
relajada, 80
superenrollada, 81
congnitas, diagnstico, 427
conservadora. V. mutacin por sustitucin.
constitutivo (gen), 292
constricciones secundarias, 90
cntigos, 250
controles G1/S, G2/M y M, 461-463
cordocentesis, 122
corea de Huntington. V. Huntington.
corion, 122
correccin
de errores en la traduccin, 330
de pruebas, 150
cortadoras infrecuentes, 237, 248, 250
corte
y empalme. V. ayuste.
y pegado. V. ayuste.
cortes tisulares, hibridacin, 176
cos, 229
csmidos, 229
cotranscripcin, 272
cotransformacin. V. transformacin.
CPEO, 442
CPRG, 189
CPSF, 302
creatinquinasa, 476
cremallera de leucina, 59
Creutzfeld-Jacob (enfermedad de)
cribado neonatal, 428
Cro (protena del fago lambda), 58
cromtidas, 85, 90, 101
separacin anmala, 448
cromatina, 6, 84
actividad transcripcional, 89, 281
condensacin, 101
descondensacin, 101
extendida, cartografa por FISH, 247
remodelado, 281
cromo, 398
cromodominio, 285
cromosoma, 6, 84
acntrico, 95, 448
acrocntrico, 90, 91, 448
anomalas. V. cromosomopatas.
anular, 448
artificial, 227, 230
asas, 85, 88
bandas, 94
brazos, 90, 101
clasificacin, 91
derivado, 448
dicntrico, 448
hibridacin, 177
homlogos, 96
interfsico, 85, 101
cartografa por FISH, 247
isocromosomas, 448
metacntrico, 90, 91
metafsico, 85, 90, 101
morfologa, 90, 91
nmero, 7, 8, 95
pares, 96
pintado de, 177
recombinantes, 241
reparto en la divisin celular, 107
rotura, 448
segregacin, 106, 107
sexuales, 95, 96
submetacntrico, 90, 91
tamao, 90, 91
X, 95
inactivacin, 89
por acetilacin, 285
Y, 95
cromosomopatas, 442
adquiridas, 443
488
cromosomopatas (cont.)
concepto, 442
constitutivas, 443
estructurales, 447
nomenclatura, 443
numricas, 444
somticas, 443
CRP. V. protena receptora de AMP cclico.
cruciforme, 55
CSB, 274
CTD, 272
asociacin con la caperuza 50 , 302
en inicio y elongacin de la transcripcin, 273
fosforilacin, 273, 291
CTF, 292
cuerpo
de empalme. V. ayustosoma.
de inclusin, 373
polar, 105
cultivo de clulas anfitrionas para clonar, 233
cumarol, 359
cumermicina, 278
curvas
Cot, 118
de desnaturalizacin, 167
de fusin. V. curvas de desnaturalizacin.
D
dactinomicina, 398
daltonismo, 440
DAPI, 94, 176, 177
daunomicina, 278
daunorrubicina, 278
dcc (gen), 456
ddNTP. V. didesoxinucletidos.
DEAE-dextrano, 231
dedo de zinc, 58
dedos de zinc, 288
defectos nutricionales, para la seleccin de clones
recombinantes, 234
degeneracin
del cdigo gentico, 318
aplicacin al diseo de sondas, 184
e impacto sobre las mutaciones, 318, 319
delecin, 387, 388
cromosmica intersticial, 448
cromosmica terminal, 448
densidad
gradiente, 125
DEPC. V. dietilpirocarbonato.
desacetilasas de histonas, 285
desaminacin, 394
de la citosina, reparacin, 402
reparacin de, 402
desarrollo embrionario, 310
descondensacin, 84, 85, 101
desenrollamiento, 154, 268
en la transcripcin, 273, 274
desequilibrado, 448
desfosforilacin, 359
del extremo 5 del mRNA, 300
deshidrogenasas, 133
en ensayos de viabilidad, 133
desmetilasas, 283
en regulacin de la expresin, 286
desnaturalizacin
agentes causantes, 164
curvas de, 167
del promotor, 273
en la PCR, 202, 203
local por la unin de protenas, 57
reversible. V. renaturalizacin.
y contenido en G+C, 167
y propiedades del DNA, 165
desoxirribonucleasas. V. DNasas.
desoxirribosa, 14
desplazamiento de la mella. V. traslado de la mella.
despurinacin, 395
destino
de protenas, 354
deteccin
de clones recombinantes, 234
directa, 185
indirecta, 185
dextrorso, 43
diagnstico prenatal, 121, 426
diana, 168
de restriccin, 212
dicntrico. V. cromosoma.
Dicer, 309
dictiosomas, 355
didesoxinucletidos, 253
dietilestilbestrol, 398
dietilpirocarbonato, 135
diferenciacin, 310
diferencias entre gentico y
fsico, 240
difosfatos, 12
difraccin de rayos X
para la estructura del DNA, 35
para la estructura del tRNA, 67
DIG. V. digoxigenina.
digestin
doble, 248
enzimtica, 124
parcial del DNA genmico, 237
digoxigenina, 189
dihidrouridina, 65
dmeros de timina, 400
reparacin, 400
dimetilnitrosamina, 397
dimetilsulfato, 397
para secuenciacin, 252
dimetoxitritilo, 183
dinuclesido polifosfatos, 25
dioxetano, 189
dioxigenasa, 360
diploida, 7, 95, 102, 104, 444
disenzimia, 434
disgregacin
de tejidos, 135
enzimtica, 124
qumica, 124
489
ndice alfabtico
disoma, 444
displasia, 451
distal. V. promotores.
distrofia muscular de Duchenne, 440
disyuncin, 106
defecto de, 445, 447
diversidad gentica. V. polimorfismo.
divisin
meitica. V. meiosis.
mittica. V. mitosis.
reductora. V. meiosis.
DMT, 183
DNA, 3
agrupado, 110, 111
altamente repetitivo, 115
anlisis de tamao por electroforesis, 143
basura, 69, 111
carcter polianinico, 84
chatarra, 111
circular, 148
codificante, 9, 110, 261, 264, 267
comparacin entre las formas A,
B y Z, 47
complementario. V. cDNA.
composicin. V. G + C.
dao y protena p53, 471
de copia nica, 9
densidad, 140
deteccin, 141
disperso, 110, 111
escalera, 141, 143, 474
espaciador, 87, 281, 474
esqueleto, 84
fetal, 122
forma
A. V. A-DNA.
B. V. B-DNA.
mutante, 383
silvestre, 383
Z. V. Z-DNA.
fragmentacin
en la apoptosis, 472, 474
anlisis electrofortico, 472
hipermetilado, 287
hipometilado, 286
iniciador, 157
interaccin con protenas, 56
intergnico, proporcin en el genoma, 110
internucleosmico, 474
ligero, 147
marcaje, 147
masa en la clula, 7
metabolismo, 145
metilacin, 282
microsatlite, 118, 421
minisatlite, 117, 421
mitocondrial, 110, 276
hebra
ligera (L), 161
pesada (H), 161
marcadores, 424
polimorfismo, 424
utilidad, 416
moderadamente repetitivo, 115
molcula(s)
progenitora, 145
hijas, 145
no codificante, 9, 110, 264, 267
pesado, 147
proporcin de bases, 36
reasociacin. V. renaturalizacin.
recombinante, 219
reparacin. V. reparacin del DNA.
repetitivo, 9, 110, 111
agrupado, 111
codificante, 112
codificante disperso, 115
disperso, 111
no codificante, 115, 421
satlite, 89, 116, 140, 421
tincin, 141
tipos en el genoma, 110
variantes estructurales, 47
velocidad de sntesis, 152
DNA glicosilasa. V. N-glicosilasas de DNA.
DNA ligasa. V. ligasa.
DNA metiltransferasa. V. metilasa.
DNA polimerasas, 85, 149, 157
actividades enzimticas, 151
centros activos, 150
del fago T7, 252
empleo para el marcaje de sondas, 187
eucariticas, 151
fragmento de Klenow, 150
masa molecular, 152
Pfu, 205, 208
procariticas, 150, 151
propiedades, 151
subunidades, 150, 152
Taq, 202, 206, 252
termoestable, 202
tipos, 151
Tth, 208
ubicacin subcelular, 151
velocidad, 151
I, 150, 151
I, aplicacin para la preparacin de sondas, 187
I, en la sntesis de cDNA, 222, 223
I, en marcaje de sondas, 187
I, fragmento de Klenow, 187, 252
II, 150, 151
III, 150, 151
III, modelo molecular, 152
III, ncleo, 152
a, 151, 154, 156, 157
a, en la sntesis de telmeros, 160
b, 151
b, actividad fosfodiesterasa, 402
g, 151
d, 151, 157
e, 151, 157
z, 151
h, 151
490
DNA polimerasas (cont.)

u, 151
i, 151
k, 151
l, 151
m, 151
DNApol. V. DNA polimerasas.
DNasas, 86, 212
I pancretica, 187
II, 212
DNMT. V. DNA metiltransferasa.
doble hlice
apilamiento, 44
carcter
hidrfilo, 44
hidrfobo, 44
curvatura, 51
de tipo A
en el DNA. V. A-DNA.
en el RNA, 62
enlaces de hidrgeno, 44
formacin de triple hlice, 55
fuerzas estabilizadoras, 44
parmetros, 43
posicin de los fosfatos, 44
relacin con la replicacin, 46
dogma central de la gentica molecular, 4, 323
comparado en citosol y mitocondria, 261
dolicol, 367
fosfato, 368
pirofosfato, 368
dominante, 98, 436
dot-blot, 171
Down (sndrome de), 447
doxorrubicina, 278
DPE, 289
drepanocitosis, 420, 438
Drosha, 309
dRPasa. V. desoxirribonucleasa.
DSE, 295
DSIF, 274
Duarte. V. galactosemia.
Duchenne (distrofia muscular de), 440
duplicacin, 407
E
E1A (protena), 471
E1B (protena), 472
E2F (protena), 468, 470
E6 (protena), 472
E7 (protena), 471
edad materna
y riesgo de trisoma, 447
edicin del RNA, 305
EDTA, 135
Edwards (sndrome), 447
eEF. V. factores de elongacin de la traduccin.
EGF. V. factor de crecimiento epidrmico.
eIF. V. factores de iniciacin de la traduccin.
elastasa
inhibicin por antitripsina, 414
elastina, 414, 451

