RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS

Centro de Transferencia de Tecnologa e Investigacin Agroindustrial LABORATORIO CETTIA UTPL

CODIGO: MMAM-06 REVISION: 5 FECHA: 2009-07-08 PGINA: 1 de 7 ELABORADO POR: D. Hualpa S. APROBADO POR: M. Jcome

UNIVERSIDAD TCNICA PARTICULAR DE LOJA ESCUELA DE BIOQUMICA Y FARMACIA LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA: Determinacin de aerobios mesfilos por agar. OBJETIVO: Cuantificar y reconocer las colonias de microorganismos aerobios mesfilos en agar plate count.

1.

ALCANCE

Se aplica a la enumeracin de Aerobios mesfilos en alimentos. El mtodo es apropiado para la determinacin de Aerobios mesfilos en alimentos. 2.- DESCRIPCIN DEL TIPO DE ITEM La muestra es alimentos en general, excepto productos fermentados. 3. PRINCIPIO

Las bacterias aerobias mesfilas son todas las bacterias capaces de desarrollarse en un medio nutritivo incubado en condiciones de aerobiosis. Las bacterias mesfilas tienen varios usos como indicadores: Determinan la posible presencia de bacterias patgenas. La mayora de bacterias patgenas son mesfilas y por tanto un recuento elevado de bacteriuas mesfilas aerobias indica que existieron condiciones que favorecieron el que ciertos microorganismos patgenos proliferaran considerablemente encontrndose en el alimento en gran nmero. Indican la calidad sanitaria de un alimento natural o procesado, ya que stos productos deben satisfacer ciertas especificaciones microbiolgicas (Normas de Calidad). Estiman la duracin de la vida de anaquel de un producto, ya que generalmente existe una relacin directa entre el grado de descomposicin y el contenido microbiano (excepto en productos fermentados o madurados.

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4.

PARMETRO Y RANGO >1 ufc/g

5. CONDICIONES AMBIENTALES REQUERIDAS Y PERODO DE ESTABILIZACIN QUE SEA NECESARIO.

Las condiciones ambientales en las que normalmente se trabaja son: Temperatura: 18 24 C Humedad Relativa: 45 65 %

6.- MEDIDAS DE SEGURIDAD

En el laboratorio de microbiologa se debe considerar lo siguiente: Ingresar al laboratorio con mandil limpio y desinfectarse los zapatos con una solucin de alcohol al 70%. Trabajar con guantes, gorro, mascarilla Incinerar, agujas, azas de platino 5 veces despus de haber terminado el trabajo de siembra. Lavarse las manos peridicamente con jabn antibacterial y secarse con toallas desechables. Ubicar correctamente las secciones donde se encuentra el material contaminado del material estril. No ingresar con alimentos. No hablar mientras se realiza la siembra. Las pipetas que han sido utilizadas despus de la siembra se las debe sumergir en agua con cloro. Al usar la Cepa de Referencia ATCC 6538, para la recuperacin de los microorganismos tener cuidado en trabajar en la cmara de seguridad biolgica, para evitar contaminarse.

7. -

APARATOS Y EQUIPOS: 1 Erlenmeyer de 500 ml 3 Erlenmeyer de 250 o 125 ml 3 pipetas de 10 ml 3 pipetas de 1 ml Un mechero Un trpode Una malla de amianto 7 cajas Petri

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Fsforos Contador de colonias Incubadora a 35 C. Cmara de seguridad Biolgica 2B2

8. REACTIVOS, PATRONES DE REFERENCIA Y MATERIALES DE REFERENCIA

REACTIVO

CODIGO DE LABORATORIO ESPECIFICACIONES

Agar Plate count Peptona de casena Cepa de referencia de S. aureus LSRC-6538

Certificado de lote de fabricacin

Cepa pura bacteriana con certificado

9.

DESCRIPCIN DEL PROCEDIMIENTO

9.1 MARCAS DE IDENTIFICACIN Las muestras para la determinacin de Aerobios Mesfilos deben identificarse con mismo cdigo asignado. 9.2 TRANSPORTE DE LOS ITEMS DE ENSAYO Las muestras deben transportarse en una bandeja adecuada para el efecto para evitar derrames o daos en las mismas. un

9.6 VERIFICACIONES PREVIAS Se debe verificar lo siguiente: Revisar los termmetros en la etiqueta que se encuentren dentro de la fecha de calibracin. Revisar que los medios de cultivo no estn expirados.

