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Oculares
Tubo de microscopio
Brazo
Objetivos
Condensador
Tornillo de platina
Tornillos macro y
Fuente luminosa micrométrico
Pie o base
Estructura de un microscopio
Sistema óptico
Condensador
El condensador de un microscopio permite dirigir el haz de luz hacia el espécimen que se
desea observar. Existen dos tipos de condensador, el más común es el de Abbe, el cual no
corrige ninguna forma de aberración óptica. El segundo tipo es el condensador acromático
que corrige tanto la aberración cromática como la esférica. De estos dos tipos de condenador
existen variantes en cuanto al uso que se le va a dar, para campo obscuro, para contraste de
fases, fluorescencia, etc. Todos los condensadores tienen grabada su apertura numérica, la
cual debe de ser igual o ligeramente mayor a la apertura numérica de los objetivos, de no ser
así la resolución con el objetivo no será total. En la mayoría de los condensadores se puede
usar aceite entre la lente del condensador y la preparación, para usar la totalidad de la
apertura numérica.
Lente frontal
Lente auxiliar
Estructura de un microscopio Sistema óptico
Objetivos.
Los objetivos son las lentes más cercanas al espécimen que se desea observar y se encuentran
montados en el revolver. Los objetivos generalmente encontrados en microscopios de
enseñanza son los objetivos acromáticos, cuales están corregidos para aberración esférica y
aberración cromática en dos colores. Otro tipo de lente son los objetivos apocromáticos, los
cuales tienen corregida la aberración cromática para los tres colores (verde, rojo y azul) y una
corrección mayor en la aberración esférica. Los objetivos semiapocromáticos tienen una
corrección intermedia entre los dos tipos anteriores.
Los tres tipos de objetivo se elaboran con un sistema compensatorio de lentes que evitan la
curvatura del campo, dando como resultado una imagen plana y se les conoce con el nombre
de plano objetivos.
Estructura de un microscopio Sistema óptico
Aumentos
Los objetivos de buena calidad tienen grabado en la pared del barril varios datos
que nos permiten conocer las características de cada una de las lentes.
Estructura de un microscopio Sistema óptico
Oculares.
El ocular es el juego de lentes a través de los cuales observamos en el microscopio,
cuya función es la de ser un sistema de lentes de proyección. Existen tres tipos de oculares, el
más común es el Huygenian, que se usa generalmente con objetivos acromáticos, y que
permite observar con el uso de anteojos. El segundo tipo es el ocular de compensación que se
usa con objetivos apocromáticos y de campo plano, logrando imágenes de calidad superior. El
tercer tipo es el ocular de fotografía que permite proyectar imágenes planas a una película de
una cámara, este tipo se considera el más fino de los oculares.
Corrector de dioptrías
Los oculares tienen en grabado en el barril información sobre las características de esa lente.
Estructura de un microscopio Sistema óptico
Diámetro del campo visual.
Este valor nos permite apreciar el tamaño de los organismos observados y se calcula
dividiendo la cifra del campo del ocular entre el aumento del objetivo, el resultado obtenido
está expresado en micrómetros. Conociendo el diámetro, es posible calcular el tamaño
aproximado de un espécimen.
50 µm
200 µm
100 µm
Aumento total.
Para los microscopios en los cuales el factor del tubo del microscopio es igual a 1X,
el aumento total se obtiene multiplicando el valor de aumento del ocular por el del objetivo.
Si el tubo del microscopio tiene un factor diferente a 1x, como puede ser 0.8x,
1.25X, 1.6X ó 2X, el resultado anterior se multiplica por el factor correspondiente
obteniéndose el aumento total. Para los factores anteriores los aumentos serían:
800x, 1250x, 1600x y 2000x respectivamente.
Estructura de un microscopio
Sistema mecánico
El sistema mecánico de un microscopio está formado por el pie o base, el brazo, la platina, el
tubo, el tornillo del condensador y los tornillos macro y micrométricos. Los componentes
marcados son partes del sistema que tienen influencia en el enfoque, la resolución, el
aumento total y la localización del espécimen.
El tubo del microscopio que permite el paso de luz del objetivo hacia el ocular tiene grabado un
número que se le conoce con el nombre de factor del tubo. La mayoría de los microscopios este
valor es de 1X, pero existen microscopios en que este valor varía (0.8X, 1.25X, 1.6X ó 2X,
cuando este es el caso el aumento total es diferente para cada combinación de ocular-objetivo
usada.
El tornillo del condensador, permite acercar o alejar la lente frontal, con lo cual podemos
variar la iluminación del objeto observado, pero también alteraremos el contraste en la
imagen.
Sobre la platina se colocan las preparaciones y con sus tornillos respectivos se busca la
imagen. Anotando los valores de referencia de las regletas horizontal y vertical, es posible
mover la preparación y localizar fácilmente la imagen ajustando los valores obtenidos
previamente.
