VIROLOGA - Interaccin virus-clula

Curva de crecimiento en un solo paso para el fago T4:

Ellis y Delbruck demostraron que era el virus el que infectaba a la bacteria y que provocaba la aparicin de calvas de lisis, para ello hicieron el siguiente experimento: Infectaron con una cantidad de virus concreta ya que la cantidad por clula debe ser la adecuada. El virus se adsorbe a la superficie de la bacteria por un determinado receptor. Por centrifugacin las bacterias se van al fondo, quedndose en el sobrenadante los virus no adsorbidos, que se eliminan. Se resuspende en medio fresco y se hacen tubos por duplicado y a cada uno se le aplica un tratamiento para analizar: o Virus extracelulares: Los que han infectado y han liberado los viriones. Slo se centrifuga. o Virus totales: Se aade cloroformo que lisa a las bacterias y luego se centrifuga. Se toman muestras en pequeos periodos de tiempo y se siembran en csped de bacterias y se halla la cantidad de virus en PFU/cel. Si representaron las u.f.p. a lo largo del tiempo se obtienen las siguientes fases: o F. Eclipse: A tiempos cortos a la infeccin, todava no existen viriones formados (no se han dado calvas). Se estn produciendo las protenas para producir las cpsulas y el ADN. o F. Latencia: No hay virus extracelulares Vtotal = Vintracelular. Aumenta los intracelulares porque comienza la formacin de partculas virales pero aun no han lisado a las clulas. (son viriones activos). o F. Acumulacin: En esta fase hay bacterias con muchos fagos dentro pero todava no tienen fagos suficientes para lisar. o F. Liberacin: Todas las bacterias han lisado. Vtotal = Vextracelular. No existen virus intracelulares. Los virus extracelulares van aumentando porque las clulas acaban siendo lisadas a medida que pasa el tiempo. Esto demostraba las fases que lleva el virus en una bacteria. En el caso de los virus con envuelta los tiempos aumentan porque tienen que recuperar la cpsula. Virus desnudo

Como los animales son ms complejos el proceso de infeccin es ms lento: lo medimos en horas y no en minutos como antes. El ciclo es bastante equivalente al fago T4, teniendo la fase eclipse, fase latencia y a partir de t = 16 h se da el ensamblaje de las partculas virales infectivas que salen al exterior. Los virus extracelulares nunca llegan a ser los virus totales. Virus con envuelta Aqu no existen virus intracelulares activos. Para ser activos necesitan salir de la clula que ha infectado y llevarse parte de ella. Por ello la cantidad de virus extracelulares y totales solapan. La curva intracelular de esta grfica se corresponde con errores cometidos en la medida, contaminacin de virus extracelulares, problemas tcnicos no debemos tenerla en cuenta.

Etapas en la infeccin viral 1. Inicio de la infeccin 1.1. Fijacin del virus a la clula
En principio cualquier molcula presente en la superficie celular puede actuar de receptor viral, para cada virus ser diferente. Generalmente suelen ser glicoprotenas integrales de membrana, aunque algunos reconocen glicolpidos, fosfolpidos... Estos receptores interaccionan con otras muchas cosas, no estn ah para ser reconocidos por virus.

Algunos receptores de membrana a) ICAM 1

Es el receptor utilizado por el rinovirus. Esta protena tiene 5 dominios extracelulares unidos por puente disulfuro, unida por el extremo carboxilo a la membrana plasmtica. Protenas extracelulares del rinovirus (HRV) reconoce el dominio ms extracelular (D1) de esta protena. Este virus tiene otras zonas de interaccin con otras sustancias, como el Lfa-1 reconocido por los linfocitos.

El receptor por el D1 interacciona con el virus e interacciona con una hendidura (can) especfica al virus. Si al rinovirus interacciona por el otro can con un anticuerpo, se bloquea y no puede reconocer la zona a infectar. Cuando la entrada del virus se hace exclusivamente por un nico receptor, podemos bloquear la entrada fcilmente usando anticuerpos monoclonales que se unan al can y bloqueen la interaccin virus-clula. La parte variable del anticuerpo se construye con la misma protena del virus.

b) Receptor de cido silico

Receptor de membrana utilizado por el virus de la influenza. Es reconocido por la hemaglutinina, presente en la cpsida. sta reconoce y se une residuos de cido silico que se encuentra en glicoprotenas y glicolpidos de las membranas celulares. Este virus tambin tiene integrada la neuraminidasa (NA) que rompe el enlace y libera el virus del receptor, ya que el virus despus de infectar no quiere quedarse unido, sino liberarse para poder colonizar otras clulas. Este receptor es menos especfico porque podra interaccionar con otros azcares.