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9.7 VERIFICACIN DE EQUIPOS, FUNCIONAMIENTO Y CALIBRACIN. Se realiza una verificacin de todos los registros: La temperatura de la incubadora (35 +/- 1 C) La cmara de seguridad Biolgica flujo de aire se encuentre dentro de lmites segn instructivo I.5.6.2.31. Si se va a trabajar con mechero se debe revisar las conexiones de gas

9.9 METODOLOGA 9.9.1 SIEMBRA

Pesar aspticamente 10 gramos de muestra en 90 ml de agua peptonada para obtener la -1 dilucin 10 luego seguir preparando las siguientes diluciones de acuerdo al tipo de alimento. -2 De esta solucin tomar 10 ml y poner en 90 ml de agua peptonada esta ser la dilucin 10 , de la misma manera tomar 10 ml de esta solucin y poner en 90 ml de agua peptonada esta ser -3 la dilucin 10 . - Con una pipeta perpendicular a la caja Petri poner 1 ml de cada una de las diluciones. - Poner aproximadamente 15 a 20 ml de agar plate count fro y templado a 45 grados centgrados, agitar suavemente 3 veces a la izquierda, 3 a la derecha una arriba y otra abajo sin levantar la caja de la mesa. Dejar solidificar. - Poner las placas en la incubadora a 35 grados centgrados por 48 horas. - Realizar el conteo de las colonias de aerobios mesfilos. - Realizar el conteo entre 25-250 colonias. 9.9.2 INTERPRETACION Y RESULTADOS Para diferenciar las colonias de aerobios mesfilos en el agar plate count, busque algunas de las siguientes caractersticas tpicas del cultivo: colonias de color crema. Para calcular el contaje de aerobios mesfilos, multiplicar el nmero total de colonias de aerobios mesfilos por placa por el respectivo factor de dilucin. Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas, calcule el nmero promedio de colonias de cada dilucin antes de determinar el contaje total de aerobios mesfilos. Se puede hacer contajes estimados en placas con ms de 250 colonias y puede ser reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el contaje promedio / 1 cm 2 y multiplicar por 30 (rea de crecimiento circular de 30 cm2).

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9.10 FIGURAS EXPLICATIVAS

A continuacin podemos observar las colonias de aerobios mesfilos.

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9.11 DIAGRAMA DE PUNTOS CRTICOS Verificar el estado de calibracin de la balanza Encerar con la cabina cerrada Verificar el nivel de la balanza La muestra debe ser completamente homognea. Pesar la muestra realizando un cuarteo imaginario tomando 2.5 g de cada parte. Triturar en una funda estril si es slida. Homogenizar completamente con el agua de dilucin

PESAJE DE LA MUESTRA

PREPARACIN MUESTRA

DE

LA

PREPARACIN DE DILUCIONES

Agitar en ngulo de 90 , 30 veces en 30 segundos Si son muestras slidas dejar reposar por un minuto y tomar la alcuota de la superficie.

INCUBACIN

La incubacin debe realizarse en incubadora calibrada con patrn.

9.12 ELIMINACIN DE RESIDUOS

Los residuos se eliminan en el autoclave de desechos 15 minutos a 15 PSI, poniendo la cinta de esterilizacin para comprobar la temperatura y presin. Una vez destruidos se los puede desechar en la basura comn.

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10. FRMULA DE CLCULO Para realizar el recuento de Aerobios mesfilos se utiliza la siguiente frmula:

Recuento de aerobios mesfilos = nmero de colonias contadas por el inverso de la dilucin.

11. CRITERIOS DE ACEPTACIN Y RECHAZO Los criterios de aceptacin y rechazo para los duplicados es de 5%. Los blancos de medios de cultivo, aguas de dilucin deben ser igual a cero, de lo contrario repetir el ensayo.

13. EXPRESIN DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan en ufc/g o ml de alimento y en forma exponencial. 14. INCERTIDUMBRE. El valor de la incertidumbre calcula del mtodo es: (<50, 14%) y (>50, 5%)

15. BIBLIOGRAFIA AOAC 990.12