LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

ISOLASI PROTEIN

Disusun oleh :
Kelompok 1

Junaida Afifa, 0906487852

Aditya Noor Dwiprakoso, 1006658101
Ahdinar Rosdiana Dewi, 1006658120
Alfiani Mar’atussalehah, 1006658133
Alvin Bramantyo, 1006658146
Ervandy Rangganata, 1006658266
Fachrul Tamrin, 1006658272
Faizah Khusnayain Wijayanti, 1006658285
Fauzan Hertrisno Firman, 1006658291
Grasella Angelika Putri, 1006658303
M. Ikhsan R. H., 0806451441

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA

Jakarta/2010-2011

1
 PENDAHULUAN

Protein adalah molekul organik terbanyak yang terdapat dalam sel. Fungsi
protein antara lain memicu kontraksi dalam melakukan gerak dan memicu
terjadinya berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula
berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian sel
sendiri. Selain itu protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang
tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang
diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri.
Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino yang
terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein jenis apapun dan berasal dari
makhluk apapun tersusun atas 20 asam amino. Jadi sebenarnya perbedaan antara
protein yang satu dengan yang lainnya disebabkan oleh jumlah dan kedudukan
asam-asam amino di dalam tiap-tiap molekul.
Molekul protein berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen
dan membentuk mantel air. Dikarenakan molekul protein besar, maka di dalam air
protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi
encer sangat meningkatkan kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yakni
kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan
elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain sifat tersebut,
protein juga mempunyai sifat lain yang berperan penting dan menjadi dasar dalam
pemisahan protein yaitu ukuran molekulnya yang berbeda-beda sebagai akibat dari
perbedaan jumlah asam amino penyusun protein serta muatan yang dikandungnya.
Sifat-sifat protein tersebut menjadi dasar pemisahan protein yang digunakan
untuk deteksi atau diagnosis molekuler. Pemisahan protein dapat dilakukan dengan
tiga cara, yaitu kromatografi gel, elektroforesis, dan salting out
Kromatografi gel berfungsi sebagai proses pemisahan protein berdasarkan
berat dan ukuran molekul. Cara ini juga sering disebut kromatografi kolom dan
size exclusion chromatography karena menggunakan butirn sintetik yang memiliki
diameter dan ukuran pori-pori tertentu sebagai penyaring molekul. Molekul yang
berukuran kecil akan mudah masuk ke pori-pori dan menjadi lambat berjalan
keluar dari kolom, sedangkan molekul dengan ukuran lebih besar akan lebih sulit
masuk ke pori-pori dan langsung menuju ke luar, sehingga hasil kromatografi akan

2
menunjukkan urutan pengeluaran molekul mulai dari yang terbesar hingga yang
terkecil.
Dasar dari proses elektroforesis adalah fakta bahwa protein adalah
makromolekul yang terdiri dari asam amino yang terikat secara kovalen. Setiap
protein dibedakan dari muatan elektronnya yang berikatan secara kovalen atau
ionik. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan dengan pH tertentu dapat
mengandung protein dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Sebab, susunan dan
jumlah asam amino setiap protein tidaklah sama.
Apabila larutan protein diletakkan dalam suatu medan listrik, tiap protein
akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari muatan yang dikandung protein
tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke anode yang adalah
kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak bermuatan tidak akan bergerak.
Suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan
membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata di antara
molekul-molekul air. Adanya muatan listrik pada molekul terlarut sangat
membantu kelarutan karena muatan yang sama saling menjauhi sehingga agregasi
molekul tidak terjadi. Inilah yang mendasari proses salting out. Setiap keadaan
yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein sangat
mengurangi kelarutan protein sehingga protein mengendap. Pada percobaan salting
out, larutan garam bivalen lebih efisien dalam mengendapkan protein karena
berdisosiasi menjadi tiga ion yang berinteraksi sempurna dengan air. Globulin
dapat diendapkan dengan ammonium sulfat setengah jenuh, sedangkan albumin
dapat diendapkan oleh ammonium sulfat jenuh, tidak dapat mengendap dengan
NaCl jenuh, kecuali dengan penambahan asama mineral yang sangat kecil.

3
 TUJUAN PRAKTIKUM
1. Mengenal reaksi umum suatu protein untuk melacak protein dalam suatu
bahan.
2. Memisahkan protein dengan metode salting out dan mampu menjelaskan
mekanismenya.
3. Melakukan pemisahan protein secara reversible, dengan menggunakan
bahan higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut.
4. Melakukan pemisahan protein secara denaturasi ireversibel dengan
menggunakan pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan
mampu melakukan untuk melacak protein.
5. Memperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan
mendenaturasi protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh
logam berat sebagai pencemar lingkungan.
6. Mengetahui cara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun suatu
senyawa lain, berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan
cara kromatografi gel penyaring molekul sederhana.

