Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1.Định nghĩa:
Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều
kiện có oxy phân tử
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí:
Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ
sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư
hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế
biến và bảo quản thực phẩm
Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất
lượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư
hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=106 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu
hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bị
chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm
có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi
cấu trúc
3.Quy trình kiểm tra:

Trang 1
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-1)+ 9ml nước

nước vô trùng nước vô trùng

Stomacher .10gr thực phẩm 10-2 10-3

+ 90ml NaCl 0.85%
(10-1)

Bước 1: đồng nhất mẫu

Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H 20 vô
trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30”
thu được nồng độ 10-1
Bước 2 : pha loãng mẫu
Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng
lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng
lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc
ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm
tương tự với các nồng độ kế tiếp
Lưu ý khi pha loãng mẫu:

Trang 2
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

-Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực
phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm
nghiệm….
-Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải
vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện
tượng sai số
-Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều
Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu
Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp
Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2
đĩa/nồng độ
Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào
các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều
dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi
trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert
Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A
hoặc N.A
Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc
Sabouraund
Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc
72h/30-370C
Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa)
Kết quả thí nghiệm
10-1 10-2 10-3
Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2 Đĩa 1 Đĩa 2
Nồng độ
Số khuẩn lạc 48 130 113 125 105 120

Trang 3
Thực tập vi sinh đại cương Nhóm 3_Lớp 071160C

Bước 5: tính kết quả theo công thức

n = c/(n1+0.1n2)*d
n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml))
c : tổng số khuẩn lạc đếm được
n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất
n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai
d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm
(113 125 105 120 ).100
=>n= (2 0,1. 2)
=21045 21000 cfu/g(ml)

4.Môi trường sử dụng

4.1.Môi trường Nutrient Agar
Peptone :5.0g
Meat extract :3.0g
Agar :12.0g
Nước cất :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0 0.2
Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
4.2.Môi trường Plate Count agar
Peptone :5.0g
Meat extract :2.5g
D(+) glucose :1.0g
Agar :14.0g
Nước cất vừa đủ :1000ml
pH sau thanh trùng : 7.0 0.2
Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
4.3.Môi trường Sabouraund
Peptone :20g

Trang 4
 Glucose :40g
Agar :20g
Nước :1000ml
Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút
BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SÔ COLIFORM
1.Những kiến thức chung về COLIFORM
Coliform là nhóm trực khuẩn gram- , không bào tư , hiếu khi hoặc ki
khi tùy ý, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ơ 37oC /24 – 48h.
Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vật dùng
để chi thi khả năng có sư hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực
phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khi và ki khi tùy ý, gram -
, không bào tư , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi
trường lỏng, dựa vào nhiệt dộ tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2
nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc tư phân các loài động
vật. Trên thực tế kiểm nghiệm coliform phân được quan tâm nhiều hơn
coliform. Coliform phân có nguồn gốc tư ruột người và các động vật máu
nóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform
phân hiện diện ơ một số lượng lớn trong mẫu thi mẫu có khả năng chứa các
vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân.Chỉ tiêu tổng coliform không thích
hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy
nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi
sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44oC. Do
đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý
nguồn nước.
Trong các thành viên nhóm coliform phân thi E.coli là loài được quan
tâm nhiều về vệ sinh an toàn thực phẩm.
 Loài vi sinh vật này phân bố ơ mọi nơi, có trong ruột người và các
động vật máu nóng.
*một số hình ảnh về coliform:

Fecal Coliform
375 x 294

Chromocult® Coliform Agar ES

297 x 300
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu
Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chi thị. Số lượng hiện diện
của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chi thi cho khả năng hiện
diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Số lượng coliforms cao thi khả năng
hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cao.
Colifrorm chịu nhiệt( coliform phân):
Là thành phần trong hệ vi sinh vật đường ruột ơ người và các
động vật máu nóng.
Được xem là vi sinh vật chi thi mức độ vệ sinh trong quá trình
chế biến, bảo quản , vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chi
thi sư ô nhiễm phân trong môi trường.
Lên men đường lactose trong môi trường E.C ơ 44.5oC.
Có khả năng sinh indol 24h/44.5oC.
Kết quả sinh hóa nghiệm pháp imvic là + + - -
3.Quy trình kiểm tra
Phương pháp MPN :
Nguyên tắc:
Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân , 2 nồng độ kế tiếp
nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống
durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 ống. Theo dõi sư sinh hơi
trong từng ống nghiệm. Xác định ống dương tính ơ mỗi nồng độ pha loãng
và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện
diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu

Sơ đồ quy trình kiểm tra :

 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-2)+ 9ml
nước vô trùng nước vô trùng

Stomacher
10gr thực phẩm 10-2 10-3

+ 90ml NaCl 0.85%( 10-1 )

hình 1.1
Bước 1:
10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoặc là nước vô trùng, stomacher
thu được nồng độ 10-1. mục đích đồng nhất là để phân bố đều vi sinh vật.
Bước 2:
Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vật có trong mẫu ban dầu.
Lấy 1ml mẫu ơ nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm thư nhất, sau đó cho 9ml
nước vô trùng. Ta được ống nghiệm có nồng độ 10-2. Sau đó lấy 1ml mẫu ơ
nồng 10-2 cho vào ống nghiệm thư hai + 9ml nước vô trùng thu được ống
nghiệm có nồng độ 10-3 . tương tư như trên ta thu được các ống nghiệm có
nồng độ 10-4, 10-5…..
Bước 3:
Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ơ 3 nồng
độ liên tiếp(10-1,10-2,10-3) như sau : Mỗi nồng độ lấy 3 ống nghiệm. Cho vào
mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiệm sao
cho ngập ống durham. Ghi 3 nồng độ liên tiếp bên ngoài ống nghiệm(mỗi
nồng độ 3 ống nghiệm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ơ nồng độ 10-1
vào 3 ống nghiệm có ghi nồng độ 10-1(chứa môi trường LT),tương tư cho
các ống nghiệm ơ những nồng độ tiếp theo. (hình 1.1) ủ ơ 37oC/24h
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury
Trytose (LT):

-Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.

- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
Laury Trytose.
- Không lắc những ống có ống durham
Bước 4:
Đọc kết quả các ống Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xảy ra:
+ ống durham không thay đổi
+ ống durham nổi lên trên
+ ống durham sinh hơi.
 Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LT
dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấy
vòng nhúng vào môi trường LT dương tính ơ trên,rồi cho vào ống có môi
trường BGBL. Ghi nồng độ trên sản phẩm. U 37oC /24h.
Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc có
bọt khi trong ống chuông (thể tích bọt khi trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông).
Ống LT - : không có hiện tượng gi xảy ra
Bước 5:
Đọc kết quả ống BGBL dương tính. Lập tỷ lệ các ống BGBL dương
tính ơ 3 nồng độ liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng
+ ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống durham ( ống chuông)
nổi hoặc có bọt khi trong ống chuông( thể tích bọt khi =1/10 thể tích ống
chuông).
+ ống BGBL âm tính: không có hiện tượng gi xảy ra.
Bước 6:
Tính kết quả:
Tổng số coliform (cfu/g hoặc cfu/ml)= số MPN 10n
n là số nguyên dương của nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy.
Bước 7:
Tư kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh thực
phẩm.
4. Môi trường sử dụng:
Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiện và đếm
coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước.
Nguyên tắc:
 Mật bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram + và
–
vi khuẩn gram không phải coliform. Brilliant green có nồng độ đặc hiệu
nhằm ngăn vi khuẩn ki khi lên men lactose sinh trưởng ơ 440C , Tránh được
hiện tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường và
sinh khi trong ống durham do lên men lactose.
5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm
Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiệm ,nồi autoclave, tủ sấy,
ống durham , micropipet, mẫu là tương ơt.
6.Kết quả thí nghiệm

_ _ _

10-1

+ + _

10-2
 _ _ _

10-3
Tỷ lệ của BGBL dương tính ơ 3 nồng độ (10-1:10-2:10-3) = (0,2,0)
Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g
colif orm = 6.2 101=62 (cfu/ml)
BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI
Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển
được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+),
không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn
cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu
chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân
và chất lượng vệ sinh thực phẩm.

Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người :

- Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em.

- Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên
có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột.

- Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai.

- Các chủng gây lây nhiễm đường ruột.

1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm.

Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt.
2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ
kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có
ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh
hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha
loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng
hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu.

3.Dụng cụ và hóa chất:

3.1.Thiết bị và vật liệu:

- Tủ ấm

- Bể điều nhiệt

- Máy lắc

- Cân

- Pipet tiệt trùng

- Các bình chứa mẫu vô khuẩn

- Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy

- Mẫu thực phẩm kiểm tra

- Ống durham

3.2.Môi trường và hóa chất:

- Môi trường E.C broth

- Môi trường Lauryl tryptose( LT)

 - Môi trường endo agar

- Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar).

- Môi trường N.A (nutrient agar)

4.Tiến hành thí nghiệm:

Bước 1: Lấy mẫu

Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khối
lượng khác nhau cho phù hợp. Khi lấy mẫu cần đảm bảo :

- Mẫu phải có tính đại diện.

- Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học.
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn.
- Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ.
- Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơi
thu mẫu.
Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ

10-1

Bước 2: Pha loãng mẫu

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng:

10ml 1ml 1ml 1ml

Mẫu 90ml NaCl vô trùng 10-2 10-3 10-4

10-1 9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl

(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng

Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn:

 10ml 1ml 1ml 1ml

10g mẫu

Stomacher

90ml NaCl vô trùng 10-2 10-3 10-4

10-1 9ml NaCl 9ml NaCl 9ml NaCl
(nước vô trùng) vô trùng vô trùng vô trùng

Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác

Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu:

- Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi
trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng
vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường
dinh dưỡng.
- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Các
dụng cụ phải được vô trùng.
 - Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh
vật phân tán đều trong mẫu.
- Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet
khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các
tế bào ở độ pha loãng sau.
- Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:
Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảo
quản, quy trình chế biến...).
Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác....).
Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT)
Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độ
liên tiếp, 3 ống/ nồng độ, 1ml dịch pha loãng/ ống LT. Ủ 37ºC/24h.

10-2 10-3 10-4

Môi trường Laury Trytose( LT)

 Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm. Ủ ở 37oC trong
24h
Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kết
quả.
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury
Trytose (LT):

- Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
- Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường
Laury Trytose.
- Không lắc những ống có ống durham
Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền
các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C. Ủ 44ºC/24h.
E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bị
hạn chế khả năng sinh trưởng .Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá
vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột
Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoặc có
bọt khi trong ống chuông (thể tích bọt khi trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông).
Ống LT - : không có hiện tượng gi xảy ra
Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.B
agar. Ủ 37ºC/24h
Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar
và E.M.B agar:
Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.
 Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn
trên môi trường endo agar và E.M.B agar
Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình:
- Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại

- Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh
kim.

Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A. Ủ
37ºC/24h.
Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5
I : indol
M :methyl red
V : V.P
C : simon citrat
Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr–
có khả năng sử dụng simon citrat
Kết quả :
+ + - - : E.coli type I
- + - - : E.coli type II

BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1. Đặc điểm của Stapylococcus aureus:
1.1. lịch sử:
Staphylococcus được Ogston phát hiện năm 1881 trong vết thương có
mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu.
1.2. Phân bố:
 Được phân bố rộng rãi, có nhiều trong sản phẩm động vật như
thịt, sữa…
Ở người thường có trên da, tóc, khoang mũi.
Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh.
Được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội(opportunist type) vì sự có
mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận
lợi để xâm nhập.
1.3. Hình dạng tế bào:
Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ ý.
Trong vết thương và máu thường thấy hình dạng giống chùm nho
1.4. Đặc điểm và điều kiện sinh trưởng:
Phát triển tốt ở các môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt ở môi
trường thạch máu hoặc huyết thanh.
Nhiệt độ tối thích là 37oC , pHop=7.2.
Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ.
Ở môi trường lỏng, tế bào ở dạng cặn, vòng nhẫn mờ trong ống nghiệm ở bề
mặt môi trường .
1.5. Đặc điểm sinh hoá:
Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol,
manitol
Không lên men salicin, raffinose,inulin.
Có khả năng chịu mặn cao
Làm đông tụ sữa
Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu.
Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương.
1.6. Khả năng gây bệnh:
Gây ngộ độc thực phẩm:
 Bệnh gây ra do vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực
phẩm đó và bị ngộ độc. Không cần có sự hiện diện của vi khuẩn còn sống
trong thực phẩm mà chỉ cần có độc tố của chúng. Loại này thường có tính
chất cục bộ, ít có khả năng truyền nhiễm
Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có
vsv gây bệnh.
Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực
phẩm đó bị ngộ độc).
Bản chất của ngoại độc tố là protein nên chúng kém chịu nhiệt (trừ
độc tố của Staphylococcus aureus) và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc
hiệu(tính kháng nguyên mạnh) do vậy có thể phát hiện được bằng phản ứng
kháng nguyên – kháng thể.
Độc tố gây viêm dạ dày, viêm ruột. Type A và D gây ngộ độc thực
phẩm cho người.
Triệu chứng bệnh:
Khi ăn phải thực phẩm có chứa các độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc
vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt
bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8h, kiệt sức ở mức nghiêm trọng,
đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy ra sau 24 – 72 h, nạn
nhân không chết nhưng rất đau đớn do các phản ứng cực kỳ dữ dội.
Ít thấy vi khuẩn trong phân người bị ngộ độc.
Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố
này. 100oC/30’; 137oC/9’độc tố này vẫn còn hoạt lực.
Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối như Jambon, kem tổng hợp,
nước súp (ít khi được sử lý ở nhiệt độ >40oC) và các loại thuỷ sản, thực
phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv này.
 Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, quá
trình chế biến.

Biện pháp phòng ngừa:

Kiểm tra sức khoẻ công nhân.
Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú.
Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả năng sinh độc tố.
Hạ pH của thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển.
toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ các tế bào, một số bị phân huỷ ở to=
80oC /0.5h.
Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt
10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương
trên da ở người và động vật do Staphylococcus gây ra dùng dung
dịch gentiant violet 2%.
Một số hình ảnh về Staphylococcus aureus

2. Ý nghĩa của việc kiểm tra vi khuẩn:

Sự hiện diện với mật độ cao của Sta. Aureus trong thực phẩm chỉ thị
điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
3. Quy trình kiểm tra:
3.1. Quy trình kiểm tra định tính
Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml
nước vô trùng .stomacher.
Bước 2: tăng sinh: hút 1ml ở dịch đồng nhất đưa vào môi trường MSB có
màu đỏ. Ủ 37oC/ 24h. Sau đó đọc kết quả:
-Ống tăng sinh âm:có môi trường MSB vẫn giữ màu đỏ
-Ống tăng sinh dương: Có môi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng.
Bước 3: từ ống tăng sinh dương, cấy phân lập lên môi trường baird parker
agar (hoặc MSA). Ủ 37oC/24h.
Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình.
Trong môi trường Baird Parker: Sta. Aureus có đặc điểm tròn,
lồi, có tâm đen, bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc.
Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, vi
khuẩn tròn, bóng.
Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex, staphylatex, đọc kết
quả.
Bước 6: Kết luận.
3.2 Quy trình kiểm tra định lượng.
Bước 1: đồng nhất mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml
nước vô trùng .stomacher.
Bước 2:pha loãng mẫu tới các nồng độ thích hợp.
Bước 3:nuôi cấy 0.1 ml dịch mẫu /đĩa. 3 đĩa/ nồng độ, tiến hành thao tác
bằng que cấy trang. Nuôi cấy dịch mẫu trên môi trường baird parker. Ủ
37oC/ 48h.
Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình. Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình và 5
khuẩn lạc không điển hình rồi cấy chúng từ môi trường BPA sang môi
trường TSA.Ủ 37oC/ 24h.
Bước 5: cấy chuyển VK sang ống nghiệm có chứa 0.3 ml huyết tương thỏ.
Ủ 37oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau 1,3,6,24h.
-Phản ứng dương tính :có khối đông hình thành.
-Phản ứng âm tính: không có khối đông hình thành, dịch mẩu giống
như ban đầu.
Bước 6: tính kết quả
Số lượng Staphylococci coagulase dương tính:
cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha)
trong đó
cs:số lượng Staphylococci coagulase dương tính.
f: nồng độ pha loãng của mẫu
nt:tổng số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa
na:tổng số khuẩn lạc không điển hình trên các đĩa
ht=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ số khuẩn lạc điển hình
được thử nghiệm
ha=số khuẩn lạc không điển hình thử nghiệm cho kết quả +/ khuẩn lạc điển
hình được thử nghiệm
Chú ý : nếu số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng 20 – 200, đếm số khuẩn
lạc điển hình và không điển hình, sau đó tính kết quả như công thức trên và
ghi rõ trong biểu mẫu.
3.3 phản ứng sinh hoá Saulatex
Dùng để định danh cả giống và loài Sta.aureus.
Quy trình:
Bước 1:lấy dd muối vào tiêu bản
Bước 2: lấy Sta.aureus vào giọt nước muối trên tiêu bản , trộn đều nhuyễn.
Bước 3: lấy 1 giọt saulatex vào bên cạnh giọt nước muối .
Bước 4: kéo 2 giọt nước lại trộn đều với nhau .
Bước 5: Đọc kết quả:
- phản ứng dương tính:có màu trắng sữa,lợn cợn những hạt nhỏ
-phản ứng âm tính:màu trắng sữa như ban đầu
4. Mở Rộng :
4.1 môi trường sử dụng:
Môi trường Chapman agar(manitol salt agar):
Là môi trường chọn lọc dùng để phát hiện, phân lập và định lượng tụ
cầu khuẩn gây bệnh tronh thực phẩm như sữa, thịt , hải sản…cũng như các
sinh phẩm khác.
Các thí nghiệm của koch cho thấy tụ cầu khuẩn có thể chịu được nồng
độ muối cao 7.5%. Sau đó Chapman xác minh hiện tượng trên, đồng thời ghi
nhận tụ cầu khuẩn nào gây đông tụ huyết tương thỏ sẽ hình thành khuẩn lạc
vàng trên môi trường chapman agar, môi trường có khả năng ức chế hầu hết
vi khuẩn khác. Nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng hầu hết các loài vi
khuẩn trừ Staphylococcus.
Vi khuẩn lên men đường manitol sinh axit làm đổi màu chỉ thị (fenol
red)của môi trường từ đỏ sang vàng.
Xác định tất cả các loại khuẩn lạc có màu vàng hoặc màu trắng vói môi
trường xung quanh có màu vàng. Tuy nhiên, có thề lẫn các khuẩn lạc trong
giống Bacillus nên cần xác định các khuẩn lạc này bằng cách quan sát dưới
kính hiển vi.
Tụ cầu khuẩn gây bệnh sẽ tạo khuẩn lạc có sắc tố vàng, đồng thời môi
trường xung quanh đổi từ đỏ sang vàng.
tụ cầu khuẩn gây bệnh thường tạo khuẩn lạc nhỏ có màu đỏ và không làm
thay đổi màu môi trường.
Sau 48h nuôi cấy, vài chuẩn cầu khuẩn đường ruột Baciilus,
Micrococcus và Serratia cũng có thể mọc trên môi trường này.
Môi trường Baird parker agar
Là môi trường dùng để phân lập và định lượng vi
khuẩn .Staphylococcus trong thực phẩm, dược phẩm.
Công thức môi trường này do baird parker khai triển năm 1962 nhằm
định lượng Staphylocoagulase. Năm 1964, Smith và Baird Parker chứng
minh rằng khi bổ sung sulfamerthzine vào môi trường sẽ ức chế sinh trưởng
của vi khuẩn proteus. Năm 1971, Tardio và Baer quan sát trong 18 môi
trường phân lập chọn lọc thử nghiệm thì môi trường B.P ít gây ức chế hơn
các môi trường khác.
Thành phần môi trường có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức
chế các quần thể vi khuẩn thường hiện diện cùng Staphylococci trong khi đó
pyruvate và glycine kích thích sự phát triển của Staphylococci .
Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc điểm:Khuẩn lạc có màu đen do
khử telurite thành telurium, dạng lồi và tạo vòng trong xung quanh khuẩn
lạc,đường kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein. Sau đó có thể xuất hiện
1 vòng đục ở trong vòng trong (có tác động của lecithinase, một loại lipase).
Đây là một đặc tính thường thấy và có tính chuyên biệt ở các tụ cầu khuẩn
gây bệnh.
Đặc tính của Staphylococcus aureus sẽ được kiểm chứng qua phản
ứng coagulase và tốt nhất bằng các thử nghiệm desoxyribonuclease và
phosphatase.
Các loại vsv ngoại lệ khác có thể mọc trên môi trường này như:
Staphylococcus epidermis, Bacillus, Micrococci, nấm men.
 rất nhỏ, màu nâu tới đen. Micrococci
màu nâu sậm đục, mọc sau 48h. Bacillus sp
trắng. nấm men