electroforesis, 171, 178
calibracin, 143
en campo pulsante, 143, 248
en gel con gradiente de temperatura, 413
fundamento, 141
preparacin de geles, 141
resolucin, 141
tipos de gel y tamao de DNA, 141
electroporacin, 231, 232
electrosttica (interaccin), 188
elementos
de respuesta. V. promotores distales.
de respuesta a hierro, 350
de respuesta a hormonas, 293
especficos de regulacin. V. promotores distales.
mviles. V. transposones.
nucleares dispersos
cortos. V. SINE.
largos. V. LINE.
transponibles. V. transposones.
ELL, 274
elongacin
de la replicacin, 156
etapas, 157
mecanismo, 157
de la traduccin, 337
translocacin, 339
transpeptidacin, 339
ubicacin, 337
de la transcripcin
complejo de, 274
factores, 274
en la PCR, 203
elonguina, 274
elutriacin centrfuga, 127
embriognesis
metilacin del DNA, 286
empaquetamiento, 83
emparejamiento
codn-anticodn, 319
de bases, 38. V. tambin complementariedad.
entre 3 bases, 66
intracatenario, 62, 66
temporal, 269
incorrecto, 403
encefalomiopata mitocondrial con acidosis lctica e
incidentes similares a apopleja, 442
endocitosis, 355
endomitosis, 96
endonucleasas
de restriccin. V. enzimas de restriccin.
de tipos a y b, 212
en la reparacin, 402
FEN1. V. FEN1.
generacin del extremo 30 del mRNA, 302
endosomas, 355
enfermedad(es), 427, 448. V. tambin bajo el nombre
especfico
asociadas a la reparacin del DNA, 404
autosmicas
491
ndice alfabtico
enfermedad(es) (cont.)
concepto, 434, 436
dominantes, 437
recesivas, 438
citogenticas, 442. V. tambin cromosomopatas.
clasificacin molecular, 432
complejas, 442
congnitas
diagnstico, 426, 427
cromosmicas, 434, 442. V. tambin
cromosomopatas.
de Huntington. V. Huntington.
dominantes ligadas a X, 439
genticas, 409, 417, 432
bsqueda del gen responsable, 425
cromosoma afectado, 434
productos gnicos, 434
hereditarias, 384
bsqueda de genes por cartografa gentica, 244
ligadas a Y, 441
ligadas al sexo, 439-441
concepto, 434, 436
mitocondriales, 441
concepto, 434
mixtas, 442
moleculares, 431
monognicas, 434, 435
ejemplos, 435
herencia, 435
multifactoriales, 442
polignicas, 442
recesivas ligadas a X, 440
enfisema, 414, 438
enlace
de hidrgeno
de tipo Hoogsteen, 56, 66, 319, 320
de tipo Watson y Crick, 319, 320
disulfuro, 369
fosfoanhdrido, 12
fosfodister, 13, 149, 269
atpico 50 -20 , 305
fosfoster, 11
N-glicosdico, 17, 364
N-glicosdico, hidrlisis, 395, 402
O-glicosdico, 364
S-glicosdico, 364
isopeptdico, 378
peptdico, formacin, 339
tioster con ubicuitina, 377
topolgico, 82
trifosfato 50 -50 , 300
enrollamiento
en la transcripcin, 274
enteroquinasa, 370
enucleacin, 194
envejecimiento
y telmeros, 160
enzima
activadora de ubicuitina, 377
como marcador de sondas, 185
hidroltica en lisosomas, 377

portadora de ubicuitina, 377
enzima de restriccin, 211
aplicacin a la cartografa, 248
caractersticas generales, 212
clasificacin, 213
como mecanismo de defensa en las bacterias, 213
cortadoras infrecuentes. V. cortadoras.
de tipo I, 213
de tipo II, 213, 215
bacteria de origen, 216
ejemplos concretos, 216
nomenclatura, 216
secuencias diana, 216
de tipo III, 213
en la preparacin de genotecas, 237
especificidad, 212
estructura, 213
frecuencia de reconocimiento, 248
nomenclatura, 212
para linealizacin de plsmido, 181
para sntesis de sondas, 187
sitios de reconocimiento, 212
epigentico, 282, 448
epilepsia mioclnica asociada a fibras rojas rasgadas, 442
equilibradas
hebras del DNA, 43
equilibrado, 448
equivalente genmico, 238
erbA (gen), 453
erbB (gen), 453
eRF. V. factores de terminacin de la traduccin.
eritromicina, 344
errores congnitos del metabolismo, 432
escalera doble helicoidal, 44
escalonados (extremos), 215
escinucleasa
estructura, 401
escisin
mecanismo, 402
de nucletidos, 400
mecanismo, 400
escorbuto, 360
esparsomicina, 344
especies reactivas de oxgeno, 416
espectrofotometra, 189
espermtidas, 104
espermatocitos, 104
espermatognesis, 102, 104
espermatogonios, 102, 104
espermatozoides, 85, 104
espermidina, 31
espermina, 31
esqueleto nuclear, 85, 88
EST, mapa fsico, 248
estabilidad del RNA, 347
estearato, 361
esterasas, en ensayos de viabilidad, 133
estimuladores, 290
estreptavidina, 129, 189
492
estreptolidigina, 276
estreptomicina, 343
estructura
terciaria relacin con la secuencia, 373
tridimensional de protenas, prediccin, 372
estructural. V. tambin gen, secuencias.
secuencias gnicas, 110
estudios familiares, 424
etanolamina, 367
etidio, 141, 278
etilmetanosulfonato, 397
etiquetas, 357. V. tambin pptido seal.
de secuencias expresadas. V. EST.
eucariontes. V. eucariotas.
eucariotas, 3
diferencias con procariotas, 5
eucromatina, 85, 88, 286
y actividad transcripcional, 269
euploida, 444
exclusin, ensayos de, 131
exocitosis, 355
exones, 299
concepto, 110, 264, 299
disposicin en el gen, 264
proporcin en el genoma, 110
exonucleasas, 212
30 y 50 , 150
50 en marcaje de sondas, 187
expresin
diferencial, 174
genes de, 293
gnica, 4
basal, 293
diferencial, 279
niveles de regulacin, 280
regulacin, 279
postranscripcional, 309
regulada, 293
extena, 371
extremos
30 , modificacin, 302
50 , modificacin, 300
cohesivos, 215, 217. V. tambin cohesivos.
compatibles, 216
romos, 215, 217. V. tambin romos.
F
FACS, 128, 247
factor(es), 157
activador de las proteasas apoptticas, 473
asociados a TBP, 291, 294, 295
de coagulacin
carboxilacin, 359
VIII de la coagulacin, 440
de crecimiento
derivado de plaquetas, 452, 454
epidrmico, 453, 455
b de crecimiento transformante, 457
de terminacin mitocondrial, 276
estimulador de la poliadenilacin
por escisin, 302
inhibidores del crecimiento, 454, 456

promotor de la maduracin o de la fase M, 464
factores de elongacin de la traduccin
eEF-1A, 337
regeneracin, 337
eEF-1B, 337
eEF-2, 339
factores de iniciacin de la traduccin, 334
eIF-2, 335, 336
actividad GTPasa, 336
regeneracin, 336
eIF-2B, 336
eIF-3, 335
eIF-4A, 335
eIF-4B, 335
eIF-4C, 335
eIF-4E, 335, 347
eIF-5, 335, 336
eIF-6, 335
factores de terminacin de la traduccin
eRF, 340
factores de traduccin, 334
factores de transcripcin, 56, 85, 272
asociacin en el complejo de inicio, 293
coactivadores, 294
cofactores generales, 294
como oncoprotenas, 453
como oncosupresores, 455
de cadena arriba, 292
de la elongacin, 274
definicin, 288
E2F, 468, 470
funcin, 288
generales, 291
inducibles, 293
interaccin con la RNA polimerasa, 293
mitocondrial, 276
motivos estructurales, 288
Myc, 468, 470
p53, 471
proximales, 292
SREBP, 473
TFI, 295
definicin, 288
TFII, 290
definicin, 288
TFIIA, 291
TFIIB, 291
TFIID, 291
TFIIE, 273, 291
TFIIF, 273, 291
TFIIH, 273, 291, 404
como helicasa, 291
como protena quinasa, 291
en la reparacin, 401, 402
subunidades, 402
TFIII, 295
definicin, 288
TFIIIA, 58, 295
TFIIIB, 295
TFIIIC, 295
493
ndice alfabtico
factores de transcripcin (cont.)

TFIIK, 291. V. tambin TFIIH.
TFIIS, 274
FAD, 25
FADH2
coenzima de la fotoliasa, 399
fagos, 228. V. tambin
bacterifagos.
l, 228
M13, 228
falciforme, 390, 420, 438.
V. tambin anemia.
Falconi (anemia de), 448
FAM, 256
familias
gnicas, 112
multignicas, 112, 407
frmacos, respuesta individual, 429
farnesilo, 362
farnesiltransferasa
y terapia antitumoral, 362
far-western, 179
fase
analtica, 119
de reposo, 100
G0, G1, G2 y M, 100
postanaltica, 119
preanaltica, 119
S, 100
Fast Red TR, 189
FCR V. fuerza centrfuga relativa.
fecundacin, 104, 108
FEN1, 158, 413
en la reparacin, 402
en la sntesis de telmeros, 160
fenilalanina-4-monoxigenasa, 438
fenilcetonuria, 438
fenol, en la extraccin de DNA, 136
fenotipo, 98
fenoxazona, 277
ferritina, 350
feto
DNA, 122
sangre, 122
fetoprotena a, 477
fetoscopia, 122
fibra
bsica de cromatina, 87. V. tambin fibra
de 10 nm.
de 10 nm, 85, 87
y control pretranscripcional, 281
y transcripcin, 269
de 30 nm, 85, 88
fibrilina, 437
fibrosis qustica
herencia, 438
Ficoll, 125
FISH, 95, 176, 177. V. tambin hibridacin in situ con
fluorescencia.
cromosmica, 246
fitohemaglutinina, 93
fluctuacin. V. balanceo.
fluorescena, 186, 256
diacetato de carboxifluorescena, 133
fluorimetra, 189
fundamento, 127
fluorocromo, 177, 127, 189, 206, 247, 252
para el marcaje de sondas, 185, 186
para secuenciacin del DNA, 256
fluorforo, 127
fMet. V. N-formilmetionina.
FMN, 25
formaldehdo, 165
formamida, 165, 169
formamidopirimidina-DNA glicosilasa, 403
formazano, 133
formiato, para secuenciacin, 252
formiato-tetrahidrofolato ligasa, 334
frmico (cido), para secuenciacin, 252
formilacin de metionina, 334
N-formilmetionina, 334
formiltetrahidrofolato, 334
fos (gen), 453
fosfatasa cida prosttica, 475
fosfatasa alcalina, 187, 189, 226
isoenzimas por duplicacin gnica, 407
fosfatasa inorgnica, 328
fosfato clcico, 231
fosfato inorgnico (Pi), 11
fosfato a en NTP. V. nucleoflico, marcaje.
fosfato g en NTP. V. marcaje.
fosfodiesterasa
I, de veneno de serpiente, 212
II, de bazo bovino, 212
fosfoprotena fosfatasa, 462
fosforamidita, 183
fosforilacin, 462
como mecanismo regulador, 359
de aminocidos en las protenas, 359
de eIF-2, 352
de histonas, 286
del CTD, 273
del dominio CTD, 272
reversible, 359, 464
fosforilasa fosfatasa, 359
fosforilasa quinasa, 359
fosfoserina/fosfotreonina fosfatasa, 359, 464
fosfotirosina fosfatasa, 359, 464
fotodmeros, reparacin, 399
fotoliasa, 399
fotoproductos, 398
fraccin de recombinacin. V. frecuencia.
fracciones subcelulares, 135
fragmentos de restriccin, 215
frecuencia de recombinacin, 242
interpretacin, 243
FRET, 206
fucosa, 364
fucosiltransferasa, 411
494
fuerza centrfuga relativa, 125

