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Desde principios de la década de 1950, los virólogos
observaron la importancia potencial de los estudios
evolutivos, en particular, el análisis de la variación viral
(diferentes características fenotípicas, como tamaño de
placa, termosensibilidad o rango de hospedadores) y su
asociación con virulencia y patogenia. Pero la limitada
calidad y cantidad de información útil que se tenía por
entonces restringía el estudio de la evolución, ya que en
virología, además de la ausencia de fósiles virales, las
características fenotípicas antes mencionadas tienen
una utilidad limitada.
Hoy, en cambio, es un tiempo promisorio para el estudio
de la evolución viral, debido al incremento significativo
de la información disponible como resultado de las
continuas mejoras en las técnicas moleculares
(fundamentalmente el secuenciamiento de nucleótidos)
y en el desarrollo de instrumentos para el análisis
filogenético.
@l estudio de los virus representa un importante apartado dentro de la patología
infecciosa. @ntre los virus más representativos destacan el virus causante de la gripe, el
virus del SIDA, el de la hepatitis, etc.
Las características técnicas de un laboratorio de virología son las siguientes:
Deberá tener un primer nivel o nivel básico en el que sólo se realizan técnicas
serológicas. Un segundo nivel o intermedio en el que además se aíslan y cultivan los
virus más frecuentes. Un tercer nivel en el que se dispone de alta tecnología para
realizar todo tipo de estudios de virus.
Todo laboratorio de virología, dado el potencial patógeno con el que se trabaja, debe
seguir estrictamente las normas de seguridad y prevención; estas normas esencialmente
son las siguientes:
a) Todas las muestras deben manipularse como si fuese material de elevado riesgo
patológico.
b) @l personal debe seguir vacunaciones y controles médicos periódicos.
c) Acceso restringido a personal capacitado, y señalización clara de "zona peligrosa".
d) Las normas para el laboratorio de bacteriología se deberán extremar en éstos.
@jemplo, no comer, no beber, usar guantes, etc.
e) Usar guantes, mascarillas, batas, lavado exhaustivo de manos.
f) Deben poseer sistemas de esterilización autoclave, cabinas de incineración, etc., para
esterilizar cualquier producto antes de ser desechado. @quipo apropiado para
conservación y almacenamiento de muestras.
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Información genética
ADN
Nucleoide ó Infectividad
ARN
Protección del nucleoide
Cápside Proteínas
Unión a receptores celulares
Determinantes antigénicos
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a) @n la siguiente discusión se presentan las bases biológicas y genéticas de estos
fenómenos, con particular atención a tres temas.
1. Los distintos virus tienen estructura genética muy diferente y esta diversidad se refleja
en sus procedimientos de replicación.
2. Por su tamaño pequeño, los virus han logrado un grado muy alto de economía genética.
3. Los virus dependen en buena medida de las funciones de la célula huésped y por lo
tanto son difíciles de combatir en el campo médico. Sin embargo, presentan pasos
singulares en sus ciclos de replicación que constituyen blancos potenciales para la
terapia antiviral.
La ventaja de la construcción de la partícula viral a partir de subunidades proteínica
idénticas es doble: 1) reduce la necesidad de información genética y 2) favorece el
autoensamblaje; es decir, no se requieren enzimas ni energía. De hecho, se han
acoplado partículas virales funcionales en un tubo de ensayo mediante la combinación de
ácido nucleico purificado con proteínas también purificadas, en ausencia de células,
fuente energética y enzimas.
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b) Las proteínas virales desempeñan varias funciones importantes. Las de la capsides
protegen el material genético y median la adherencia del virus a receptores específicos
en la superficie de la célula huésped. @sta interacción de las proteínas virales con el
receptor celular es el principal determinante de la especie y de la especificidad de órgano.
Algunas de las proteínas interiores se asocian con el ácido nucleico, por ejemplo, ácido
nucleico polimerasas, que son esenciales para la replicación. Las proteínas similares a
las histonas tienen una función reguladora o pueden neutralizar la carga negativa del
ácido nucleico durante el ensamblaje de la partícula viral y también se localizan
internamente.
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'. La mayoría se inactivan a 56°C durante 30 min. a 100°C
en pocos segundos.
4 Dada su estabilidad frente a bajas temperaturas, muchos
virus pueden almacenarse a ²40° C o preferiblemente a ²70°
C; algunos son parcialmente inactivados en el proceso de
congelación y descongelación.
)) Variable; algunos sobreviven a ésta, mientras que
otros quedan inmediatamente inactivados.
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' Los inactiva.
'+ Los virus con envoltura lipídica son
inactivados, mientras que el resto son resistentes. @ste
procedimiento se utiliza como criterio de clasificación de los
virus.
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)" Los virus son inactivados por
formaldehido, cloro, yodo y peróxido de hidrógeno.
"' La mayoría son relativamente resistentes.
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* Microscopio óptico. Para observación del efecto
citopático de los virus sobre cultivos celulares,
Microscopio electrónico.
