ESTRUTURA DOS CROMOSSOMOS E CICLO CELULAR Coloracio Convencional - Cultivo de Linfécitos Humanos A técnica mais usada para estudo de caridtipo humano & o cultivo de linfécitos de sangue circulante periférico. Essa técnica tem a vantagem de oferecer grande numero de metéfases em apenes trés dias e de eliminar a necessidade de biépsias, como no cultivo de fibroblasto. No cultivo de linfécito emprega-se um agente mitogénico, a ftohemaglutinina, que estimula a atividade mitética. Para evitar contaminago do material, todo 0 processo, desde a obtengao até o tratamento com colchicina, deve ser felto sob a mais completa condigao de assepsia, Toda a manipulagdo com o meio de cultura, 0 soro bovino fetal e o sangue deve ser fetta em fluxo laminar. a) b) m) n) 9°) PROCEDIMENTO Com uma seringa previamente umedecida de heparina, colete 5 mi de sangue: Em cada tubo de cultura (tubo cnico) coloca-se 4 mi de meio de cultura (RPMI 1640 da Sigma), 2 ml de soto bovino fetal, 0,5mi de sangue total e 0,2 mi de fitohemaglutininas Os tubos sero colocados em estufa de CO2 @ 37°C por 72 horas; ‘Apés 71 horas de cultiva, adicionar 3 gotas de colchicina 0,0016% e deixar por 1 hora; Utilizar seringa de insulina para aplicar as gotas de colchicina (Qs tubos s80 devolvidos a estufa onde permanecem por mais uma hora, Retirados da estufa, os tubos s40 centrifugados por 6 minutos com 1800 rpm: O sobrenadante ¢ retirado, e jateia-se aproximadamente 8 mi de KCi, sendo efetuado desta forma 0 choque hipoténico; Inigiaimente, coloca-se 4 mi de KCI, homogeneizar, completar para 8 ml. (Os tubos sao colocados em banho-maria @ 37°C por 15 minutos; ‘Apés sair do banho-maria, os tubos devem ser novamente centrifugados, sempre pelo tempo e velocidade previamente desorites; . Retira-se 0 sobrenadante e goteja-se aos poucos a solugdo fixador (3:1 Metanol Acido acético) ate completar 8 mi. Deixa por 20 minutos a temiperatura ambiente; ‘pos este tempo, mais uma vez 0 material € centrifugado. O sobrenadente € retirado, (98 tubos so entéo Unidos de acordo com o pelet e mais fixacor € eorescentado até 8 mi, Caso nao seja feita lamina teste no mesmo dia, os tubos podem ser armazenados em geladeira Para a confecgao de laminas teste, seré realizada tantas centrifugagbes e trocas de fixador quanto 0 necessario para que o conteddo da cultura esteja transparente: Ressuspenca 0 sedimento em 0,5 2 ‘ml de fixador fresco e pingue duas gotas em lamina limpa, conservada na geladeira. Passe a lamina rapidamente na chama para evaporar o fixador ou deixe secar @ temperatura ambiente Identifique cada lamina Core o material com uma solugao de Giemsa a 5 %, durante 5 minutos, Lave em agua corrente. 1. Use a metafase mitética em anexo para fazer a montagem do cariograma 2. Qual a contribuigao da endlise convencional no estudo de cromiossomos humenos?