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Imunologia
APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS 2006
SUMÁRIO
PARTE I
Diluições......................................................................................................................... 6
Cromatografia em Coluna................................................................................................ 8
Eletroforese de proteínas................................................................................................. 12
Reação de Imunohemólise............................................................................................... 17
Reação de Aglutinação.................................................................................................... 22
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PARTE II
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Resistência Inespecífica................................................................................................ 37
Células do Sistema Imune............................................................................................ 38
Formação de Células T e B e Órgãos Linfóides........................................................... 39
Antígeno....................................................................................................................... 40
Imunoglobulinas (I)...................................................................................................... 41
Imunoglobulinas (II).................................................................................................... 42
Sistema Complemento................................................................................................. 43
Fagocitose.................................................................................................................... 44
Complexo Principal de Histocompatibilidade (CHP/MHC)......................................... 45
Células Apresentadoras e de Antígeno e Mecanismo de Apresentação........................ 46
Linfócitos T................................................................................................................... 47
Linfócitos B e Resposta Primária e Secundária............................................................. 48
Genética de Imunoglobulinas........................................................................................ 49
Interação do Sistema Imune.......................................................................................... 50
Tolerância Imunológica................................................................................................. 51
Reações de Hipersensibilidade..................................................................................... 52
Transplantes.................................................................................................................. 54
Eletroforese................................................................................................................... 55
PARTE III
ESTUDOS DIRIGIDOS E EXERCÍCIOS
Radioimunoensaio........................................................................................................... 57
ELISA............................................................................................................................. 58
Western blotting.............................................................................................................. 59
Imunohistoquímica.......................................................................................................... 60
Exercício sobre Resposta Imune às infecções.................................................................. 61
Citometria de Fluxo......................................................................................................... 62
Referências Bibliográficas............................................................................................... 65
Anexo Portaria 23 para normatização do diagnóstico sorológico da Brucelose............... 66
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PARTE I
TÉCNICAS
UTILIZADAS NAS
AULAS PRÁTICAS
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OBTENÇÃO DE SORO
O soro é a fração líquida do sangue, sem o fibrinogênio. Para obtê-lo colhemos uma
amostra de 5 a 10 ml de sangue por punção intravenosa. Este sangue deve ser passado
instantaneamente para um frasco, tendo-se para isto, o cuidado de retirar a agulha da
seringa. O processo de coagulação do sangue começará a se estabelecer, então, de 30
minutos à 1 hora após a punção, coleta-se a fração líquida que se separou do coágulo . A
seguir essa fração líquida é submetida à centrifugação de 1500 RPM durante 5 minutos para
separar o soro do resto das hemácias. As hemácias se sedimentarão pela centrifugação e o
sobrenadante se constituirá em uma amostra de soro isenta de hemólise e pronta para ser
utilizada nas reações.
OBSERVAÇÕES IMPORTANTES
CONSERVAÇÃO DO SORO
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DILUIÇÕES
A diluição é o ato de tornar mais fraca uma dada solução. Isto é conseguido
geralmente adicionando-se a uma solução que se pretende diluir um diluente tal como água,
ou cloreto de sódio a 0,85%, que não contenha nenhuma das substâncias diluídas, na
quantidade requerida para conseguir uma diluição determinada. Usualmente se expressam
as diluições como uma unidade da solução original sobre o total de unidades da solução
final. Portanto, uma solução diluição 1/10 significa que uma unidade da solução
concentrada foi diluída para um volume total de 10 unidades, ou seja, uma unidade em um
total de 10 unidades. As diluições não devem ser interpretadas como significando uma
unidade mais 10 unidades. As diluições podem ser representadas como 1:10, 1:50, etc, ou
1/10, 1/50 etc.
Quando colocamos, por exemplo, 0,5 ml de NaCl a 0,85% em um tubo e
adicionamos a esta solução 0,5ml de soro, ficamos com uma diluição do soro a 1:2, pois há
0,5 ml de soro em um volume total de 1,0 ml de solução, portanto uma diluição de 0,5:1,0
ou 1:2.
Em imunologia clínica o título indica a concentração de anticorpo no soro do
paciente. O título de anticorpo de um soro é a diluição mais alta de soro que reage com o
antígeno. Por exemplo, se o último tubo que demonstra reação contém um volume de 1 ml
e o soro neste tubo é uma parte em um total de 640 partes, o título é 640 unidade/ml de
soro.
Diluição em múltiplos de 10
Diluição a 1/10
1 ml + 9 ml ou 0,1 ml + 0,9 ml
Diluição a 1/ 50
1 ml + 49 ml ou 0,1 ml + 4,9 ml
1 ml da diluição 1/10 + 4 ml do diluente
Diluição 1/100
1 ml + 99 ml ou 0,1 ml + 9,9 ml
1 ml de 1/10 + 9 ml
Diluição 1/500
1 ml 1/100 + 4 ml
Diluição 1 /5000
1 ml 1/1000 + 4 ml
Diluição 1/10000
1 ml 1/1000 + 9 ml
DILUIÇÕES VARIADAS
Diluição a 1/5 = 1 ml + 4ml
Diluição a 1/15 = 1 ml + 14 ml ou 0,1 ml + 1,4 ml
Diluição a 1/20 = 1 ml + 19ml ou 0,1 ml + 1,9 ml
Diluição a 1/25 = 1 ml + 24ml ou 0,1 ml + 2,4 ml
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DILUIÇÕES SUCESSIVAS
Exercício de Fixação:
1) Esquematize uma diluição 1/50 de uma solução previamente diluída a 1/10;
2) Esquematize uma diluição na razão 2 de um soro, utilizando inicialmente apenas o
volume de 0,5ml dessa amostra e diluindo até o 8º tubo;
3)Utilizando um volume de soro de 0,4ml, esquematize uma diluição na razão 3 até o 5º
tubo;
4)Esquematize uma diluição 1/64 de uma solução previamente diluída a 1/8;
5)Esquematize uma diluição 1/625, partindo de uma diluição 1/5;
6)Vamos imaginar que após a interação entre o antígeno e ao anticorpo, quando esses
estavam presentes em concentração suficiente, tenha ocorrido a formação de um
precipitado no fundo do tubo (como descrito abaixo na legenda). Com base no esquema
abaixo, determine o título dessa reação:
Não ocorreu
Ocorreu interação interação
Ag-AC
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Técnicas cromatográficas são atualmente métodos amplamente empregados para o
fracionamento de proteínas e isolamento de imunoglobulinas. Nestas técnicas, uma amostra
é depositada no ápice de um cilindro ou coluna de vidro, cheia de um gel sintético, e flui
através do gel. As características físicas das moléculas de proteínas resultam em retenção
destas na matriz do gel em graus diferentes, e a subsequente eluição, sob condições
apropriadas, permite a separação das proteínas.