funiculocentesis, 122
fusdico (cido), 344
fusin
celular, 244
del DNA, 167
G
G+C (contenido), 38, 139, 167
galactosa, 364
galactosa-1-fosfato uridililtransferasa, 413
galactosaminiltransferasa, 411
galactosemia
bioqumica, 413
descripcin, 413
gentica, 413
genotipos y fenotipos, 413
localizacin cromosmica, 413
mutaciones causantes, 414
b-galactosidasa, 189, 228, 234
galactosiltransferasa, 411
GALT. V. galactosemia.
gametognesis, 102
gametos, 97, 99, 102
ganciclovir, 15
GC (caja), 292
GC (secuencia o caja), 289
GDP-fucosa, 367
GDP-manosa, 367
gen
AB0, 410
anlisis, 417
bsqueda. V. genes, anlisis.
comparado con cistrones, 325
con varios productos gnicos, 265, 298
constitutivos, 292
de clase I, definicin, 288
de clase II, definicin, 288
de clase III, definicin, 288
de expresin diferencial, 293
de mantenimiento, 292
de resistencia a antibitico, 223
definicin, 263
actual, 265
casos lmite, 265
matizaciones, 264, 298
eucaritico
componentes, 264
promotores, 264
secuencias
estructurales, 264
reguladoras, 264
evolucin del concepto, 263, 265
expresin. V. expresin gnica.
H, 410.
fragmentos de, 114
y transcripcin, 267
inducibles, 290, 293
marcadores, 223, 234
monomorfos, 409
nomenclatura, 266
oncosupresor, 454. V. tambin oncosupresor.

NF1, 393
organizacin, 299
polimorfos, 409
regiones
no traducidas 50 y 30 , 264, 298, 299
no traducidas internas. V. intrones.
traducida, 264
transcrita, 264
transcritas eliminadas antes de la traduccin, 264
regulables, 293
secuencias
estructurales, 110
reguladoras, 110
terminadoras, 264
solapantes, 265
supresor de tumores, 393, 454, 456. V. tambin
oncosupresor.
truncados, 114
variantes, 114, 409
genealoga, 424
gnico, 240
genochips. V. biochips.
genoma, 3, 5
codificante, 267
diversidad. V. polimorfismo.
extranuclear, 6
fraccin transcrita, 267
nuclear, 6
tamao, 6, 8
tipos de DNA, 110
genoma humano
datos, 6
nmero
de cromosomas, 6
de genes, 9
tamao, 6
genoma mitocondrial
caractersticas, 10
magnitud, 10
genmica, 239, 432
estructural, 417
genosensores. V. biochips.
genoteca, 236
de cDNA, 238
en la bsqueda de genes, 417
genmicas, 237
nmero de clones, 238
genotipo, 98
gentamicina, 344
geometra de los pares de bases
comparada en A- y B-DNA, 49
geranilgeranilo, 362
geranilo, 362
Giemsa (tincin), 94
girasa, 156
inhibicin por antibiticos, 278
glicanos. V. oligosacridos.
N-glicanos
estructura central, 365
reacciones de biosntesis, 368
495
ndice alfabtico
N-glicanos (cont.)
ricos en manosa, complejos e hbridos, 366
tipo complejo, 366
tipo hbrido, 366
O-glicanos, 364
glicolpido
en la biontesis de N-glicanos, 368
glicoprotenas. V. glicosilacin.
glicosaminoglicanos, 363
glicosilacin
en N-, 365
en O-, 364
localizacin subcelular, 367
propiedades que induce en la protena, 363
tipos, 364
ubicacin subcelular, 367
glicosilasa, 283
N-glicosilasas de DNA, 403
glicosilfosfatidilinositol, 367
glicosiltransferasas, 367
A y B, 411
de grupo sanguneo AB0, 410
globina
expresin en el desarrollo animal, 115
genes de, 114
herencia, 438
origen evolutivo, 114
polimorfismo, 420
S, 420
tipos, 115
velocidad de traduccin, 352
y talasemia, 438
bS, 390
glbulo fundido, 373
glucgeno fosforilasa, 359
glucosa, 364
g-glutamiltranspeptidasa, 476
glutaraldehdo, 188
glutatin, 369
GMP cclico, 25
Golgi (complejo o aparato de),
355, 368
gonadotropina corinica, 475
GPI, anclaje, 367
Gppp, 300
gradiente de densidad, 125,
140, 147
grnulos de secrecin, 371
Griffith, 4
gRNA. V. RNA gua.
GroEL, 375
GroES, 375
Grunberg-Manago y Ochoa, 269
grupo(s)
sanguneo AB0
anticuerpos, 410
antgenos, 410
bioqumica, 411
ensayo serolgico, 410
fenotipos, 410, 412
gentica, 410
genotipos, 412
localizacin cromosmica, 411
puntos polimrficos, 411
resumen, 412
prostticos, 369
GTPasa
protena Ras, 461
guanidina, 136, 137
guanilato, 21
guanosilacin
del extremo 50 del mRNA, 300
guanosina, 18
gua (hebra). V. adelantada.
Guthrie (tarjeta), 122
H
haplogrupo, 416
haploide, 7, 95, 102, 104
haploida, 444
haplotipo, 242
HAT (medio de cultivo)
composicin, 246
fundamento para la seleccin de clulas, 246
HAT. V. histona acetiltransferasas.
hCG, 475
HCI, 352
HDAC. V. histona desacetilasas.
H-DNA, 55
hebra
adelantada, 156, 157
antisentido, 267
codificante, 267
con sentido, 267
H. V. DNA mitocondrial.
informativa, 267
L. V. DNA mitocondrial.
molde, 267. V. tambin molde.
negativa, 267
no codificante, 267
no informativa, 267
no molde, 267
no transcrita, 267
positiva, 267
transcrita, 267
helicasa, 153, 154
TFIIH, 291
hlice de reconocimiento, 57
hlice-bucle-hlice, 58
hlice-giro-hlice, 57
hlice-vuelta-hlice, 57
helicidad del DNA, 43
hemicigtico, 439
hemo, 369
como regulador de la traduccin, 352
hemofilia A, 440
hemoglobina
de clulas falciformes, 420. V. tambin hemoglobina S.
glucosilada, 363
S, 390, 420
496
hemoglobinopatas, 390
herencia, 4, 436. V. tambin rbol genealgico.
de las mutaciones, 383
del cncer, 473, 475
materna, 441
patrn
mendeliano, en enfermedades monognicas, 435
no mendeliano, 441
Hershey y Chase, 4
heterocarionte, 244
heterocigosis
y polimorfismo, 406
heterocigtico, 98
heterocromatina, 85, 88, 90, 116, 286
constitutiva, 89, 95
facultativa, 89
heterodplex, 168
heterogamtico, 97
heteroplasmia, 441
heteroploida, 444
hexosa fosfato isomerasa, 476
hexosaminidasa A
herencia, 438
mutacin, 391
HGPRT
deficiencia, 246
hibridacin, 163
anlisis molecular, 168
de DNA, 171
de RNA, 172
de Southern. V. Southern.
dot-blot, 171
en fase lquida, 169
en la PCR, 202, 203
en soporte slido, 170., 172. V. tambin
sobre biochips.
especfica de alelo, 424
factores que afectan, 168
fundamento, 168
in situ, 175
con fluorescencia, 95, 177. V. tambin FISH.
mtodos, 169
Northern. V. Northern.
para la deteccin de clones recombinantes, 234
rigor, 168
slot-blot, 171
sobre biochips, 172
sobre cortes tisulares, 176
sobre preparaciones cromosmicas, 177
hbridos, 222, 223, 275
DNA-DNA, 163, 168
DNA-RNA, 163, 267
mRNA-cDNA, 222, 223
RNA-cDNA, 207
RNA-DNA, 62, 274
desestabilizacin en la terminacin
de transcripcin, 275
RNA-RNA, 163
hidrato de pirimidina-DNA glicosilasa, 403
hidrazina para secuenciacin, 252
hidrocarburos aromticos policclicos, 398
hidrofobia
de las bases nitrogenadas, 16
efecto hidrfobo, 16, 373
influencia en el plegamiento, 373
hidrlisis
alcalina del RNA, mecanismo, 32
qumica de cidos nucleicos, 31, 395
hidroxiapatito, 169
hidrxido (ion), 396
8-hidroxiguanina, 396, 398
hidroxilacin
de aminocidos, 360
hidroxilasas, 360
hidroxilo, 398
radical, 396
hidroxiprolina, 360
hierro
captacin, 351
reserva, 350
transporte, 351
hipercolesterolemia familiar, 174, 437
diagnstico, 428
hipercrmico, 166
hiperplasia, 451
hipervariables. V. regiones, minisatlites.
hipocrmico, 166
hiptesis
un gen - un polipptido, 263
un gen - un producto gnico, 265
un gen - un RNA, 265
un gen - una enzima, 263
un gen - una protena, 263
hipoxantina, 19
como resultado de la desaminacin, 395
en medio HAT, 246
hipoxantina/guanina fosforribosiltransferasa. V. HGPRT.
histona, 31, 87
acetilacin, 284, 359
ADP-ribosilacin, 286
fosforilacin, 286
genes de, 112
H1, 84, 88
H2a, 84, 88
H2b, 84, 88
H3, 84, 88
H4, 84, 88
acetilacin, 359
metilacin, 361
H5, 84, 88
metilacin, 285
octmero, 88
reduccin de la carga positiva, 284
sumoilacin, 286
tipos, 84
ubicuitinacin, 286
histona acetiltransferasas, 285
histona desacetilasas, 285
histona desmetilasas, 285
histona metiltransferasas, 285
HLH. V. hlice-bucle-hlice.
HMG (protenas), 85, 87
497
ndice alfabtico
HMT. V. histona metiltransferasas.

