UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CAMPUS IV, TAPACHULA

DIAGNOSTICO MOLECULAR

TRABAJO DE INVESTIGACION

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE PROTEINAS”

CATEDRATICO:

DR. LUIS MIGUEL CANSECO AVILA

ALUMNO:

RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL

SEMESTRE: 6° GRUPO: “A”

TAPACHULA CHIAPAS A 30 DE ABRIL DEL 2010

INTRODUCCIÓN
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la purificación, al menos
parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran
esfuerzo ya que una célula contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que
buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy
bajas. En este tema se presenta una visión general de las técnicas más usuales
empleadas para la purificación de proteínas, aunque muchas de ellas son aplicables a
la separación de la mayoría de las moléculas biológicas.

Los recientes avances en genética molecular han aumentado la importancia que

tienen los procesos de recuperación y purificación de proteínas.

A lo largo de los años, el aumento del uso de microorganismos como fuente de

proteínas, particularmente enzimas, ha conducido a la mejora en la eficiencia de
producción y a productos más reproducibles. La gran mayoría de las enzimas de uso
industrial son proteínas extracelulares procedentes de organismos como: Aspergillus
sp. Bacillus sp. e incluye a las enzimas α-amilasa, proteasas y glucoamilasa

Muchas de estas son producidas a partir de cepas silvestres de microorganismos. Sin

embargo, en la producción de proteínas para uso en el campo del diagnóstico clínico
y para aplicaciones terapéuticas, la ingeniería genética y proteica está comenzada a
jugar un papel muy importante día a día. La ingeniería genética además de permitir
enormes incrementos del rendimiento, ha permitido la transferencia del material
genético de animales a bacterias. De esta forma, esos productos sólo disponibles en
pequeñas cantidades en los tejidos animales pueden ser producidos ahora en
cantidades virtualmente ilimitadas a partir de bacterias crecidas de forma muy sencilla.

Las enzimas o las proteínas producidas por los microorganismos pueden ser
intracelulares, periplásmicas o secretadas al medio de cultivo. Para enzimas
extracelulares, el grado de purificación requerido es mínimo y los procesos a gran
escala pueden rendir toneladas de producto proteico.

Muchas otras enzimas sin embargo, son producidos en mezclas intracelulares mas
complejas y representan un mayor desafío implicado en la purificación proteica. Los
productos para un uso terapéutico deben presentar unas características de purezas
muy exigentes y exactas. De nuevo, la ingeniería genética ha sido capaz de ayudar
en esta tarea. En el caso de las proteínas terapéuticas, hay grandes ventajas si la
proteína de interés puede ser secretada, bien al periplasma, bien al medio. Esto
provoca una enorme reducción del nivel de proteínas contaminantes y otras
macromoléculas de forma que se puede obtener el producto puro tras solo dos o
tres pasos de purificación.

Ahora es posible añadir grupos a la proteína los cuales ayudan a su purificación Ya

que confiere propiedades específicas, pudiendo posteriormente eliminar estos grupos
cuando ya no es necesario.

DESARROLLO
 PROTEÍNA

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. El

nombre proteína proviene de la palabra griega πρώτα ("prota"), que significa "lo
primero" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar.

Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las
biomoléculas más versátiles y más diversas.
Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

• Estructural (colágeno y queratina)

• Reguladora (insulina y hormona del crecimiento),
• Transportadora (hemoglobina),
• Defensiva (anticuerpos),
• enzimática (sacarasa y pepsina),
• Contráctil (actina y miosina).

Las proteínas de todo ser vivo están determinadas mayoritariamente por su genética
(con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal), es
decir, la información genética determina en gran medida qué proteínas tiene una
célula, un tejido y un organismo.

Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes

que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El
conjunto de las proteínas expresadas en una circunstancia determinada es
denominado proteosoma.

CARACTERÍSTICAS

Los prótidos o proteínas son biopolímeros, es decir, están constituidas por gran
número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran
tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman
siempre dispersiones coloidales, con características que las diferencian de las
disoluciones de moléculas más pequeñas.

Por hidrólisis, las moléculas de proteína se escinden en numerosos compuestos

relativamente simples, de masa molecular pequeña, que son las unidades
fundamentales constituyentes de la macromolécula. Estas unidades son los
aminoácidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre sí
mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar
en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína.

Todas las proteínas tienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas
poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el
contenido de nitrógeno representa, por término medio, 16% de la masa total de la
molécula; es decir, cada 6,25 g de proteína contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza
para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición
de N de la misma.

La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las
directrices de la información suministrada por los genes.
Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre
el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido
adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una proteína está codificada en su gen
(una porción de ADN) mediante el código genético. Aunque este código genético
especifica los 20 aminoácidos "estándar" más la selenocisteína y —en ciertos Archaea
— la pirrolisina, los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas
en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula,
o como parte de mecanismos de control. Las proteínas también pueden trabajar juntas
para cumplir una función particular, a menudo asociándose para formar complejos
proteicos estables.

FUNCIONES

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas

constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos
biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan
algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que
desempeñan.

Son proteínas:

• Casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos

vivientes;
• Muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
• La hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la sangre;
• Los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones
o agentes extraños;
• Los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de
desencadenar una respuesta determinada;
• La actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo
durante la contracción;
• El colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostén.
 ESTRUCTURA

Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una
disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas
condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso
denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene
determinada por la secuencia de aminoácidos.

Para el estudio de la estructura es frecuente considerar una división en cuatro niveles

de organización, aunque el cuarto no siempre está presente.

Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional:

• Estructura primaria.
• Estructura secundaria.
• Nivel de dominio.
• Estructura terciaria.
• Estructura cuaternaria.

A partir del nivel de dominio sólo las hay globulares.

ETAPAS POSTERIORES DE PROCESAMIENTO: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

DE PROTEÍNAS

LISIS CELULAR
Para obtener proteínas intracelulares de los microorganismos existen tres métodos
generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser
utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo mas destacado es la
sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el
laboratorio.

Métodos enzimáticos de ruptura celular

La lisozima cataliza de forma específica, la hidrólisis de enlaces β- 1,4-glucisidícos

presentes en los mucopéptidos de las paredes celulares de las bacterias. Las
bacterias Gram-positivas son las que presentar mayor sensibilidad a la lisozima. Sin
embargo, la ruptura final de la envoltura celular, depende a menudo de la presión
osmótica del medio de suspensión una vez que se ha digerido la pared. En las
bacterias gran-negativas la ruptura de la pared celular se consigue con lisozima y la
adición de EDTA, que actúa como agente quelante de iones metálicos, origina
generalmente la lisis celular. Esta técnica no se puede utilizar para extracciones a
gran escala de enzimas bacterianas debido al costo relativamente alto de la lisozima.
En situaciones concretas se ha empleado glucanasas microbianas para hidrolizar las
paredes de las levaduras, que contienen β-1,3 glucano, 3 y la lisoestafina empleada
para liberar proteínas de estafilococos por ejemplo, la proteína A de S. aureus.