A B C
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------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Molaridade de NaCl PH Proteínas eluidas
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
0,025 7,8 IgG
0,045 7,0 transferrina, fibrinogênio
0,050 7,0 α 2 globulina, albumina, IgA
0,080 6,5 albumina, α 2 globulina, β lipoproteína
0,100 6,5 α2 globulina, β globulina, haptoglobina
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
OH
- + +
SO3 Na H3N COOH AMINOÁCIDO B ELUÍDO
pH 4,5
9
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A B
10
11
11
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ELETROFORESE DE PROTEÍNAS
Princípio:
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APLICAÇÕES NA IMUNOLOGIA
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TÉCNICA:
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM ACETATO DE CELULOSE
Material necessário
• Fitas de acetato de celulose (CellogelR)
• Tampão de corrida pH 8,6 forca iônica 0,036 (Veronal sódico 0,04M)
• Corante Ponceau`s
• Solução descorante (Metanol a 50%)
• Solução de eluição (ácido acético a 80%)
• Fonte de continua para 200 volts
• Cuba de eletroforese
• Espectrofotometro
Pipetas, papel de filtro, microaplicador, tubos de ensaio e etc..
Método
1. Fazer a dosagem de proteínas totais da amostra de soro.
2. Colocar as fitas de cellogel imersas em tampão de corrida por pelo menos 10 minutos.
3. Preencher cada um dos compartimentos da cuba de eletroforese com tampão de corrida.
4. Retirar as fitas do tampão e secá-las com papel de filtro.
5. Colocá-las esticadas sobre o suporte da cuba, com a face absorvente voltada para cima
(Obs. Só uma superfície da fita é penetrável, essa é a face opaca, visível depois de seca .
As tiras tem um angulo picotado, o qual deverá estar situado na posição inferior a direita
do operador).
6. Observar para que ambas as extremidades da fita estejam em contato com a solução
tampão e o picote da fita na canaleta positiva.
7. Lavar o microaplicador com água destilada e colocá-lo em contato com a amostra de
soro. Fazer, então, uma leve aplicação do soro a cerca de 2,0 cm do polo negativo.
8. Tampa a cuba e ligar, ajustando para 200 Volts; deixar correndo a amostra por 35
minutos.
9. Terminada a corrida, desligar a cuba, retirar a fita e colocá-la em banho corante por 10
minutos.
10.Retirar as fitas do banho corante e transferir para um recipiente com a solução
descorante, agitar para propiciar a descoloração da fita e transferir para outro banho
descorante. Repetir o processo até as partes sem proteína na fita ficarem brancas.
11.Para a determinação quantitativa das frações protéicas, cortar as frações coradas e
introduzí-las em tubos de ensaio respectivamente marcados, contendo 2 ml de solução
de eluição. Agitar até a fita dissolver-se completamente. Fazer um tubo com um pedaço
da fita sem proteína (branco) para zerar o aparelho.
12.Ler em espectrofotometro usando um comprimento de onda de 520nm, obtendo assim a
densidade óptica da amostra (D.O.)
13.Fazer os, cálculos conforme modelo da apostila (pag.15)
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CÁLCULOS
EXEMPLO
FRAÇÕES D.O. Valor relativo (%) Valor absoluto g/100ml
Albumina 0,553 65,8 4,67
α1- globulina 0,034 4,0 0,28
α2- globulina 0,061 7,3 0,52
β - globulina 0,085 10,1 0,72
γ- globulina 0,108 12,9 0,91
total 0,841 100,0 7,10
0,553---------------- x
Valores normais :
Albumina....................................................... 3,6 a 5,0 g/100 ml
α1-globulina.................................................. 0,1 a 0,4 g/100 ml
α2-globulina.................................................. 0,5 a 1,0 g/100 ml
β -globulina.................................................... 0,6 a 1,2 g/100 ml
γ-globulina..................................................... 0,6 a 1,6 g/100 ml
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I - Introdução:
Em 1894, Pfeifer mostrou que, quando cobaias restabelecidas de cólera eram
infectadas com o vibrião colérico, seu soro possuía forte atividade bacteriolítica contra esse
microorganismo. Quando o soro da cobaia era aquecido, essa atividade desaparecia.
Estudos posteriormente demonstraram que a atividade bacteriolítica se devia a duas
substâncias encontradas no soro: uma resistente ao calor, encontrada somente no sangue de
animal imune (anticorpo); e outra sensível ao calor (termolábil), presente no soro de quase
todos os animais de sangue quente, imunes ou não (complemento). A bactéria que induziu a
imunidade e contra a qual atividade era dirigida, é o ANTÍGENO.
Quando ocorrer a união desses três elementos, antígeno da superfície bacteriana-
Anticorpo-complemento in vivo ou in vitro poderá haver bacteriólise. Se o anticorpo estiver
ausente, mesmo existindo complemento em abundância, este não poderá se fixar as
bactérias e, portanto não as lisará. Se, ao contrário, o complemento estiver ausente, ocorrerá
a união do anticorpo com a bactéria, mas não haverá bacteriólise. Em tal caso, diz-se que a
bactéria está sensibilizada, e a adição subsequente do complemento acarretará rapidamente
a bacteriólise.
Outras substâncias, além das bactérias, podem agir como antígenos, sobretudo os
glóbulos vermelhos, cuja destruição se denomina hemólise. O processo de hemólise,
quando se processa in vitro, é facilmente visível a olho nu, por causa da liberação de
hemoglobina das hemácias lisadas. Logo que se misturam os reagentes os eritrócitos
formam uma suspensão vermelha opaca. Quando ocorre hemólise, a hemoglobina difunde-
se no líquido, que toma coloração vermelha transparente, sem sedimento visível. Se não
ocorre a hemólise, os glóbulos intactos depositam-se lentamente no fundo, formando
sedimento vermelho, com sobrenadante claro e incolor.