4
 PRAKTIKUM BIOKIMIA I
SALTING OUT

PRAKTIKUM UJI BIURET

I. Tujuan
Memperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang
bereaksi positif dengan uji biuret dan reaksi ini tidak terjadi pada makro
molekul lain (menguji adanya kandungan protein dalam suatu bahan).

II. Dasar Teori

Ikatan-ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam
larutan bersuasana alkali akan bewarna lembayung bila direaksikan dengan
Cu2+.

III.Bahan dan Pereaksi

1. Bahan yang diuji (pada praktikum I : serum)
2. NaOH 10%
3. CuSO4 0,1 % ± 10 tetes (hingga larutan berubah warna menjadi
lembayung atau biru)

PRAKTIKUM SALTING OUT

I. Tujuan
Memperlihatkan bahwa protein sebagai makromolekul yang larut
dalam bentuk koloid dapat dipisahkan satu sama lain dengan menggunakan
larutan garam divalent konsentrasi tinggi.

II. Alat dan Bahan

- Alat
o Tabung reaksi
o Kertas saring
o Batang pengaduk
o Pipet tetes

5
 o Corong
o Rak tabung reaksi
- Bahan
o Serum Sapi 10 mL.
o Larutan amoonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh
o Kristal amonium sulfat
o Larutan NaOH 10%
o Larutan CuSO4 0,1%
o Larutan NaCl 0,9%

III.Cara Kerja
1. Siapkan tabung reaksi, gelas ukur, pipet, dan kertas saring.
2. Ambil 20 mL bovine serum tambahkan dengan 20 mL
larutan amonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh.
3. Putar gelas tersebut namun tidak boleh sampai berbusa.
4. Kemudian larutan terebut disaring dengan kertas saring.
5. Ambil 1 mL filrat 50%. Kemudian, lakukan uji Biuret 
Tabung 1.
6. Ambil sedikit presipitannya (presipitate 50%), tambahkan 1
mL NaCl 0,9%. Kemudian, lakukan uji Biuret  Tabung 2.
7. Sisa filtrat ditambahkan kristal amonium sulfat (NH4)2SO4
sampai jenuh (kristal tidak dapat larut lagi) lalu disaring.
8. Ambil 1 mL filtrat 100%. Kemudian, lakukan uji Biuret 
Tabung 3.
9. Ambil sedikit presipitannya (presipitate 100%), tambahkan 2
mL NaCl 0,9%. Kemudian, lakukan uji Biuret  Tabung 4.

IV. Dasar Teori

Dalam melakukan berbagai studi maupun tes di laboratorium, sering
kali diperlukan protein tertentu yang murni dari pelarut maupun molekul lain.
Teknik purifikasi dan isolasi protein yang klasik digunakan ialah teknik salting
out. Awalnya, teknik ini umum digunakan dalam usaha fraksinasi protein.

6
Namun, metode ini tidak memberikan tingkat diskriminasi yang tinggi dan
jarang memberikan hasil berupa fraksi yang murni. Sekarang, metode salting
out ini digunakan sebagai cara yang cukup murah untuk mengkonsentrasikan
ekstrak protein dari sebuah larutan.1
Solubilitas protein dalam sebuah larutan dipengaruhi oleh konsentrasi
garam yang ada di dalam larutan tersebut. Efek ini muncul karena adanya
interaksi antara ion-ion garam dengan gugus bermuatan pada protein. Adisi
garam ke dalam larutan bisa menyebabkan dua hal yang berbeda. Pada
beberapa larutan dengan protein yang tidak dapat atau sulit untuk larut dalam
akuades, adisi garam dalam jumlah kecil bisa menyebabkan protein tersebut
larut. Fenomena ini disebut salting in. Apabila adisi garam dilanjutkan, akan
terdapat suatu titik dimana adisi lebih lanjut dari garam tidak akan menambah
solubilitas protein, malah akan menyebabkan presipitasi dari protein.
Fenomena ini disebut salting out. 2
Garam yang paling sering digunakan dalam metode ini adalah
ammonium sulfat [(NH4)2SO4]. Penggunaan ini didasarkan pada fakta bahwa
secara empiris, anion polivalen lebih efektif daripada anion univalen dalam
salting out. Sedangkan, kation polivalen cenderung menghilangkan efek dari
anion polivalen. Dapat disimpulkan bahwa kombinasi terbaik bagi garam yang
akan digunakan untuk salting out ialah kombinasi antara anion polivalen dan
kation univalen. Anion-anion sendiri dapat disusun berdasarkan efektivitasnya
dalam proses salting out (Hofmeister series). Urutan daripada anion dari
efektivitas tinggi ke rendah yakni:
Sitrat > Sulfat > Fosfat > Klorida > Nitrat > Tiosianat