c) Unin del HIV a CD4

Este virin tiene envuelta, en ella hay antgeno, (glicoprotena SU), que est normalmente formando dmero o tetrmeros (en la imagen slo se ve uno). Posee tanto dominios constantes como variables. SU interacciona con CD4 (tipo I6) con 4 dominios globulares unidos por puentes disulfuros, presente en linfocitos T4. Esta unin produce un cambio conformacional en la glicoprotena viral que permite su posterior interaccin con uno de los receptores de quimioquininas (CCR), que actan como correceptores del virus. La unin de SU-correceptor conduce a la exposicin de un dominio de la glicoprotena TM, la que promover la fusin de las dos membranas y la entrada de la nucleocpsida dentro de la clula. Muchos retrovirus desarrollan un proceso de interferencia, una vez que el virus interacciona con receptores se bloquean el resto de CD4 (slo infecta un virin).

Podramos aadir CD4 lo que bloqueara parte de los virus e impedira la entrada. Cuando se hicieron ensayos clnicos, se degradaba CD4 antes de llegar al virus por la inestabilidad de CD4 en sangre. De esta forma se disminuye la cantidad de virus (es la va de entrada principal), pero no se bloquea la entrada a la clula debido a que el virus tiene vas alternativas de entrada: existen hasta 8 receptores distintos aparte del CD4. Cuando intentamos infectar clulas de ratn con CD4 iguales a los humanos, los virus HIV de humanos no pueden infectar esas clulas de ratn. Se necesitan correceptores para que el virus entre ms eficientemente. En el ratn los correceptores son diferentes.

1.2. Entrada
La entrada supone un coste energtico (a diferencia de la unin, interaccin electrosttica entre dos protenas) y la clula debe estar metablicamente activa. La energa es requerida para que se desencadenen 3 mecanismos principales: Translocacin: Utilizada por virus desnudos. Est mediado por un receptor especfico de la membrana y una protena de la cpsida. Tras la unin especfica se produce un cambio de conformacin de la protena que hace que entre el virus (no se generan poros). El receptor es finalmente reciclado a la membrana citoplasmtica. Este mecanismo es poco frecuente y no est muy caracterizado. Endocitosis mediada por receptor: o Es utilizada por la mayora de virus animales tanto desnudos como con envuelta. o El virus se ancla a un receptor especfico de membrana y se produce una invaginacin recubierta por clatrina (coated pit) que da lugar al endosoma (coated vesicle). o Se produce una bajada de pH mediada por la protn ATPasa vacuolar de la membrana del endosoma que bombea protones al interior, provocando la maduracin del mismo. o Posteriormente se pierde la cubierta de clatrina. En virus con envuelta o La bajada de pH desorganizan los componentes proteicos de la envuelta y adems activa protenas con actividad fusognica de la superficie de virus. Esto genera la fusin de la membrana viral y del endosoma permitindose la liberacin. o El cido nucleico entra rpido en el ncleo para que no le afecten las endonucleasas.

En virus desnudos

o Una vez el virus dentro del endosoma se han propuesto dos posibilidades: Lisar al endosoma liberando el contenido al citoplasma (adenovirus), pero la cpsida protege al DNA hasta el ncleo que penetra por un poro. La partcula viral o genoma pasan al citoplasma con una perturbacin de la membrana pero sin lisis, como formacin de un poro. o En ambos casos existe un proceso secuencial de decapsidacin, en el que se liberan los cidos nucleicos. Entrada del virus influenza La entrada es por endosoma mediada por receptor (HA-cido silico). A la bajada del pH, la hemaglutimina cambia de conformacin. Cuando se produce la unin al cido silico se expone un domino de sta con actividad fusiognica y permite la fusin de las membranas, permitiendo la salida del material gnico al exterior y la posterior entrada al ncleo. Fusin: Solamente virus con envuelta ya que se produce una fusin directa de la membrana del virus con bicapa lipdica. Este proceso se lleva a cabo por la accin de protenas fusognicas situadas en la envuelta de la partcula viral. Una vez fijado el virus al receptor se activan cambios conformacionales que dispara la actividad fusognica que permiten la fusin entre dos membranas y penetra la nucleocpsida portando el material gentico. Puede haber coreceptor o no, y no se requiere un pH bajo.