Antígenos solúveis também reagem com anticorpos específicos fixando o
complemento.
A aplicação da reação de fixação do complemento permite determinar a presença do
anticorpo especifico no soro do paciente, o que serve para diagnosticar a infecção
correspondente. Quando se mistura o soro desconhecido com um antígeno específico e o
complemento, num tubo de ensaio, acontecerá uma das duas hipóteses:
1- Se o paciente tiver a infecção em questão e se, por conseguinte, seu soro tiver o
anticorpo correspondente, o complemento será ligado ou fixado ao complexo antígeno-
anticorpo específico e nenhum complemento será deixado livre.
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REAÇÃO IMUNOHEMÓLISE
Quando injetamos hemácias de carneiro num coelho, este animal produz anticorpos
anti-hemácias de carneiro. Os anticorpos encontrados no soro do coelho podem ser
demonstrados pela reação de imunohemólise entre outras.
A reação de imune hemólise se verifica nas seguintes condições:
+ Suspensão de hemácias de
Fresco carneiro + incubação a 37º C hemólise
Material:
a - Estante de metal
b - 3 tubos de ensaio
c - Pipetas de 1 ml graduadas em 0,1
d - Suspensão de hemácias de carneiro a 5%
e - Soro hemolítico (hemolisina)
f - Complemento
g - Solução tampão com veronal
Técnica:
1 - Numerar os tubos
2 - Pipetar 0,1 ml de suspensão de hemácias nos 3 tubos
3 - Pipetar 0,1 ml do soro hemolítico nos tubos 1 e 2
4 - Pipetar 0,5 ml de complemento nos tubos 1 e 3
5 - Pipetar solução fisiológica tamponada: (os respectivos valores em cada tubo)
0,8 ml no tubo 1
1,3 ml no tubo 2
0,9 ml no tubo 3
6 - Incubar em banho-maria a 37ºC, por 15 minutos.
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Técnica:
1. Pipetar os reagentes segundo o quadro abaixo:
TUBOS Soro do Antígeno Complemento tampão
paciente (dose ótima) DH 50%
1(reação) 0,2 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,1 ml
2(controle do soro) 0,2ml - 05 ml 0,6 ml
3(testemunho do ag) - 0,5 ml 0,5 ml 0,3 ml
4(testemunho do C`) - - 0,5 ml 0,8 ml
RESULTADO INTERPRETAÇÃO
Reação
Soro
Controle do soro
Testemunho do Ag
Testemunho do C
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Esta técnica pode ser definida como a difusão de antígenos e anticorpos homólogos
um em direção ao outro num meio gelificado, em que em determinado ponto de ótima
proporção dos reagentes ou próximos deste, ocorre a reação de precipitação.
Geralmente usam-se lâminas de microscopia revestidas com camada de gel de ágar
a 1% em solução salina ou tamponada.
Na imunodifusão radial dupla, os reagentes são colocados em orifícios separados e
opostos feitos no gel. Os reagentes difundem-se radialmente formando uma linha visível
resultante da precipitação e somente na região onde os dois reagentes se encontram nas
proporções adequadas.
O complexo antígeno - anticorpo se apresenta sob a forma de linha ou arcos de
precipitação, sendo que, tais arcos podem fundir-se dando identidade total ou parcial
(esporão) ou intercruzam-se, demonstrando independência imunológica total entre os
reagentes pesquisados.
Fatores que interferem na reação de precipitação são: pH, temperatura, forca iônica
do tampão, tempo e principalmente as concentrações relativas de antígenos e anticorpo. O
pH deve ser entre 6,5 a 8,8 pois em pH abaixo de 6,5 pode ocorrer precipitação não
específica e o pH acima de 8,8 pode impedir a reação e dissociar complexos de Ag - Ac . A
temperatura deve ser constante e entre a 4ºC e 37ºC . Na temperatura mais baixa, a reação
ocorre mais lentamente e a temperatura acima de 37ºC pode resultar na formação das linhas
de precipitação. A forca iônica maior ou menor do que a do tampão recomendado, poderá
interferir na solubilidade das proteínas. A reação usualmente ocorre entre 16 a 24 horas,
mas deve se esperar 40 a 48 horas para o resultado final.
A principal aplicação desta técnica tem sido na identificação de antígenos e
anticorpos em misturas desconhecidas (como os fluídos biológicos).
Outra grande importância é a de se poder saber se duas substâncias são
imunológicamentes idênticas, parcialmente idênticas ou independentes. A imunodifusão é
usada também com finalidade diagnóstica, como por exemplo, na anemia infecciosa
eqüina, na hepatite crônica ativa, bem como na paracoccidioidomicose.
MATERIAL
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TÉCNICA:
OA O3 O4
O1 O2 OB
A – Antígeno Pb B - Antígeno Pb
(extraído do Paracoccidioidis brasiliensis) (extraído do Paracoccidioidis brasiliensis)
1 - soro do paciente 1 3 - soro controle positivo
2 – soro controle positivo 4 - soro do paciente 2
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E A C
LEGENDA:
A= Solução de anti-IgA das secreções
B=Saliva humana
C=Solução de anti-IgM
D= Solução de cadeias pesadas α
E=Solução de IgA sérica
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REAÇÃO DE AGLUTINAÇÃO
As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno faz parte
da superfície de eritrócitos, bactérias ou mesmo de partículas inertes (ex: látex) que foram
recobertas por um antígeno. Os anticorpos adicionais a estas suspensões combinam com o
antígeno localizado na superfície das partículas unindo-as entre si, formando um agregado
nítido.
No teste de aglutinação direta eritrócitos, bactérias e uma variedade de espécies
microbianas podem ser diretamente aglutinadas por anticorpos séricos. Testes para detectar
anticorpos especificos são realizados pela titulação de soros imunes em diluições seriadas (2x)
na presença de uma quantidade constante de antígeno. Após poucas horas de incubação, a
aglutinação está completa e as partículas são examinadas diretamente ou microscopicamente
para evidência dos grumos. Os resultados são expressos geralmente em títulos isto é, o inverso
da maior diluição do soro na qual ocorre aglutinação. Por causa da variabilidade intrínseca no
sistema de teste, um título precisa diferir em pelo menos duas diluições (dois tubos) para ser
diferente de qualquer titulo dado. Os testes são feitos em pequenos tubos de ensaio em volumes
de 0,2 - 0,5 ml ou em placas de microaglutinação com quantidade bem menores de reagentes,
resultando em maior sensibilidade.