Dari Hofmeister series ini, sitrat adalah anion terbaik yang dapat
digunakan dalam salting out. Namun, ammonium sulfat [(NH4)2SO4] lebih
umum digunakan karena solubilitasnya yang tinggi dan kemudahan
mendapatkan bentuk murninya dengan biaya rendah. Selain itu, ammonium
sulfat tidak memiliki efek toksik terhadap berbagai enzim. Hofmeister series
juga merupakan susunan anion berdasarkan efek stabilisasi terhadap protein.
Semakin ke kiri maka tingkat kosmotropy (kemampuan stabilisasi protein)

7
 semakin meningkat sedangan semakin ke kanan tingkat chaotropy
(kemampuan destabilisasi protein) semakin meningkat.1,2
Proses salting in, faktor yang memainkan peran penting ialah ionic
strength dari garam yang digunakan. Ionic strength dapat dirumuskan sebagai
berikut:

ci = konsentrasi dari tiap ion garam (mol/liter)

zi = muatan dari setiap ion garam.
Ionic strength berefek pada konsentrasi garam yang rendah (0->0,2M).
Pada ionic strength lemah, solubilitas protein berada pada tingkat minimum
pada pI protein. Pada pH ini, gaya elektrostatis intramolekular antara rantai
samping asam amino berada pada tingkat maksimum dimana konformasi
protein sangat ketat dan hidrasi protein pada tingkat minimum. Pada pH selain
pI, titrasi dari gugus-gugus yang bisa diionisasi mengarah pada pengurangan
interaksi intramolekular. Hal ini mengakibatkan struktur protein lebih
terelaksasi dan solubilitas serta hidrasi protein meningkat. Adisi garam
memiliki efek yang sama dengan perubahan pH. Kedua efek ini bersifat
kumulatif.1,3

Grafik 1. Kurva solubilitas protein terhadap pH pada penambahan garam.1

Pada konsentrasi lebih dari 0,2 M, sifat kosmotropy berperan dalam
mengurangi solubilitas protein. Peran kosmotrop dalam menstabilisasi protein
terletak pada efeknya yang membuat struktur protein menjadi lebih ketat dan
kompak. Proses kerja garam (khususnya ammonium sulfat) dalam stabilisasi

8
protein bisa dijelaskan berdasarkan interaksi hidrofobik protein. Amonium
sulfat yang ditambahkan ke dalam larutan dapat dilarutkan dengan cepat oleh
air karena afinitasnya yang tinggi. Pada adisi lebih lanjut, jumlah molekul air
yang tersedia untuk melarutkan ammonium sulfat semakin berkurang hingga
mencapai pada suatu titik dimana semua molekul air telah habis terpakai. Pada
adisi lebih lanjut, molekul air akan terikat lemah pada gugus hidrofobik protein
untuk digunakan dalam pelarutan garam. Hal ini menyebabkan bagian
hidrofobik protein terekspos pada air dan untuk mengurangi efek ini, protein
membentuk agregat yang kompak dan stabil.1,2,3
Perubahan solubilitas protein pada proses salting in atau salting out
dapat diprediksi dengan menggunakan persamaan semiempiris Cohn, yaitu:

Cs = Solubilitas protein di dalam air.

C’s = Solubilitas protein dalam larutan garam.
β = Rasio solubilitas protein pada titik isoionik.
I = Ionic strength garam.
Ks = Konstanta.
Perlu diperhatikan bahwa efek salting in dan salting out berlangsung
secara bersamaan pada adisi garam. Dengan mempertimbangkan hal ini,
persamaan semiempiris Cohn dapat diturunkan menjadi:

Kin = konstanta salting-in.

Kout = konstanta salting-out.
Apabila tingkat salting-out lebih besar, solubilitas protein akan
menurun. Sebaliknya, apabila tingkat salting-in lebih besar, solubilitas protein
akan naik.3
Suatu molekul yang larut dalam air berarti molekul tersebut bereaksi
dengan air dengan membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut
tersebar merata diantara molekul air. Dengan adanya muatan dalam molekul

9
air, akan meningkatkan kelarutan karena adanya muatan yang saling menjauhi
dan mencegah terbentuknya agregasi molekul.
Protein adalah senyawa yang mempunyai berat molekul yang besar dan
mudah larut. Protein dapat mudah larut karena protein mempunyai gugus –
NH- dan –CO- yang ada pada ikatan peptida yang dapat berikatan dengan air.
Pada muatan yang sama dalam 2 partikel molekul protein yang sama akan
bertolakan sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein (salting in).
Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul
protein sangat mengurangi kelarutan protein sehingga protein menjadi
mengendap. Pada larutan berkonsentrasi tinggi, menetralkan muatan pada
protein sehingga membuat protein mengendap. Namun perubahan ini bersifat
reversibel karena cara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein
namun protein sendiri tidak mengalami perubahan struktur.
Protein dalam serum darah hanya albumin dan globulin. Kedua protein
dalam serum darah ini memiliki muatan dan berat jenis yang berbeda. Dalam
serum sudah tidak mengandung fibrinogen lagi, sehingga apabila serum
dibiarkan tidak akan mengalami koagulasi.
Larutan garam divalen lebih efisien dalam mengendapkan protein
karena di dalam air garam tersebut berdisosiasi menjadi 3 ion yang berinteraksi
sempurna dengan air, sebagai contoh:
- Globulin dapat diendapkan oleh (NH4)2SO4 setengah jenuh sedangkan NaCl
baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada dalam larutan jenuh.
- Albumin baru akan mengendap oleh (NH4)2SO4 jenuh dan tidak dapat
diendapkan dengan NaCl jenuh kecuali dengan penambahan asam mineral
dalam jumlah yang sangat kecil.
Amonium sulfat digunakan karena mudah larut sehingga dapat
diperoleh amonium sulfat dengan range konsentrasi yang cukup luas.
Urutan efektivitas anion garam yang digunakan untuk salting out dari
yang terbesar adalah sitrat, fosfat, sulfat, asetat / klorida, nitrat, dan thiosianat.

