Imunofluorescência

A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em

células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com
fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao
microscópio de fluorescência.
Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligar covalentemente a
fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.
De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em
fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.

A imunofluorescência é considerada:

• Teste qualitativo/semi-quantitativo.
• Método de alta sensibilidade e alta especificidade.

Fluorocromos
Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz
visível, ou seja, ficam fluorescentes.

Em 1941 foi a primeira vez que anticorpos foram conjugados com

fluorocromos.

Fluorocromos mais utilizados

Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos

mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes
sob condições adequadas de iluminação.

Isotionato de fluoresceína: se excita com luz azul a 490 nm e emite a

514 nm. Seu rendimento quântico é de 0,5. Produz Quenching.

OBS: Quenching se refere a qualquer processo que diminui a intensidade

de fluorescência de uma dada substância. Uma variedade de processos
pode resultar em extinção, tais como reações de estado animado, a
transferência de energia, formação de complexos e extinção de colisão.
Como conseqüência, extinguindo muitas vezes é fortemente dependente da
pressão e temperatura. Oxigênio molecular eo íon iodeto de supressores
químicos comuns. Têmpera um problema para a não-instantâneas métodos
espectroscópicos, tais como fluorescência induzida a laser.

Compostos da rodamina: Rodamina é um nome genérico para uma

família de compostos orgânicos, corantes chamados fluoronas. Exemplos
são Rodamina 6G e Rodamina B. Elas são usadas como corantes e como
corantes laser como meio amplificador. São oferecidas como corantes
traçantes para determinação de vazão e direção de fluxos d'água. Os
corantes de rodamina fluoresce e pode ser medido facilmente e a baixo
custo com instrumentos chamados fluorímetro. Os corantes do tipo
 Rodamina são usados extensivamente em aplicações biotecnológicas tais
como a microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e os testes do tipo
ELISA.

MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de
epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é
excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).

A epifluorescência é um conjunto de óptica para um microscópio fluorescente

no qual a objetiva é usada tanto para focalizar a luz ultravioleta sobre o
espécime, como para captar a luz fluorescente do espécime. Ela é mais
eficiente do que a fluorescência transmitida, na qual uma lente ou condensador
é empregado para focalizar a luz ultravioleta no espécime. A
epifluorescência também possibilita que a microscopia fluorescente seja
combinada com outro tipo no mesmo microscópio.

Sistema óptico

O sistema óptico para fluorescência epi é realizado utilizando uma combinação

padrão de filtro de excitação, espelho dicróico e filtro de emissão, aplicado a
uma lâmpada de mercúrio de 100 w. Fornecido EW10X/22 mm ampla oculares
de campo, os objetivos LWD FLUO
longa distância de trabalho corrigido ao infinito (IOS), e um conjunto duplo de
filtros (excitação azul e verde). A vasta gama de acessórios permite alterar
rapidamente o método de contraste, sem ter que remover a placa de amostra.
 Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se
utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo.

Imunofluorescência direta
1. O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é
adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável.
2. O anticorpo não ligado é removido por lavagens.
3. O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

VANTAGENS

• Alta especificidade e sensibilidade

• Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua
localização.

DESVANTAGENS

• Alto custo do microscópio de fluorescência.

• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja
identificar ou localizar.
• Subjetividade da leitura.

APLICAÇÕES: Detecção direta de microrganismos em secreções, na

urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na
fenotipagem de células tumorais.

Imunofluorescência Indireta

PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS

1. Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o

anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação
de um imunocomplexo.

2. Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.

3. A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado

com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal.

4. O preparado é observado em microscópio de fluorescência.

PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS

1. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro.

2. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para

permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo

3. Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados.

4. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver

anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o
antígeno.

5. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência.

VANTAGENS

• Especificidade
• Reprodutibilidade
• De simples padronização e execução
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
• Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados
conjugados específicos
• Sensibilidade

DESVANTAGENS

• Necessidade de microscópio de fluorescência

• Subjetividade na leitura
• Não-automação
•

APLICAÇÕES : Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas

como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em
doenças auto-imunes.

Bibliografia
• http://www.molecularstation.com/pt/immunofluorescence/
• http://www.quirumed.com/pt/Catalogo/articulo/42882/-%B1-u-u-u-u-o-o-
o-%B1-u-o-o-o-