Métodos químicos de lisis celular

• Álcali.
Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas
bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica L-
asparaginasa puede liberarse por tratamiento de Erwinia chrysanthemi a un pH
alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20 minutos.4 el éxito del tratamiento depende de la
estabilidad en álcali del producto a obtener. El elevado pH puede inactivar las
proteasas y este método también es valioso en la inactivación lisis de
microorganismos manipulados por ingeniería genética.

3
(R. Kobayashi, T. Miwa, S. Yamamoto, and S: Nagasaki, Eur. J. Appl. Miccrobiol. Technol., 1982, 15, 14.)
4
(T. Atkinson, B. J. Capel, and R. F. Sherwood, in `safety in industrial microbiology`, ed c. h. Collins and A.
J. Beale, butterworth, Oxford, 1992, p. 161.)
• Detergentes.
Los detergentes, tanto iónicos, como es el caso del lauril sulfato sódico, colato sódico
(aniónico) y el bromuro de cetiltrimetilamonio (catiónico), o no-iónicos, por ejemplo el
tritón X-100, X-450 o incluso el Tween, se han utilizado para favorecer la lisis celular.
Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden
ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas.
La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de
purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales. Esto
puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico
o por ultrafiltración

el tritón X-100 ha sido empleado para la liberación a gran escala del colesterol
oxidasa a partir de Nocardia sp.5y el colato sódico se ha utilizado para solubilizar
pululanasa una enzima ligada a membrana, a partir de células intactas de Krebsiella
pneumoniae.6

Métodos físicos de lisis celular

• Choque osmótico.

El choque osmótico ha sido utilizado en la extracción de enzimas hidroliticas y

proteínas ligadas del espacio periplásmico de cierto número de bacterias Gram-
negativas, incluyendo a Salmonella typhimurium y E. coli.7 El método implica el lavado
del cultivo de bacterias en una solución tampón para tratar de eliminar los restos del
medio de cultivo y posteriormente, por ejemplo, resuspenderlo en tapóm con sacarosa
al 20%. Tras equilibrarse, las células se recogen y resuspenden rápidamente en agua
a una temperatura aproximada de 4°C. Solamente un 4-8% de la proteína total
bacteriana se libera por choque osmótico pero si la enzima requerida se localiza en la
región peri plasmática, el choque osmótico puede producir un incremento de 14 a 20
veces en la purificación con otras técnicas de extracción. 8
El empleo del choque osmótico se está viendo favorecido con el incremento en el
número de proteínas recombinantes que se secretan al periplasma.
Homogeneización con abrasivos.

Inicialmente esta técnica se utilizaba para la homogeneización de pastas celulares en

un mortero con polvo abrasivo tal como cristal, alúmina o kieselguhr. El sistema ha
sido desarrollado y mecanizado utilizando dispositivos desarrollados originalmente
para la homogeneización húmeda y la dispersión de pigmentos en las industrias de
impresión y pintura. Un producto típico, el Dynomill (w. a. Bachofen, Suiza) se emplea
para liberar proteínas de una amplia variedad de microorganismos. Consiste en una
cámara que contiene bolsa de vidrio y varios discos fijos y rotatorios. La suspensión
celular se bombea en la cámara, y la rápida agitación es suficiente para romper incluso
las bacterias más resistentes. La cámara de desintegración está refrigerada para
eliminar el calor que se genera.

5
(B. C.Buckland, W. Richamond, p. Cunnill, and M. D. Lilly, in `industrial Apsects of Biochemestry`, ed. B.
Spencer, North Holland Publishing company, Amsterdam, 1974. P.65.)
6
(6 K. H. Kroner, H. Hustedt, S. Granda, and M-R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1978, 20, 2967.)
7
Neu and L. A. Heppel, J. Biol. Chem., 1965, 240, 3685.
8
S. E. Charm and C. C. Matteo, Methods Enzymol., 1971, 22, 476.
Un elevado número de factores influyen en la proporción de células lisadas, entre ellos
el tamaño y concentración de bolas de vidrio, el tipo, la concentración y la edad de las
células, la velocidad de agitación, el flujo a través de la cámara, la temperatura de
ruptura y la disposición de los discos del agitador, habiéndose investigado todos ellos
para levaduras10 y para bacterias.11

Tamización sólida
El método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de
pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a
-20°C. Se ha descrito un proceso semicontinuo, basado en una prensa X a escala de
laboratorio, el cual presenta un peso de 10 Kg de pasta celular bacteriana por hora a
una presión de 150 MPa y con una deficiencia del 90 % en la ruptura.12

Tamización líquida

Este es ahora el método de ruptura celular de elección utilizado en la lisis a gran

escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicación tanto en procesos
industriales como de investigación. Es particularmente útil en la ruptura de células
bacterianas aunque también puede ser efectivo en la rotura de hongos o levaduras.13

Las células en una suspensión líquida son forzadas a pasar a través de un orificio de
pequeño diámetro bajo una presión muy elevada. Para trabajos a pequeña escala se
puede emplear una versión continua de la Prensa Frech

Para trabajos a gran escala se emplea generalmente un homogeneizador que se

pensó para la producción de emulsiones en la industria lechera.

Para trabajos a gran escala el homogeneizador Manton-Gaulin es el más empleado.

Las proporciones de rotura celular y de liberación proteica dependen de diversos
factores, entre los que se incluyen el tipo de células, la concentración de las mismas y
el pre tratamiento. El grado de liberación proteica de células de levadura se describe
por la ecuación empírica de primer orden.14

log (Rm / Rm – R) = K n p2.9

Donde Rm = cantidad teórica máxima de proteína soluble que puede ser liberada, R =
cantidad de proteína soluble liberada, K = constante dependiente de la temperatura, n
= número de veces que la suspensión pasa a través de la máquina, y p = presión de
trabajo.

Ejemplos sobre el empleo de los homogeneizadores Manton-Gaulin para la rotura a

gran escala de células microbianas. La β-galactosidasa se ha obtenido de E. coli 15.16 y
la carboxipep-tidasa a partir de Pseudomonas spp.17

Un elevado número de enzimas se han obtenido de la bacteria termofílica Bacillus

stearothermophilus,18 incluyendo la gliceroquinasa19.21 y una hexoquinasa glucosa
específica.22
10
F. Marfy and M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1974, 16, 623.
11
J.R. Woodrow and a. v. quirk, enz, microbial. Technol., 1982, 24, 385
12
K.E. Magnusson and L. Edebo, Biotechnol. Bioeng., 1976, 18, 975.
13
S. T. L. Harrison, J. S. Dennis, and H. A. Chase, Cioseparation, 1991, 2, 95.
14
M. Follows, P. J. Hetherington, and M. D. Lilly, Biotechnol, Bioeng., 1971, 13, 549.

PURIFICACIÓN INICIAL

Eliminación de restos celulares

Una vez provocada la ruptura celular, la primera etapa en la purificación de una

enzima intracelular es la separación de los restos celulares. La separación de sólidos
de líquidos es una operación clave en el aislamiento de una enzima y normalmente se
lleva a cabo por centrifugación o filtración.

Centrífugas
Existen diferentes centrífugas con rangos de capacidad desde las de menos de 1 ml
hasta aquellas que superan varios litros, capaces de aplicar una fuerza centrífuga
superior a 100.000 g. Sin embargo, para la eliminación de células bacterianas, de
restos celulares o de los precipitados proteicos es suficiente disponer de 20.000 g.

