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PRACTICA #1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS POR REACCIONES SEROLOGICAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA Conocimiento terico de las principales tcnicas serolgicas utilizadas en el diagnstico microbiolgico y desarrollo de una tcnica de aglutinacin en placa para obtener bases aplicativas. INTRODUCCION En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre clulas o sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen. Entre los extraos se incluyen clulas de otros organismos, virus, bacterias, toxinas, toxoides, vacunas, etc. Cuando estos materiales penetran en el organismo son reconocidos como sustancias extraas. La Inmunologa estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del hospedador frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la inmunidad adquirida especfica. Las clulas germinales de la mdula sea que participan en las respuestas inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles poblaciones de linfocitos: 1.- Linfocitos B, o Clulas B. Reciben ese nombre, porque las clulas precursoras maduran en un pequeo rgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en las aves (en los mamferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de Peyer del tracto digestivo) y se transforman en linfocitos B. Slo el 20 % de los linfocitos circulantes son Clulas B; el resto de las clulas estn en el tejido linfoide. Viven das o semanas. Las Clulas B son las responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el antgeno, originan clulas plasmticas productoras de anticuerpos. Tambin pueden originar clulas con memoria, linfocitos de larga supervivencia que estn en reposo despus de haber sido estimulados por un antgeno; cuando se renueva el contacto con un antgeno igual, producen la llamada "respuesta secundaria" que es ms rpida y vigorosa que la "respuesta primaria", porque hay una mayor y ms rpida produccin de anticuerpos. El resultado es que el individuo responda con mayor prontitud e intensidad a una segunda exposicin al antgeno. 2.- Linfocitos T, o Clulas T, que tambin se originan a partir de precursores producidos en mdula sea por las clulas germinales. Se desarrollan en el Timo, de donde toman su nombre. Abandonan el timo y se concentran en bazo, ganglios linfticos y tambin van a la sangre. Viven durante varios meses. Como consecuencia de la activacin antignica, los Linfocitos T dan lugar a las clulas Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T participan en la muerte o eliminacin de materiales extraos y microorganismos invasores, e incluso clulas cancerosas. Son las principales responsables del

rechazo de trasplantes y de reacciones alrgicas cutneas. Se encargan de movilizar a los macrfagos en la destruccin de patgenos y de estimular a las clulas B para intensificar la produccin de anticuerpos (hay una "cooperacin celular"). Aunque ms difcil de medir, la inmunidad celular tambin est reforzada por una segunda exposicin a un antgeno, lo que es representado por una nueva y mayor poblacin de clulas T con memoria, capaces de responder a la segunda aparicin del antgeno. En el laboratorio clnico, la Serologa permite el estudio de las reacciones antgeno-anticuerpo que se encuentran en el suero sanguneo. Las reacciones serolgicas son especficas entre un antgeno y un anticuerpo y pueden ser usadas para el trabajo de diagnstico. Cuando uno de los componentes es conocido, el desconocido puede ser detectado con un alto grado de sensibilidad y exactitud. Las pruebas serolgicas de reaccin antgeno-anticuerpo, amplan la capacidad diagnstica del clnico y orientan la teraputica. Hay muchas tcnicas disponibles.

PRUEBAS SEROLOGICAS MAS COMUNES: - Prueba de AGLUTINACION: En las reacciones de aglutinacin el antgeno es una clula o una partcula. la adicin del anticuerpo homlogo provocar la aglutinacin o la agregacin, dando como resultado la formacin de agregados visibles de clulas o partculas. Pueden llevarse a cabo en portaobjetos o en tubos de ensayo. La mayora de estas pruebas se efectan en tubo, con diluciones seriadas del suero conteniendo el anticuerpo (antisuero), aadiendo una cantidad fija del antgeno (la clula o la bacteria). Despus de la incubacin se observa la formacin de agregados, determinndose el ttulo. El ttulo es un valor relativo representado por el recproco de la mxima dilucin que provoca aglutinacin. Por ejemplo, si un antisuero aglutina a una dilucin 1:256, pero no a 1:512, su ttulo es 256. Ejemplo de esta tcnica es la Prueba de Vidal para diagnstico de Salmonella, la Prueba de Weill-Felix para Rickettsias, etc. - PRECIPITACION: Aqu se utiliza un antgeno soluble y un anticuerpo homlogo. la reaccin se manifiesta por la formacin de un precipitado visible en la interfase de los reactivos. Generalmente la cantidad del anticuerpo (antisuero) es constante y la del antgeno es variable. A medida que la cantidad del antgeno aumenta, el precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, cuando las proporciones de ambos son ptimas. A partir de aqu, si contina incrementndose la cantidad del antgeno, entonces disminuye el precipitado. Por ello las pruebas de mayor utilidad son las que se realizan hasta alcanzar las proporciones ptimas.

