Professional Documents
Culture Documents
Bioteknologi Farmasi
FAR 40541
2 SKS
SASARAN PEMBELAJARAN:
PUSTAKA :
Pokok-pokok Bahasan
•Pendahuluan
•Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam
bidang farmasi,
•Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi,
•Teknologi bioproses
•Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi:
fermentasi dan kinetikanya, proses hilir
•Materi genetik
•Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan
•Terapi gen pada manusia,
•Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang
farmasi,
•Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Overview
BIOTEKNOLOGI FARMASI
BIOTEKNOLOGI:
- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang
penting dan
Bermanfaat : protein dan enzim
PATOFISIOLOGI PENYAKIT
DRUG ACTION
ORGANISME REKOMBINAN
Gene cloning
1994:
21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA
150 produk dalam taraf “clinical trial”
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
TUGAS:
DAMPAK BIOTEKNOLOGI
TERHADAP BIDANG FARMASI
Profesi FARMASIS “
• Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )
• Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat
dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
RAKAYASA GENETIKA
Definisi
Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik
dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang
dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga
memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang /
diperbanyak di dalam sel inang yang baru.
RAKAYASA GENETIKA
Material genetik :
adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan
dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat
DNA : deoksi ribonucleic acid
RNA : ribonucleic acid
Vektor Kloning :
adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke
inang tertentu.
Gen :
adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
ASPEK KLONING
ASPEK KLONING
Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya
mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi
organisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif.
Mikroorganisme
Tanaman BIOREAKTOR
Hewan
( E. coli ) à why ?
DEFINISI
§Isolasi DNA
mengekstraksi molekul DNA dari sel
§Memotong DNA ( digestion )
memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada
sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi
§Menyambung DNA ( Ligation )
Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA
vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase
§Transformasi
§Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
ISOLASI DNA
1.Penghancuran dinding sel : - mekanik
- enzimatis
2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat
- Triton X – 100
3. Membersihkan debris sel
- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven
organik
Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;
atau proteinase-K
4. Presipitasi
- + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro-
- + alcohol + NH4 asetat
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
2. Sifat denaturasi
- dengan alkali, pemanasan
- DNA plasmid lebih mudah renaturasi
3. Ultrasentrifugasi :
CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah
DNA size
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
•Elektroforesis
- DNA diwarnai dengan Etidium bromida
- dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+)
- dapat diketahui adanya degradasi
Degradasi :
Ik. Fosfodiester putus
Penyimpanan :
> - 200C - DNAse tidak aktif
- mencegah degradasi oleh DNAse
> TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
VEKTOR KLONING
PLASMID
bereplikasi diri ( self replicating )
utas ganda : d s
molekul DNA sirkulator
di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal
copy number ( Jumlah kopi per sel ):
high copy number 10 – 100 kopi / sel
low copy number 1 – 4 kopi / sel
medium copy number diantaranya
Ukuran : 1 s/d 500 kb
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
VEKTOR KLONING
Spektrum inang :
broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies
bakteri
narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus
PLASMID
-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri,
berbentuk sirkular, utas ganda.
STABILITAS PLASMID
kondisi optimum, stabil medium tumbuh
- Mandiri à tidak tergantung kromosom
ada gen ORI : untuk replikasi mandiri
- Plasmid rekayasa
Untuk teknologi DNA rekombinan
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
5’ versus 3’ overhang
• Enzyme cuts à
5’ G
GAATTC 3’
3’ CTTAAG
G 5’
5’ G 3’ 5’ AATTC 3’
3’ CTTAA 5’ 3’ G 5’
§ Generates 5’ overhang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
• EcoRI 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
– Escherichia coli
– 5’ overhang
• PstI 5’ CTGCAG 3’
– Providencia stuartii 3’ CACGTC 5’
– 3’ overhang
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Agarose Electrophoresis
• Arus listrik yang membawa DNA bermuatan
negatif ke elektroda muatan (warna
merah)positif melalui suatu gel agaros
TRANSFORMASI
GFP
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
TRANSFORMASI
TRANSFORMASI
• Electroporation
– Electrical shock yang menyebabkan membran
menjadi permeabel terhadap DNA
Electroporation
Electric shock
SELEKSI
E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap
E.coli yang tidak membawa rekombinan
Macam seleksi : ( 4 )
REPLICA PLATING
• Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN
– Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)
PRESS
AMP LATE
= Transforman
AMPR
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
REPLICA PLATING
• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh
Kain
BLOCK Beludru
PRESS
BLOCK
AMP LATE AMP LATE
BLOCK
BLOCK
REPLICA PLATING
• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
– Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh
GROW
TETRES NON-
RECOMBINANTS
TET PLATE
TETRES NON-
RECOMBINANTS TET PLATE
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Vertifikasi :
àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor,
menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double
digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di
elektroforesis gel agarose.
Pemetaan :
Manfaat ER dalam biologi molekuler.
Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs
Enzim restriksi.
à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):
pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
SEKTOR :
Medicinal :
-Human Therapeutic
-Human Diagnostic
Non medical :
-Agriculture
-Specialities
-Non-medical Diagnostic
Contoh : INDIGO à pewarna jeans
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
INDIGO
-diekstraksi dari tanaman
-batubara
-rekombinan DNA
Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans
DIAGNOSTIK MOLEKULER
KENDALA : lama
mahal
Pharmaceutical biotechnology
• Diabetes Insulin
• Haemophilia Factor VIII
• Stroke Tissue plasminogen activator
• Growth failure Human growth hormone
• Anaemia Erythropoietin
• Viral infection Interferon
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Isolasi cDNA
Engineering (Rekayasa)
§Isolasi cDNA
Strategi I:
Isolasi protein target
Sintesis oligonukleotida
MRNA (mature)
Reverse transcribed
cDNA
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
§Engineering
D-glucose
L- ascorbic Acid
Acetobacter
Gluconobacter D. glucose 2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)
Erwinia
melalui beberapa lintas metabolisme
TERAPI GEN
PENDEKATAN
Gen remedial
Antisense therapy
Dirancang untuk pencegahan;
- penurunan ekspresi gen tertentu,
- bekerja pada tahap translasi (mRNA)
Ada 2 cara:
A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas)
B.Menggunakan gen antisense yang diklon
Base pairing
AGCUGAU
TCGACTA
No translation
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
DNA
------ A G C T G A T ---------- -------T G C G A C T A-------
-------T C G A C T A ---------- -------A C G C T G A T-------
transcription
mRNA
AGCUGAU UCGACUA
Base pairing
mRNA sense AGCUGAU
mRNA antisense TCGACTA
No translation
Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.
Tahap – tahap :
-denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA
- enzim Taq DNA polymerase
- primer
-renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C
primer berikatan dengan template DNA
-sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi
katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk
mensintesis DNA.