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Técnicas de inoculación en animales de laboratorio.
Técnicas de inoculación en embrión de pollo.
Técnicas de cultivo celular.
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* Reacción de fijación del complemento.
* Método RIA.
* Método @LISA.
* Hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación.
* Determinación de la inmunoglobulina M.
* Reacciones de neutralización.
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Salvo raras excepciones, el diagnóstico de laboratorio de
las infecciones virales es lento, de modo que por lo general
el paciente se encuentra ya en fase de convalecencia al
obtener el resultado. Pero, aunque el diagnóstico de
laboratorio se encuentra limitado en cada caso particular,
es de gran importancia en la investigación médica y
epidemiológica. @l virus de la viruela es una excepción, ya
que tiene un rápido diagnóstico, lo que facilita
notablemente el control de las epidemias.
@l diagnóstico de laboratorio se basa en tres técnicas
fundamentales:
* Aislamiento del virus en histocultivos.
* Serología, o demostración de anticuerpos frente al virus.
(niveles)
* Demostración directa del virus o de antígenos víricos a
partir de frotis de las lesiones. (intra/extracelulares).
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67 c8
Durante la primera mitad del siglo pasado
predominaba el misticismo en el desarrollo de
cultivos de células in vitro. @l éxito dependía de
condiciones experimentales muy precisas. Por
mucho tiempo sólo se lograba el crecimiento de
células de cortes de tejidos extirpados de
animales y mantenidos en coágulos formados
por extractos de esos tejidos y plasma o suero
del mismo animal. Las contaminaciones
bacterianas impedían una continuidad en el
crecimiento.
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Para mantener las mismas condiciones fisiológicas, de presión osmótica, pH, así
como las concentraciones adecuadas de iones inorgánicos esenciales, in vitro
como in vivo, se precisa una solución de sales equilibrada (Balanced Salt
solution, BSS) que es la base de todos los medios de cultivo químicamente
definidos. Algunos medios contienen glucosa que proporciona los hidratos de
carbono necesarios.
Los medios que se emplean en cultivo celular son los siguientes:
BSS de Hanks.
BSS de @arle, con mayor capacidad tampón que el anterior.
BSS suplementado con vitaminas, aminoácidos, y otros nutrientes para formar
medios sintéticos.
Los medios disponibles en el mercado más utilizados en virología son:
N° 199.
BM@: Medio Basal de @agle.
M@M: Mínimum @sential Médium.
Contiene las concentraciones óptimas de nutrientes esenciales, vitaminas,
aminoácidos, es el más utilizado. Se conserva a 4°C. Se sabe que la luz
fluorescente va en detrimento de los medios de cultivo, porque provoca la
formación de fotoproductos tóxicos derivados de la riboflavina y triptófano
presentes en el medio. Por lo que se recomienda que el medio líquido se
conserve en la oscuridad.
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@l cultivo celular es la técnica idónea y la más utilizada actualmente para el cultivo y aislamiento de
virus, pues presenta muchas ventajas sobre la inoculación en animales vivos y en embrión de pollo.
Los cultivos celulares son de tres tipos según las células que lo constituyen:
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Se obtienen células que proceden de un organismo vivo. @stas células se obtienen por fragmentación
del tejido y dispersión de las células de forma apropiada para obtener una monocapa en la que se
reproducirán los virus. Se pueden emplear células de riñón de mono o de riñón embrionario humano.
Las células así obtenidas tienen una pequeña capacidad de reproducción aunque solamente se
pueden emplear durante 2-3 semanas.
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Constituidas por subcultivos obtenidos a partir de cultivos celulares primarios. Se reproducen
rápidamente y no se pueden exceder de 50 subcultivos. @jemplo de estos son las células
fíbroblásticas embrionarias.
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Son obtenidas a partir de tumores humanos malignos o de células animales tales como riñón de
mono, riñón de hámster, etc. @jemplo de ellas son: líneas HeLa, Vero, K-13.
@n las células de riñón de mono rhessus pueden aislarse, a través de cultivos primarios, virus como
Adenovírus, @chovírus, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus de la Parainfluenza, virus de
las paperas, virus respiratorio sincitial.
@n células de pulmón humano, a través de líneas celulares diploides, se pueden aislar virus como;
Adenovirus, virus del Herpes simple, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus respiratorio
sincitial.
@n células de pulmón humano, a través de líneas celulares diploides, se pueden aislar como:
adenovirus, virus del Herpes simple, virus de la poliomelitis, virus Coxackie B, virus respiratorio
sincitial.
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Acciones tempranas (entrada o Amantadita, rimantadina
desnudamiento del virus)
Síntesis de ácido nucleico por DNA y RNA Aciclovir, ganciclovir, vidarabina,
polimerasas virales idoxuridina, trifluridina, foscarnet,
azidotimida, dideoxiinosina,.