Centrífugas de flujo continuo

Debido a los grandes volúmenes de líquido que es necesario manejar al comienzo de

un proceso de purificación enzimática a gran escala, es preferible utilizar una
centrífuga de flujo continuo para eliminar el material particulado.

Existen tres tipos básicos de centrífugas: la centrífuga tipo disco o multicámara, la

centrífuga de cámara hueca y la centrífuga de cestillo.

Las centrífugas de cámara hueca tienen un rotor tubular que provoca un flujo de
extracto elevado, el cual se bombea en el fondo y fluye hacia la superficie de la
cámara. El material particulado se deposita en las paredes del rotor y los extractos
clarificados salen por la parte superior y son recogidos en un recipiente receptor.
La facilidad para cambiar el rotor o la utilización de un mecanismo de transporte para
recuperar el sedimento han contribuido a la popularidad de este tipo de centrífugas.

Las centrífugas de disco permiten excelentes rendimientos en la clarificación de

extractos crudos y en muchos casos el sedimento se puede eliminar sin interrumpir el
proceso de centrifugación. La cámara contiene una serie de disvos alrededor de un
cono central. Al entrar los extractos, el material particulado es arrojado al exterior,
chocando con los discos y sedimentando el material sobre la pared de la cámara.

Una desventaja de este tipo de centrifugación es la perdida de actividad cuando se

descargan los sólidos.

15
P. P. Gray, P. Dunnill, and M. D. Lilly, in proceedings of the IVth International Fermentation Symposium,
ed. G. Terui, Socety for Fermentation Technology, Osaka, Japan, 1972, 347.
16
J. J. Higgins, D. J. Lewis, W. H. Daly, F. G. Mousqueira, P. Dunnill, and M. D. Lilly, Biothenol. Bioeng.,
1987, 20, 159.
17
R. F. Sherwood, R. G. Melton, S. M. Alwan, and P. Hughes, Eur. J. Biochem., 1985, 148, 447.
18
T. Atkinson, G. T. Banks, C. J. Bruton, M. J. Comer, R. Jakes, T. Kamalagharan, A. R. Whitaker, and
G.P. Winter, J Appl. Biochem., 1979, 1, 247.
19
M. J. Comer, C. J. Bruton, and T. Atkinson, J Appl. Biochem., 1979, 1, 259.
21
P. M. Hammond, T. Atkinson, M. D. Scawen, J Chromatogr., 1986, 366, 79.
22
C. R. Goward, R. Hartwell, T. Atkinson, and M. D. Scawen, Biochem. J., 1986, 237, 415
Los rotores de estos instrumentos que carecen de la facilidad para descarga del
sedimento durante el proceso son difíciles de limpiar y ello puede resultar en una
perdida de producto cuando se necesitan estos sólidos.

Una variación de la centrifuga tipo disco es la centrifugación con un rotor de cámaras

múltiples en la que el rotor s divide por cilindros montados verticalmente en una serie
de cavidades interconectadas. Este tipo de acoplamiento asegura un paso fijo corto y
constante para el llenado del rotor y es más fácil de desmontar y de limpiar que la
centrifuga de tipo disco.

Centrifugas de ese tipo son comercializadas por De Laval Separator Co. (Nueva
York; USA) wesfalia separator Ltd. (wolver ton, UK) y por Bird machine co. (south
Walpole, Massachusetts, USA). Existe una revisión del desarrollo y la construcción de
separadores para centrifugas en gran escala.23

Un problema que se presenta en todos los tipos de centrifugación cuando se trabaja a

nivel industrial en la recuperación de encimas es que la mayora de los homogenizados
produce precipitados poco consistentes. En algunos casos, puede evitarse mediante la
adición de un agente tal como el CDR basado en la celulosa24

Centrifugas de cestillo

El principal objetivo de estas maquinas es la obtención de material particulado de gran

tamaño. En el contexto de la purificación de enzimas esto se refiere generalmente a
materiales intercambiadores iónicos, lo cuales han sido empleados apara la adsorción
de la proteína deseada.

Filtración através de la membrana.

Un método alternativo para la clarificación de extractos celulares es la filtración. Sin

embargo, la preparaciones microbianas frecuentemente son gelatinosas y por ello
difíciles de filtrar por los métodos tradicionales a menos que se empleen áreas de
gran tamaño para la filtración.

Para evitar estos problemas se utiliza la filtración tangencial o de flujo cruzado.

Las arilacilamidasa y carboxipptidasa G procedentes de especies seleccionadas de
Pseudomonas se han aislados con éxito a partir de estos celulares rotos por micro
filtración tangencial usando el sistema pellicon de millipore (millipore (UK) Ltd.,
Londres, UK).

Las membranas con una estructura de poro asimétrica son bastante menos propensas
a ensuciarse. Este tipo de membranas se han utilizados para separar arilacilamidasa
de restos celulares de Pseudomonas. Membranas de este mismo tipo también se han
usado en mayor escala para obtener L-asparaginasa a partir de Erwinia chrysanthemi.
Esta misma estructura se empleo también para clarificar un extracto producido
mediante la lisis alcalina de estas bacterias.

23
H. Hemford and W. Kohlstette, Chem. Ind., 1985, 108, 412.
24
M. Hoare, P. Dunnill, and D. J. Bell, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1983, 413, 254.
SEPARACIÓN ACUOSA BIFÁSICA

Los sistemas acuosos de dos fases, típicamente creados almizclar soluciones de

polietilenglicol y dextrano o polietilenglicol y sales especificas como fosfato potásico o
sulfato amonico se pueden utilizar tanto para la separación de proteínas durante la
purificación proteica como para la separación de proteínas de los restos celulares.29-33
Este fenómenos refleja el balance entre los componentes implicados: polímeros, sales,
proteínas y solventes (agua).

Una separación de proteínas precisas depende de parámetros tales como su peso

molecular y carga, la concentración y el peso molecular de los polímeros, la
temperatura, el pH., la fuerza iónica de la mezcla y la presencia de sales polivalentes
tales como sulfato o fosfato.29-30 Las condiciones óptimas requeridas para una proteína
pedicular se deben encontrar empíricamente. Aunque las condiciones requeridas para
llevar acabo una separación satisfactoria pueden a menudo ser definidas de forma
precisa, el mecanismo de separación es muy poco conocido y la influencia precisa de
las sales inorgánicas, desconocida.

Además, el polietilenglicol, que es usado comúnmente en estas separaciones de

fases, puede unirse a proteinas y esto puede causar comportamientos anómalos en
los siguientes pasos cromatograficos típicos.34
Las fases se pueden separar en un depósito, pero una separación mas rápida y
eficiente se lleva acabo mediante centrifugación.

Se están investigando sustitutivos del dextrano crudo36 o el hidroxipropilalmidon.37

Abbott et al. Ofrece una buena visión general de los sistemas acuosos bifásicos con
polímetros.

La separación bifásica se a empleado en la purificación y separación a gran escala

de la pulgada -6-glucan hidrolasa y de la 1,4-ßglucan-fosforilasa a partir de 5 Kg, de
homogenizado celular de klebsiella pneumoniae39, y RNA polimerasa y glutamina
sintetasa de E.coli40.