Principios de microscopia
La calidad de una lente se establece básicamente con el valor denominado apertura numérica
(AN), que depende del diámetro de la lente, la distancia de trabajo y el índice de refracción. En
lentes de calidad este valor siempre esta grabado en un lado del barril del objetivo. Para
determinar este valor se hace uso de la siguiente fórmula:
AN = n sen θ
Con la apertura numérica se puede conocer el aumento efectivo de un objetivo, es decir el número
de veces que se puede aumentar un objeto. Esto se logra multiplicando la apertura numérica por
mil.
d = 0.5 λ/ AN ó d= λ/2AN
Aumento del
4X 10X 40X 100X
objetivo
Apertura
0.1 0.25 0.65 1.30
numérica
Poder de
Resolución 3.05 1.22 0.47 0.24
(micrometros)
Principios de microscopia Aberraciones
Las aberraciones son imperfecciones de las lentes que modifican substancialmente el poder de
resolución. Estas aberraciones pueden ser de forma cromática, esférica o por curvatura de
campo.
La aberración por curvatura de campo no enfoca en una superficie plana sino esférica, esto da
como resultado que cuando se enfoca el centro se desenfoca la orilla y viceversa.
Principios de microscopia Contraste
Se entiende por contraste al número de sombras que se pueden observar en una imagen. Así por
ejemplo imágenes de alto contraste sólo tienen dos colores blanco y negro, sin matices de gris. A
mayor número de sombras habrá menor contraste, pero esto permite mayor información al poner
de manifiesto otras estructuras, esta última característica se le denomina intervalo dinámico. En
las imágenes a color se considera que a mayor número de colores y con menor número de
matices tendremos un mayor contraste. En los microscopios de campo claro el contraste y la
resolución inversamente proporcionales, por lo tanto a mayor contraste menor resolución, por lo
tanto se requiere aplicar un colorante o dos, para obtener un mejor contraste. Asimismo, a mayor
iluminación menor contraste y a menor iluminación mayor contraste. Por lo tanto, el enfoque
correcto requiere la correcta combinación de contraste, resolución e iluminación.
A B C
Microfotografías de la observación de una amiba con tres condiciones de contraste.
A, bajo contraste; B, contraste normal; C, alto contraste.
Principios de microscopia Profundidad de campo
Se entiende por profundidad de campo el área visible entre el frente y el fondo de un espécimen
y cuyos componentes tienen un enfoque aceptable. Esta profundidad de foco depende de la
apertura numérica del objetivo; a menor apertura numérica la profundidad de foco es mayor y a
mayor apertura numérica menor profundidad de campo.
Para calcular la profundidad de campo de cada uno de los objetivos de un microscopio se utiliza
la siguiente fórmula:
DPC = λ / NA2
DPC = distancia de la profundidad de campo expresada en micrómetros
λ = longitud de onda de la luz utilizada expresada en micrómetros (luz verde 0.507 µm)
NA = apertura numérica
Microscopios compuestos Microscopio de campo claro
b Subir el diafragma hasta hacer nítido el borde del campo. Se observara en el campo visual
un halo rojo o azul. Mover el condensador al punto donde se combinen
ambos colores o el más cercano al azul.
b Después de este ajuste puede cambiar de objetivo, pero sin mover el condensador.
Staphylococcus aureus
Streptococcus sp.
IMAGENES
b d
En el microscopio electrónico de barrido, la muestra se coloca en una cámara al alto vacío con
controles de posición en las tres dimensiones.
El haz de electrones se produce en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento
de un filamento metálico con un voltaje de 10 a 30 KV. El rayo de electrones primarios sigue un
recorrido a través de la columna de vacío del microscopio, siendo modificado por un conjunto de
bobinas deflectoras (campos magnéticos). Primero atraviesa las lentes condensadoras o
electromagnéticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el
diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que
controlan la cantidad de electrones en el interior. Cuando los electrones primarios golpean la
muestra, son emitidos electrones secundarios que son atraídos por un colector, donde se aceleran
y se dirigen al escintilador. Una vez ahí la energía cinética es convertida en señales luminosas de
mayor o de menor luminosidad. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en señal
eléctrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen es formada línea por línea y
punto por punto, y ésta puede ser vista en tercera dimensión.
Microscopios electrónicos Microscopio de barrido
Las imágenes que se obtienen por microscopía electrónica son inicialmente en blanco y negro,
sin embargo pueden ser digitalizadas y modificadas para convertirlas en colores falsos.
Estomas de Zelkova
Pseudomonas
Virus de la vid
Eritrocito
Micrografía de Saccharomyces cerevisiae observada con microscopía de fuerza atómica. Nótese la
Cicatriz que deja la gena al separarse.
Micrografía de los detalles de la superficie de Escherichia coli. La superficie en apariencia rugosa
corresponde al arreglo de los lipopolisacáridos de la membrana externa.
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El primer microscopio
Jorge
Ortigoza