HNPP, 189
hnRNA, 63, 270, 298
hnRNP, 310
Hoechst, 94
Hogness (caja de). V. TATA.
holoenzima. V. modelo.
homeodominio, 58, 288
homocarionte, 244
homocigtico, 98
homodplex, 168
homogamtico, 97
homogeneizacin, 135
homologa de secuencia e hibridacin, 168
Hoogsteen. V. enlaces de hidrgeno de tipo Hoogsteen.
HOP, 376
hormonas
esteroides, receptores de, 293
tiroideas, receptores de, 293
horquilla, 54, 62, 157
de replicacin, 148, 154, 156. V. tambin retardada.
de replicacin C, 157
de RNA, 350
hospedadora. V. clula anfitriona.
HRE. V. elementos de respuesta a hormonas.
Hsp, 374. V. tambin protenas de choque trmico.
Hsp pequeas, 376
Hsp10, 375
Hsp26, 376
Hsp27, 376
Hsp40, 374
Hsp60, 375
Hsp70, 374
Hsp90, 375
hSPT4, 274
hSPT5, 274, 301
HTH. V. hlice-giro-hlice.
hTR. V. telomerasa, componentes.
huella
dactilar gentica, 416, 425
de DNA
y DNA minisatlite, 118
gentica, 416
humo, 400
productos mutgenos, 398
Huntington (enfermedad de), 437
huso mittico, 101
I
ICR, 295
identidad, pruebas de, 425
idiograma, 92
IF. V. factores de iniciacin de la traduccin.
impronta genmica, 286
inactivacin insercional, 234
incidencia, 433
indicadores, 185, 188
tipos, 189
individualidad gentica, 406
inducible
gen, 293
informacin gentica, 3, 261

informativa, 267
ingeniera gentica, 3, 211
inhibidor(es)
controlado por hemo, 352
promotores, elementos o secuencias, 290
iniciacin
aleatoria, 187
de la traduccin, energtica, 336
de la transcripcin, modelos, 272
inicio (punto de control del ciclo celular), 461
inicio
especificidad, 333
etapas, 334
por el extremo N, 324
de la transcripcin, 272
como punto de control, 287
complejo de, 272, 291
determinacin del punto de inicio, 291
modelos, 273
de la holoenzima, 292
escalonado, 291
transicin a elongacin, 273, 291
protenas de, 153
INK4, 466
inmunoanlisis, 129
inmunofilina, 376
inmunoglobulina M
gen y ayuste alternativo, 310
inosina, 19, 65
en el anticodn, 320
inositol, 367
Inr, 272, 289
insecto, 228
insercin, 387, 389
mtodo de preparacin de virus recombinantes, 229
inserto, 219
de cDNA, 222
tamao, 221
insulina, 370
integrinas, 451
intena, 371
intensificadores, 290
intercalantes, 94, 142, 188, 247, 277, 398
interfase, 99, 101
y transcripcin, 269
interfern, 344
intergnico, 110
intragnico, 110
intrn, 299
concepto, 72, 110, 264, 298
disposicin en el gen, 264
eliminacin por autocatlisis, 72
en forma de lazo, 304
en pre-tRNA, 308
magnitud, 303
nmero, 303
polimorfismo, 409
proporcin en el genoma, 110
498
intrn (cont.)
tipos I y II, 72, 305
tipos III y IV, 305
invasividad, 451
inversin
cromosmica, 448
paracntrica, 448
pericntrica, 448
IRE, 350
IRE-BP, 350
IRP, 350
islotes CpG, 167, 215
metilacin, 282
isobutirilguanina, 183
isocoros, 94
isocromosomas, 448
isoenzimas, 407
isoesquizmeros, 216
isoformas, 407
isoleucil-tRNA sintetasa
isopeptidasa, 379
isopeptdico, 378
isopcnica. V. centrifugacin.
istopos radiactivos, 189, 252
como marcadores de sondas, 185
para estudiar la traduccin, 324
isozimas, 407
IVS. V. intrn.
J
JOE, 256
jun (gen), 453
K
kanamicina, 344
Kaposi, 404. V. tambin xerodermia.
Kearns-Sayre (sndrome), 442
Khorana, 182
KIP, 464, 466
kirromicina, 344
Klenow (fragmento de), 150. V. tambin DNA polimerasa I.
para la sntesis de sondas, 187
Klinefelter (sndrome), 447
Kozak (secuencia de), 333
Kpn, 118
KSS, 442
L
L. V. nmero de enlace.
L1. V. LINE.
L-19 IVS, 72
lactato deshidrogenasa, 476
lacZ, 227, 228, 234
LA-PCR, 208
lazo. V. intrn.
LCR, 114
Leber (neuropata), 442
leucemia, 475
leucina. V. cremallera.
LHON, 442
Li-Fraumeni (sndrome), 471

ligamiento, 242
ligasas, 158, 217, 218
mecanismo de reaccin, 218
para formar el rDNA, 225, 226
LINE, 118
LINE-1, 408
linfoma, 475
lipofeccin, 231
liposomas, 231
lquido
amnitico, 121
articular, 124
asctico, 123
cefalorraqudeo, 123
pericrdico, 123
peritoneal, 123
pleural, 123
seroso, 123
sinovial, 124
lisis celular, 134
lisosomas, 355
en la degradacin de protenas, 377
primarios, 377
Lk. V. nmero de enlace.
lobucavir, 15
locus/loci, 97
distancia entre loci, 242
Los ngeles. V. galactosemia.
L-PCR, 208
luciferasa, 189
luciferinas, 189
lumen. V. retculo endoplsmico, Golgi.
luminol, 189
luz visible y reparacin del DNA, 399
Lymphoprep, 125
M
maduracin
de protenas, 358
de mRNA, 300
de rRNA, 307
de rRNA y tRNA, 72
postranscripcional, 261, 262, 264, 297
diferencias entre procariotas y eucariotas, 298
en la mitocondria, 309
regulacin, 309
magntico
microesferas, 129
manosa, 364
MAP quinasas, 461
mapas
de cntigos, 250
de ligamiento. V. mapa gentico.
de restriccin, 248
de SNP, 424. V. tambin polimorfismo SNP.
fsico
de baja resolucin, 244
499
ndice alfabtico
mapas (cont.)
de EST, 248
de restriccin, 248
de STS, 248
empleo de Southern, 248
interpretacin, 240, 248
resolucin, 248
gentico, 240
aplicacin para localizar un gen, 244
obtencin, 243
genmico, 240
de cntigos, 250
marca de secuencia expresada. V. EST.
marcadores, 185., 240., 247. V. tambin mapa.
de DNA mitocondrial, 424
EST. V. EST.
gentico, 240
gnicos, 248
no gnicos, 240, 248
no radiactivos, 189
polimrficos, 243
STR, 421
STS. V. STS.
tipos, 189
tumorales
clasificacin, 473, 476
de secrecin, 476
VNTR, 422
marcaje
con azufre radiactivo, 4
con cuatro fluorocromos, 255
con DNA polimerasa, 187
con fsforo radiactivo, 4
con indicador, 188
con polinucletido quinasa, 187
de NTP en fosfato a, 187
de NTP en fosfato g, 187
de sondas no nucleotdico, 188
deteccin, 189
directo, 186
en cultivo, 185
in vitro, 185
indirecto, 188
para la protelisis, 378
por cebado al azar, 187
por traslado de la mella, 187
terminal, 187, 252
por relleno, 187
marco de lectura, 314, 391
desplazamiento, 315
marco de lectura abierto, 318
Marfan (sndrome de), 437
material gentico
extranuclear, 5
nuclear, 5
matriz
extracelular, 124, 449, 451
nuclear, 85, 88. V. tambin esqueleto nuclear.
Max (protena de ratn), 58
Maxam y Gilbert, 252
May-Grnwald-Giemsa (tincin de), 88

b2mc, 475
MCS. V. sitio de clonacin mltiple.
mdm-2 (gen), 453
MeCP1, 284
MeCP2, 284
mediador, 294
medicina predictiva, 428
mdula sea
muestras, 122
puncin, 122
meiosis, 99, 101, 104, 107
comparacin con mitosis, 106
no-disyuncin, 445, 447
MEK, 461
MELAS, 442
mella, 187, 217, 218. V. tambin marcaje.
Mendel
primera ley, 106
segunda ley, 107
MERRF, 442
Meselson y Stahl, 147
metabolismo oxidativo, 396, 416
metafase, 101
metaloproteasas de matriz extracelular, 449
metstasis, 449, 451, 452
metil lisina, 361
metilacin
de aminocidos, 361
de histonas, 285
de la caperuza 50 , 301
de mantenimiento, 286
de novo, 286
del DNA, 282
en el desarrollo embrionario, 286
regulacin de la expresin gnica, 283
y cncer, 287
metilacin-restriccin, 213
metiladenina-DNA glicosilasa, 403
N-metil-4-aminoazobenceno, 398
N-metil-4-antraceno, 398
metilasas, 283, 301
asociadas a las enzimas de restriccin, 213
O6-metilguanina
reparacin de, 400
metilnitrosoguanidina, 397
metilnitrosourea, 397
metiltransferasas, 361
metionil-tRNA
iniciador, 334
metionil-tRNA-formiltransferasa, 334
metionina
incorporacin interna y N-terminal, 334
mtodos de introduccin del rDNA, 231, 232
metotrexato, 246
metrizamida, 125
MFP, 464
microarreglo de DNA, 172. V. tambin biochips.
microesferas magnticas, 129, 138
microglobulina b2, 475
microinyeccin, 194, 231, 232
500
micromatriz de DNA, 172. V. tambin biochips.

para el diagnstico, 428
microRNA, 63
microsatlites, 118. V. tambin DNA microsatlite.
aplicacin a la huella gentica, 425
microscopa, 130, 189
de fluorescencia, 94, 177
migracin de clulas tumorales, 451
minisatlites, 117. V. tambin DNA minisatlite.
aplicacin a la huella gentica, 425
hipervariables, 421
mioinositol, 367
miristato, 361
miristilacin de protenas, 362
miRNA, 63. V. tambin microRNA.
biosntesis, 309
mitocondrias, 5, 10, 355
divisin, 161
expresin gnica, 261
generacin de mutgenos, 396
rotura en la apoptosis, 472
mitgenos, 455
mitosis, 99-101, 104
comparacin con meiosis, 106
regulacin, 463, 464
seales de inicio, 468
sin citocinesis, 445
mixoploida, 444, 447
MMP. V. metaloproteasas de matriz extracelular.
modelo
de la holoenzima para el inicio de la transcripcin,
292, 273, 292
escalonado para el inicio de la transcripcin, 273, 291
modificacin
de aminocidos, 369
en protenas, 358
postraduccional, 353, 358. V. tambin procesamiento
postraduccional.
mdulos de control. V. promotores distales.
molde, 148, 261, 269
molculas seal, 459
mongolismo, 447
monocistrnico, 324
monofocal, 148
monomorfos, 409
monosoma, 444
mecanismo, 447
mrula, 121
mosaico, 385, 447
mostazas nitrogenadas, 397
motivos estructurales
en protenas ligantes de DNA, 57, 288
mRNA, 63
bloqueo, 350
como muestra
para clonacin, 222
para PCR, 208
degradacin, 347
estabilidad, 347
extraccin por afinidad, 139
maduracin, 300
polimerasa que los transcribe, 270