Para alterar el proceso de separación de proteínas se han unido ligados a los

polímetros (partición-.afinidad).29.32.33

La separación por afinidad se ha utilizado para purificar la fórmico deshidrogenasa a

partir de la levadura cándida bodinii, usando el colorante tiazinico rojo porción HE-3B,
inmovilizado sobre polietilenglicol29. La separación acuoso bifásica es un método que
puede ser fácilmente aumentando de escala a un nivel de manufacturación, aunque el
coste de los polímeros podría ser un factor limitante.
29
M. R. Kula, in ‘Extraction and purification of Enzymes, Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2’,
ed. L. B. Wingard jnr., E. Katchalski-Katzir, and L. Goldstein, Academic Press, New York, 1979, p. 71.
30
M. R. Kula, D. H. kroner, and H. Husterdt, Adu. Biochem. Eng., 1982, 24, 73
33
H. Walter andG. Johansson, Anal Biochem, 1986, 155, 215.
34
J. Woodrow and A. V. Quirk, Enz. Microb. Technol, 1986, 8, 183.
32
G. Johansson, j. Biotechnol. 1985, 3, 11.
34
J. Woodrow and A. V. Quirk, Enz. Microb. Technol, 1986, 8, 183.
36
K. H. Kroner, H. Hustedt, and M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, 1015.
37
F. Tjerneld, S. Berner, A. Cajarville, and G. Johansson, Enz. Microb. Technol., 1986, 8, 417.
38
N. L. Abbott, D. Blankschtein, and T. A. Hatton, Biosepatarion, 1990, 1, 191.
39
H. Hustedt, K. Kroner, W. Stach, and M. R. Kula, Biochnol. Bioeng., 1978, 20, 1989.
40
H. Vilter, Bioseparation, 1990, 1, 283.

PRECIPITACION

Sulfato amónico

La precipitación de proteínas mediante el uso de sales ha sido utilizada durante

muchos años, siendo útil tanto para su purificación como para su concentración. La sal
más comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta solubilidad, a la
ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo costo. La
precipitación de una proteína mediante el tratamiento con una sal depende de diversos
factores: como el pH, temperatura, la concentración de proteínas y la sal empleada.46

Solventes orgánicos
La adición de solventes orgánicos a soluciones acuosas reduce la solubilidad de las
proteínas al disminuir la constante dieléctrica del medio. Siendo los más utilizados el
etanol, la acetona y el 2-propanol, que es el más empleado. Debido a que las
proteínas se desnaturalizan en presencia de solventes orgánicos es aconsejable
trabajar a temperaturas inferiores a 0⁰C.

La naturaleza inflamable de los materiales junto al alto costo y la baja selectividad

hacen que los solventes orgánicos no sean usados a menudo en purificaciones
enzimáticas a gran escala.

Polímeros de alto peso molecular

Existen otros agentes precipitantes orgánicos que pueden ser empleados para el
fraccionamiento de proteínas; entre ellos nos encontramos los polímeros
acuosolubles, de los cuales es el polietilenglicol el más ampliamente utilizado. Este
compuesto presenta las siguientes ventajas: no es toxico, no es inflamable y además
no produce la desnaturalización de proteínas.48 Se usa fundamentalmente en el campo
del procesamiento de sangre.49

CROMATOGRAFIA

La purificación de enzimas por cromatografía ha sido una práctica de laboratorio

durante muchos años. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser
empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de
proteínas

La cromatografía es la única metodología con la selectividad suficiente para purificar

una proteína de una mezcla proteica compleja con un grado de purificación final
superior al 99,8%.

48
K. C. Ingham, methods Enzymol. 1984, 104, 351.
49
Y. L. Hao, W. Hoenig, and M. Wickerhauser, in `Methods of Plasma Fractionation`, ed. J. Curling,
Academic press, New York, 1980, p. 57.
Optimización del salto de escala y de la calidad del proceso

En la cromatografía analítica, así como en muchas aplicaciones a escala de

laboratorio, la cantidad de muestra que se aplica es pequeña y el fin principal es el de
obtener el mayor numero de picos o el producir una pequeña cantidad de proteína
altamente purificada. La velocidad de flujo empleada suele ser baja, siendo la
resolución el factor decisivo. Por el contrario, el propósito principal en la cromatografía
preparativa es la purificación de grandes cantidades de proteína en el menor tiempo
posible. Los flujos suelen ser elevados ya que la velocidad de procesamiento es más
importante que la resolución.

El salto de escala en la separación cromatografica es, en principio, sencillo, ya que la

teoría de esta metodología señala que el diámetro de la columna no presenta un
efecto importante sobre la resolución, de forma que bastaría con incrementar el
diámetro de la columna para provocar el salto de escala.
Antes de realizar un proceso a gran escala es importante que el proceso de
purificación que se ha de efectuar este optimizado y totalmente estudiado a nivel de
laboratorio. La búsqueda inicial de las condiciones ideales en una técnica de adsorción
debe efectuarse empleando diferentes adsorbentes bajo diversas condiciones de pH y
fuerza iónica. Se pueden poner a punto métodos cromatograficos adecuados
utilizando tanto equipos convencionales de baja presión como de elevada presión, con
grandes prestaciones.

A continuación de este proceso de optimización, el siguiente paso es el aumento de la

cantidad de muestra que se puede separar en la columna, que debe multiplicarse por
un factor de entre diez y veinte. La altura de la columna debe Mantenerse constante,
mientras que el área superficial deberá incrementarse en proporción a la cantidad de
muestra. El gel debe ser el mismo, o al menos tener características similares. El flujo,
la fuerza iónica y el pH deben mantenerse invariados. Si se emplea un gradiente de
elución, la relación entre los volúmenes de gradiente y de la columna debe ser
idéntica.

En principio, estos procesos de salto de escala deben repetirse hasta alcanzar la

escala de operatividad deseada.

En la proporción en que aumenta el diámetro de la columna incrementa el costo, así

como la dificultad para asegurar la carga de la muestra sobre toda la superficie.
Si el producto proteico va a ser destinado para uso humano existen otros factores,
junto a los mecanismos del salto de escala, hay que tener en cuenta. Existiría la
necesidad de demostrar que cualquier material que pudiera haber entrado en contacto
con el producto durante su elaboración no. esto tiene presencia residual en el
producto final. Es necesario un control estricto de las materias primas, incluidas las
matrices de cromatografía utilizadas, para asegurar criterios estrictos en términos de
pureza y aceptación. Esto, a su vez podría influir en la elección del método.

Para llevar a cabo un procesado de calidad, es necesario distinguir entre los

contaminantes procedentes del sistema biológico de las materias primas del proceso
de aquellos introducidos incidentalmente durante el procesado. Es especialmente
necesario disponer de métodos analíticos adecuados para la cuantificación de estas
impurezas, las cuales podrían estar presentes en el producto final. Los contaminantes
introducidos durante el procesado pueden ser de muy diversa naturaleza. Antes de la
introducción deliberada de cualquier elemento durante el protocolo de purificación, es
necesario asegurarse de que su presencia puede ser seguida de forma adecuada- se
debería demostrar, así mismo, que puede ser eliminada satisfactoriamente (usando un
paso de eliminación) en una etapa posterior.