Na aglutinação indireta faz-se adsorsão passiva ou acoplamento químico de antígenos
solúveis a eritrócitos ou outras partículas inertes. Muitos antígenos se acoplam
espontaneamente com eritrócitos e formam reagentes estáveis para a detecção de anticorpos.
Os testes de aglutinação indireta podem ser também realizados em tubos ou placas de
microaglutinação. Em anti-soros com títulos aglutinantes altos, um fenômeno de pro-zona pode
obscurecer os resultados. O fenômeno de pro-zona produz reações de aglutinação falsamente
negativas em concentrações altas de anticorpos.
As reações de aglutinação requerem a presença de eletrólitos, uma vez que os
eletrólitos vão neutralizar a carga elétrica da partícula que em pH neutro possuem carga livre ou
resultante negativa . Neutralizada esta força repulsiva, as células se aproximam permitindo a
formação de pontes moleculares.
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O antígeno utilizado nessa reação foi preparado de acordo com técnica internacional
recomendada pelo Ministério da Agricultura, estando em uma concentração celular de
11%, em salina fenicada a 8,5% e corada com verde brilhante e cristal violeta.
TÉCNICA
01 - Com uma pipeta específica para reação aglutinação direta para o diagnóstico da
brucelose (Pipeta de Bang) ou com pipeta de 0,2 ml, pipetar 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 e
0,05 ml do soro teste depositando separadamente cada fração do material sobre uma
série de quadrados numa placa de vidro específica para esta reação (ou pipetar
individualmente cada uma das quantidades indicadas colocando-as em lâminas
individuais de microscopia, previamente identificadas com a respectiva diluição);
05 - Fazer a leitura observando a aglutinação com uma fonte de luz apropriada. Reação
positiva (+): presença de aglutinação. Reação negativa (-): não aglutinação.
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MATERIAL NECESSÁRIO:
1 - Lâminas escavadas;
2 - Suspensão do antígeno;
3 - Soros a testar, soros positivo e negativo, inativados a 56ºC durante 30 minutos;
4 - Pipetas Pasteur;
5 - Seringa de 1 ml sem o bisel (ponta);
TÉCNICA:
01 - Em cada escavação da placa colocar 01 gota (0,05 ml ) dos diferentes soros;
02 - Acrescentar a cada soro uma gota de suspensão antigênica com uma seringa de 1,0 ml
(agulha sem bisel);
03 - Agitar, no agitador próprio, durante 04 minutos, a 180 r.p.m., ( a agitação pode ser
manual); movimentos rotatórios da placa sobre a superfície da mesa com amplitude de mais
ou menos 03 cm;
04 - Leitura: A leitura deve ser feita imediatamente após a agitação observando ao
microscópio de acordo com a intensidade da reação.
INTERPRETAÇÃO
- Partículas finamente dispersas - não reativo
- Partículas agrupadas em pequenos grumos - soro fracamente reativo.
- Partículas agrupadas em grandes grumos - soro fortemente reativo.
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TÉCNICA:
01 - Preparar uma diluição a 1/20 do soro, pipetando 0,95 ml do tampão glicina e a seguir
0,05 ml do soro teste no tubo contendo o tampão e homogeneizar bem;
02 - Colocar no círculo central da placa fornecida, 1 gota da diluição 1/20 do soro a testar;
04 - Adicionar uma gota do reativo látex globulina, previamente agitado, a cada um dos
círculos;
05 - Misturar e distribuir o conteúdo de cada círculo por toda sua área com um estilete.
Usar um para cada círculo;
RESULTADO:
NEGATIVO: Suspensão homogênea;
POSITIVO: Aglutinação nítida que se apresenta como grumos visíveis
macroscópicamente dentro de 2 minutos.
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IMUNO-HEMATOLOGIA
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
MATERIAL:
a) Sangue total;
b) Soro anti A;
c) Soro anti B;
d) Pipetas Pasteur;
e) Lâminas de microscopia.
TÉCNICA:
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MATERIAL:
a) Soro desconhecido;
b) Hemácias A;
c) Hemácias B;
d) Pipetas de Pasteur;
e) Lâminas.
Seguir o esquema
- Misturar com o bordo de uma lâmina limpa e efetuar a leitura pela presença ou não de
aglutinação.
MATERIAL:
a) Sangue total;
b) Soro anti D (Rh);
c) Lâminas;
d) Pipetas Pasteur.
TECNICA:
A tipagem comumente é feita em lâmina usando-se como reagente soro anti
- D (Rh) observando-se a aglutinação ou não das hemácias a temperatura ambiente.
Sangue:
1 gota de sangue
Soro: anti -D
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TESTE DE COOMBS
A prova de Coombs, também denominada prova de antiglobulina humana, consiste
no emprego do soro antigamaglobulina humana (soro de Coombs) para promover a
aglutinação de hemácias previamente incubadas com anticorpos incompletos.
Teste de Coombs indireto é utilizado para o diagnóstico de anticorpos incompletos
no soro de qualquer pessoa possivelmente sensibilizada por antígenos eritrocitários do
sistema Rh (sensibilização pós-transfusional ou no decurso de gestação).
O teste de Coombs direto é feito para diagnóstico da D.H.R.N. Em recém-nascido
de mães sensibilizadas. Consiste na lavagem de hemácias já sensibilizadas, de crianças e
adição de soro de Coombs.
02 - Colocar em um tubo de ensaio uma gota do soro a ser testado (marcar T no tubo); em
um 2º tubo colocar uma gota de soro controle positivo (marcar (+) no tubo); em um 3º tubo
colocar uma gota de soro controle negativo (marcar (-) no tubo).
