PREPARACIN DE FASES MOBILES

Los

solventes acuosos, orgnicos y la mezcla entre ellos son tpicamente

usados como fases mviles en cromatografa liquida (HPLC).Por su parte las

soluciones buffer son tambin muy usadas junto con soluciones acuosas. Sin
embargo existen entre ellas algunas restricciones en su preparacin y uso.
Para algunas bibliografas la definicin de buffer es vaga y a veces confusa.
Existen casos donde, debido a las diferencias entre las instrucciones dadas
en la documentacin y los mtodos de preparacin actualmente usados se
muestra disparidad en cuanto a la preparacin de las fases mviles, las cuales
afectan el resultado de los cromatogramas y por supuesto el anlisis de los
resultados.
Existen mltiples aspectos en la preparacin de fases mviles que pueden
convertirse en un punto ciego en el tema. Esto aplica no solo a soluciones
buffer sino tambin por ejemplo a los mtodos de mezclado de solventes. Aqu usaremos un
buffer de fosfato como ejemplo, y observaremos el efecto que puede ocasionar el utilizar un
mtodo de preparacin diferente, en el anlisis de los resultados, especialmente para la
separacin de compuestos como cafena, dihidrocodeina y acetaminofen.
1) En la preparacin de la Solucin Buffer.
En general Cmo se describe una solucin buffer de 20mM de fosfato (pH 2,5) y como
se prepara? El valor de pH de una solucin acuosa de 20mM de fosfato de sodio es
aproximadamente 5.0, entonces en orden de tener un valor de pH de 2.5 indudablemente
se requiere el ajuste con algn tipo de sustancia cida. Para esto tenemos dos posibles
alternativas. La primera se obtiene si asumimos que tomamos una solucin buffer y
ajustamos el pH a 2,5 con cido fosfrico, mas los contra iones usados no estn claros, si
se incluyen en la concentracin o no, de esta forma el problema es que 20 mM se
refiere a la concentracin de acido fosfrico o fosfato de sodio. Si asumimos que hay una
cierta cantidad de iones sodio, el siguiente problema es Como sabemos si en efecto
tenemos una solucin buffer de 20 mM de acido fosfrico o tenemos una solucin fosfato
sdico? , Podemos considerar que 20 mM ser la concentracin del acido fosfrico?
Podramos decir a ciencia cierta que 20mMser la concentracin de sodio simplemente,
podemos pensar que esta solucin como una solucin buffer creada por el ajuste de pH
de una solucin de 20 mM de fosfato dihidrogenado de sodio. Es as que dependiendo

del cido utilizado en el ajuste de pH, el efecto de par inico puede ocurrir o no, y de ah
surgen algunas discrepancias en al anlisis de los resultados.
De esta manera podemos ver que existen dos posibles y muy validas interpretaciones de
solucin buffer.

Fig1 Muestra el efecto en el

FIGURA 1. INFLUENCIA DEL A
anlisis de los resultados de
CORMATOGRAFICO
interpretar el ejemplo anterior
en las dos diferentes maneras.
La lnea superior muestra el
resultado obtenido de
interpretar 20 mM como
concentracin de acido
fosfrico y usando una solucin
prepara como 20mM de
cido fosfrico (sdico)
ajustado a (pH 2.5) como fase
mvil.
El cromatograma de un medio e
inferior muestra el resultado
obtenido
interpretando
20mM como la concentracin
de fosfato hidrogenado de
sodio
y
posteriormente
ajustado a pH 2,5 adicionando
el respectivo par inico (cido
fosfrico) y con ajuste usando
un cido diferente como cido
perclrico.
Como
se
muestra
la
hidrocodeina en este ejemplo,
se encuentra que en algunos
casos donde el tiempo de
retencin y consecuentemente
la robustez de la tcnica de
anlisis son significativamente
afectadas. Indicando que el mtodo de preparacin de la solucin buffer y la presin en
encontrar ayudas adecuadas previene los problemas resultante de las diferentes
interpretaciones.

2. En la mezcla de solventes orgnicos y acuosos.

Soluciones obtenidas de mezclar solventes orgnicos y acuosos son en algunos momentos

usadas como fases mviles. La forma en que esta mezcla es obtenida puede causar efectos
significativos en los resultados. Como ejemplo, consideremos una mezcla del 90% 20mM
de solucin de acido fosfrico (sdico) a pH2.5 y 10% de acetonitrilo.
Si
consideramos
esta
descripcin
para indicar que la
relacin de mezcla
es 9:1 esto implica
que la relacin en
volumen de la
solucin de buffer
de 20mM de cido
fosfrico (sdico) a
pH
2.5,
con
acetonitrilo
es
9:1,
en
otras
palabras,
la
cantidad
correspondiente
est medida fuera
de la preparacin y
posteriormente
mezclada. Por otro
lado,
si
se
considera
esta
descripcin
simplemente como 10% de acetonitrilo, esto implica que la 20 mM de acido fosfrico
(sdico) ajustado a pH2,5 es usado, y que este es diluido con acetonitrilo dentro de la
preparacin. Aplicando la ltima interpretacin los cambios en los volmenes relativos y la
concentracin de buffer 20 mM de cido fosfrico (sdico) es consecuentemente mayor.
Existe una tendencia de pensar que no hay diferencias significativas entre estas dos
interpretaciones.
La figura 2., Sin embargo muestra como los mtodos de mezcla usados pueden tener un
efecto significativo en el anlisis de los resultados (particularmente en los tiempos de
retencin). En general, dependiendo de la preparacin de las fases mviles en HPLC, se
puede notar que A:B= 3:2 (V:V), indica que la cantidad de solucin A corresponde a un
volumen relativo de 3 a que la cantidad de solucin B corresponde a un volumen relativo
de 2, que son medidas separadas y posteriormente mezcladas, como comnmente se
debera interpretar. (En la prctica, el volumen total de la mezcla deber ser inferior que el
volumen relativo de 5 = 3+2).

Los problemas mencionados no solo ocurren en la preparacin de las fases mviles, sino
tambin en la preparacin de las muestras y en otras diluciones. Sin embargo las
diferentes prcticas y las convenciones usadas en diferentes campos ( ej, farmacuticos, e
industria qumica), causando adems una potencial causa de confusin. Documentos
oficiales, como la Farmacopea Japonesa, el Standard Methods para anlisis para
qumicos de higiene, y la (JIS) de sus siglas Estndar de Industria Japonesa, da unos
principios generales y unas definiciones relacionadas para la preparacin de las soluciones.
Es recomendable referirnos a estos documentos y esforzarnos a diario para utilizar la
notacin que evite la confusin.
Escrito por: Juan Felipe Barrios
Qumico, Especialista en Aplicaciones, Unidad de Instrumental
Purificacin y Anlisis de Fluidos.