Los niveles de pureza deben ser extremadamente elevados, y esto podría eliminar
ciertos abordajes para el salto de escala. La demostración de pureza es una
consideración importante para lograr un proceso de calidad y ha conducido a la
necesidad de complejas estratégicas para el análisis de la pureza de las proteínas
incluso donde estas proteínas de uso farmacéutico se han producido mediante
tecnología de DNA recombinante.51
51
V. R. Anicetti, B. A. Keyt, and W. S. Hancock, Trend Biotechnol., 1989, 7, 342.

Selección de la metodología
 Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier
de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio
iónico, interacción hidrofobica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.

Tabla 1 métodos cromatografico para la purificación de proteínas a gran escala

Característica Tipo de Características Aplicación
molecular cromatografía
aprovechada
Tamaño Gel filtración Resolución moderada para el El fraccionamiento es mejor
fraccionamiento y buena para en las últimas etapas de la
tampones intercambiadores. purificación. En cualquier
Capacidad limitada por el momento puede ser utilizado
volumen de la muestra. los tampones
intercambiadores y podrá
existir una limitación respecto
al volumen de la muestra.
Carga Intercambiador La resolución puede ser alta. Es más efectiva en las
iónico Capacidad alta no limitada por primeras fases del
el volumen de la muestra. La fraccionamiento cuando se
velocidad puede ser muy van a manipular grandes
elevada dependiendo de la volúmenes.
matriz.
Cromatoenfoque La resolución puede ser alta. Es mejor usarla en una
La capacidad puede ser alta. purificación posterior, ya que
La velocidad puede ser alta. las matrices son caras.
Polaridad Interacción Resolución buena. Capacidad Puede ser utilizado en
hidrofobica muy alta y no limitada por el cualquier fase, pero es mejor
volumen de la muestra. aplicarla cuando la fuerza
Velocidad alta. iónica es alta tras la
precipitación con sales o
después de un intercambio
iónico.
Afinidad afinidad La resolución puede ser Puede emplearse en
biológico elevada. Capacidad puede ser cualquier etapa, aunque
alta o baja, dependiendo de normalmente no es
ligando y no limitada por el recomendable en las
volumen de la muestra. primeras fases.
Velocidad elevada.

En este sentido, etapas en las que se produce una concentración del producto, como
es la cromatografía de afinidad, hidrofobica o de intercambio iónico deben realizarse
antes que aquellas que causan una dilución, como es el caso de la filtración a través
de geles. La cromatografía de interacción hidrofobica puede realizarse posteriormente
a una de intercambio iónico con un cambio mínimo en el tampón, puesto que la
mayoría de las proteínas se unen mas fuertemente a un soporte hidrofobica a fuerzas
iónicas altas.

LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD ES CAPAZ, POR SI SOLA, PARA LLEVAR A

CABO LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A ESCALA DE LABORATORIO.

Elección de la matriz
Quizás la decisión mas importante que se debe tomar cuando se diseña un proceso de
purificación a gran escala sea la concerniente a la selección del tipo de matriz de
cromatografía. Una matriz de cromatografía a gran escala deberá ser hidrofilica,
macroporosa, rígida, con partículas esféricas, químicamente estable, ligandos
delicados y de fácil modificación.

Tabla 2 ejemplos de matrices para cromatografías a gran escalas. Este listado no es

exhaustivo, pero se pretende dar ideas acerca de la cantidad de material disponible.
Matriz ejemplo proveedor
Dextrosa con enlaces entrecruzados Sephadex 1
Poliacrilamida con enlaces entrecruzados Biogel-P 2
Agarosa Sefarosa 1
Biogel-A 2
Ultrogel-A 3
Agarosa con enlaces entrecruzados Sefarosa CL 1
Sefarosa FF 1
Superosa 1
Compuesto de poliacrilamida y dextrosa Sephacry1 1
Compuesto de poliacrilamida y agarosa UltragelAcA 3
Compuesto de dextrosa y agarosa Superdex 1
Polímeros etilenglicol-metacrilato Trisacry1 3
celulosa Fractogel 4
Cellex 2
DE-52, CM-52 5
Sephacel 1
Cellufina 6
Polímeros orgánicos rígidos Monobeads 1
TSK-PW 4
POROS 7
Sílice porosa Zorbax 8
Aquapore 9
1
Pharmacia AB, Uppsala, Suecia. 2BioRad Laboratories, Richmond, California, USA. 3IBF Biotechnics,
Villeneuve la Garenne, Francia. 4TosoHass, Montgomeryville, Pennsylvinia, USA. 5Whatman Ltd.,
Maidstone, Kent, UK. 6Amicon Ltd., Stonehouse, Goucestershire, UK. 7Perseptive Biosystems Inc.,
Cambridge, Massachusetts, USA . 8 Rockland Technologies, Wilmington, Delaware, USA. 9 Brownlee
Laboratories Inc., California, USA.
Tabla 3. Propiedades de las matrices cromatográficas básicas.

Porosidad Adsorció Rigide Estabilida Facilidad Coste

Tipo de Matriz n z d de relativo
no- modificació
específic n
a
Dextrano con enlaces Baja Baja Baja Buena Buena Bajo/medio
entrecruzados
Poliacrilamida con Baja Baja Baja Buena Buena Medio
enlaces entrecruzados
Agarosa Alta Baja Baja Deficiente Buena Medio
Agarosa con enlaces Alta Baja Media Buena Buena Medio
entrecruzados
Compuesto Alta Media Media Buena Buena Medio
Poliacrilamida/Dextrano
Compuesto Media Baja Media Buena Buena Medio/alto
Poliacrilamida/Agarosa
Polímero acrílico Media Media Media Buena Buena Medio
hidroxilado
Copolímero etilenglicol- Baja/media Media Media Buena Buena Medio
metacrilato
Celulosa Media/alta Alta Baja Buena Buena Bajo
Sílice porosa Baja/media Alta Alta Deficiente Deficiente Alto
Polímero orgánico Media/alta Baja Alta Buena Buena Alto
rígido

Algunos geles, como los basados en agarosa o celulosa, son productos naturales;
otros, como aquellos basados en dextranos entrecruzados o agarosa, son productos
Naturales modificados; un tercer grupo esta basado en componentes totalmente
sintéticos tales como la poliacrilamida, el polihidroxietilmetacrilato o el poliestireno.

Los geles pueden clasificarse además en macroporosos, como los geles de agarosa o
de celulosa, o microporos como los geles de dextrano o de poliacrilamida con enlaces
entrecruzados. Los geles macroporosos son de mayor utilidad en la cromatografía de
afinidad o de intercambio ionico o para el fraccionamiento de moléculas de gran
tamaño, virus, proteínas muy grandes, o micro proteínas.

Los geles de microporosos son más aplicados para el fraccionamiento de restos de

proteínas. Los primeros geles con consistían en matrices de dextrano con enlaces
entrecruzados, celulosa, poliacrilamida, o agarosa, eran muy blandos no se
adecuaban fácilmente a procesos cromatográficos a gran escala. La nueva generación
de geles macroporosos a un que formados por un elevado numero de enlaces
entrecruzados, son matrices de agarosa o de poliacrilamida-agarosa, son mucho mas
rígidos y adecuados para purificación a gran escala. Poseen un tamaño de partícula
más pequeño y mejor controlado, lo que permite una reproducibilidad mayor cuando
se usan grandes velocidades de flujo.
Gel filtración

Éste tipo de separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria esta

formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente móvil. Cuando se añade la
muestra, las moléculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.