Resumen de la ENTRADA A travs de la membrana plasmtica A travs de endosomas

Entrada directa

Fusin directa

Endocitosis mediada por receptor

1.3. Decapsidacin viral

Trmino que engloba los procesos que tienen lugar despus de la entrada, en los que la cpsida se desprende del virin dejando el complejo nucleoproteico expuesto. La cpsida se rompe y los cidos nucleicos quedan expuestos. Una vez que el genoma est en el citoplasma (ms expuesto a la degradacin) o entra en el ncleo, el proceso de replicacin y expresin depende del virus. Los virus de RNA (+) suelen ser citoplasmticos porque usan los ribosomas del citoplasma para comenzar directamente la traduccin. Si se trata de virus de DNA irn al ncleo (la mayora). Entre las fuerzas que desestabilizan a la partcula viral se pueden destacar: Los cambios conformacionales e incluso la prdida de la cubierta externa durante las etapas de fijacin y de entrada. Las condiciones intracelulares, que suelen ser bien distintas a las extracelulares (diferencia de concentraciones de cationes, pH). Entre los distintos mtodos de decapsidacin destacamos: Virus del bosque de Semliki: Es un virus de RNA que entra por endocitosis. Cuando rompe la envuelta por el bajo pH, sale la cpsida con el RNA dentro para evitar ser degradado hasta que encuentre los ribosomas celulares. Adenovirus: Reconoce un receptor y entra por endocitosis. La bajada de pH desetabiliza protenas de la cpsida, pero todava protege al RNA, siendo transportada por microtbulos al ncleo, al cual entra por un poro. Poliovirus: El mecanismo de entrada de este virus parece ser: se une a la clula produciendo un cambio conformacional en el virus que forma un poro en la membrana a travs del cual el RNA viral es inyectado dentro del citoplasma.

2. Expresin y replicacin del genoma viral La estrategia en la replicacin depende de cada familia viral en funcin del material gentico que tenga. Se ir estudiando caso por caso, pero en lneas generales podemos decir que: Virus DNA: expresan en primer lugar los genes que codifican protenas implicadas en replicacin; la replicacin comienza simultneamente mientras se siguen transcribiendo genes que codifican las protenas estructurales que conformarn el virin. Virus RNA: La replicacin del genoma y la expresin del material gentico estn profundamente imbricados. 3. Morfognesis Ensamblaje: Reunin de los componentes necesarios para formar el virin. Puede tener lugar en el ncleo (adenovirus, poliomavirus y parvovirus), en el citoplasma (picornavirus, poxvirus y reovirus). El ensamblaje comienza cuando se alcanzan unos niveles adecuados de los componentes virales (genomas, protenas y a veces otras molculas). Maduracin: Es la etapa en la que el virus pasa a ser infeccioso. Tienen lugar cambios estructurales como consecuencia de procesamiento de protenas de la cpsida, o cambios conformacionales durante el ensamblaje. Intervienen proteasas virales aunque tambin pueden jugar un papel otras actividades celulares. La maduracin interfiere con la antigenicidad del virin. Virus desnudos: El ensamblaje se inicia de fuera a dentro. Una vez estn las protenas bien ensambladas cogen el DNA y lo introducen en la cpsida. HSV. Protenas estructurales en el citoplasma pero se sintetizan en el ncleo. Se requiere gran sealizacin para que luego todas se ensamblen formando la cpsida. Una vez formada toma el DNA que estar en el ncleo. Adenovirus. Se traducen secuencialmente las protenas en el citoplasma. Se ensamblan en forma de trmeros, adoptando la forma de precpsida. Se irn adicionando protenas y entrar el material gentico para originar el virin maduro. Virus con envuelta: Virus de la influenza (gripe): El ensamblaje se produce en el citoplasma. A la vez que hay ensamblaje algunos fragmentos de RNAm traducen HA y NA

que tienen que pasar por el R.E y por el Golgi para poder ir a la membrana y pueda salir el virus (el ensamblaje y maduracin es simultneo). La partcula viral infectiva es la forma madura, una vez que ha salido de la clula y ha adquirido la envuelta. Retrovirus: Es un virus de RNA. Se integra en el ncleo y se mantiene latente. En un cierto momento empieza a replicarse y a producir partculas virales. Se encapsida en el citoplasma y se dirige a la membrana donde se envuelve y sale. Para hacerse infectivo tiene que adquirir la envuelta.