V. Hasil
Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4
Presipitat 50% Filtrat 50% Presipitat 100% Filtrat 100%

10
Uji biuret + + ++ -
Tabel 1. Hasil Pengamatan Praktikum Isolasi Protein
Keterangan tabel:
+ = berwarna ungu, jumlah tanda (+) menunjukkan intensitas.
- = berwarna biru
Hasil percobaan salting out ini menunjukkan bahwa pada Tabung 1
(presipitat 50%) larutan berubah warna menjadi warna ungu. Begitu
pula pada Tabung 2 (filtrat 50%), larutan berubah menjadi warna ungu.
Pada Tabung 3 (presipitat 100%), larutan berubah warna menjadi
warna ungu yang lebih pekat dibandingkan tabung 1 dan tabung 2.
Sedangkan, pada Tabung 4 (filtrat 100%), larutan berubah warna
menjadi biru.

VI. Analisis
Tabung Warna Hasil uji biuret Analisis
1 Lembayung (Merah) + Mengandung globulin
2 Lembayung (Merah) + Mengandung albumin
3 Lembayung (Merah) + Mengandung albumin
4 Biru - Tidak mengandung protein
Tabel 2. Analisis Hasil Pengamatan Praktikum Isolasi Protein
Endapan I, merupakan presipitat 50% yang kemudian diencerkan
dengan menambahkan NaCl 0,9 % sebanyak 2 ml dan dilakukan uji biuret
kepada endapan tersebut. Dilakukan uji biuret dengan menambahkan 2 ml
NaOH 10% kedalam larutan setengah jenuh (presipitat 50%) dan kemudian
ditambahkan CuSO4 0,1 % tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna
pada larutan. Setelah ditetesi CuSO4 larutan berubah warna menjadi ungu yang
menandakan bahwa di dalam larutan tersebut terdapat protein globuler. Hal ini
dikarenakan berat dan ukuran protein globulin lebih besar dibanding protein
albumin sehingga pada proses pengendapan setengah jenuh protein globulin
tidak dapat melewati kertas penyaring.
Filtrat I, merupakan filtrat 50% yang kemudian diencerkan dengan
menambahkan NaCl 0,9% sebanyak 2 ml kemudian dilakukan uji biuret. Uji
biuret dilakukan dengan menambahkan NaOH 10% sebayak 2 ml dan
kemudian ditambahkan CuSO4 tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna
pada larutan. Setelah diberikan CuSO4 tetes demi tetes, larutan berubah warna

11
menjadi ungu yang membuktikan adanya protein yang terkandung dalam
larutan tersebut. Protein yang terkandung dalam larutan tersebut ialah
Albumin, sebab albumin tidak mengendap pada larutan setengah jenuh
sehingga akan melewati kertas penyaring sehingga akan tetap berada dalam
filtrat.
Pemberian amonium sulfat pada tahap 2 menyebabkan sebagian protein
larut air (salting in) dan lolos dari kertas saring sedangkan sebagian lainnya
tertahan. Hal ini juga yang memberikan intensitas warna ungu yang mirip pada
tabung 1 dan 2.
Endapan II, merupakan presipitat 100% yang kemudian diencerkan
dengan menambahkan NaCl 0,9 % sebanyak 2 ml dan dilakukan uji biuret
kepada endapan tersebut. Dilakukan uji biuret dengan menambahkan 2 ml
NaOH 10% kedalam larutan jenuh (presipitat 100%) dan kemudian
ditambahkan CuSO4 0,1 % tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna
pada larutan. Setelah ditetesi CuSO4 larutan berubah warna menjadi ungu yang
menandakan bahwa di dalam larutan tersebut terdapat protein. Warna ungu
pada presipitat 100% ini lebih pekat dibandingkan warna ungu pada presipitat
50%. Semakin kuat intensitas warna ungu yang dihasilkan, semakin besar
konsentrasi protein. Ini berarti tabung 3 (Presipitat 100%) memiliki larutan
yang memiliki protein dengan konsentrasi lebih besar dibandingkan tabung 1
dan tabung 2 karena tabung 3 berasal dari filtrat 50% yang diberi ammonium
sulfat hingga jenuh (terjadi presipitasi protein, salting out). Tabung 3
(Presipitat 100%) ini mengandung protein albumin.
Filtrat II, merupakan filtrat 100% yang kemudian diencerkan dengan
menambahkan NaCl 0,9% sebanyak 2 ml kemudian dilakukan uji biuret. Uji
biuret dilakukan dengan menambahkan NaOH 10% sebayak 2 ml dan
kemudian ditambahkan CuSO4 tetes demi tetes hingga terjadi perubahan warna
pada larutan. Setelah diberikan CuSO4 tetes demi tetes, larutan berubah warna
menjadi biru yang membuktikan bahwa tidak ada protein yang terkandung
dalam larutan tersebut. Perubahan warna biru pada larutan menunjukkan tidak
adanya ikatan peptida pada larutan yang diuji, seperti pada tabung 4.
Ditemukannya albumin pada presipitat 100% sedangkan globulin tidak
disebabkan oleh dua hal, yakni berat molekul dan konsentrasi kedua protein