Las moléculas de tamaño, incapaces de atravesar los poros, pasan a través de los
espacios intersticiales y eluyen en primer lugar. Las moléculas más pequeñas que
pueden pasar a través de los poros, se eluyen posteriormente, en orden decreciente
de tamaño.

El volumen total de una columna puede representarse por:

Vt = V0 + Vi + Vm (2)

Donde Vt es el volumen total de la columna, V0 el volumen del solvente en el

exterior de las partículas, Vi el volumen del solvente que ocupa el interior de las
partículas, y Vm el volumen de la matriz.

El volumen de elución de una proteína puede por tanto variar entre, V0 para
una proteína que no penetra en los poros del gel, y Vi para aquellas que son capaces
de entrar en la matriz. Así es posible calcular un coeficiente de partición efectivo, Kav,
el cual varía entre 0 y 1.

Kav = (Ve – V0) / (Vt – Vo) (3)

Donde Ve es el volumen de elución del soluta, Vo el volumen vacío de la columna y Vt

el volumen total de la columna. Para las proteínas globulares se ha demostrado
empíricamente que el valor de Kav es inversamente proporcional al logaritmo de la
masa molecular relativa.
Es esencial que no exita interacción entre la matriz y el soluto; por consiguiente, la
sustancia ideal que forma la columna debería ser totalmente inerte, y para tener
capacidad máxima, debería ser también altamente porosa y rígida.

Para el trabajo a gran escala, la rigidez es quizás el factor más importante ya que
determina la velocidad de flujo que se puede utilizar.

Por esta razón, la mayoría de las aplicaciones del gel filtración se limitan a proceso de
eliminación de sales, empleando geles de baja porosidad, aunque sean rígidos como
es el caso de Sephadex G-25 y G.50.

Cromatografía de intercambio iónico

Tradicionalmente para el fraccionamiento de proteínas se han empleado los

intercambiadores iónicos basados en compuestos de celulosa con diversos
sustituyentes;
Tabla 4. Sustituyentes en intercambiadores iónicos
Intercambiador anionico
Amina cuaternaria (Q) -CH2-N+-(CH3)3
-O-CH2-CH2-N+-
Amino etilo cuaternario (QAE)
(C2H5)3
-O-CH2-CH2-N+-
Dietilaminoetilo (DEAE)
(C2H5)2
Los intercambiadores celulósicos iónicos son ideales para diversas operaciones como
primera etapa en varios procesos.

No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de

celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren
cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza iónica siendo muy
complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

La cromatografía de afinidad es quizá el método de purificación más elegante para

obtener una proteína a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en
el laboratorio, solo en los últimos años parece aceptable en purificaciones a escala
industrial.

Esta metodología se basa en la interacción de una proteína con un ligando

inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una proteína particular, por
ejemplo un sustrato, un análogo del substrato, un inhibidor, o un anticuerpo. Existen
alternativas en las que el ligando es capaz de interaccionar con una variedad de
proteínas, en este caso del NAD, AMP, ADP, colorantes, o cadenas de hidrocarburos.

La cromatografía de afinidad con nucleótidos inmovilizados es escasamente usada en

procesos de purificación a gran escala quizá debido a su inestabilidad, corte, baja
capacidad y las dificultades de su incorporación a una matriz solida.

Para la purificación a gran escala de muchas enzimas, se ha empleado colorantes

inmovilizados, puesto que poseen ventajas tales como facilidad de unión a un soporte
matriz, estabilidad, alta capacidad y al económicos.55
55
Y. D. Clonis, C. R. Lowe, T. Atkinson, and C. J. Bruton,`Reactive Dyes in Protein and Ensyme
Technology`, Macmillan, London, 1987.

Tabla 5. Ejemplos de enzimas purificadas a gran escala por cromatografía de afinidad

con colorantes.
Enzima Colorante Eluyente
Gliceroquinasa Proción azul-MX-3G 5 mM ATP
Glucoquinasa Proción marrón H-3R 2 mM ATP
Glicerol deshidrogenasa Proción rojo HE-3B 2 mM NAD
Metionil- tRNA sintetasa Proción verde HE-4BD Gradiente de fosfato
Triptofanil tRNA sintetasa Proción marrón MX-5BR 50 mM triptófano
1 M KC1
3-hidroxibutirato deshidrogenasa Proción rojo H-3B

Proción azul MX -4GD 1 M KC1 + 2 mM NADH

Malato deshidrogenasa
Proción rojo H-3B 1 M KC1 + 2 mM NADH
Gradiente 0-0,7 mM KC1
Proción azul MX-4GD

Adsorbido en presencia
de 0,2 mM Zn2+ y tris
Carboxipeptidasa G2 C1H 0,1 M, eluido con
10 mM EDTA pH 5,8y
Proción rojo H-8BN después, con tris-C1H
0,1 M pH 7.3

Albumina de suero bovino Cibracron azul F3-GA 20 mM octanoato sódico

Albumina de suero bovino Cibracron azul F3-GA 3 M NaCl, pH 8,6

Los colorantes son, a menudo, estructuras del tipo de la antraquinona, que unen
proteínas por la interacción con los dominios de unión a nucleótidos de las
deshidrogenasas. Han sido aislados muchos otro tipos de proteínas con estos
colorantes, 56 por lo que se piensa que la interacción específica para cada caso debe
ser mas variable y, en las mayoría de los casos, desconocida.

En los últimos años se han empleado de forma más amplia la cromatografía de

inmunoafinidad debido a la mayor disponibilidad de anticuerpos monoclonales. Por
ejemplo, el interferon leucocitario recombinante60 y las tres hormonas pituitarias
humanas61, 62 han sido purificadas usando esta técnica.

Puesto que la cromatografía de afinidad presenta una alta selectividad, es por lo que
se pueden purificar proteínas varios miles de veces en un solo paso. A menudo, es
posible separar formas activas e inactivas de una proteína, mediante el uso de un
anticuerpo o pseudosubstrato, o eliminar una pequeña cantidad de impureza de un
producto puro. Existen otros muchos ejemplos sobre la utilidad de esta metodología en
procesos a gran escala, entre ellos están los descritos por Hill y Hirtenstein y Clonis.64
56
M. D. A. Scawen and T. Atkinson in `Reactive Dyes in Protein and Ensyme Technology`, ed. Y. D.
Clonis, C. R. Lowe, T. Atkinson, aand C. J. Bruton, Macmillan, London, 1987, p.76.
61
G. W. Jack and R. Blazek, J. Chem. Tech. Biotechnol., 1987, 39, 1.
62
G. Q. Jack, R. Blazek, K. james, J. E. Boyd, and L. R. Micklem. J. Chem. Biothecnol., 1987, 39, 45.
Se pueden usar iones metálicos inmovilizados, como Zn2+ o Ni2+, para separar
proteínas. Esta separación depende de la interacción entre el ion metálico y los
residuos de histidina de la superficie proteica. El ion se inmoviliza quelandolo a un
grupo iminodiacetato que, a su vez, está unido a una matriz adecuada, normalmente
agarosa. Las proteínas unidas se pueden eluir usando un ligando competitivo, como
por ejemplo el imidazol. 65