precursores de, 270
proteccin frente a la degradacin, 351
transporte, regulacin, 346
mRNA(guanina-N7-) metiltransferasa, 301
mRNA(nuclesido-20 -O) metiltransferasa, 301
MTE, 289
mTERF, 276
MTS (protenas), 464, 466
mtTFA, 276
muerte celular
equilibrio con proliferacin, 452
programada. V. apoptosis.
muesca. V. mella.
muestras
bucales, 122
de DNA mitocondrial, 416
disociacin, 124
tipos, 120
multifocal, 148
mupirocina, 343
mutaciones, 145
a gran escala, 386
a pequea escala, 386
asintomtica. V. silenciosa.
clasificacin, 384
con cambio de marco, 391
con desfase o desplazamiento de marco.
V. con cambio de marco.
con sentido. V. silenciosa.
con terminacin prematura. V. mutacin sin sentido.
con terminacin retrasada, 394
conservadora, 409
de aminocido, 390
de sentido alterado, 390
de sentido equivocado o falso. V. de sentido alterado.
de terminacin prematura, 392
efecto beneficioso o perjudicial, 390
en DNA mitocondrial, 416
endgenas, 394
espontneas, 394
exgenas, 396
frecuencia, 386
gnica, 384
germinal, 384
heredable, 384
incidencia, 386
inducidas. V. mutaciones exgenas.
inducidas por agentes fsicos, 398
magnitud, 386
materia prima para cambios evolutivos, 384
neutral. V. silenciosa.
no heredable, 385
no silenciosa, 390
no sinnimas. V. de sentido alterado.
origen del cncer, 386
por delecin, 387, 388
por desaminacin de bases, 394
por insercin, 387, 389
por sustitucin, 387
prematura de la traduccin, 392
501
ndice alfabtico
mutaciones (cont.)
puntual, 387
silenciosa, 389, 409
sin cambio de marco, 392
sin sentido, 392
sinnima. V. silenciosa.
somtica, 385
sustitucin
conservadora, 391
no conservadora, 391
terminadora, 392
transicin, 387
transversin, 387
y degeneracin del cdigo, 319
y metabolismo, 396
y polimorfismo, 406
y sustancias ambientales, 396
mutagnesis, 396
mutgenos
eliminacin, 399
endgenos, 396
exgenos, 396
myc (gen), 453
Myc (protena), 468, 470
NAD+, 25
como cosustrato de la ligasa, 218
NADP+, 25
naftol, 189
nailon, 170
NAO, 410
naranja de acridina. V. acridina.
NBT, 189
necrosis, 472
NELF, 274
neomicina, 344
neoplasia. V. cncer.
NER. V. escisin de nucletidos.
neurofibromatosis de tipo 1, 457
herencia, 437
neurofibromina, 437, 457
mutada, 393
neuronas, 99
neuropata ptica hereditaria de Leber, 442
nf1 (gen), como oncosupresor, 455
NF1, 288, 292
nitratos, 398
nitritos, 398
nitrocelulosa, 170
nitrgeno
istopos 14N y 15N, 147
nitrosaminas, 397
nitroso (cido), 398
no-disyuncin, 445, 447
norfloxacina, 278
Northern, 172
comparado con Southern y Western, 178
novobiocina, 278
NPP, 189
N-terminal. V. protenas, extremo.

NTP
marcado en fosfato a, 187
marcado en fosfato g, 187, 252
nucleasas
aspectos generales, 212
de restriccin. V. enzima de restriccin.
S1, 169
nucleicos (cidos), 3
absorcin en el ultravioleta, 32, 167
apirimidnicos, 31
apurnicos, 31
carcter
hidrfilo, 31
polianinico, 31
componentes, 11
esqueleto, 28
estructura primaria, 28
extraccin, 136
con microesferas magnticas, 139
funcin, 27
hidrlisis qumica, 31
localizacin, 27
niveles estructurales, 28
propiedades fsicoqumicas, 30
purificacin, 136
reactividad, 31
representaciones lineales, 29
solubilidad, 136
tipos, 29
viscosidad, 31
nuclena, 4
ncleo, 6
celular, 4
nucleoflico/nuclefilo, 149, 218, 269,
305, 339
nucleoide, 6
nuclolo, 270
nucleoproteidos, 27, 75
nuclesidos
absorcin en el ultravioleta, 167
componentes, 17
de los cidos nucleicos, 18
-difosfato, 20
infrecuentes, 19
en el rRNA, 65, 68
en el tRNA, 65, 307
-monofosfato, 20
propiedades fisicoqumicas, 23
que forman los cidos nucleicos, 18
tipos, 18
-trifosfato, 20
nucleosomas, 84-86
desensamblado, 281
fibra de, 87
liberacin, 281
posicin y control de la expresin, 281
5-nucleotidasa, 476
502
nucletidos
absorcin en el ultravioleta, 167
cclicos, 25
como grupo activador de azcares, 367
complejos, 25
complejos con Mg2+, 24
componentes, 19
didesoxi-. V. didesoxinucletidos.
nomenclatura, 21
posicin del enlace fosfato, 19
propiedades
fisicoqumicas, 23
inicas, 23
sencillos, 20
tipos, 19
unidos a azcares, 367
nuclvulo, 194, 195
nuliploida, 444
nulisoma, 444
numeracin de los nucletidos en genes y RNA, 267
nmero de enlace, 82
modificacin por topoisomerasas, 156
nmero n, 95
variacin en la fecundacin, 108
Nycoprep, 126
O
Oct-1, 295
octmero de histonas, 88
octapptido, 277
oftalmopleja externa progresiva crnica, 442
Okazaki (fragmentos de), 151, 156, 157
maduracin, 158
progreso de la sntesis, 157
unin de fragmentos, 158
oleato, 361
oligo-dT, 139, 222, 223
oligonucletido, 187
empleo como sondas, 182
empleo en PCR, 202
especfico de alelo, 420
sntesis qumica, 182
oligosacridos, 363
estructura qumica, 365
precursor del grupo AB0, 411
unidos por N, 365
unidos por O, 364
olivomicina, 95
oncochip, 429, 477
oncogenes
comparacin con gen oncosupresor, 456, 458
concepto, 454, 455
expresin dominante, 453, 456
expresin recesiva, 454
que estimulan el ciclo celular, 469
oncoprotena, 452, 457
oncosupresor (gen), 454
comparacin con oncogn, 456, 458
concepto, 456, 457
expresin recesiva, 458

tipos, 456
oncosupresor (protena), 454, 457
concepto, 456, 457
oocito, 105, 194, 195
secundario, 195
oognesis, 102, 105
oogonios, 102, 105
opern, 272, 326
ORF. V. marco de lectura abierto.
organizacin tridimensional, 157
orgnulos, 6, 354
origen
de cambios evolutivos, 384
de replicacin. V. replicacin, origen.
mitocondrial, 161
plasmdico, 227, 228
de transcripcin
como referencia de numeracin, 267
orina, muestras, 124
oro
coloidal, 189
microesferas para clonacin, 231, 232
vulos, 105
2-oxoglutarato, 360
P
p105-Rb (protena). V. Rb (protena).
p21 (protena), 469
p21Ras. V. Ras (protena).
p23, 376
p53 (gen y protena), 471
actuacin sobre el ciclo celular, 467, 469
como factor de transcripcin, 471
inactivacin por protenas vricas, 472
incidencia en el cncer, 469, 471
papel dual en ciclo celular
y en apoptosis, 474
PAC, 227
pactamicina, 344
palndromos, 51
como diana de restriccin, 215
monocatenarios, 52
palmitato, 361
PAP, 475
papilomavirus, 471, 472
parentesco, grados de, 436
pares de bases. V. complementariedad.
geometra, 42
modelo molecular, 42
pares A-T, A-U y G-C, 40
PARP, 473
partcula
central, 87
de reconocimiento de la seal, 357
Patau (sndrome), 447
paternidad, pruebas de, 424
patologa molecular
concepto, 432
pauta de lectura. V. marco.
PBP, 295
503
ndice alfabtico
PCNA, 152, 157

secuestro por GADD, 471
PCNA, 403. V. tambin DNA polimerasas d y e.
PCR, 193
anidada, 208
aplicaciones, 201
asimtrica, 209
ciclo, 203
con adaptadores, 209
con comienzo en caliente, 208
con transcriptasa inversa, 206
cuantitativa, 205
de RNA, 206
duracin, 204
en tiempo real, 205
especfica de alelo, 424
especificidad, 204
etapas, 203
fidelidad, 205
fundamento, 202
grado de amplificacin, 204
inversa, 208
LA-PCR, 208
larga, 208
lmite de deteccin, 204
L-PCR, 208
mltiplex, 423
nmero
de ciclos, 204
de copias conseguidas, 204
objetivos, 201
para la deteccin de polimorfismos, 422
para obtencin de sondas, 181
para obtener DNA monocatenario, 209
reactivos, 202
rendimiento, 204
RT-PCR, 206
PDGF. V. factor de crecimiento derivado de plaquetas.
PEG.V. polietilenlicol
penciclovir, 15
peptidasa, 379
de la seal. V. proteasa del pptido seal.
peptidiltransferasa, 74
centro activo, 79
peptidil-tRNA
hidrlisis, 342
pptido C, 370
pptido seal, 356, 370
eliminacin, 358
partcula de reconocimiento de, 357
peptidoglicanos, 363
periodicidad en la estructura del DNA, 36
permanganato potsico para secuenciacin, 252
peroxidasa, 188, 189
peroxisomas, 355
PEST, 379
PFGE. V. electroforesis en campo pulsante.
PGH. V. Proyecto Genoma Humano.
pH
efecto sobre el emparejamiento de bases, 41
efecto sobre la desnaturalizacin, 165
pintado de cromosomas, 177