Difusin Simple: En un tubo pequeo se deposita la solucin del antgeno sobre una solucin del antisuero, mismas que al difundir forman un anillo de precipitacin en la interfase. Doble difusin: En el mtodo de Ouchterlony los reactivos difunden desde pocillos excavados en una placa de agar. Las bandas de precipitacin aparecen entre los dos pocillos correspondientes a antgeno y anticuerpo. Inmunoelectroforesis: Cuando se aplica la electroforesis al estudio de las reacciones antgeno anticuerpo, se le denomina electroforesis. Es un proceso electroqumico en el que las partculas o macromolculas coloidales suspendidas, con una carga elctrica neta, emigran en solucin o en el gel de agar, bajo la influencia de una corriente elctrica. Las cargadas positivamente emigran hacia el ctodo, mientras que las negativas van hacia el nodo. Cuando se deposita una solucin que contiene antgenos proteicos en un pocillo excavado dentro de una lmina de agar y se aplica la corriente elctrica, los antgenos se distribuyen en manchas separadas a lo largo de una lnea. Cuando se suspende la corriente comienza la difusion de esas sustancias a partir de las manchas correspondientes. Si se depositan los anticuerpos en una zona rectangular excavada en paralelo a la linea de distribucion de los antigenos, se produce una reaccion de precipitacion, adecuada para estudiar la naturaleza de las macromoleculas que se difunden. En este caso los anticuerpos se difunden en un frente lineal, mientras que los antigenos se difunden circularmente, como si estuvieran impregnando un disco, dando zonas de precipitacin en forma de arco. En el suero aparecen 2 o ms arcos. Gel de agar

ctodo

o pozo con antgeno

+ nodo

zona de reaccin o pozo con suero (Ac)

- FIJACION DEL COMPLEMENTO: Esta prueba es til en aqullos casos en que la interaccin antgeno-anticuerpo no se traduce en un efecto observable, como precipitacin o aglutinacin. Se basa en la presencia de anticuerpos fijadores de complemento en el suero. Estos anticuerpos, en presencia del complemento, son capaces de provocar la lisis de clulas especficas. La finalidad de esta prueba es detectar anticuerpos especficos en suero en forma indirecta. I) Reaccin positiva: 1. Antgeno + Suero conteniendo el Anticuerpo homlogo + Complemento. Incubacin. 2. El complemento se agota durante la reaccin antgeno-anticuerpo (pero no hay cambios visibles). 3. Adicin de eritrocitos de carnero + Hemolisina anti-eritrocitos de carnero (anticuerpo hemoltico). Incubacin. 4. No hay hemlisis, porque no queda complemento disponible para que ocurra la reaccin antgeno-anticuerpo (eritrocitos de carnero con el anticuerpo homlogo: hemolisina antieritrocitos). Se deduce que si se agot previamente el complemento, fue porque se utiliz en la primera reaccin Ag-Ac. II) Reaccin negativa: 1.) Antgeno + Suero que no contiene el anticuerpo homlogo + Complemento. 2.) Incubacin 3.) El complemento no se gast (no se utiliz), porque no hubo reaccin antgenoanticuerpo. 4.) Adicin de eritrocitos de carnero + hemolisina-antieritrocitos de carnero 5.) Incubacin 6.) Hemlisis de eritrocitos de carnero. Esto es debido a que el complemento no fu utilizado al no ocurrir la reaccin Ag-Ac previamente, por lo tanto sigui quedando disponible para que ocurriera la segunda reaccin Ag-Ac (eritrocitos de carnero con la hemolisina antieritrocitos). - RADIOINMUNOENSAYO (RIA): Es una microtcnica de gran sensibilidad para la determinacin de cantidades pequeas de antgeno: 1. Primer paso. Competencia entre el antgeno no marcado (no radiactivo) a ensayar, en concentracin desconocida + antgeno marcado (radiactivo) en concentracin conocida. Esta competencia se establece al adicionar una cantidad limitada de anticuepo especfico para el antgeno marcado. 2. Se incuba varias horas. 3. En el segundo paso, se adiciona al sistema un suero conteniendo anti-