4. Liberacin de viriones
La salida de virones maduros se produce mediante dos mecanismos: Virus lticos (la mayora de los desnudos): Cuando hay gran cantidad de ellos en el interior celular (ncleo o citoplasma) lisan a la clula y salen. Esta lisis es un proceso gradual, se requieren protenas virales (se han propuesto las viroporinas) que modifican y desestabilizan las membranas celulares. Virus con envuelta: Adquieren la envuelta al salir por gemacin. Las protenas han sido dirigidas por el virus a esa zona de la membrana, para al salir obtenerlas.

5. Tipos de infeccin viral

a) Infeccin ltica: Se produce la lisis celular con liberacin de la progenie viral y la muerte celular. Para que se de esta infeccin, la clula tiene que ser permisiva, es decir tiene que ser capaz de reconocer e interaccionar especficamente con el virus. b) Infeccin abortiva: La progenie viral producida es muy pequea o casi nula. En estas infecciones el virus se fija y libera el genoma en el interior de la clula, pero algo falla en las fases posteriores que hacen poco eficiente la formacin de partculas virales. El estudio de estas interacciones nos sirve para comprender mejor el funcionamiento de determinados procesos virales. Algunas aplicaciones son: El virus chickenpox infecta clulas de pollo y produce infecciones abortivas en humanos, por lo que se puede manipular genticamente y usarse como vector para la vacunacin contra distintos parsitos. c) Transformacin celular: La infeccin viral provoca el paso de una clula de normal infectada a oncognica. Los efectos que se producen son: En clulas que crecen adheridas a un soporte slido (como los fibroblastos), producen una inhibicin por contacto, y dejan de dividirse cuando han alcanzado la confluencia. Se altera su citoesqueleto y la matriz extracelular. Se acidifican el medio. Producen tumores si estas clulas se inyectan en animales. Los virus que producen estos se llaman virus oncognicos (oncogen = gen cuya expresin provoca la transformacin celular), los hay tanto de DNA como de RNA.

El virus en el interior celular no expresa todo su genoma, con un solo gen (oncogen) es suficiente para generar la transformacin celular. Las clulas no mueren sino que se induce su divisin y proliferacin descontrolada.

o o o o

d) Infeccin crnica: El virus se perpeta en el husped sin llegar a matarlo. Se dividen en dos tipos de infecciones: Persistente Las clulas infectadas producen de forma constante viriones infectivos. o Para que el virus se establezca de forma constante ejerce un control sobre el sistema inmune. Desarrollan estrategias que limitan la apoptosis celular. Se generan variantes atenuadas. Infectan clulas parcialmente permisivas. Latente o No se producen viriones infectivos. o El virus libera el material gentico al interior celular, pero ste slo se expresa en parte o incluso permanece totalmente silencioso.

6. Alteraciones celulares durante la infeccin viral

Efecto citoptico (ECP): Alteracin celular, bioqumica o morfolgica causada en una clula a consecuencia de la infeccin de un virus: 1. Cambios morfolgicos: Estos son muy variados y ocurren prcticamente en cada orgnulo y estructura celular: Lisis Muerte celular. Cuerpos de inclusin Formacin de vesculas en el citoplasma, normalmente el virus engloba all complejos replicativos, transcripcionales, de ensamblaje Formacin de sincitios Grupos de clulas fusionadas. Est relacionado con cambios en distintas protenas de la membrana. Transformacin celular. 2. Cambios bioqumico: Se ven afectados gran cantidad de procesos metablicos y enzimas a lo largo de la infeccin. Inhibicin de la sntesis de protenas celulares. Inhibicin de la sntesis del DNA celular. Inhibicin de la sntesis del RNA celular. Alteraciones en las membranas celulares.

o Cambios en la actividad de las enzimas. o Modificacin en el sistema vesicular. o Alteracin en la permeabilidad de la membrana plasmtica. 3. Muerte celular: apoptosis y necrosis Apoptosis: Muerte celular programada. Se puede ver estimulada o inhibida segn virus. Este proceso consiste en eliminar las clulas que ya no son necesarias, siendo las caspasas las enzimas que la ejecutan. Las protenas p53 o E2F1 regulan varios componentes implicados en ciclo celular y estimulan la apoptosis. Consecuencias: Condensacin de la cromatina en la periferia del ncleo, reduccin del tamao celular formacin de protuberancias en la membrana plasmtica disminucin en la adhesin celular. La membrana celular no se rompe pero se forman cuerpos apoptticos. Necrosis: La clula muere a causa de una agresin externa que provoca un dao en la membrana plasmtica: Ruptura de mitocondrias. Cese de la sntesis proteica y cidos nucleicos. Desorganizacin general y lisis celular.