piperidina para secuenciacin, 252
pirimidina, 14
pirofosfatasa, 149, 269
pirofosfato, 149, 269
pistolas de genes, 231, 232
plantilla. V. molde.
plsmido, 6
artificial, 227
caractersticas, 227
circularizacin, 208, 226
como vector de clonacin, 219
F, 230
linealizacin, 181
origen de replicacin, 227, 228
pSP64, 181
plegamiento de protenas, 261, 372, 373.
V. tambin carabinas.
deficiencia en la fibrosis qustica, 392
enfermedades, 372
mecanismo, 372
poli(A). V. cola de poli(A).
poli(A) polimerasa, 302
poli(ADP-ribosa)polimerasa, 473
poli(dT), 303
poli(T), 303
poli(U), 303
poliacrilamida, 141, 178
poliaminas, 31
policationes, 188, 231
policistrnico, 324
policonector, 224, 227, 228, 234
polietilenglicol, 231, 244
polietilenimina, 188
polimorfismo, 97, 99, 243, 420. V. tambin
marcadores polimrficos.
aplicaciones, 424
diagnstica, 426, 427
con efecto fenotpico, 409
concepto, 406
de conformacin de molculas monocatenarias, 413
de mini- y microsatlites, 425
de oligosacridos, 410
de un solo nucletido. V. polimorfismo SNP.
deteccin, 418
en el nmero de repeticiones en tndem V. VNTR.
en genoma mitocondrial, 416
en intrones, 409
en la longitud de los fragmentos de
restriccin. V. RFLP.
fisiolgico y patolgico, 406
gentico, 405
no proteico, 390
gnico, 405, 409
ejemplos, 409
gnico no codificante, 415
grado de, 406
mecanismos de aparicin, 407
no gnico, 415
proteico, 390, 409, 410
RFLP. V. RFLP.
504
polimorfismo (cont.)
sin efecto fenotpico, 409
SNP, 405, 418, 424
deteccin, 418
STR. V. STR.
uso forense, 421
VNTR. V. VNTR.
y heterocigosis, 406
y mutacin, 406
polinucletido fosforilasa, 269
polinucletido quinasa, 187, 252
polioma, 81
polipptido naciente, 79
poliploida, 96, 444
polirribonucletido, 269
polirribosomas, 75
polisomas. V. polirribosomas.
polisoma, 444
poli-U, 139
poliubicuitina, 378
Polymorhoprep, 126
poro nuclear, 297, 346, 356
postranscripcional
control de la expresin gnica, 309
potenciadores, 290
pRb (protena). V. Rb (protena).
precipitacin salina diferencial, 137
prefoldina, 375
pre-miRNA, 309
prenilacin de aminocidos en protenas, 362
preparacin de muestras, 119
esquema unificado, 120
preproinsulina, 370
pptido seal, 357
pre-pro-protena, 357, 370
pre-protena, 357
prequimotripsingeno, 370
pre-RNA, 261, 264, 297
con varios productos gnicos, 298
maduracin. V. maduracin
postranscripcional.
mitocondriales, 276, 309
mixto para tRNA y rRNA, 308
precursor grande del RNA ribosmico, 68
productos gnicos, 270
ribosmico, 76
de Tetrahymena, 72
grande, 270, 308
pequeo, 270, 308
transferente, 308
pretraduccional
pretranscripcional
pretripsingeno, 370
prevalencia, 433
Pribnow (caja de), 289. V. tambin TATA.
primasa, 149, 151, 156
pri-miRNA, 309
primosoma, 156
priones, 372. V. tambin PrP.
probando, 436
procariontes. V. procariotas.
procariotas
diferencias con eucariotas, 5
genoma, 5
procesamiento
postranscripcional. V. maduracin
postranscripcional.
proteoltico de protenas. V. protelisis.
procesividad, 151, 152, 274
procolgeno, 360
producto gnico, 264
nomenclatura, 266
profase, 101
proflavina, 398
prohormona convertasa PC2 y PC3, 370
proinsulina, 371
proliferacin, 233
control
negativo, 456
por seales extracelulares, 454, 458
positivo, 454
equilibrio con muerte celular, 452
monoclonal, 451
prolil hidroxilasa, 360
prolina
hidroxilacin, 360
prometafase, 101
promotores, 288
basales, 272, 289
complejo plurimolecular, 291
reconocimiento por TBP, 291
de clases I, II y III, definicin, 288
de tipo III, 295
desnaturalizacin, 273
distales, 290
en vectores de expresin, 236
Inr, 272
liberacin del, 273
metilacin, 282
mitocondriales, 276
potenciadores, 290
proximales, 289
silenciadores, 290
TATA, 272
proncleo, 108
propagacin celular, 233
propidio, 132, 133
propositus, 436
pro-protenas, 357, 370
protaminas, 31, 85
proteasas, 124, 379, 451
cisteinproteasas, 473
del pptido seal, 357, 358
digestivas, 370
inhibidores, 452
lisosomales, 377
proteasoma, 379
proteccin de grupos funcionales, 182, 183
505
ndice alfabtico
protenas, 4
activacin proteoltica. V. protelisis.
anclaje a membranas mediante lpidos, 367
como producto gnico. V. producto gnico.
de adhesin, 451, 476
de anclaje, 357
de choque trmico, 374
de fusin, 236
de membrana, 357
de pausa, 275
de replicacin A. V. RPA.
de secrecin, 357, 370
degradacin, 376
citoslica, 377
lisosmica, 377
destino, 354
detectora, 185, 188
distribucin, 354
extremo
amino o N-terminal, 324
carboxilo o C-terminal, 324
funcional, 353
G, 461
glicosilacin, 363
interaccin con DNA, 56
ligante, 185
de DNA monocatenario, 154, 155
de IRE, 350
de la caperuza, 335. V. CBP.
de TATA, 291, 295. V. TBP.
funcin mltiple, 296
del telmero, 96
localizacin, 354
metabolismo, 354
naciente, 324, 340, 373
no histnicas, 85
oncosupresora, 454
plegamiento, 261, 372. V. tambin plegamiento.
prinica, 372
procesamiento proteoltico. V. protelisis.
receptora
de AMP cclico, 57
de SRP, 357
del ribosoma, 357
recombinantes, 236
reguladoras del hierro, 350
secrecin, trfico, 357
secretadas, 357, 370
sntesis de, 323. V. tambin traduccin.
SR, 311
supresora de tumores, 454, 456. V. tambin
oncosupresores.
terminadoras de la transcripcin, 275
trnsito, 354
transportadora de cloruro, 392, 438.
V. regulador de la conductancia
transmembrana.
ubicuitinadas, 377
vida media, 377
protena-disulfuro isomerasa, 369, 372
protena fosfatasa, 359
protena quinasa, 359, 464

dependiente de ciclinas, 462, 464. V. tambin Cdk.
TFIIH, 291
proteoglicanos, 363
protelisis, 369, 473. V. tambin proteasas.
de la DNApol I, 150
de protenas marcadas con ubicuitina, 379
ubicuitina como marcador, 378
proteoma, 239
protemica, 239
protooncogn
concepto, 454, 455
tipos, 454
proximal. V. promotores.
Proyecto Genoma Humano, 257
caractersticas, 240
PrP, 372
PSA, 475
PSAP, 475
PSE, 295
pseudogenes, 114
y transcripcin, 267
pseudomnico (cido), 343
pseudouridina, 19, 65
psoraleno, 400
pSP64, 181
P-TEFb, 274
PTF, 295
pUC19, 227
puentes disulfuro. V. enlaces.
punto de restriccin, 461
punto R, 461
purina, 14
puromicina, 19, 344
mecanismo de accin, 345
peptidil-, 345
Q
qPCR, 205
quiescencia, 100
quimera, 447
quimioluminiscencia, 189
quimotripsina, 370
quimotripsingeno, 370
quinacrina, 94
quinasa
activadora de Cdk, 465, 467
inhibidora de Cdk, 465, 467
quinolonas, 278
R
Rab (protena), 458
Rab, 461
radiaciones
rayos gamma, 398
rayos X, 398
radicales libres, 396, 399
de oxgeno
reparacin, 402
Raf, 461
506
ramificacin, centro de, en ayuste, 303

ras (gen), 453
Ras (protena), 455
en neurofibromatosis tipo 1, 393
farnesilacin de, 362
funcin, 461
mutada, 461
rasgo falciforme, 438
rasgos, 98
razn de asimetra, 37
Rb (gen), 470
inactivacin y cncer, 471
Rb (protena)
actuacin sobre el ciclo celular, 469
como sustrato de Cdk, 468, 471
fosforilacin, 470
inactivacin por protenas vricas, 471
rDNA, 219. V. tambin DNA recombinante.
formacin, 225
introduccin en la clula anfitriona, 231, 232
subproductos, 225
reaccin en cadena de la polimerasa, 201. V. tambin PCR.
reasociacin del DNA, 118. V. tambin curvas Cot.;
renaturalizacin.
recambio proteico, 376
receptor, 453
de factores
de crecimiento, 454
inhibidores del crecimiento, 457
de hormonas tiroideas, 453, 455
de transferrina, 351
recesivo, 98, 436
Recklinghausen (enfermedad de), 393
recombinacin, 145, 242
fraccin de. V. frecuencia.
homloga, 108, 241
meitica, 241
no homloga o desigual, 407
relacin con la cartografa, 241
y segregacin de alelos, 241
recuento de clulas viables, 131
recuperacin de bases
va metablica, 246
reemplazamiento
mtodo de preparacin de virus
recombinantes, 229
regin
estructural. V. gen, secuencias.
reguladora. V. gen, secuencias.
organizadora del nucleolo, 95
regiones
hipervariables en el DNA mitocondrial, 416
internas de control, 295
regulacin
por fosforilacin reversible, 462, 464
traduccional, 347
regulador de la conductancia transmembrana, 438
reguladora (secuencias gnicas). V. gen, secuencias.
relacin de codificacin, 314
relleno, 187
renaturalizacin, 118, 163, 164, 167
rendimiento
de la PCR, 204
reparacin, 145
actividad 5-exonucleasa, 150
de bases metiladas, 400
de emparejamientos incorrectos, 403
del DNA, 402. V. tambin escisin.
por escisin, esquema global, 400
sistemas enzimticos, 398
tipos, 399
del uracilo en el DNA, 402
por recombinacin, 403
repeticiones, 111. V. tambin DNA repetitivo.
cortas en tndem, 421. V. tambin STR.
directas, 54
especulares, 54
invertidas. V. palndromos.
terminal. V. telmeros.
replicacin, 145
autnoma, 223
bifocal, 161
bloqueo por GADD o p21, 471
cofactores, 148
comparacin entre procariota, eucariotas y
mitocondrias, 161
complejo de. V. replisoma.
conservadora, 146, 147
continua, 161
del RNA, 4, 149
demostracin del mecanismo, 147
direccin, 149
dispersante, 146
elongacin, 156
en el ciclo celular, 100
en la PCR, 202
enzimologa, 148
errores, 394, 403
final. V. terminacin.
hiptesis, 146, 147
horquilla, 148, 154
inicio, 153
mecanismo, 146
de la reaccin, 149
mitocondrial, 161
monofocal, 148
multifocal, 148
no simultnea, 161
origen, 95, 148, 153, 230
orgenes mltiples en un cromosoma, 158
reaccin
comparada con transcripcin, 269
global, 149
relacin con el ciclo celular, 104
semiconservadora, 146, 147
seales de inicio, 468
sustratos, 148
terminacin. V. terminacin.
unidad de. V. replicn.
unidireccional, 161
velocidad, 152
507
ndice alfabtico
replicador, 153
replicn, 148, 153, 158
replisoma, 154, 156, 157
reprogramacin del genoma, 286
resazurina, 133
resistencia a antibiticos, 223, 227, 228, 234, 343
resorufina, 133
restriccin. V. enzimas de restriccin.
restriccin-modificacin, 213
restrictasas. V. enzimas de restriccin.
retardada (hebra), 156, 157
retculo endoplsmico
lumen, 357
rugoso, 354
reticulocitos
para estudiar la traduccin, 324
retinoblastoma. V. Rb.
retrasada (hebra). V. retardada.
retrotransposicin, 408
retrotransposones, 408
retrovirus, 4, 70, 228, 263
revelado del DNA tras electroforesis, 142
reversin directa de la mutacin, 399
RFC, 157, 403. V. tambin DNA polimerasas d y e.
RFLP, concepto, 418
Rho (protena), 458, 461
riboedicin, 305
riboforina, 357
ribointerferencia, 69
ribointerruptor, 69
ribonucleasa, 212. V. tambin RNasas.
como marcador tumoral, 476
como protena modelo de plegamiento, 372
ribonucleoprotenas nucleares
pequeas. V. snRNP.
riborregulador, 69. V. tambin ribointerruptor.
ribosa, 14
ribosiltimina, 18
ribosoma
centros activos, 79
composicin, 76, 79
deslizamiento
en el inicio de la traduccin, 335, 336
en la elongacin, 339
disociacin, 342
durante la traduccin, 335
en mitocondrias y cloroplastos, 75
interaccin con mRNA, 79
reasociacin de subunidades, 336
separacin de subunidades, 335
sitios A, P y E, 337
subunidades, 76
mayor, 335
menor, 333, 335
tamao, 75, 76
ribosondas.V. sondas de RNA
ribotimidina, 18, 65
ribovirus, 70
ribozimas, 71
autoayuste, 305
autocatalticas, 305
RNA autocataltico, 305