12
 tersebut. Protein albumin memiliki berat molekul yang lebih besar daripada
berat molekul globulin (Berat molekul albumin serum adalah 69 kDa
sedangkan β2-mikroglobulin memiliki berat molekul 11.5 kDa). Hal tersebut
terkait pula dengan tingkat konsentrasi kedua protein dalam plasma.
Konsentrasi albumin serum dalam plasma adalah 35 – 45 mg/ml sedangkan
konsentrasi β2-mikroglobulin dalam plasma adalah 0.0013 mg/ml. Tingginya
konsentrasi albumin serum dalam plasma mengindikasikan keberadaannya
dalam fase presipitat 100% sedangkan rendahnya konsentrasi β2-
mikroglobulin dalam plasma mengindikasikan keberadaannya dalam fase
filtrat 100% yang nol (tidak ada).

VII. Kesimpulan
Tabung 1,2 dan 3 berubah warna menjadi ungu setelah diuji dengan uji
biuret menunjukkan adanya protein. Intensitas warna ungu yang lebih kuat
pada tabung 3 menunjukkan larutan pada tabung 3 memiliki konsentrasi
protein yang lebih besar dibandingkan tabung 1 dan tabung 2. Tabung 3
menunjukkan perubahan warna menjadi biru sebagai tanda bahwa tidak ada
protein pada larutan ini.
Globulin merupakan protein yang berukuran lebih besar sehingga dapat
dipisahkan pada penyaringan pertama. Albumin berukuran lebih kecil daripada
globulin sehingga bovine serum harus diberi garam sampai jenuh untuk dapat
dipisahkan. Pada campuran setengah jenuh, presipitan mengandung globulin
dan filtrat mengandung albumin. Pada campuran jenuh, presepitan
mengandung albumin dan filtrat tidak mengandung protein.

REFERENSI
1. Dennison C. A Guide to Protein Isolation. 2nd Edition. Dordrecth: Kluwer
Academic Publishers; 2003. p. 74-81.
2. Ghosal S, Srivastava AK. Fundamentals of Bioanalytical Techniques and
Instrumentation. New Delhi: PHI Learning Private; 2009. p.75-78,
3. Kaul RH, Mattiason B. Isolation and Purification of Protein. New York:
Marcel Dekker, Inc; 2003.p. 256-261,

13
 PRAKTIKUM BIOKIMIA II
KROMATOGRAFI GEL PENYARING

I. Tujuan
Memisahkan molekul hemoglobin dari molekul vitamin B12 dengan
menggunakan butiran-butiran mikroskopis dekstran (suatu bentuk polimer dari
glukosa) sebagai penyaring molekuler.

II. Dasar Teori

Kromatografi merupakan salah satu cara yang sering digunakan untuk
memisahkan / mengisolasi molekul-molekul biologi seprti protein. Istilah
Istilah ini diciptakan Tswett (1906) dari bahasa Yunani chroma yang berarti
warna. Ia memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain dalam tanaman
dengan menggunakan tabung (kolom) yang diisi padat dengan kalsium
karbonat sebagai adsorben. Ekstrak tanaman dimasukkan ke dalam kolom dan
bila dialirkan pelarut organik yang sesuai, pigmen-pigmen dalam ekstrak
bergerak turun dari kolom dengan kecepatan yang berbeda-beda dan masing-
masing terpisah membentuk cincin atau pita berwarna. Kemudian ternyata
bahwa cara ini juga dapat juga digunakan untuk memisahkan molekul yang
tidak berwarna.
Pada pemisahan molekul dengan teknik kromatografi, molekul-molekul
yang akan dipisahkan terdistribusi antara dua fasa zat, yaitu fasa stasioner
yang tidak bergerak dan fasa mobil yang bergerak. Fasa stasioner data berupa
zat padat atau cairan, sedangkan fasa mobil mungkin suatu cairan atau gas.
Fasa mobil disebut juga eluen dan proses pergerakan suatu molekul sepanjang
fasa stasioner yang disebabkan oleh eluen disebut elusi. Hasil pemisahan
dengan teknik kromatografi disebut kromatogram.

Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan molekul-molekul dari
campurannya dengan melewatkan larutan yang mengandung molekul-molekul
yang akan dipisahkan tersebut melalui kolom yang berisi matriks padat sebagai
fasa stasioner. Sifat matriks dapat dibuat sedemikian rupa, sehingga

14
memungkinkan pemisahan selektif molekul-molekul tersebut. Sifat ini antara
lain: kelarutan, ukuran, atau muatan molekul.
Pada kromatografi kolom yang klasik, umumnya digunakan tabung gelas
berdiameter 1 cm atau lebih, dengan panjang sekitar 10 – 30 cm. Adsorben
berupa partikel-partikel mikroskopis dipadatkan pada kolom membentuk fasa
stasioner. Laju aliran eluen diatur dengan keran (pengatur aliran), biasanya
sekitar 1 mL/menit.
Sampel, yang berupa larutan yang mengandung campuran molekul-
molekul, dituang ke dalam kolom dan molekul-molekul dipisah dengan
mengalirkan eluen yang sesuai. Elusi berlangsung sampai molekul-molekul
keluar satu-persatu dari kolom. Fraksi-fraksi yang terdiri dari beberapa
milliliter eluen yang keluar dari kolom ditampung dalam tabung-tabung secara
manual atau menggunakan kolektor otomatis. Deteksi fraksi yang mengandung
molekul-molekul itu dilakukan dengan cara membandingkan volume retensi
(VR) dengan waktu retensi (tR) molekul-molekul tersebut dengan standar yang
telah diketahui. Volume retensi adalah volume eluen yang diperlukan untuk
mengelusi suatu molekul pada kadar maksimumnya, sedangkan waktu retensi
menyatakan waktu yang diperlukan untuk mengelusi molekul pada kadar
maksimumnya. Selanjutnya penetapan kuantitatif molekul-molekul dapat
dilakukan dengna cara titrasi, spektofotometri atas metoda analisis lain.

Kromatografi Gel Penyaring

Pada teknik ini, protein/molekul lain dipisahkan dari campurannya
berdasarkan perbedaan berat atau ukuran molekul. Cara ini disebut juga
molecular sieve chromatography atau size exclusion chromatography karena
butiran sintetis dengan diameter dan ukuran pori-pori tertentu yang dipadatkan
pada kolom bekerja sebagai penyaring molekuler.
Bila larutan yang mengandung campuran protein dilewatkan pada kolom,
molekul yang lebih kecil dapat masuk ke pori-pori sehingga relatif tertahan
dan lebih lambat keluar dari kolom, sedangkan molekul yang lebih besar dari
pori-pori terus lewat di sela butiran penyaring sehingga lebih cepat keluar dari
kolom. Penyaring molekuler yang biasa digunakan adalah gel dekstran atau
poliakrilamid yang tersusun dari butiran mikroskopis.

15
 Dalam percobaan ini, digunakan butiran-butiran mikroskopis dekstran,
suatu bentuk polimer dari glukosa, dengan ukuran terterntu yang seragam,
sebagai fasa stasioner atau matriks pemisah. Dekstran yang menyusun butiran
mikroskopis tersebut teranyam sedemikian rupa, sehingga mempunyai mata
anyaman dengan ukuran terterntu pula. Partikel yang larut dalam fasa mobil
dan dengan ukuran lebih kecil dari mata anyaman tersebut akan terperangkap
lagi dalam butiran yang lain, demikian seterusnya. Sebaliknya, molekul
dengan ukuran lebih besar dari mata anyaman tidak terperangkap dan mengalir
dalam cairan di antara partikel-partikel tersebut. Akibatnya, molekul dengan
ukuran lebih besar dari mata anyaman tersebut menempuh jalan yang lebih
pendek dan keluar lebih dahulu dari kolom pemisah.

III.Alat dan Bahan

Alat:
a. Kolom berisi gel penyaring molekul
b. Tutup atas dan bawah dari dapar kolom
c. Pipet tetes
d. Tabung reaksi
e. Rak tabung reaksi
f. Spetrofotometer
Bahan:
a. Larutan yang akan dipisahkan, mengandung Hemoglobin dan Vitamin
B12
b. Dapar kolom (Buffer NaCl 0.1 M + azida)

IV. Cara Kerja

1. Menyiapkan 16 tabung reaksi yang digunakan sebagai penampung.
Setiap tabung ditandai dengan angka 1-16. Tabung ke-16 digunakan
untuk menampung sisa dapar kolom yang tidak terpakai dan ditandai
dengan “sisa”.
2. Membuka penutup atas dan penutup bawah dari kolom pemisah.
Kemudian, dapar kolom ditampung ke dalam tabung ke-16 (yang

