UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

BIOLOGIA CELULAR

ORGANIZACIÓN SUBCELULAR
 INTRODUCCION

Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente
debido a la agregación espontánea de moléculas. Las primeras células eran
relativamente simples y pequeñas, similares a los organismos que actualmente
conocemos como procariontes. Luego aparecieron las células eucariontes, más
grandes y de organización más compleja, que hoy forman parte de animales y
plantas.

Por definición, y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes

poseen un núcleo que contiene la mayoría del DNA envuelto en una membrana.
Esto deja al material genético en un compartimento separado del resto de los
contenidos de la célula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas.
En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos,
mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas,
lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas dentro de la
célula.
El Núcleo es el organelo más grande de la célula y está separado del citoplasma
por una envoltura que consiste en dos membranas. Contiene todo el DNA
cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su
asociación con proteínas denominadas histonas. El núcleo se comunica con el
citosol mediante aperturas en su envoltorio llamadas poros nucleares.

La Membrana Plasmática es la envoltura externa de la célula. Corresponde a un

bicapa continua de fosfolípidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran
embebidas varias proteínas. Algunas de estas proteínas sirven como bombas y
canales para el transporte de moléculas específicas hacia el interior de la célula,
y desde la célula al medio externo.

Las Mitocondrias son muy similares a las bacterias tanto en tamaño como en
forma. Contienen su propio DNA, sintetizan proteínas y pueden reproducirse al
dividirse en dos, por lo que se cree que provienen de la simbiosis de una célula
eucarionte primitiva con un organismo procarionte, que correspondería a una
mitocondria primitiva. Estos organelos son responsables de los procesos de
respiración celular y producción de energía.
Los Cloroplastos, al igual que las mitocondrias, también tendrían un origen
simbiótico. Se encuentran sólo en los organismos capaces de realizar la
fotosíntesis, como las algas verde-azules y las plantas. Los cloroplastos
corresponden a plastidios que contienen clorofila, y están rodeados de una
membrana doble. Además, contienen un elaborado sistema de membranas en su
interior en el cual se encuentra el aparato fotosintético propiamente tal.

El Retículo Endoplásmico (R.E.) corresponde a sacos, tubos y capas de

membranas que se extienden a través del citoplasma y que ocupan un amplio
sector de la célula. La membrana del Retículo endoplásmico es una continuación
de la membrana nuclear. Se especializa en la síntesis de lípidos y proteínas de
membrana, así como también de materiales que están destinados a ser
exportados de la célula. El Retículo endoplásmico rugoso está asociado a los
ribosomas, que se unen en su parte externa y se encargan de la síntesis de
proteínas. El Retículo endoplásmico liso no contienen ribosomas y se encarga
del metabolismo de lípidos.

El Aparato de Golgi o Dictiosomas también corresponde a un sistema de sacos

membranosos. Se encarga de la modificación, destinación, y
empaquetamiento de macromoléculas de secreción o que están destinadas a
otros organelos. Alrededor de él se encuentran numerosas vesículas pequeñas
que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes
compartimentos de la célula.
Los Lisosomas son vesículas membranosas que contienen enzimas
hidrolíticas requeridas para la digestión de moléculas al interior de la célula. De
este modo, estas enzimas se mantienen aisladas del resto de los componentes
celulares evitando la degradación de moléculas como proteínas y ácidos
nucleicos.

Los Peroxisomas también corresponden a vesículas. En ellas se produce

peróxido de hidrógeno (H2O2) durante la oxidación por el oxígeno de varios tipos
de moléculas. Esta sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los
peroxisomas se mantiene aislada al resto de los componentes de la célula.