03 - A cada um dos tubos acrescentar uma gota de suspensão de hemácias O Rh (+) 5%;
INTERPRETAÇÃO
10 - Aglutinação presente: Teste positivo
Aglutinação ausente: Teste negativo
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PROCEDIMENTO
1) Utilizando a linha A, colocar 50µl de tampão diluente em cada poço, a partir do 2º poço até o
11º poço dessa linha;
2) Colocar 100 µl de soro humano no 1º poço;
3) Homogeneizar o conteúdo do 1º poço e passar 50µl para o 2º poço ; homogeneizar novamente e
passar 50 µl do 2º poço para o 3º ; proceder com esta diluição até o último poço (numero 11);
4) Desprezar 50µl do 11º poço (último);
5) Agitar levemente a placa;
6) Colocar 50µl de soro anti-antígeno Hbs em cada poço, do 1º ao 11º poço;
7) Agitar levemente a placa;
8) Colocar 50µl de hemácia sensibilizada com o antígeno do vírus Hepatite B em todos os poços;
9) Selar com fita Durex para que não haja evaporação dos reagentes e colocar a placa sobre uma
superfície rígida, onde não sofra vibrações;
10) Ler a reação após 2 horas.
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Este teste foi desenvolvido em 1971 por Engvall e Perlmann como alternativa ao
radioiumunoensaio. Anticorpos ou antígenos podem ser conjugados a enzimas de maneira que,
ao ser adicionado o substrato da enzima à reação, é gerado um produto colorido que poderá ser
observado a olho nu (ensaio qualitativo) ou ter sua densidade óptica medida por
espectrofotometria (ensaio quantitativo). A enzima peroxidase é muito utilizada para este teste,
e reage especificamente com seu substrato, o peróxido de hidrogênio, gerando um complexo
que na presença de um terceiro composto um doador de elétrons (cromógeno ) forma um
polímero intensamente colorido. O cromógeno mais utilizado em ELISA é o OPD (ortofenileno
diamina).
O princípio básico é a adsorção de um dos reagentes (antígeno ou o anticorpo) a uma
fase sólida, tal como placas de poliestireno ou polivinil, materiais que possibilitam a ligação
covalente de proteínas. Tais placas contêm séries de poços onde serão depositados os reagentes.
O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter
elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados.
A adsorção não específica de componentes à placa pode ser reduzida incluindo-se uma
proteína inerte (caseína, gelatina, BSA) no diluente da amostra (bloqueio). Os conjugados
devem ser preparados com anticorpos de alta afinidade, preferencialmente monoclonais.
Independente do método escolhido para leitura é necessário determinar o limite de
reatividade ou “cut-off” do teste, que pode ser obtido pela relação entre a coloração da amostra
e a coloração do controle positivo (D.O da amostra/D.O do controle positivo).
Vários métodos são realizados utilizando o principio do enzima-imunoensaio, entre eles
os mais empregados são:
• Método indireto: amplamente empregado para a pesquisa de anticorpos apresentando
como vantagem a utilização de um único conjugado em diferentes sistemas.
• Método de captura: Um anticorpo específico é adsorvido à placa para reter o objeto da
pesquisa, que poderá ser o antígeno ou mesmo uma classe de anticorpo em particular.
O conjugado utilizado deverá ser específico para a estrutura capturada na placa.
Material necessário:
Placas de poliestireno
Solução contendo antígenos de T. cruzi
Solução tamponada de Caseína a 1%
Solução tampão para lavagem
Pipetas automáticas
Pipetas Pasteur
Estufa à 37°C
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31
Metodologia:
Sensibilização da placa:
Material necessário:
Metodologia:
1. Pipetar em duplicata (em dois poços consecutivos) 100µl dos soros controles e dos
soros testes de acordo com o esquema abaixo:
A: Controle negativo
B: Controle negativo
C: Controle positivo
D: Controle Positivo
E: Soro teste 1
E: Soro teste 2
F: Soro teste 3
G:Soro teste 4
31
32
32
33
REAÇÕES DE IMUNOFLUORÊSCÊNCIA
FINALIDADE: Detecção de anticorpos ou de antígenos.
É possível tornar visível a reação Ag-Ac marcando um dos reagentes com
substâncias ditas fluorocromos, que tem a capacidade de absorver a energia luminosa,
armazená-la durante curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 de segundos) para, em seguida
emiti-la sob a forma de uma radiação de maior comprimento de onda, resultando em
fluorescência.
A fluorescência é a emissão de luz de uma cor, isto é, comprimento de onda,
enquanto uma substância é irradiada com luz de cor diferente. O comprimento da onda
emitido (fluorescente) terá necessariamente menor energia, ou seja maior comprimento de
onda do que o da luz incidente ou absorvida.
Os fluorocromos mais usados em laboratório clínico são a fluoresceína e a
rodamina. Ambos os fluorocromos são empregados sob a forma isotiocianato, que se
conjuga facilmente as proteínas em pH alcalino (acima de 9 ).
Os fluorocromos apresentam espectros de absorção e emissão característicos. A
absorção máxima do isotiocianato de fluoresceína é de 490 - 495 nm, e emite sua cor verde
característica a 517 nm. O isotiocianato de tetrametilrodamina, que emite cor vermelha,
tem um máximo de absorção a 550 nm e emissão máxima a 580 nm. Para a observação
microscópica da fluorescência é necessária uma adaptação do microscópio óptico comum,
contendo uma fonte de luz excitadora de alta intensidade; filtros de excitação para produzir
um comprimento de onda capaz de causar ativação do fluorocromo e filtros para evitar a
passagem pela ocular, de luz de baixo comprimento de onda.
C
A B
A - Lâmpada de halogênio
B - Preparo fluorescente
C - Filtros excitadores
D - Filtros de barreiras
Esquema do sistema óptico do microscópio de fluorescência.
As técnicas utilizadas para o estudo de imunofluorescência comportam duas
modalidades principais:
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TOXO
1/16 1/1024 _
1/256
1/64 1/4096 +
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PARTE II
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
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UNIDADE:
RESISTÊNCIA INESPECÍFICA
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UNIDADE:
CÉLULAS DO SISTEMA IMUNE
d- Diferenciar as células que atuam na defesa especifica, daqueles que atuam na defesa
inespecifica.
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UNIDADES:
FORMAÇÃO DE CÉLULAS T E B e
ÓRGÃOS LINFÓIDES
Objetivos gerais e específicos:
1) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides primários no sistema
imunológico.
2) Reconhecer quais são e qual a função dos órgãos linfóides secundários no sistema
imunológico.
3) Descrever as características histológicas e anatômicas dos órgãos linfóides primários
e secundários.
4) Relacionar funcionalmente a membrana do saco vitelino, o fígado fetal e a medula
óssea, para o sistema imune.
5) Relacionar os passos envolvidos na formação de células T efetoras, à partir da
célula primitiva.