Didesoxicitidina y ribavirina
Otras enzimas específicas de virus @n investigación
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Basándose en aspectos clínicos , podemos dividir de la siguiente manera :
8 @ @ @ .- Aquí las lesiones celulares y la multiplicación del
virus solo afectan el foco inicial, el virus puede afectar primero una célula y
luego pasar de una célula a otra.
%8 @ @ .- Pueden ocurrir muchas infecciones, de tipo tanto
citolítico como de estado estable, sin que aparezca síntomas. @stas infecciones
son importantes en medicina, pues confieren inmunidad sin enfermedad clínica,
se explican por la naturaleza del virus o el estado inmunológico del huésped
8 @ @ c @ .- Se pueden definir como un grupo de
entidades que "crecen provocar por virus para loe cuales los periodos de
incubación son muy largos y las expresiones clínicas de tipo patológico son de
progresión relativamente lenta. @l signo principal de estas infecciones es la
presencia de un agente viral oxenoma en un huésped que, en última instancia,
sufre lesiones celulares y tisulares por efecto del virus, así las respuestas
inmunológicas en el huésped que normalmente son eficaces para eliminar los
virus comentes no son estimuladas o resultan inoperantes, además, en algunos
casos puede producir verdadera lesión celular y tisular a consecuencia de la
propia respuesta inmune, tales infecciones por virus lentos se han observado
en el hombre y en los animales.
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Los virus forman una variedad especial de agentes infecciosos, que son
parásitos Ínter celulares obligados. @stos se diferencian de los demás tipos de
microorganismos por su:
* Organización,
* Composición y
* Mecanismo de duplicación.
La partícula viral completa se puede considerar como un fragmento básico de
subsánela genética, de DNA ó RNA, rodeada de una capa protectora de
proteínas que son agentes de transmisión de una célula huésped a otra.
@l espectro de enfermedades producidas va desde las infecciones virales
agudas, en las cuales la interacción de virus y respuesta inmune del huésped
origina aclaramiento del virus é inmunidad, o bien diseminación, infección y
muerte, hasta formas más crónicas de infección viral, en !as cuales tienen
lugar una reproducción viral prolongada, junto con respuesta inmune, causa de
lesión y origen de enfermedad.
Se lograron erradicar muchas infecciones virales empleando vacunas muy
eficaces que estimulan las respuestas inmunológicas especificas. @s probable
que se dispongan pronto, en terapéutica, de otros tipos de agentes que
estimulan el sistema inmunológico inespecífico, por ejemplo,
inmunipotenciadores.
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La multiplicación de los virus en cultivos de
células puede comprobarse por procedimientos
bioquímicos o serológicos que indican el
incremento de macromoléculas virales, como
enzimas o antígenos, o de partículas virales. Sin
embargo, para los cultivos que crecen adheridos
a un soporte, los métodos usados son más
sencillos y consisten en la evaluación de
alteraciones morfológicas de las células,
modificación de sus membranas (hemadsorción)
o por fenómenos de interferencia viral.
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Crecimiento en Sí Sí No No No
medio artificial
División binaria Sí Sí Sí Sí No
Contiene: Sí Sí Sí Sí No
DNA + RNA No No No No Sí
DNA o RNA
Reproducción No Sí No No Sí1
por AN aislado
Variación de Sí Sí Sí Sí No
tamaño
Sistema Sí Sí Sí Sí No
energético
Ribosomas Sí Sí Sí Sí No2
Contiene ac. Sí3 No Sí Sí No
Murámico
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La virología como toda ciencia biológica experimental se
ha visto beneficiada por la aplicación de las técnicas
moleculares que enseña la ingeniería genética. Así es
como en los últimos años se ha ido develando la
intricada relación del virus con la célula que parasita, en
especial, la exquisita regulación de los genes virales,
que deviene en la producción de nuevos virus. @ste
conocimiento ha permitido, por ejemplo, la síntesis de
moléculas antivirales que bloquean en forma específica
pasos de la replicación, sin afectar al huésped.
Dentro de este contexto, los virus no sólo han sido y son
responsables de muchas enfermedades, sino que fueron
las herramientas útiles que permitieron el desarrollo de
las técnicas moleculares, las que a su vez sirven para su
estudio.
Dentro del campo de la virología médica, dichas
técnicas se aplican en el diagnostico virológico en
estudios de patogenia, análisis epidemiológico, en la
producción de vacunas. A la vez han permitido rastrear,
en muchos casos, al agente responsable de infecciones
emergentes.
Los libros y los artículos que tratan sobre los virus se
han enriquecido en nuevas terminologías (muchas de
las cuales ni siquiera se han traducido), que reflejan el
uso generalizado de las técnicas moleculares.
@l estudiante de ciencias médicas debe realizar un
esfuerzo para adquirir los conocimientos básicos que le
permitan la cabal comprensión de algunas expresiones,
como hibridación molecular, sondas genéticas,
expresión de genes en organismos inferiores,
transcripción reversa, reacción en cadena de la
polimerasa y muchas otras.