Los Ribosomas son grandes complejos de RNA y proteínas. Se componen de

una subunidad grande y una subunidad pequeña que se ensamblan para formar
un complejo que se encarga de llevar a cabo el proceso de traducción en la
síntesis de proteínas. Los ribosomas procariontes y eucariontes son muy
similares, y pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a
membranas formando parte del retículo endoplásmico rugoso,

El Citoesqueleto corresponde a filamentos de proteínas que forman un enrejado

en el citoplasma. Esta red de filamentos está formada por los microtúbulos,
filamentos de actina y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da ala célula
su forma y provee la base de sus movimientos. Generalmente se organiza desde
una región cercana al núcleo donde se encuentran los centríolos y desde ahí se
extiende al resto de la célula.

Aunque técnicas avanzadas como la Microscopía Electrónica permiten una

visualización detallada de la estructura de la célula, esto no es suficiente para
definir la función de sus componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los
organelos del resto de la célula para realizar estudios bioquímicos que permitan
determinar la función exacta de cada uno de ellos.
 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las
técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y
macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal
propósito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes
celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta
técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre
1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula en base
a su tamaño y densidad.

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u

homogenización de la muestra. Esto se logra a través de diferentes
procedimientos como sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), schok
osmótico, o simplemente moliendo las células en homogenizadores mecánicos.
En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la
membrana plasmática y el retículo endoplásmico, las que queda formando
pequeños fragmentos o vesículas que dan origen a la fracción microsomal. El
resto del los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato
de Golgi, lisosomas y perixosomas) permanecen intactos. Las partículas y
vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas
originales y permiten el estudio de la función de cada organelo celular por
separado.

La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u

homogenizado, y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se
realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que
los componentes de la célula se separan en un campo gravitacional.

Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo

medio, el cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad
debido a su mayor Peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de
gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de
sedimentación también aumentará.

Para aumentar el campo gravitacional se usan las Centrífugas. Estos

instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen
girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo
gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo
y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado
depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotación.
Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el
fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet, y sobre él una parte líquida
llamada sobrenadante.

FIGURA 1: Esquema de una centrífuga.

Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a
baja velocidad a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las
partículas subcelulares más grandes, los núcleos. Así, el primer pellet obtenido
corresponde a una fracción enriquecida en núcleos y el sobrenadante contiene al
resto de los componentes celulares en suspensión.

El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a

velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos,
lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se recentrifuga a alta velocidad
obteniéndose un pellet enriquecido en membrana plasmática y retículo
endoplásmico (fracción microsomal). Una última centrifugación del sobrenadante
anterior a velocidades aun mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas,
dejando el sobrenadante sólo la porción soluble del citoplasma, el citosol.

FIGURA 2. Esquema de un fraccionamiento subcelular típico.

Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones
enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras
modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad,
que se obtienen con soluciones de sacarosa, polímeros o proteína. Permiten
realizar el proceso de separación en gradientes de densidad, obteniendo
organelos con mayores grados de pureza.

Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evalúa mediante el análisis

de la forma en que se distribuyen algunos componentes celulares de localización
subcelular conocida en las diferentes fracciones obtenida. Estas moléculas son
llamadas marcadores de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el DNA es un
marcador de la presencia de núcleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la
cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias, y el proceso de fotosíntesis
indica la presencia de cloroplastos. De este modo, el análisis de la distribución de
los diferentes marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite
conocer la distribución y pureza relativa de los distintos organelos, y el nivel y
calidad de los componentes contaminantes de cada fracción.

La obtención de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma

relativamente específica algunos procesos celulares que ocurren en
compartimentos particulares, aislándolos de las reacciones que ocurren en otros
organelos. Por ejemplo, se puede estudiar la síntesis de proteínas en ribosomas
aislados o asociados a membranas, el transporte de sustancias a través de la
membrana plasmática, la fotosíntesis en cloroplastos, el procesamiento de
glicoproteínas en el aparato de Golgi, etc.

ACTIVIDA PRACTICA

ACTIVIDAD Nº 1: Fraccionamiento subcelular.

