Introdução

Existem poucos estudos publicados sobre análise citogenética de embriões

clonados por transferência nuclear.

A análise citogenética pela técnica de secagem ao ar é limitada devido ao baixo

número de metáfases analizáveis.

Teoricamente, o tratamento prolongado com colcemida (N-deacetil-N-

metilcolchicina) permite que mais células entrem em metáfase.

Objetivo: testar o aumento do tempo de incubação das células em meio com

colcemida e a diminuição do tempo em solução hipotônica visando a produção
de lâminas com mais cromossomos (metáfases) identificáveis.
Material e métodos

Clonagem dos embriões por tranferência nuclear

Embriões bovinos TN foram formados pela fusão de oócitos enucleados com

células do cumulus.

Cultivo in vitro

Cultivo in vitro dos embriões até os estágios de mórula (dia 5) e blastocisto (dia
7).
Análise cromossômica e contagem de células

Tratamento 1

Incubação em meio com colcemida: 10 – 12h

Incubação em solução hipotônica: 3 – 5 min

Tratamento 2

Incubação em meio com colcemida: 16 – 18h

Incubação em solução hipotônica: 3 – 5 min

Tratamento 3 (controle)

Incubação em meio com colcemida: 5h

Incubação em solução hipotônica: 15 – 20 min
Transferência de cada embrião individualmente (com 1-2µL de meio) para uma
lâmina de vidro.

Sobre cada embrião, foi gotejado de 2-3µL de fixador (metanol : ácido acético, 1:1).

Secagem das lâminas (em temperatura ambiente de 25°C) por 24h.

Coloração com solução de Giemsa 1% por 10 – 15 min.

Análise dos cromossomos em aumento de 1000x.

Resultados
Resultados
Discussão e conclusão

Em experimentos preliminares, foram testadas incubações em soluções

hipotônicas com 8, 10 e 15 min de duração. Resultados ruins.

Incubações de 3 a 5 min resultaram em metáfases espalhadas em áreas

limitadas e de fácil contagem (87% das metáfases obtidas nos tratamentos 1 e 2
foram identificáveis e analisáveis).
O novo método facilita a diferenciação entre cromossomos de células distintas,
pois:

Mesmo com o tratamento, cromossomos de células diferentes ainda

possuem diferenças morfológicas em aumento de 1000x.

Apenas 15-20% das células mitóticas apresentaram condensação

extrema.

O novo método facilita a análise de múltiplos de grupos inteiros de

cromossomos (embriões triplóides e tetraplóides).
A porcentagem de embriões diplóides foi a mesma em relação ao método
tradicional (aprox. 70%). Os resultados confirmaram que células diplóides são
predominantes em mórula e blastocistos clonados bovinos.

A mixoploidia é um fenômeno comum em embriões clonados.

O mecanismo de formação de células poliplóides ainda não é claro. Pode

resultar de diversos fatores como as condições das células doadoras, dos
oócitos enucleados e do meio de cultura.