CICLO CELULAR PROCARITICO

Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comienza con la formacin de una nueva clula y termina cuando dicha clula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procaritico son: fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico; fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular; fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica. Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.

2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIN DEL TIEMPO DE GENERACIN

Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qu ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generacin. Cuando g>C+D Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas condiciones podemos observar ntidamente periodos diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin celular). Cuando g=C+D Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir, cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la clula inicia la divisin celular). Cuando g<C+D Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que haya terminado la divisin celular del anterior (superposicin parcial entre fases C y D). Cuando g<C ya no se puede detectar fase D como tal. La sntesis de ADN es continua durante todo el ciclo. Se inician rondas de replicacin cromosmica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un tpico patrn de replicacin dicotmica y en que dichos cromosomas pasan a cada clula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicacin. Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas. Es decir, los individuos

de una cepa bacteriana que est en un medio rico son ms grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.

2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR

De lo anterior se deduce que debe de existir algn tipo de acoplamiento entre las ondas de replicacin y la divisin celular. Este es un campo de investigacin an joven, del que no conocemos todava todos los detalles. Las copias de cromosomas recin replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citoplsmica (unidas a sendos mesosomas?) probablemente unidas a travs de sus respectivos orgenes de replicacin (oriC). No se sabe muy bien cmo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una clula hija. Se sabe que en este reparto o particin de los cromosomas intervienen varias protenas, entre ellas ParA y ParB, que en las clulas a punto de dividirse se sitan en los dos polos opuestos. Es posible que exista algn mecanismo activo para separar estos cromosomas, pero parece ser que tambin intervienen los mecanismos pasivos de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento. Tambin se sabe hoy que existen dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular: un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicacin del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral (en el caso de los bacilos) para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formacin del tabique. El comienzo de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de muchas unidades de la protena DnaA (unida a ATP) al origen de replicacin (oriC). Una vez que se ha iniciado una ronda de replicacin en oriC, esta regin queda hemimetilada, pero en vez de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa Dam y de la maquinaria de replicacin. Se sugiere que en este fenmeno est implicada una protena (SeqA), que a su vez ayudara a esconder a oriC en la membrana. Slo ms tarde (y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporcin entre sitios de inicio y algn parmetro celular como masa o volumen), vuelven a quedar las secuencias oriC disponibles para su metalicin y uso en una nueva ronda.
NOTA: La metilasa Dam es una enzima que metila las dos adeninas de la secuencia GATC/CTAG. El alumno seguramente sabr ya que esta metilasa metila las adeninas de esa secuencia a partir de ADN hemimetilado. El ADN de la clula est totalmente metilado en esas secuencias, pero cuando pasa la horquilla de replicacin, la cadena recin sintetizada carece de esa modificacin, hasta que llega la metilasa Dam, que reconoce la secuencia hemimetilada y metila la adenina de la cadena no metilada. Un rasgo curioso de la regin oriC para el inicio de la replicacin cromosmica es que contiene una proporcin de secuencias GATC/CTAG muy superior a la media del resto del genoma.

El comienzo de la tabicacin parece que requiere dos seales:

por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas deben de estar separadas en extremos opuestos por otro lado, la clula debe haber alcanzado una longitud umbral Llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta entonces estaba diseminada por toda la clula), se concentra ahora en la parte central, sealando el plano de la tabicacin: se forma un anillo citocintico o divisoma, en el que la FtsZ se va contrayendo hacia el interior (hidrolizando GTP hasta GDP). A continuacin se van ensamblando en el divisoma varias protenas Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una transglucosidasa-transpeptidasa especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. La terminacin del tabique seala el final del ciclo celular.

INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LOS PROCARIOTAS

Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procariticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo cmodamente a pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En este captulo veremos algunas de estas notables adaptaciones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que 1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

2)

condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales; permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para: a) b) c) la mutagnesis, la esterilizacin y desinfeccin, la quimioterapia.

3)

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciacin (si la hubiera) o de reproduccin. Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera: Agentes fsicos (tema 13) Temperatura Desecacin Radiaciones Ondas sonoras Presin hidrosttica Presin osmtica pH Agentes qumicos (tema 14) Desinfectantes y antispticos Quimioterpicos de sntesis Antibiticos

2 EFECTO DE LA TEMPERATURA

2.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

La temperatura es uno de los parmetros ambientales ms importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generacin, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva caracterstica de tasa de crecimiento en funcin de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos caractersticos llamados temperaturas cardinales:

Temperatura mnima: por debajo de ella no hay crecimiento; Temperatura mxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento; Temperatura ptima: permite la mxima tasa de crecimiento (o sea, g mnimo). El margen entre la temperatura mnima y la mxima se suele llamar margen de crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.

La temperatura mnima se puede explicar en funcin de un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de protones. Por encima de la temperatura mnima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura ptima, debido a que las reacciones metablicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su ptimo. En dicha temperatura ptima las enzimas y reacciones se dan a su mxima tasa posible. A partir de la temperatura ptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura mxima. Dicha temperatura refleja desnaturalizacin e inactivacin de protenas enzimticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplsmica y a veces lisis trmica de la bacteria. Obsrvese en el grfico que la temperatura ptima est ms cerca de la mxima que de la mnima.