transpeptidasa, 339
Rich-Dickerson, 47
ricina, 344
rifamicinas, 276
rifampicina, 271, 276
rigor, 168
RISC, 309
RNA
7SL, 118, 357
abundancia, 63
cataltico. V. ribozimas.
citoplsmico pequeo. V. scRNA.
como producto gnico. V. producto gnico.
composicin de bases, 61
cromosmico, 4
diversidad de estructuras, 62
en orgnulos, 63
estabilidad, 302, 347
estructura, 61
secundaria, 62, 66
funcional, 264, 297. V. tambin RNA maduro.
genmico, 5, 79
gua, 306
interferencia por. V. ribointerferencia.
interferente pequeo, 63. V. tambin siRNA.
interferentes, 309
maduracin. V. maduracin
postranscripcional.
maduro, 261, 264, 270
mensajero. V. mRNA.
mitocondrial, 276
maduracin, 309
naciente, 269, 274
nuclear
heterogneo. V. hnRNA.
pequeo. V. snRNA.
pequeos, 69
poliadenilado. V. cola de poli(A).
precursor, 68, 264, 297.
V. tambin pre-RNA.
secuenciacin, 257
tamao, 63
tipos, 61, 63
transporte, 261
al citoplasma, 302
ubicacin en la clula, 63
vida media, 302
RNA polimerasa, 85, 261
activacin por el complejo de inicio, 291
cloroplsticas, 270
en la transposicin, 408
especializacin, 270, 288
holoenzima, 292
inhibicin
por amanitina, 270
por rifampicina, 271
localizacin subcelular, 270
mitocondrial, 270, 276
pausas, 275
procaritica, 269
508
RNA polimerasa (cont.)

enzima mnima o ncleo, 271
subunidad s, 271
SP6, 181
subunidades, 271
tipos, 269
transcritos primarios sintetizados, 270
I, 270, 295
II, 270, 291
dominio C-terminal, 272. V. CTD.
fosforilacin, 272
III, 270, 295
RNA replicasas, 4, 149
RNA ribosmico. V. rRNA.
RNA transferente. V. tRNA.
RNApol. V. RNA polimerasas.
RNasas, 212
A, como protena modelo del plegamiento, 372
como contaminacin, 172
D, 307
de Bacillus cereus,, 257
degradacin del mRNA, 347
H1, 158
P, 71, 307
Phy M, 257
T1, 257
U2, 257
I, 307
de pncreas bovino, 212
III, 307, 309
ro (protena)
anlogos eucariticos, 275
Robertson. V. translocacin.
rodamina, 256
rodopsina, 361
rojo neutro, 131
romos (extremos), 215
ROS. V. especies reactivas de oxgeno.
ROX, 256
RPA, 154, 155
rRNA
5, 8S, 63, 68, 76, 308
5S, 63, 68, 76, 308
12S, 308
16S, 63, 68, 76, 308
18S, 63, 68, 76, 95, 308
23S, 63, 68, 75, 76, 308
28S, 63, 68, 75, 76, 95, 308
28S, actividad transpeptidasa, 339
genes de, 112
maduracin, 307
precursores de, 270
tipos, generacin por maduracin, 308
RT-PCR, 205, 206. V. PCR con transcriptasa
inversa; PCR en tiempo real.
S
saco amnitico, 121
salientes 50 y 30 en los extremos de restriccin, 215
saliva, muestras, 122
Sanger, 252
sangre
fetal, 122
manchas, 122
perifrica, muestras, 122
sarcosina, 278
satlite. V. DNA satlite.
cromosmico. V. cromosoma.
SCC, 475
scRNA, 63
miRNA, 69
secuenasa, 252
secuencia
cis. V. cis.
cos, 229
de etiquetado. V. pptido seal.
de replicacin autnoma, 230
estructurales. V. gen, secuencia.
gnicas. V. gen, secuencia.
Inr, 272
intercaladas. V. intrn.
lder. V. pptido seal.
no traducidas 5 y 3, 299
promotoras. V. promotor.
reguladoras. V. gen, secuencia.
seal, 355, 356. V. pptido seal.
subtelomricas, 96
TATA, 272
telomricas. V. telmeros.
trans. V. trans.
secuenciacin, 240
de RNA, 257
didesoxi. V. secuenciacin, mtodo enzimtico.
enzimtica, variantes, 256
mtodo
enzimtico, 252
qumico, 252
por terminacin de cadena. V. secuenciacin, mtodo
enzimtico.
secuencial, replicacin, 148
sedimentacin, 124
segregacin
de alelos, 241
de cromosomas y cromtidas, 106, 107, 241
segundo cdigo gentico, 329
seleccin, 246
de clulas hbridas, 246
de clones recombinantes, 234
fenotpica, 234
negativa, 129
positiva, 129
sellado gnico, 286
semen, 122
semiconservadora. V. replicacin.
semidiscontinua, 157
sealizacin, tipos, 459
separacin, mtodos, 124
serina/treonina quinasa, 359, 464
Shine-Dalgarno (secuencia de), 333
showdomicina, 344
silico (cido), 364
509
ndice alfabtico
sigma. V. RNA polimerasa procaritica.

silenciadores, 290
simultnea, replicacin, 148
SINE, 118
sinistrorso, 43
Z-DNA, 49
sntesis de novo de nucletidos, 246
siRNA, 63, 69
biosntesis, 309
sis (gen), 452
sistema endomembranoso, 354
sitio
A, 337, 339
aminoaclico. V. sitio A.
de clonacin mltiple, 224
de restriccin, 212
ejemplo en un plsmido, 227, 228
de salida. V. sitio E.
de secuencia marcada. V. STS.
E, 339
EA, 337
marcados nicos. V. STS.
P, 337, 339
peptidlico. V. sitio P.
SL1, 295
slot-blot,, 171
SNAPc, 295
snip. V. polimorfismo SNP.
SNP. V. polimorfismo SNP.
snRNA, 63, 69, 270, 295
tipos, tamao y funcin, 304
snRNP
tipos, tamao y funcin, 304
sobrecruzamiento. V. recombinacin.
solapamiento de codones, 314
solenoide, 85. V. tambin fibra de 30 nm.
sonda, 168, 179, 206
clasificacin, 179
de DNA, 180
de RNA, 181
diseo, 184
fluorescentes, 177, 246
marcaje, 185
obtencin
por clonacin, 180
por PCR, 181
para detectar anemia de clulas
falciformes, 418
preparacin, 179
sntesis, 187
sintticas, 182
soporte slido
unin a, 182
Southern, 171
comparado con Northern y Western, 178
interpretacin de resultados, 172
para detectar
anemia de clulas falciformes, 418
RFLP, 418
VNTR, 421
south-western, 179
SP1, 292
SP6, 181
SREBP, 473
SRP, 357
SRP-R, 357
SSB. V. protenas ligantes de DNA monocatenario.
SSCP, 413
Staf, 295
STR, 421, 425
en el cromosoma Y, 424
stRNA, 69
STS, mapa fsico, 248
subclonacin, 237
subtilisina, protelisis de la DNApol I, 150
suicidio celular. V. apoptosis.
sulfatacin, 369
SUMO, unin a histonas, 286
sumoilacin, 369
superenrollamiento, 79, 83, 88
aspectos tericos, 82
demostracin experimental, 81
negativo, 81, 156
parmetros cuantitativos, 82
plectonmico, 82
positivo, 81
toroidal, 82
superhlice, 80
superxido, 396, 399
superxido dismutasa, 399
surco
mayor, 43, 45
unin de protenas al, 57
menor, 43, 45
unin de protenas al, 291
susceptibilidad tumoral, 449
sustancia H. V. antgeno H.
sustitucin, 387. V. tambin mutacin.
mtodo de preparacin de virus recombinantes, 229
SV40, 228
svedberg. V. coeficiente de sedimentacin.
SII, 274
SIII, 274
T
Tf, 167. V. tambin Tm.
Tm
en la PCR, 203
y contenido en G+C, 167
TAF, 291, 294.V. factores asociados a TBP
de tipo I, 295
de tipo II, 291
de tipo III, 295
talasemia
alfa, 438
beta, 438
tallo, 62
TAMRA, 256
tndem, 111, 421
TATA, 272, 289, 295
reconocimiento por TBP, 291
tautomera
amina-imina, 16
510
tautomera (cont.)
ceto-enlica, 16
lactama-lactima, 16
relacin con la mutacin, 394
Tay-Sachs (enfermedad de), 438
TBP, 291, 295. V. tambin protena ligante de TATA;
protena ligante del telmero.
funcin mltiple, 296
telofase, 101
telomerasa, 149, 159
ausencia, 160
componentes, 160
funcin, 160
y cncer, 161
y proliferacin celular, 161
telmero, 89, 95, 96
acortamiento, 158160
en vectores de clonacin, 230
funciones, 96
replicacin, 158
secuencia, 160
y DNA minisatlite, 118
y DNA satlite, 116
y envejecimiento, 160
temperatura
de fusin del DNA. V. Tm.
en la PCR, 203
y desnaturalizacin, 164
TER. V. telomerasa, componentes.
terapia antitumoral
y telomerasa, 161
terminacin
de cadena. V. secuenciacin enzimtica.
mitocondrial, 276
retrasada de la traduccin, 394
terminador, 275
termociclador, 202
termoestable, 202, 252
terpenos, 362
tetraciclinas, 344
gen de resistencia, 234
tetrahidrofolato, 246, 334
Tetrahymena, 72
tetraploida, 97, 444, 445
tetrazolio, 189
sales de, 133
TF. V. factores de transcripcin.
TFIIS, 274
TGB, 476
TGF-b, 457
TGGE, 413
timidilato, 21
timidina, 18
en medio HAT, 246
tritiada, 134
timidina quinasa, 246
timina
dmeros, 398
timina glicol, 396
reparacin de, 402
tincin, 93-95
de la cromatina, 88
del DNA, 142
NOR, 95
tiouridina, 65
tiroglobulina, 476
tirosina quinasa, 359, 464
TK. V. timidina quinasa.
TMB, 189
topognesis, 354
topoisomerasas, 80, 85, 88, 154
de tipo I, 155
de tipo II, 156
topologa, 82
toxina diftrica, 344
TR. V. telomerasa, componentes.
traduccin, 4, 261, 264
caractersticas, 323
conexin espacial y temporal con la transcripcin, 262
elongacin. V. elongacin.
energtica, 342
fases o etapas, 326
frecuencia, 348
inhibidores, 343
inicio. V. inicio.
macromolculas implicadas, 324
regulacin, 345
regulada
por bloqueo del mRNA, 350
por estabilizacin del mRNA, 351
por fosforilacin, 352
resumen, 326, 342
sentido, 324
tasa de error, 332
terminacin. V. terminacin.
velocidad, 345
trfico, 354. V. tambin trnsito.
de protenas, 354, 356
secrecin, 357
trans, 355. V. tambin Golgi.
elementos, 288
factores, 288
secuencias, 288
transcripcin, 4, 261, 264
asimetra, 266
caractersticas comparadas con replicacin, 268
cofactores, 269
comparacin entre procariotas y eucariotas, 268
conexin espacial y temporal con la traduccin, 262
del genoma mitocondrial, 276
direccin, 269
e interfase, 269
elongacin. V. elongacin.
energtica, 269
enzimologa, 269
etapas, 272
hebra
511
ndice alfabtico
transcripcin (cont.)
codificante y no codificante, 267
con sentido y antisentido, 267
informativa y no informativa, 267
molde y no molde, 267
negativa, 267
positiva, 267
positiva y negativa, 267
transcrita y no transcrita, 267
inhibidores, 276
inicio. V. inicio.
mecanismo de la reaccin, 269
mitocondrial, 276
origen. V. origen de transcripcin.
promotor. V. promotor.
reaccin
comparada con replicacin, 269
global, 269
nicial, 273
regulacin, 279
por seales, 290
positiva y negativa, 290
postranscripcional, 309
terminologa, 288
y accesibilidad del DNA, 281
relacin con la condensacin del DNA, 268
sentido contrario en cada hebra, 266
sustratos, 269
terminacin. V terminacin.
terminologa, 267
unidad de, 272
y eucromatina, 269
y fibra de 10 nm, 269
transcripcin inversa, 4
transcriptasa. V. RNA polimerasas.
transcriptasa inversa, 149, 263
empleo para la secuenciacin, 252
empleo para PCR, 207
en la transposicin, 408
para preparar cDNA, 222
para secuenciar RNA, 257
transcrita, 267
transcrito primario. V. pre-RNA.
transduccin de seales, 455
esquema global, 460
transesterificacin, 305, 328
transfeccin, 229, 231
transferasa terminal, 222, 223
transferencia, 171, 178
nuclear, 193
transferrina
receptor de, 351
transformacin, 230, 231
bacteriana, 230
transfosforilacin, 305
transfusin
compatibilidad, 410
transicin, 387
trnsito de protenas, 354, 355
translocacin
de protenas del citosol al retculo endoplsmico, 357
de Robertson, 448
del ribosoma, 339