6) Relacionar os passos envolvidos na formação de plasmócitos secretores de
anticorpos, à partir da célula primitiva.
7) Comparar e justificar os efeitos da timectomia neo-natal e na fase adulta.
8) Reconhecer aspectos da adaptabilidade dos órgãos linfóides secundários para a fase
de reconhecimento antigênico na resposta imune.
9) Explicar o centro germinativo nos linfonodos.
10) Justificar a hiperplasia de um órgão linfóide secundário, considerando as fases de
uma resposta imunológica.
11) Reconhecer a principal via de acesso das “estruturas estranhas”, aos órgãos linfóides
secundários.
12) Explicar o tráfego de linfócitos no organismo.
13) Explicar como os linfócitos efetores produzidos em um linfonodo têm acesso a um
sítio de infecção em outra região ou tecido.
14) Reconhecer o papel das vênulas pós-capilares de endotélio alto nos linfonodos com
relação ao tráfego de linfócitos.
15) Justificar a proliferação linfocitária nos órgãos linfóides secundários.
16) Justificar a proliferação celular nos órgãos linfóides primários.
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UNIDADE:
ANTÍGENOS
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UNIDADE:
IMUNOGLOBULINAS (objetivos I)
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UNIDADE:
IMUNOGLOBULINAS (objetivos II)
Objetivos gerais e especificos:
a) Conceituar o termo Imunoglobulinas.
b) Reconhecer a estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina.
c) Definir a natureza química de uma molécula de imunoglobulina.
d) Identificar os fragmentos resultantes após a clivagem enzimática de uma molécula
de imunoglobulina pela ação de pepsina e da papaína.
e) Diferenciar os diversos isótipos de cadeias leves e de cadeias pesadas existentes.
f) Reconhecer as imunoglobulinas que apresentam subclasses e diferenciar estas
subclasses de acordo com a nomeclatura vigente.
g) Conceituar e exemplificar alotipia em cadeias leves e pesadas.
h) Conceituar idiótipos.
i) Esquematizar uma molécula de IgG reconhecendo nela os seguintes tópicos.
1- Cadeia pesada
2- Cadeia leve
3- Domínios variáveis e constantes nas cadeias leves e pesadas
4- Região carboxi-terminal
l) Definir a quantidade relativa de IgG encontrada no soro, em relação as outras
imunoglobulinas.
m) Identificar as sub-classes de IgG existentes.
n) Definir as principais propriedades biológicas da IgG.
o) Definir a propriedade de opsonização de que é dotada a IgG.
p) Reconhecer as subclasses existentes de IgA.
q) Discriminar estruturalmente uma molécula de IgG e uma de IgAS.
r) Esquematizar o mecanismo de formação da IgAS desde sua síntese até sua chegada
nas secreções.
s) Explicar a importância da IgAS na defesa local das mucosas.
t) Determinar estruturalmente a composição de uma molécula de IgM.
u) Determinar o peso molecular e quantidade relativa de IgM encontrada no soro.
v) Reconhecer as principais propriedades biológicas da IgM.
w) Determinar estruturalmente a composição de uma IgD.
x) Reconhecer a forma de participação de IgE nas reações alérgicas.
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UNIDADE:
SISTEMA COMPLEMENTO
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UNIDADE:
FAGOCITOSE
e) Definir opsonização.
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UNIDADE:
Complexo de Histocompatibilidade Principal(CHP, “MHC”)
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UNIDADE:
Células Apresentadoras de Antígenos (APCs) e mecanismos de
Apresentação de Antígenos
1) Definir quais são as principais células apresentadoras de antígenos e onde elas se
localizam;
5) Definir em qual situação, uma molécula viral pode ser apresentada no contexto de
moléculas de classe I do CHP:
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UNIDADE:
Linfócitos T
1. Definir estrutural e funcionalmente os principais marcadores de superfície dos
linfócitos T
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UNIDADE:
Linfócitos B e
Resposta Humoral Primária e Secundária
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UNIDADE:
Genética das Imunoglobulinas
Objetivos gerais e específicos:
1. Conceitue “Fenômeno de Restrição Isotípica”.
10. Identifique a seqüência genética existente para a síntese das diferentes cadeias
pesadas de imunoglubulinas.
12. Diferencie o rearranjo gênico que existe durante a fase primordial e a fase tardia de
síntese das imunoglobulinas.
13. Diferencie os rearranjos gênicos que existem nas cadeias leves e pesadas.
15. Explicar por que uma célula que sofreu um “Switch” para a síntese de IgG não
mais poderá voltar a sintetizar IgM;
16. Responder: por ‘que, durante o “Swicth”, há variação na síntese da porção constante
da cadeia pesada de imunoglubolinas e não ocorre o mesmo para a porção variável?
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UNIDADE
Tolerância Imunológica
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UNIDADE
HIPERSENSIBILIDADE
5. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo II.
6. Descrever o que é o estado de sensibilidade para uma reação de hipersensibilidade tipo III.
10. Identificar qual o infiltrado celular característico de uma reação inflamatória desencadeada
por uma reação de hipersensibilidade tipo IV.
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23. Descrever os principais mecanismos da lesão celular por hipersensibilidade tipo II.
27. Explicar o papel do sistema do complemento nas reações de hipersenbilidade tipo III.
29. Diferenciar a formação de uma reação de Arthus com uma reação tipo III sistêmica.
32. Justificar a isquêmia que pode acompanhar as reações de hipersensibilidade tipo III.
37. Justificar o eritema que caracteriza as reações intradérmicas de hipersensibilidade tipo IV.
39. Justificar a escolha dos Ag em uso nos testes intradérmicos de avaliação de imunidade
celular.
40. Explicar o mecanismo da injúria tecidual pelo mecanismo de hipersensibilidade tipo IV,
reconhecendo os fatores liberados por células responsáveis.
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UNIDADE:
TRANSPLANTES
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SUBUNIDADE:
“ELETROFORESE DE PROTEÍNAS”.
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PARTE III
ESTUDOS DIRIGIDOS
EXERCÍCIOS
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RIE (RADIOIMUNISAIO)
METODOLOGIA:
A cada tubo foi adsorvido previamente anticorpos anti-IgM humana. A adsorção
se dá por ligações covalentes entre os anticorpos e o material do tubo (poliestireno).
Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim
recobrir os espaços não ocupados pelo anticorpo (bloqueio do tubo).