OBJETIVOS

• Conocer las técnicas de homogeneización usadas en el fraccionamiento

subcelular.
• Comprender los fundamentos de la técnica de centrifugación usada en el
fraccionamiento subcelular.
• Comprender el concepto de moléculas marcadoras y su utilidad en la
evaluación del fraccionamiento subcelular.

a) Fraccionamiento Subcelular de Hígado:

El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de

ruptura u homogeneización, y una segunda etapa de fraccionamiento
propiamente tal. El fraccionamiento o separación de los distintos componentes
celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que
sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de su
masa y tamaño.

Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: la pella

que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que
corresponde a la fracción líquida que permanece sobre el material sedimentado.

Las pellas obtenidas corresponden a los organelos que han sedimentado, éstos se
resuspenden y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que
los sobrenadantes se vuelven a centrifugar.

La etapa de ruptura y homogeneización de la muestra se realiza colocando el

tejido fresco a fraccionar y una cantidad adecuada de solución tampón, la que deja
los organelos en suspensión y sirve para que no se rompan durante el
fraccionamiento en un homogeneizador. Todo el proceso se realiza además en
frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las estructuras celulares y así
conservar intactas la mayor parte de las características funcionales originales del
organelo que se pretende aislar.

EXPERIMENTO Nº 1:

Usted recibirá un trozo de hígado que ha sido previamente perfundido (lavado) con
suero fisiológico (NaCl 0,15 M) para eliminar los restos de sangre ya que los
glóbulos rojos interfieren en la observación de organelos. Con él siga atentamente
las siguientes instrucciones:

1. Utilizando pinzas, tome un trozo de tejido de tamaño adecuado, séquelo con

toalla de papel y transfiéralo a un vaso de precipitado limpio que se encuentra
previamente en hielo.
2. Usando una tijera, corte el trozo de tejido en pedazos pequeños y agregue la
solución tampón de homogeneización que consiste en Sacarosa 0.25M,
Cloruro de calcio (CaCl2) 3mM y Tris-HCl 20mM. Esta solución tiene un pH 7,4
(pH fisiológico), y se encuentra también en hielo.
3. Suspenda el tejido en esta solución, y transfiéralo a un homogeneizados para
romper el tejido.
4. Cuando el tejido se encuentre homogeneizado fíltrelo a través de un embudo
que contiene gasa. Reciba el filtrado en un tubo limpio que se encuentra en
hielo, y manténgalo ahí.
5. Centrifugue el tubo a 4500 x g por 2 minutos y 15 segundos aproximadamente.
6. Transfiera el sobrenadante (S1) a otro tubo limpio que se encuentre
previamente en hielo y guárdelo en frío.
7. Resuspenda la pella (P1) en medio de homogeneización y guárdela en frío.
8. Centrifugue el sobrenadante S1 a 5000 x g por 30 minutos.
9. Transfiera el sobrenadante (S2) a un tubo limpio que se encuentre previamente
en hielo y guárdelo en frío.
10. Resuspenda la pella (P2) en tampón de homogeneización y guárdelo en frío.

La pella P1 corresponde a su sedimento enriquecido en núcleos, la pella P2 es su

sedimento rico en mitocondrias, y el sobrenadante S2 contiene la fracción
microsomal y los ribosomas.

b) Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores

moleculares.

Cada organelo contiene enzimas o moléculas que lo caracterizan, las que no se

encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos.

El DNA es la molécula marcadora de núcleos. Esta macromolécula puede ser

identificada mediante colorantes básicos que se unen a ella cuando se encuentra
ionizada, como el azul de tripán, azul de toluidina y azul B.

Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato

deshidrogenasa que cataliza la deshidrogenación estereoespecífica de Succinato
a Furamarato durante el ciclo de Krebs, según la siguientes reacción:

Succinato Succinato DH
Fumarato + 2 H+ + 2 e-

Los protones y electrones liberados permiten seguir la reacción a través de la

decoloración del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse
se torna incoloro. Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fácilmente ser
oxidado por el oxígeno del aire, y recobrar su coloración azul intensa. Para evitar
esto, se cubre el medio de reacción con aceite mineral o vaselina líquida, lo que
permite realizar la reacción en ausencia de oxígeno.
 EXPERIMENTO Nº 2:

En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensión de núcleos P1

obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo. Coloque sobre ella un
cubreobjetos y observe su preparación al microscopio usando para ello el objeto
de 40X.
Agregue el azul de tripán y vuelva a observar su preparación de núcleos. ¿Qué
observa?.

Repita el proceso con la fracción enriquecida en mitocondrias P2. Coloque una

gota de la muestra en un portaobjetos, coloque sobre ella un cubreobjetos, realice
la tinción con azul de tripán y observe al microscopio usando el objetivo de 40X.
¿Qué ocurre?

EXPERIMENTO Nº 3

Separe 4 tubos de ensayo, rotúlelos en forma adecuada y colóquelos en hielo de

manera que estén fríos. Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que
correspondan según el siguiente esquema:

Nº Tubo Succinato Azul de Agua Fracción Fracción Fracción

0,1 M Metileno destilada nuclear mitocondrial microsomal
(P1) (P2) (S2)

1 Blanco 1 mL 1 mL 1 mL - - -

2 Fracción 1mL 1 mL 1 mL 1 mL - -
nuclear

3 Fracción 1mL 1 mL 1 mL - 1 mL -
mitocondrial

4 Fracción 1 mL 1 mL 1 mL - - 1 mL
microsomal

Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 2 mL de aceite

mineral o vaselina líquida. Coloque los tubos en un baño termorregulado a 37º C
y observe si ocurre decoloración en algunos de los tubos.

ACTIVIDAD Nº 2: Observación de un corte de hígado de rata utilizando el

objetivo de inmersión.

OBJETIVO

• Aprender a utilizar correctamente el objetivo de inmersión.

El poder de resolución de un microscopio depende también de la apertura

numérica, capacidad de una lente para aprovechar la mayor cantidad de rayos
para formar la imagen. Esta puede aumentarse al usar entre el objetivo y el objeto
a observar una sustancia con índice de refracción mayor del aire. Para esto se
usan los llamados aceites de inmersión.
EXPERIMENTO Nº 4:

En base a sus conocimientos de microscopía, observe la muestra de hígado de

rata utilizando los objetivos de 4, 10 y 40 X.

Enfoque la zona que desea observar con el objetivo seco de aumento mayor (40
X). Sin bajar la platina ni cambiar la preparación de posición, gire el revólver
portaobjetivos de modo que quede en una posición intermedia entre el objetivo
mayor seco y el de inmersión. El objetivo de inmersión corresponde al aumento
de 100X, y tiene una inscripción que dice “oil”.

Deposite cuidadosamente sobre el cubreobjetos de su preparación una gota de

aceite de inmersión. Tenga cuidado de no manchar con aceite su microscopio. El
aceite de inmersión NO deber ser utilizado en los otros objetivos, por lo tanto, una
vez que se ha colocado el aceite NO deberá cambiar de objetivo sin antes limpiar
cuidadosamente el aceite usando para eso un trozo de papel absorbente especial
embebido en xilol.

Lleve el objetivo de inmersión al eje óptico y enfoque utilizando para ello el

TORNILLO MICROMETRICO. El objetivo de inmersión DEBE quedar inmerso en
el aceite.

Una vez finalizado su trabajo retire la preparación y limpie muy bien su

microscopio con xilol de manera que no queden en él restos de aceite. Recuerde
limpiar también su preparación.

BIBLIOGRAFIA

• Biología Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 ed., 2da

impresión, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires.

• Biología Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4° Edición, Ed.

Panamericana

• Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 2: Estructura y Función

Celulares. Métodos de Estudio en Biología Celular. Fraccionamiento
Subcelular. López, R.
• 1ª ed., 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de
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• Molecular Biology of de Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson.
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• The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press,

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