16
 berlabel “sisa”) sampai hampir seluruh dapar keluar dan berada di batas
dekstran. Setelah itu, bagian bawah dari dapar kolom ditutup kembali.
3. Menempatkan kolom ke tabung nomor 1.
4. Meneteskan 3 tetes campuran HB dan vitamin B12 tepat di atas
permukaan gel dengan menggunakan pipet tetes. Penetesan dilakukan
dengan tidak mengganggu permukaan gel.
5. Menambahkan dapar kolom berupa buffer NaCl 0.1 M dan azida
secukupnya ke atas permukaan gel dalam kolom secara perlahan-lahan.
Setelah itu, penutup kolom bagian bawah dibuka.
6. Menampung fraksi 5 tetes dalam setiap tabung penampung.
Permukaan gel tidak boleh kering sehingga penampungan frkasi
dilakukan sambil menambahkan dapar kolom terus sedikit demi sedikit
ke permukaan gel.
7. Menutup kembali kolom pemisah bagian bawah dengan penutup
bagian bawah.
8. Mengamati dan mencatat warna dan intensitas setiap fraksi apakah
berwarna coklat, merah, ataupun tidak berwarna.
9. Menambahkan NaCl 0.1 M sebanyak 1 mL ke dalam masing-
masing tabung, yaitu tabung nomor 1-15.
10. Mengukur dan mencatat nilai absorban dari fraksi yang telah
ditambah NaCl 0.1 M dari setiap tabung (1-15) dengan menggunakan
alat spektrofotometer dengan λ 540 nm.

V. Hasil percobaan:
Tabel Warna, Intensitas dan Serapan Fraksi

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8
orang pink
benin benin merah kecoklat pink
Warna merah e mud
g g gelap an terang
muda a
Intensitas + + ++ + + + +++ ++
Serapan 0.01 0.26 1.12 0.44 0.13 0.08 0.18 0.17

Tabung 9 10 11 12 13 14 15

17
 pink
Warna bening bening bening bening bening bening
pudar
Intensitas + + + + + + +
Serapan 0.04 0.03 0.03 0.03 0.01 0.00 0.00

Kurva Pengukuran Serapan fraksi

VI. Pembahasan
Berdasarkan hasil percobaan di atas, perbedaan antara dasar teori dengan
hasil percobaan dimana dasar teori menyatakan bahwa molekul yang lebih
berat akan keluar terlebih dahulu pada kromatografi gel penyaring sementara
hasil percobaan kami menunjukkan molekul yang lebih besar (B12) keluar
bersamaan dengan molekul yang lebih kecil (Hb) di awal-awal fraksi sehingga
warna fraksi menjadi merah gelap karena campuran warna kecoklatan dari B12
dan merah dari Hb. Hal ini menunjukkan bahwa kromatografi gel penyaring
yang kami gunakan tidak berfungsi sebagaimana mestinya karena jaring-jaring
pembentuknya tidak cukup kuat mengikat Hb. Penyaringan yang tidak berhasil
ini juga mengakibatkan nilai serapan di awal fraksi meningkat sangat tajam.
Padahal jika penyaringan berhasil, nilai serapan tidak akan melebihi 1.

VII. Jawaban Pertanyaan:

1. Fungsi Vitamin B12: (pada praktikum)

18
 Untuk menjadi pembanding terhadap molekul Hemoglobin dimana
berat molekul Vitamin B12 jauh lebih besar daripada Hemoglobin.
2. Penyebab Vitamin B12 berwarna merah:
Vitamin B12 memiliki pigmen alami berupa warna merah yang
diturunkan secara genetik seperti pigmen alami lainnya melalui
urophorpirinogen III1.
Penyebab Hemoglobin berwarna merah:
Adanya pigmen Hem dimana terdapat atom besi di pusat struktur Hem.
Kadar kemerahan yang ditunjukkan oleh Hem bergantung pada jumlah
oksigen yang diikat oleh ion Fe2+. Rentang warna dimulai dari merah
segar menandai oksigen dalam jumlah maksimum dan warna merah
kebiruan dalam jumlah minimum1.
3. Rumum Kimia Vitamin B12 dan gugus prostetik pada Hemoglobin1:

4. Berat Molekul Vitamin B12: ±64000 gram/mol.

Berat Molekul Hemoglobin: ±13555,35 gram/mol
5. Logam yang terdapat dalam Hemoglobin
dan Vitamin B12
Hemoglobin: Fe (Besi)
Vitamin B12: Co (Kobalt)

VIII. Kesimpulan:

19
 Kolom kromatografi gel penyaring dapat memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan berat molekul dengan menggunakan penyaring
molekuler.

REFERENSI
Murray, Robert K. Granner, Daryl K. Rodwell, Victor W. Biokimia Harper.
27th ed. Jakarta.Penerbit Buku Kedokteran EGC: 2006.