PERGUNTA-SE
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METODOLOGIA
A cada poço foi adsorvido previamente antígenos extraídos dos vírus da AIDS.
A adsorção se dá através de ligações covalentes entre os antígenos e o material da placa.
Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina, para assim
recobrir os espaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da placa).
2- A placa foi levada a uma estufa a 37 ºC por 30 minutos, uma condição favorecedora
da interação Ag/Ac.
3- A seguir esse poço foi lavado com uma solução tampão com finalidade de retirar
moléculas livres.
7- Logo após observou-se que a solução no poço 1 ficou alaranjada enquanto que no
poço 2 não houve alteração.
Responda:
a- Esquematize os dois poços evidenciando as reações Ag/Ac que ocorrerem ou
deixarem de ocorrer.
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WESTERN BLOTTING
É um dos métodos mais utilizados para identificar proteínas reconhecidas por
anticorpos, sendo designado também de immunoblotting, diferenciando-se do
“Southern ou Northen blotting”, que se prestam a identificação de ácidos nucléicos.
Abaixo está apresentado um exemplo de Western blotting que se presta ao
diagnóstico sorológico da AIDS. Leia com atenção e responda.
2- Em seguida as proteínas fracionadas no gel são transferidas por corrente elétrica, para
uma membrana de nitrocelulose que posteriormente será recortada em tiras.
Posteriormente adiciona-se uma proteína inerte como a albumina bovina ou a caseína,
para assim recobrir os pedaços não ocupados pelo antígeno (bloqueio da fita).
RESPONDA:
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IMUNOHISTOQUÍMICA
A aplicação da imunohistoquímica (IHQ) à rotina diagnóstica já é uma realidade
em nosso meio. De modo genérico, podemos considerar como principais indicações
para o exame:
♦ Diagnóstico histogenético de neoplasias morfologicamente diferenciadas
♦ Subtipagem de neoplasias
♦ Caracterização da origem de carcinomas.
♦ Caracterização de produtos de secreção de células neoplásicas
♦ Discriminação da natureza benigna X maligna de determinadas proliferações
celulares.
♦ Avaliação prognóstica de neoplasias
♦ Identificação de agentes infecciosos.
Como exemplo, temos representado abaixo uma reação de IHQ para a pesquisa de
receptores de estrógeno em células de adenocarcinoma de mama, um fator
prognóstico neste caso.
1- Para a realização reação de imunohistoquímica utilizamos cortes de tecido incluído
em parafina com aproximadamente 3 µ de espessura, colocados em lâminas tratadas
com silano ( silanizadas), para propiciar uma forte adesão do corte histológico à
lâmina
2- Em seguida as lãminas são desparafinizadas, sendo deixadas na estufa à 60°C por 24
horas, no xilol à 60°C e no xilol a temperatura ambiente para desparafinização
3- Após a desparafinização as lâminas são levadas à uma sequência de banhos de álcool
absoluto até 80% para hidratação.
9- Posteriormente segue-se a etapa conhecida como recuperação antigênica. Necessária
para que se restabeleça a estrutura antigênica das proteínas estruturais, modificada
pela ação do formol. Tal etapa poderá ser feita por dois métodos:
Calor úmido: em solução tampão citrato de sódio pH 6,0 4M, em banho-maria, panela
de pressão ou microondas por tempo determinado.
Enzimático: tratamento do corte com proteinase K
RESPONDA:
Qual a finalidade das etapas de lavagem?
Por que fazemos a recuperação antigênica?
Como seria um resultado negativo?
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2.Se em uma situação hipotética, nosso organismo for infectado por uma bactéria
extracelular qualquer, tal como uma do gênero Streptoccocus, que possua em sua parede
antígenos de natureza polissacarídica e glicoproteíca, qual seria a resposta esperada do
sistema imune?.
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CITOMETRIA DE FLUXO
Pela acadêmica de Farmácia Daniela Silva Moreira
Introdução:
Desenvolvimento:
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63
63
64
Conclusão:
• Bibliografia:
-www.do.med.unipi.it/apher/write/cytome.htm
-www.icnet.uk/axp/facs/davies/flow.html
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexo
Art. 1º. Aprovar as Normas para a Profilaxia da Brucelose Animal, anexas à presente Portaria, assinadas pelo
Diretor Geral do Departamento Nacional de Produção Animal.
Art. 2º. Revogar as Portarias Ministeriais números 486 e 222, de 22 de abril de 1958 e 5 de março de 1969,
respectivamente.
NORMAS PARA A PROFILAXIA DA BRUCELOSE ANIMAL
CAPÍTULO I - DO DIAGNÓSTICO
Art. 1º. O diagnóstico de rotina da Brucelose em bovinos será realizado através das provas de soroaglutinação rápida
ou lenta, cuja interpretação obedecerá aos quadros a seguir:
Art. 3º. Como provas especiais, poderão ser utilizadas as provas de fixação do complemento, precipitação pelo rivanol,
redução pelo mercapto-etanol, prova do antígeno tamponado acidificado (prova do cartão - "card test") e prova
individual do anel do leite, visando dirimir eventuais dúvidas, em provas de rotina no caso de rebanhos-problema.
Art. 4º. A prova de sêmen-plasma-aglutinação será utilizada em reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial e
além da prova de soroaglutinação.
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Art. 5º. Como necessário, poderão ser realizados exames bacteriológicos de fetos abortados, anexos fetais, leite, sêmen
e outros materiais possivelmente infetados.
Art. 6º. Os animais que revelarem reação positiva serão marcados a ferro candente, no lado esquerdo da cara, com um
P contido um circulo de 8 cm (oito centímetro) de diâmetro conforme Anexo 1.
Art. 7º. Recomenda-se o sacrifício dos bovinos com reação positiva, considerando a porcentagem de incidência da
doença e as condições locais, observando-se os seguintes critérios.
a. os sacrifício será realizado em matadouro sob inspeção federal e o julgamento efetuado de acordo com as
disposições em vigor, constantes do Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal (RIISPOA);
b. o Serviço de Inspeção Federal no estabelecimento onde será realizado o sacrifício deverá ser notificado com
antecedência, de forma a permitir a adoção das medidas previstas no RIISPOA.