Los criterios para elegir una matriz de cromatografía de afinidad son similares a
aquellos que se usan para cromatografía de intercambio iónico. Como resultado de
ello, las más usadas matrices macroporosas, como Sefarosa o Trisacryl. La matriz ha
de ser activada químicamente para unir covalentemente al ligando. Existen muchos
métodos para hacerlo, 66 pero el más habitual es el de bromuro de cianógeno.
También se pueden adquirir matrices activadas de los proveedores de productos de
cromatografía si no se desea hacerlo por uno mismo. Los colorantes tienen la
desventaja de que pueden ser acoplados directamente a la agarosa sin previa
activación. 56, 67
Los métodos para eluir una proteína ligada pueden ser específicos, mediante el uso de
un substrato o cofactor, o no específicos, por ejemplo modificando el pH o la
concentración salina. La elución no-especifica se utiliza habitualmente cuando
adsorbentes muy selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos
selectivos se unen a un solo componente; con adsorbentes menos selectivos, la
elución especifica proporciona mayor grado de purificación. Para la elución se puede
emplear, un substrato o ligando libre, cambios en el pH o la fuerza iónica, la adición de
agentes desnaturalizantes o caotropicos (por ej., KSCN, urea, hipoclorito de
guanidino), o cambios en la polaridad de los solventes, por adición de un modificador
orgánico, como es el etilenglicol.

Se prefiere el método mas suave, que, por lo general, se encuentra de forma empírica,
siendo importante en muchos casos las consideraciones económicas. Aunque los
procesos de purificación por afinidad pueden realizarse directamente o en columnas,
se lleva a cabo generalmente en estas ultimas.

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Este tipo de cromatografía se desarrolla al comprobarse que las proteínas se retienen,

de forma inesperada, sobre geles de afinidad con cadenas espaciadoras
hidrocarbonadas. Empleando este concepto, se desarrollaron familias completas de
absorbentes empleando una serie de cadenas homologas entre C2 y C1068, aunque en
la practica la mayoría de las proteínas pueden purificarse con agarosa acoplada con
grupos fenilo y optilo.

Las interacciones hidrofobicas son más fuertes a fuerza iónica alta, con lo que, a
menudo, la absorción puede ser llevada a cabo tras la precipitación salina o la
cromatografía de intercambio iónico, sin necesidad de modificar la concentración
salina de la muestra. Las proteínas ligadas se puede eluir alterando el pH del
solvente, la fuerza iónica o mediante el empleo de un agente caotropico o un
modificador orgánico tal como el etilenglicol.
65
E. Sulkowski, Trends Biotechnol., 1985, 3, 1.
66
M. Wilchek, T. Miron,and J. Kohn, Methods Enzymol., 1984, 104, 3.
67
C. R. Lowe and J. C. Pearson, Methods Enzymol., 1984, 104, 97.
68
S. Shaltiel, Methods Enzymol., 1984, 104, 69.
64
E. A. Hill and M. d. Hirstenstein, in `Advances in Biotechnological Processes`ed. A. Mizrahi and A. van
Wezwl, Ala R. Liss, New York, 1983, p.31.ç64 Y. D. Clonis, Biol Technology, 1987, 5, 1290.
Los iones utilizados se pueden agrupar en series dependiendo de si promueven
interacciones hidrofobicas (efecto de eliminación de sales) o si se rompe la estructura
del agua (efecto caotropico) para debilitar la fuerza de interacción hidrofobica.

Se ha utilizado la cromatografía sobre columnas de fenil – sefarosa para purificar una

arilacilamidasa de pseudomonas fluorescens. La enzima se éluyo de una columna de
intercambio iónico en tampón fosfato 0,3 M, pH 7,6 a partir de 2 Kg de bacteria, y se
purifico mediante una columna de 500 ml de fenil – sefarosa en el mismo tampón y el
empleo de un gradiente decreciente de 0,1M a o,01 M tris – HCL, pH 7,6 2.

Cromatografía líquida de gran resolución

Uno de los mayores avances en cromatografía ha sido el desarrollo de matrices de

relativamente bajo tamaño de partícula con gran capacidad de resolución y que sean
capaces de trabajar a altas presiones. Se desarrollaron originalmente para separa
pequeñas moléculas orgánicas solubles en solventes no acuosos, pero la técnica se
perfecciono para poder separa proteínas y enzimas en solventes acuosos, pudiendo
utilizar así todos los métodos cromatografícos habituales. 69,70 la mayoría de las
aplicaciones reseñadas se usan solo a escala de laboratorio.

La eficacia de las matrices de HPLC se deriva del pequeño tamaño de sus partículas
(3 a 50µm), necesitándose presiones elevadas para generar velocidades de flujo
adecuadas. Por ello, se necesitan partículas muy rígidas y, en este sentido, se han
realizado dos aproximaciones para resolver este problema. Las matrices de sílice son
los suficientemente rígidos y pueden ser activadas de forma adecuada como
monocloro-o monoalcoxi-silanos para producir una superficie hidrofilica que puede
posteriormente modificarse.71 sin embargo, presentan la desventaja de ser inestables a
pH superior a 8; este problema se ha solucionado mediante el recubrimiento de un
polímero para reducir las disponibilidad de las partículas inorgánicas al solvente, o
más específicamente por estabilización de la superficie con sirconio. Las segunda
aproximación ha sido el desarrollo de soportes poliméricos rígidos con enlaces entre
cruzados, como el monobeads (pharmacia) o el TSK-PW (tosoHaas).

Tras estas verdaderas matrices de gran resolución se ha desarrollado derivados de

gran disolución de materiales del empaquetado convencionales, que presenta un
menor número de tamaño de partícula, para lo que se denomina (cromatografía liquido
de resolución intermedia) [MPLC].

69.
C. Horvath, `High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 3`, Academic
Press, New York, 1983.
70
J. F. Kennedy, Z. S. Rivera, and C. A. White, J. Biotechnol., 1989, 9, 83.
71
R. E. Majors, in ` High Performance Liquid Chromatography: Advances and perspectives, Vol. 1`, ed. C.
Horvath, Academic Press, New York, 1981, p. 2.
Otra aproximación del problema de las velocidades de flujo y la presión en
separaciones de alta resolución ha sido la cromatografía de perfusión.72

Existen pocos ejemplos en la literatura sobre las aplicaciones de HPLC debido

principalmente a que son propiedad de productos específicos aunque algunos
ejemplos de uso de técnicas convencionales de HPLC y de técnicas de afinidad de
alta resolución de han descrito. 73,74 por ejemplo, la lactato deshidrogenasa del musculo
del conejo se ha purificado empleando Proción azul MX-R inmovilizado sobre sílice.

ULTRAFILTRACION

La ultrafiltración ha sido una técnica de uso corriente en el laboratorio para la

concentración de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. También es una
alternativa para la diálisis y filtración a través de geles para la eliminación de sales o
los cambios de tampones.