Pastorex:
Là một thử nghiệm dùng để định danh S.aureus được thực hiện trực
tiếp với vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy đầu tiên.
Bằng phản ứng ngưng kết latex trên kính (latex đã được mẫn cảm với
huyết tương người), thử nghiệm cho phép phát hiện đồng thời 2 yếu tố: yếu
tố cụm “clumping factor” (một chất có ở bề mặt tế bào vi khuẩn và có ái lực
cao với fibrinogen) và protein A
Kết quả nghiên cứu với pastorex với 228 chủng Staphylococci cho
thấy:độ nhạy cảm 97.5%, độ đặc hiệu 92.5%.

BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO

PARAHAEMOLYTICUS
1.Giới thiệu chung
1.1.Lịch sử
Vibrio cholera : năm 1883,Robert Kock với vai trò là trưởng nhóm
nghiên cứu bệnh dịch tả đã phát hiện ra vi khuẩn này trong phân bệnh nhân
ở vụ đại dich tả lần thứ 5 ở vùng Alexandria,Ai cập
V.parahaemolyticus được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè
năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá ,hào…
Người ta đã xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio,trong đó có 4 loài
thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm : V.cholera,V.parahaemolyticus
,V.vulnificus,V.alginolyticus
1.2.Đặc điểm phân bố
 V.cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới cả chân Mỹ,gây
bệnh dịch tả cho một số vùng châu Á,Ấn Độ và Đông Nam Á.Chúng từng
gây đại dịch do lây truyền qua tiếp xúc, nước ,sữa,thực phẩm và côn trùng
V.parahaemolyticus là vi sinh vật biển,tồn tại tự nhiên trong nước
biển,thường gặp ở các loại hải sản loại nhuyễn thể và giáp sát trong nước
biển
Trừ V.cholera tồn tại trong nước ngọt,còn tất cả các loại Vibrio khác
đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập ở các vùng
nước ven biển
1.3.Đặc điểm hình thái
Là vi khuẩn Gram -,hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình
dấu phẩy,không sinh bào tử,di động nhờ 1 lông roi
1.4.Đặc điểm sinh trưởng và phát triển
T0op=370 C , pHop=8.6 ,sống kị khí tùy ý, có khả năng phát triển tốt
trên môi trường kiềm. V.cholera bị tiêu diệt ở nhiệt độ là t0=560C trong 30’,
trong điều kiện khô hạn,ánh sáng và các chất diệt khuẩn
1.5.Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
V.cholera sinh độc tố ruột và nội độc tố trong đường tiêu hóa,kích
thích nghiêm trọng màng nhày tạo ra dịch dạ dày,gây tiêu chảy nặng ,mất
nước,choáng,thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%.Biện pháp điều
trị tốt nhất là bổ sung nước và chất điện giải thay thế
Phần lớn các đợt dịch bệnh do V.parahaemolyticus gây ra thường vào
mùa hè,khi nước ở các thủy vực ấm lên.Các triệu chứng như tiêu chảy,nôn
mửa,hơi ớn lạnh,đau đầu xuất hiện sau 12 h sau khi ăn một lượmg lớn vi
sinh vật sống (105 tế bào/g).Cá triệu chứng trên tương tự như triệu chứng do
Salmonella gây ra nhưng trầm trọng hơn.Salmonella tác dụng lên vùng bụng
trong khi V.parahaemolyticus tác dụng lên dạ dày người bệnh
2.Quy trình kiểm tra
Bước 1:
Tăng sinh 25 g thực phẩm ( mắm tôm) + 225ml peptone kiềm,
stomacher . Ủ 370C/24h
Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu,vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn
là 25g.Và cũng chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio
sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm
Bước 2 :
Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS
agar.Ủ370C/24h
Bước 3 : nhận diện khuẩn lạc điển hình
Vi sinh vật Đặc điểm
Vibrio cholera Vàng,chuyển màu môi trường từ xanh sang
vàng,dẹp,2-3mm
Vibrio parahaemolyticus Không màu,tâm xanh lá cây đậm hơn màu
môi trường,3-4mm
Vibrio alginolyticus Khuẩn lạc vàng lớn
Vibrio fluvialis,V.vulnificus Khuẩn lạc vàng lớn
Pseudomonas,Aeromonas Khuẩn lạc xanh dương
Các loại vk đường ruột khác Khuẩn lạc nhỏ ,trong suốt