anticuerpo especfico, y por lo tanto, capaz de fijarse al anticuerpo integrante de los complejos inmunitarios formados durante el primer paso. Esto conduce a la precipitacin de los complejos antgeno-anticuerpo. Si el antgeno que se ensaya en el primer paso ha reaccionado con el anticuerpo, el antgeno radiactivo indicador no podra reaccionar con el anticuerpo. En este caso la radiactividadad en el precipitado sera muy baja. Sin embargo, si el antgeno que se ensaya no reacciona con el anticuerpo, el anticuerpo quedar libre para reaccionar con el antgeno indicador radiactivo. Con ello la radiactividad del precipitado ser elevada. Esta tcnica es importante para detectar el antgeno del virus de la Hepatitis B, en suero del donante de sangre. - ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA): Esta tcnica de inmunoabsorcin de enzima-ligada (enzyme-linked-immunosorbent assay) se utiliza para el diagnstico serolgico de infecciones vrales y para la deteccin de otros antgenos microbianos. Adems de ser tan sencillo como el RIA, es de menor costo, mayor rapidez y seguridad y tiene la misma confiabilidad. Es muy sensible y se pueden detectar antgenos y anticuerpos a niveles de 10 a la menos 10 gr, o de una parte por 10 a la 4 millones. Procedimiento en microplaca: El antgeno se fija por adsorcin pasiva a pocillos de poliestireno. Se ade el antisuero a probar y se incuba. Si los anticuerpos que contiene el antisuero son homlogos, quedarn fijados al antgeno. Despus se aaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana marcados con enzima, que se fijarn a los complejos antgeno-anticuerpo formados en el primer paso. Finalmente se aade el sustrato de la enzima cuya degradacin determina un cambio de color proporcional a la concentracin de anticuerpo presente en la muestra ensayada, que se puede apreciar por observacin o medir en el colormetro. Es aplicable en la determinacin de muchos hongos, parsitos y virus tales como herpes 2, rubeola, etc. - ANTICUERPOS FLUORESCENTES: Se basa en la capacidad de ciertos colorantes de presentar fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta. Por ejemplo los isocianatos de fluoresceina y de rodamina. Los anticuerpos pueden conjugarse con estas molculas, constituyendo anticuerpos marcados. Las observaciones se llevan a cabo en un microscopio de campo oscuro con luz ultravioleta. Mtodo directo: Se mezclan en un portaobjetos microorganismos con suero conteniendo anticuerpos fluorescentes y se observan al microscopio de fluorescencia, solo se observan los microorganismos (antgenos) que reaccionan con los anticuerpos marcados. Mtodo indirecto: En primer lugar el anticuerpo no-fluorescente es enlazado a su antgeno. A continuacin se aplica un segundo anticuerpo (antisuero-humano) marcado con fluorescena.

MATERIALES Y METODOS I. REACCION DE AGLUTINACION EN PLACA: Prueba de Reacciones febriles: Esta prueba representa un mtodo de laboratorio til para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinacin entre los antgenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antgenos presentes en el suero del paciente. La tcnica comprende: 1. - Reaccin de Widal para diagnstico de la fiebre tifoidea, entrica y ondulante. La reaccin mide el ttulo de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensin de antgenos conocidos de Salmonella typi , S.paratyphi A y S.paratyphi B. 2. - Reaccin de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis). - Reaccin de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antignicos idnticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK). En esta prueba se utilizan antgenos de Proteus para diagnstico de tifo. Antgenos comerciales: Brucella (B. abortus) Tfico O (somtico) Paratfico A (flagelar) Sueros control comerciales : control negativo control positivo 1. 2. Elija un brazos del paciente para localizar una vena adecuada. En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule ltex, aproximadamente a 6 cm por encima de la vena. 3. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar antes de sangrar, para evitar posibles reacciones alrgicas y que no arda. Introduzca la aguja del vacutainer la muestra sangunea: 4. Se revisan ambos paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando que el en el visel de la aguja, el orificio quede hacia arriba. 5. Se introduce el tubo para recoleccin de muestra, en el soporte del vacutainer y automticamente se obtendrn 3 ml. 6. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga ms sangre del paciente. 7. Deje coagular la sangre y centrifugue.

Paratfico B (flagelar) Tfico H (flagelar) Proteus OX-19

8.

Separe el suero con una pipeta pasteur y depostelo en un tubo limpio, para las pruebas serolgicas.

PRUEBA CUANTITATIVA # POZO 1 2 3 4 5 6 7 ml SUERO PROBLEMA 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005 0.02 de Suero control (+) 0.02 suero control (-) ANTIGENO 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota AGLUTINACION TITULO 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 3+ No aglutina 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:80

Interpretacin de los resultados: Se observa la aglutinacin macroscpica y se valoran los resultados en la siguiente forma: (4+) 100% aglutinacin (3+) 75 % " (2+) 50 % " (1+) 25 % " 0 Los enfermos de brucelosis aguda mostrarn un ttulo de aglutininas 1:80 o mayor. Pueden persistir por meses o aos. Un ttulo tfico somtico (O) significativo es 1:80, pero mayor es importante. Para el tifo, el menor ttulo significativo es 1:80. Un aumento cudruple se considera importante. Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete das. Si en la segunda muestra se encuentra un ttulo ms elevado que en la primera, indicar una infeccin activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un ttulo menor que en la primera, indica que el paciente est en recuperacin y los anticuerpos detectados son de memoria. Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tfico O positivo 1:80, Proteus negativo, etc. Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cmo se puede saber en base al ttulo obtenido, si el resultado de una titulacin alta es a consecuencia de una enfermedad activa o de inmunoglobulina (IgG) de memoria.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES

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