20
 PRAKTIKUM BIOKIMIA III
ELEKTROFORESIS

A. Tujuan Percobaan
Tujuan dari elektroforesis ini adalah untuk memisahkan protein berdasarkan
muatannya.

B. Landasan Teori
Protein adalah heterobiopolimer yang terdiri dari asam amino melalui
ikatan peptida. Protein-protein ini dibedakan berdasarkan muatan elektronnya yang
berikatan secara ionik atau kovalen. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan
protein memiliki muatan listrik yang berbeda-beda. Selain itu, dapat juga
dibedakan berdasarkan berat molekulnya.
Pada teknik pemisahan protein dengan metode elektroforesis, protein serum
dipisahkan berdasarkan muatan listriknya. Apabila larutan protein diletakkan dalam
suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari
muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan
bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak
bermuatan tidak akan bergerak.

C. Alat dan Bahan

Alat:
1. Pipet mikrometer
2. Tip
3. Aplikator
4. Power supply
5. Elektroforesis chamber dengan larutan buffer
6. Sample plate
7. Membran selulosa asetat
Bahan:
1. Marker
2. Serum
3. BSA

21
 4. Precipitate 50 %
5. Filtrate 50 %
6. Filtrate 100 %
7. Precipitate 100 %
8. Asam asetat 5 %
9. Larutan Ponceau Stain (pewarna merah)

D. Cara Kerja
1. Menyuntikkan sampel marker, serum, BSA, Precipitate 50%, Filtrate 50%,
Filtrate 100%, dan Precipitate 100% masing-masing sebanyak 10 ul ke
dalam pelat dengan sampel menghadap ke bawah.
2. Pelat yang sudah berisi sampel larutan tersebut distempel menggunakan
aplikator yang ditekan sebanyak tiga kali masing-masing selama 10 detik.
Lalu, aplikator ditempelkan pada kertas membran selulosa asetat dan
ditekan 1 kali selama 10 detik.
3. Meletakkan membran selulosa asetat pada elektroforesis chamber yang
berisi larutan buffer 100 ml. Mengalirkan chamber tersebut dengan arus
listrik selama 15 menit dengan tegangan sebesar 180 volt.
4. Setelah 15 menit, mengangkat membran selulosa asetat menggunakan
pinset dari bak elektroforesis dan memasukkannya ke dalam wadah berisi
larutan pencuci berupa asam asetat yang dibubuhi Ponceau Stain selama
enam menit. Membran tersebut direndam sambil digoyang-goyangkan.
5. Mengangkat dan memindahakan membran selulosa asetat untuk direndam
dalam larutan pencuci. Mengulangi pencucian sebanyak dua kali dalam dua
wadah dengan kepekatan yang berbeda masing-masing selama dua menit .
6. Mengangkat dan meletakkan membran di atas kertas saring untuk
mempermudah pembacaan pemisahan protein berupa pita-pita.

22
 Power supply

marker
Serum, BSA, filtrate, - +
-
precipitate

Sumur
(well)

Membran
selulosa
asetat

E. Hasil

23
  Garis yang berada di kutub positif merupakan albumin, sedangkan
globulin berada di kutub negatif.
 Serum mengandung protein albumin dan globulin ditunjukkan pada
gambar di paling kanan
 BSA hanya mengandung albumin ditujukkan pada gambar nomor
dua dari kanan
 Precipitate 50 % seharusnya hanya mengandung globulin, namun
pada gambar (nomor tiga dari kanan) menunjukkan pita yang juga
terkontaminasi oleh albumin. Hal ini dapat disebabkan oleh bercampurnya
sampel pada saat penyuntikan dll.
 Filtrate 50 % hanya mengandung albumin (nomor tiga dari kiri)
 Filtrate 100 % tidak mengandung albumin maupun globulin, jadi
bukan merupakan protein (nomor 2 dari kiri, berwarna putih/ pita tidak
tampak)
 Precipitate 100 % hanya mengandung albumin (gambar nomor satu
dari kiri)

F. Pembahasan

24
  Adanya perbedaan muatan antara protein albumin dan globulin
menyebabkan keduanya bergerak ke arah kutub yang berbeda.
 Protein yang mengandung globulin bergerak ke arah kutub negatif karena
globulin bermuatan positif.
 Protein yang mengandung albumin akan bergerak ke arah kutub positif
karena albumin bermuatan negatif.

REFERENSI
1. Gel Filtration Chromatography.
http://www.science.fau.edu/chemistry/Mari/ biochemlab/05_012.jpg.
Diunduh tanggal 23 Maret 2008
2. L. G. Wade, Jr. Organic Chemistry, 6th ed. New Jersey : Pearson, 2006
3. Lauralee Sherwood. Human Physiology.USA: Thomson, 2007
4. M. Sadikin. Protein Biochemistry : A Brief Introduction, 2007.
5. Robert K. Murray. Biokimia Harper edisi 25. Jakarta : EGC, 2003
6. Tim Penyusun Biokimia FKUI. Biokimia, Eksperimen Laboratorium.
Jakarta: Widya Mandala, 2001

25