Bước 4: từ khuẩn lạc nghi ngờ,cấy chuyền sang môi trường N.A. Ủ 370 C /
24h
Bước 5 : lấy vi khuẩn trên môi trường N.A làm khánhg huyết thanh
Vibrio ,đọc kết quả phản ứng ngưng kết hoặc làm BIS 14 GNE, ủ rồi đọc kêt
quả
-Huyết tương thỏ bị đông lại sau 30 phút khi cấy vi khuẩn vào.Trên
vách tế bào bi khuẩn có chứa protein A và enzyme
 - BIS 14 GNE gồm 14 phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Gr
- ,có 10 giếng (giếng 8 có 2 phản ứng là phản ứng sinh H2S và phản ứg
Indol) và 3 phản ứng bên ngoài.Trong đó MOB kiểm tra khả năng di động
của vi khuẩn

MOB- MOB+(mọc lan nhòe

trên đường cấy)
3.Môi trường sử dụng
Môi trường TCBS agar là môi trường chọn lọc để phân lập Vibrio
cholera và các loài Vibrio gây bệnh đường ruột khác ( đặc biệt là Vibrio
parahaemolyticus) trong các mẫu bệnh phẩm hoạc trong các mẫu thực phẩm
,hải sản
Nồng độ cao các chất thiosulfate và sodium citrate cùng với tính kiềm
sẽ ức chế tương đối sự phát triển của vi khuẩn đường ruột
Mật bò và muối mật làm chậm sinh trưởng cầu khuẩn đường ruột và
ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram +
Sự acid hóa môi trường do Vibrio lên men saccharose làm thay đổi
màu của chỉ thị bromothymol blue sang vàng
Hydrogen sulfide sinh ra do sư hiện diện của thiosulfate và ferric
citrate,tất cả các loài Vibrio đều không sinh H2S
 Các vi khuẩn khác cũng có thể mọc trên TCBS agar như : E.coli
,Salmonella typhy, Klebsiella,Shingella…nhưng những khuẩn lạc này không
có màu vàng

MỤC LỤC

Trang
BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT 1
HIẾU KHÍ
1.Định nghĩa 1
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí 1
3.Quy trình kiểm tra 1
4.Môi trường sử dụng 4
BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SÔ COLIFORM 5
1.Những kiến thức chung về COLIFORM 5
2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu 7
3.Quy trình kiểm tra 7
4. Môi trường sử dụng 10
5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm 11
6.Kết quả thí nghiệm 11
BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI 12
1.Mục đích thí nghiệm 12
2. Nguyên tắc 12
3.Dụng cụ và hóa chất 12

4.Tiến hành thí nghiệm 13

BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18

1 Đặc điểm của Stapylococcus aureus 18
2. Ý nghĩa của việc kiểm tra vi khuẩn 21
3. Quy trình kiểm tra 21
4. Mở Rộng 24
BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO 26
PARAHAEMOLYTICUS
1.Giới thiệu chung 26
2.Quy trình kiểm tra 27
3.Môi trường sử dụng 29