papel de las carabinas, 372
recproca, 448
translocasa. V. eEF-2, riboforina.
transpeptidacin, 339
transpeptidasa. V. peptidiltransferasa.
transporte
a travs de poros nucleares, 261
de mRNA, 346
regulado, 356
transmembrana, 356
vesicular, 356
transposasas, 408
transposicin, 407
transposones, 407
transversin, 387
traslado de la mella, 187
trbol, estructura del tRNA, 66
TRiC/CCT, 375
trifosfatos, 13
triple hlice, 55
triplete. V. codn.
triploida, 97, 444
tripsina, 370
proteolisis de la DNApol I, 150
tripsingeno, 370
triptfano
deficiencia de biosntesis, 234
trisfosfatos, 25
trisoma, 444
13, 447
18, 447
21, 385, 447
en cromosomas sexuales, 447
mecanismo, 447
tritilo, 183
tRNA, 63
especificidad por aminocido, 64
estructura terciaria, 67
isoaceptores, 329
maduracin, 307
modelo molecular, 67
nomenclatura, 64
nmero de molculas diferentes, 320
papel adaptador en la traduccin, 315
precursores de, 270
separacin del polipptido al terminar la traduccin, 342
sinnimos, 64, 329
tRNAfMet, 334
tRNAiMet, 334
tRNAMet, 334
complejo ternario con eIF-2 y GTP, 335
tRNA nucleotidiltransferasa, 307
trofoblasto, 121, 200
trombina, carboxilacin, 359
troponina T gen y ayuste alternativo, 310
TRP1, 234
TRT. V. telomerasa, componentes.
tumor, 449. V. tambin cncer.
maligno, 451
512
tumor (cont.)
primario benigno, 449, 451
secundario, 450, 451
tungsteno, microesferas para clonacin, 231, 232
U
U1, U2, U3, U4, U5, U6. V. snRNA y snRNP.
UBF, 295
ubicuitina, 377
unin a histonas, 286
ubicuitina protena ligasa, 377
ubicuitinacin, 369, 377
inducida
por aminocido N-terminal, 378
por secuencias PEST, 379
UCE, 295
UDP-galactosa, 367
UDP-glucosa, 367
UDP-N-acetilgalactosamina, 367
UDP-N-acetilglucosamina, 367
ultracentrifugacin, 81, 140
isopcnica, 81
unidad
de codificacin
tamao, 314
de repeticin. V. DNA repetitivo.
de replicacin. V. replicn.
de transcripcin, 272
mitocondrial, 276
unidireccional, replicacin, 161
unin
clula-matriz extracelular, 451
intercelular, 451
universalidad. V. cdigo gentico.
uracilo
reconocimiento en el DNA, 402
urea, 136, 165, 169
rico (cido), 15
uridilato, 21
uridina, 18
3UTR y 5UTR. V. secuencias no traducidas.
V
valil-tRNA sintetasa
valor C, 7, 97
variacin
en la fecundacin, 108
en la meiosis, 106
variabilidad gentica. V. polimorfismo.
vascularizacin, 452
vector
ARS/CEN/TEL, 230
BAC, 230
clasificacin, 226
csmidos, 229
de clonacin, 219, 223
de expresin, 224, 236
de insercin, 224, 229
de propagacin, 224
de sustitucin, 229
plasmdicos, 227
preparacin, 224
propagacin, 227
tamao del inserto admitido, 227
tipos, 226
vricos, 228, 231
YAC, 230
vellosidades corinicas, 122
velocidad de sedimentacin, 125, 126
vesculas
de secrecin, 354
de transicin, 354
de transporte, 354
viabilidad celular, 131
vida media
de protenas, 377
del RNA, 347
viroides, 73
virus, 228. V. tambin bacterifagos.
adenovirus, 471, 472
bacterifago T2, 4
cpsida, 4
como vectores, 228, 231
del mosaico del tabaco, 4
del papiloma, 471, 472
empleo como vectores. V. vectores vricos
recombinantes, 228
SV40, 471, 472
tumorales, 471, 472
viscosidad
variacin en la desnaturalizacin del DNA, 165
vitamina
B12. V. cobalamina.
5-desoxiadenosil-, 19
C, 360
K, 359
VNTR, 244, 421
W
WAF1, 464
WAF1 (protena), 466
Watson y Crick, 4
modelo para el DNA, 38
Western
comparado con Southern y Northern, 178
X
xantina, 15
como resultado de la desaminacin, 395
xerodermia de Kaposi, 404
X-gal, 189, 234
Y
YAC, 227, 230
yoduro de propidio, 132. V. tambin propidio.
Z
Z-DNA, 49
zeiosis, 472
zimgenos, 370
zinc. V. dedo de zinc.

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Introduccin y aspectos generales

1.1 TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA

1.3.1 Genoma de procariotas y eucariotas

1.1 TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA

1.2 EL DNA COMO MATERIAL GENTICO

1. Introduccin y aspectos generales

1.3 CARACTERSTICAS GENERALES DEL GENOMA

6,4 Gb = 6.400 Mb = 6.400.000 kb = 6,4 10 pb

23 distintos, 2 copias: 46 en total

Uno, con varias copias en cada

Alrededor del 50% de la masa, histonas y otras

Poco numerosas o ausentes

1 gen cada 128 kb

1 gen cada 0,45 kb

1. Introduccin y aspectos generales

1.3.2 Magnitud del genoma nuclear de eucariotas

Comparaciones que resaltan la magnitud del DNA nuclear en eucariotas:

1. Introduccin y aspectos generales

1.3.3 Magnitud y caractersticas del genoma mitocondrial

Componentes de los cidos nucleicos

2.1 COMPONENTE CIDO: FOSFATOS

2.4.2 Tipos de nuclesidos

2.1 COMPONENTE CIDO: FOSFATOS

2012. Elsevier Espaa, S.L. Reservados todos los derechos

2. Componentes de los cidos nucleicos

2.1.3 Tipos de enlaces fosfato

2.2 COMPONENTE NEUTRO: AZCARES

2.3 COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS

2. Componentes de los cidos nucleicos

2.3.1 Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos

2.3.2 Otras bases de inters biolgico y clnico

Web 2.2. Agentes antivirales: anlogos de bases, nuclesidos y nucletidos.

2.3.3 Propiedades fisicoqumicas de las bases purnicas y pirimidnicas

2.3.3.3 Disposicin coplanar de los anillos

2.3.3.4 Tautomera o isomera dinmica

2.3.3.5 Propiedades cido-base

2.3.3.6 Absorcin de la luz en el ultravioleta

2. Componentes de los cidos nucleicos

2.4 ESTRUCTURA DE NUCLESIDOS

2.4.1 Caractersticas generales

2.4.2 Tipos de nuclesidos

2.4.2.1 Nuclesidos que forman parte de cidos nucleicos

2. Componentes de los cidos nucleicos

2.4.2.2 Otros nuclesidos de inters biolgico y clnico

Nuclesidos componentes de los RNA, como inosina, pseudouridina, dihidrouridina, etc.

Web 2.7. Estructuras de otros nuclesidos.

2.5 ESTRUCTURA DE NUCLETIDOS

2.5.1 Caractersticas generales

2.5.2 Nucletidos sencillos

2. Componentes de los cidos nucleicos

Correspondencia entre los nombres de bases, nuclesidos y nucletidos:

Web 2.8. Desarrollo en profundidad de la nomenclatura y de las abreviaturas normalizadas.

Nomenclatura de nucletidos sencillos purnicos

La desoxirribosa no tiene -OH en C2.

Nomenclatura de nucletidos sencillos pirimidnicos

2. Componentes de los cidos nucleicos

2.5.3 Propiedades fisicoqumicas de nuclesidos y nucletidos

2.5.3.2 Formacin de complejos

Web 2.9. Estructura del complejo ATP:Mg.

2.5.3.3 Absorcin de la luz en el ultravioleta

2.5.3.4 Nucletidos como molculas de reserva energtica

2. Componentes de los cidos nucleicos