Art. 8º. Nos casos em que não seja possível o sacrifício, recomenda-se a adoção das seguintes providências:
Art. 9º. Os bovinos positivos ou suspeitos de Brucelose, não poderão ser objeto de comércio, salvo quando
comprovadamente destinadas ao abate ou a instituições científicas.
Art. 10. A imunização dos bovinos contra a Brucelose será levada a efeito pela vacinação de bezerras, somente uma
vez, com vacina viva, elaborada com a amostra 19 de Br. abortus, controlada pelo órgão oficial competente.
Art. 11. A aplicação da vacina da amostra 19, será efetuada sob a responsabilidade de médico veterinário, observando-
se o seguinte critério:
a. vacinar somente bezerras entre 3 e 8 meses de idade, não se admitindo vacinação de machos;
b. marcar as bezerras vacinadas, com ferro candente, no lado esquerdo da cara, com um V, acompanhado do
algarismo final do ano da vacinação, conforme modelo do anexo 2. Excluem-se da marcação, as bezerras
destinadas ao Registro Genealógico, quando devidamente identificada;
c. emitir atestado de vacinação, em 3 (três) vias, destinando-se a 1ª ao proprietário, a 2ª ao serviço veterinário
oficial e a 3ª ao emitente.
Art. 12. A vacinação de fêmeas adultas com a amostra 19 poderá ser autorizada em propriedades onde estiverem
ocorrendo surtos de abortos brucélicos, observando-se as seguintes condições:
a. a vacinação será realizada apenas uma vez, em cada propriedade afetada, mediante requerimento do
proprietário e autorização expressa do responsável pelo programa de combate à Brucelose na respectiva
Unidade da Federação;
b. as fêmeas vacinadas com a idade superior a 8 (oito) meses, serão identificadas com ferro candente, no lado
direito da cara, com um P contido um circulo de 8 cm (oito centímetros) de diâmetro, conforme Anexo 1.
c. o proprietário dos animais deverá assinar termo de compromisso, aceitando as condições estabelecidas.
Art. 15. Os frascos de vacina levarão etiquetas oficiais, que serão fornecidas pela unidade de controle, após a liberação
da partida correspondente.
Art. 16. A vacina com a amostra 19 será apresentada sob a forma liofilizada, admitindo-se a vacina líquida até o
aparelhamento dos laboratórios produtores, a critério da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da
Agricultura.
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Art. 17. A comercialização da vacina será objeto de fiscalização oficial e sua aquisição e aplicação sob responsabilidade
de médico veterinário.
Art. 18. Os antígenos para diagnóstico da Brucelose, prova rápida, lenta e do anel no leite, serão produzidos por um só
laboratório oficial, obedecendo as técnicas de produção e controle recomendadas pela Organização Mundial da Saúde.
Art. 19. A produção de antígenos para diagnóstico de Brucelose pelos demais laboratórios oficiais poderá continuar até
a instalação e o funcionamento do laboratório central do Ministério da Agricultura, submetida cada partida a controle
oficial.
Art. 20. O controle da distribuição de antígenos para diagnóstico de Brucelose, será efetuado pelo órgão competente do
Ministério da Agricultura, devendo o mencionado produto ser fornecido somente a médicos veterinários.
Art. 21. Somente será fornecido certificado de inspeção sanitária animal, para fins de trânsito interestadual, quando os
reprodutores apresentarem resultados negativos atestados acompanharão os animais.
Art. 22. Não será exigido atestado negativo para fêmeas bovinas com idade inferior a 30 (trinta) meses, quando
acompanhadas de atestado de vacinação contra a Brucelose, estando as bezerras e novilhas devidamente marcadas e
identificadas.
Art. 23. O trânsito internacional de bovinos, sêmen e produtos derivados reger-se-á pela legislação específica vigente.
Art. 24. O atestado de exame negativo para Brucelose será válido por 60 (sessenta) dias, a contar da data da realização
do respectivo exame.
Art. 25. A inscrição de bovinos no Registro Genealógico e a participação dos mesmos em Exposições e Feiras
Agropecuárias, dependerá da apresentação de:
a. atestado de vacinação contra a Brucelose, para fêmeas bovinas até 30 (trinta) meses de idade, vacinadas
entre 3 e 8 meses de idade, ou
b. atestado negativo para Brucelose, admitindo-se o título máximo aglutinante até 1:50 para fêmeas bovinas
com idade superior a 30 (trinta) meses, vacinadas na idade recomendada.
Art. 26. Os criadores poderão inscrever-se um esquema voluntário, para obtenção do Certificado de Propriedade Livre
de Brucelose.
Art. 27. Os animais da propriedade serão identificados por tatuagem ou outra forma, inclusive pelo Registro
Genealógico.
Art. 28. As condições que uma propriedade deve preencher para ser considerada livre de Brucelose serão estabelecidas
através de instrução da Divisão de Defesa Sanitária Animal do Ministério da Agricultura.
Art. 29. A profilaxia da Brucelose suína será baseada na adoção das seguintes medidas:
a. diagnósticos da situação, através de exame dos rebanhos em áreas de suinocultura mais expressiva,
utilizando-se as provas de soroaglutinação rápida e lenta ou a prova com antígeno acidificado tamponado
(prova do cartão - "card test"), realizadas nos suínos com idade superior a 6 (seis) meses;
b. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta, considera-se com infetado o rebanho no qual forem
identificados um ou mais suínos com aglutinação completa na diluição de 1:100, sendo neste caso, positivos
os animais com títulos iguais ou superiores a 1:25;
c. utilizando-se a prova de antígeno acidificado temponado (card test), os animais são classificados somente em
positivos e negativos;
d. são considerados negativos os rebanhos que não apresentarem qualquer animal com aglutinação superior a
1:100 - Incompleta;
e. nas provas de soroaglutinação rápida e lenta, também não é admitida a classificação de suínos suspeitos,
sendo que a interpretação das mesmas obedecerá o critério constante dos quadros a seguir:
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+ I - Negativa
+ + - Negativa
+ + I Negativa
+ + + Positiva
Art. 30. A presença de suínos infetados numa criação justifica o sacrifício do rebanho, considerados os antecedentes
clínicos e epidemiológicos.
Art. 31. A profilaxia da Brucelose ovina e caprina será baseada na adoção das seguintes medidas.
Art. 32. A interpretação dos resultados das provas sorológicas de aglutinação para ovinos e caprinos, obedecerá o
seguinte critério:
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