DISEÑO DE PROTEINAS PARA SU PURIFICACION

Los factores presentes en pasos previos a la purificación de las enzimas, tienen un

gran impacto en su desarrollo y los métodos de purificación, así, la tecnología de DNA
recombinante ha tenido un gran impacto en la purificación.

La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una

proteína heterologa se exprese en un organismo madre hasta un total de un 10 al 40%
de la proteína soluble total de la célula en comparación con la expresión de muchas
proteínas naturales de la células, que constituyen un 0,01 a un 4% de la proteína total
celular.

72
N. B. Afeyan, S. P. Fulton, N. F. Gordon, I. Mazsaroff, L. Varady, and F. E. Regnier, Biol. Technology,
1990,8, 203.
73
S. J. Brewer and B. R. Larsen in `Separations for Biotechnology`, ed. M. S. Virrall and M. J. Hudson,,
Ellis Horwood, Chichester, 1987, p. 113.
74
S. Ohlson, L. Hansson, M. Glad, K. Mosbach, and P-O. Larsson, Trends Biotechhnol., 1989, 7, 179.
De esta forma, la purificación final se simplifica. Estos altos niveles de expresión
pueden provocar que la proteína se produzca como granulos denso e insolubles
denominados cuerpos de inclusión. Se ha observado con muchas proteínas
recombinantes, como por ejemplo, laurogastrona, la interleuquina 2, la proquimosina y
los interferones. Tras la rotura celular, se pueden sedimentar los gránulos a pocas
revoluciones produciendo un material insoluble que contiene hasta un 50% de la
proteína buscada. La solubilización y re naturalización de este material, especialmente
cuando tiene enlaces disulfuro, Es difícil y requiere condiciones muy controladas. La
solubilizacion precisa del uso de pH alto, urea o cloruro de guanidino; la eliminación de
estos reactivos hace que la proteína precipite en solución acuosa.

La célula productora también es importante, ya que si bien la hormona recombinante

de crecimiento humana se produce en algunas estirpes de E.Coli bajo la forma de
cuerpos de inclusión, en la estirpe RV308, en cambio, es soluble e, incluso forma
puentes disulfuro correctos. La estructura precisa de una proteína recombinante puede
afectar también a la formación de los cuerpos de inclusión. Un estudio a gran escala
utilizando el interferon gama humano recombinante demostró que unos pocos cambios
en los aminoácidos de la proteína podían convertirla de soluble a insoluble en la
misma cepa de E. coli. 80

Otro ejemplo de la ayuda que presta el diseño genético en la purificación de proteínas

es el concepto de las colas de afinidad. El gen de la proteína de interés se fusiona en
fase con una secuencia de DNA que codifica alguna secuencia aminoacidica (cola de
afinidad) que simplifica la purificación de dicha proteína, modificando sus propiedades
de una manera conocida de antemano.81,82

Uno de los primero ejemplos fue la fusión de algunos residuos de arginina al extremo
carboxi-terminal de la urogastrona. Esto hace convertirse a la proteína en
extremadamente básica y unirse frecuentemente a una matriz de intercambio ionico
cationico. Al unirse a este tipo de matrices solo un 10% de las proteínas totales
celulares, se puede obtener una gran purificación al eluir dicha columna. La columna
de poliargininas puede ser eliminada tras la purificación mediante una carboxi-
peptidasa A inmovilizada; al ser introducida la proteína tratada otra ves en la misma
columna la posición en la que eluye cambia, pero no la de los contaminantes que se
hubiese podido arrastrar. Se han descrito otras funciones que permiten purificar
posteriormente por afinidad

80
R. Wetzel, L. J. Perrry, and C. Veilleux, Biol Technology, 1991, 9, 731.
Cola Matriz o ligando Condiciones de Condiciones de
 unión elución
poliargininaa S-Seforosa pH 4-8 Gradinete de NaCl
polifenialaninab Fenil sefarosa (NH4) SO41m, pH7
Etilenglicol
polihistidinac Nitroltriacetato pH8 +-HCl de
Gradiente de pH
sefarosa (Ni2+) guanidino
bajo +-HCl de
guanidino
Dipeptido His-Trp4 Iminodiacetato pH8 Gradiente de pH
2+
sefarosa (Ni ) bajo
Péptido Anticupero anti Flag NaCl 0.15 M, CaCl EDTA, pH 7.4
antigenicocFlagTM pH7.8 2 1Mm
b-galactosidasaf Sefarosa TPEG 1.6 M NaCl, pH7 Borato 0.1 M
Colramfenicol p- NaCl 0.3M pH 7.8 Cloramfenicol 5mM
acetiltransferasag amonicloranfenicol
sefarosa
Proteína Ah Sefarosa con IgG pH 7.6 Acido acético 0.5 M
Gltation S- Sefarosa con pH7.3 Agente reductor de
j.k
trasnferasa glutation tioles

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Los problemas de purificación de fusiones por afinidad son, en 1 lugar los derivados de
las condiciones necesarias para la posterior elución y, en 2 lugar, los inherentes al
eliminación de la cola de afinidad una ves que sea purificada la proteína. Un ejemplo
son las funciones de la proteína A, que aunque se han aplicado con éxito al factor de
crecimiento similar a la insulina (IGF-1)84, a la fosfatasa alcalina proteína muy estable,
y, con menor éxito a la galactosidasa, 85 adolecen de 2 ventas. La 1 es que si se
utilizan las condiciones extremas de pH o grandes concentraciones de sustancias
caotropicas que se requieren para eluir a la proteína A de la IgG inmovilizada ne la
columna, las proteínas de fusión pueden desnaturalizarse.

En 2 lugar, existen la dificultad de eliminar proteolítica o químicamente los residuos de

la proteína A de las proteínas de fusión una vez que se han purificado sin alterar la
estructura del producto deseado.

El problema podría ser resuelto introduciendo genéticamente puntos de corte

específicos para determinadas proteasas o bien enlaces lábiles mediante acidos en
aquellas zonas de unión entre el residuo que permite el aislamiento y la proteína
recombinante de interés.
81
H. M. Sassenfeld, Trends Biotechnol. 1990, 8, 88.
82
R. F. Sherwood, Trends Biotechnol., 1991, 9, 1.
84
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1985, 13, 1151.
85
B. Nilsson, L. Abrahmsen, and M. Uhelem, EMBO J., 1985, 4, 1075.

CONCLUSION
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del
análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio
permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis
nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas (de los cual se trato
este trabajo) al final del procedimiento.

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las

moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en
el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su
tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las
moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas
deberán ser teñidas con diferentes colorantes.

Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples

bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.

En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados

requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento
presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar.
En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN
como proteínas, mientras que en la electroforesis
horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen
otros métodos electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así
tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para
separar fragmentos
muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para
un análisis más sofisticado de las proteínas etc.

Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas

tales como PCR, e hibridación, brinda una gran ayuda en el campo de la
salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN
de patógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar
una nueva proteína, entre otros.
 REFERENCIAS:

CAPITULO 17
Etapas posteriores de procesamiento: extracción y purificación de proteínas
M.D. SCAWEN, T. ATKINSON, P.M. HAMMOND, Y R.F. SHERWOOD

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