2.2

CLASES DE MICROORGANISMOS SEGN LA TEMPERATURA: ADAPTACIONES EVOLUTIVAS

Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura ptima superior a la temperatura mxima de otra, o inferior a la temperatura mnima de una tercera. Segn el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales: 2.2.1 MICROORGANISMOS PSICRFILOS

Las psicrfilas o crifilas: crecen a partir de entre -5 a 5C. a) Las llamadas psicrfilas obligadas tienen temperatura ptima a 1518C, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antrtida es lo que pudiramos llamar un psicrfilo extremo: tiene su ptimo de crecimiento en 4C, y es incapaz de crecer a 14C (se muere de calor!). Las psicrfilas facultativas o psicrotolerantes (tambin llamadas psicrotrofas) presentan temperatura ptima en torno a los 20-30C y mximas a los 35C. Las bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.

b)

Ejemplos de medios permanentemente fros son la mayor parte de las aguas ocenicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan slo 1-2C por encima de cero) y las reas permanentemente heladas del rtico y de la Antrtida. En los medios helados existen pequeas bolsas o microcavidades de agua lquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no bacteriano muy caracterstico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis), que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaa a mitad de la estacin estival. Las principales adaptaciones bioqumicas a medios fros exhibidas por estos microorganismos psicrfilos son: enzimas ms resistentes al fro; sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas; los fosfolpidos de la membrana celular aumentan la proporcin de cidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitndose su congelacin. Los psicrotrofos (psicrfilos facultativos) son ms abundantes, ya que estn adaptados a soportar grandes oscilaciones trmicas, y en verano pueden crecer a unos 30C-40C. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y hortalizas) que se guardan en frigorficos, alterando las cualidades organolpticas e incluso, echndolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido). 2.2.2 MICROORGANISMOS MESFILOS

Los mesfilos presentan temperaturas ptimas a los 25-40C y mximas entre 35 y 47C. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patgenas) pertenecen a esta categora. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los simbiontes y parsitos, pertenecen a esta categora. 2.2.3 MICROORGANISMOS TERMFILOS

Las nicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65C son todas procariotas. Los termfilos presentan ptimos a 50-75C y mximos entre 80 y 113C. Dentro de esta categora se suele distinguir las termfilas extremas (=hipertermfilas), que pueden llegar a presentar ptimos cercanos a los 100C, y que taxonmicamente pertenecen al dominio de las Archaea.

Los hbitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50C) estn restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenmenos volcnicos: fuentes termales volcnicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japn, Nueva Zelanda e Islandia); fuentes termales submarinas: los llamados humeros (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales ocenicas); fumarolas Los materiales en fermentacin como acmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar 65C.
Como ejemplo clsico, muy conocido por documentales de divulgacin, recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe la mayor concentracin mundial de fuentes volcnicas, con giseres que emiten a ms de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones de +/1 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullicin. El riachuelo que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. All fue donde T.D. Brock descubri la eubacteria termfila Thermus aquaticus, de la que se extrae la ADN polimerasa termorresistente (Taq) empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) automatizada. Recientemente se est recurriendo a usar la polimerasa de una arquea hipertermfila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy bien a 100C.

Los hipertermfilos, con ptimos por encima de los 80C son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas arqueas (ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su ptimo nada menos que a 105C y puede llegar a aguantar 113C, y parece que detiene su metabolismo (por fro) a la agradable temperatura de 90C (!). Las termfilas facultativas pueden crecer a menos de 37C, como p. ej. la eubacteria Thermus aquaticus. Se han aislado bacterias termfilas en medios artificiales, como calentadores de agua domsticos e industriales. Las principales adaptaciones bioqumicas a altas temperaturas en clulas vegetativas bacterianas son: enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrfobo; ribosomas termorresistentes;

membranas ricas en cidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofbicos ms fuertes.

EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS

Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mnima) no son tiles para la esterilizacin, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelacin (p. ej., especies patgenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo, bacteriosttico, sin contar aquellos organismos psicrfilos o psicrotrofos. Los efectos de someter una suspensin bacteriana a temperaturas menores de 0C dependen de: el medio donde estn suspendidas las bacterias; el modo en que se realice la congelacin y una ulterior descongelacin. Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelacin del medio, el citoplasma queda en sobrefusin (sin congelar) entre -1 y -10C. Pero como la tensin de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser: por prdida de agua de la clula (cuando la congelacin se efecta lentamente), o bien por cristalizacin de agua en el interior (cuando la congelacin se realiza rpidamente). En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la solucin del citoplasma puede llegar a saturarse, con precipitacin de sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentracin de electrolitos provocan la desnaturalizacin de protenas y daos a la membrana; otro efecto de menor importancia es el dao mecnico a la pared celular y a la membrana provocado por los cristales de hielo. En general, el enfriamiento rpido es ms lesivo que el lento, existiendo una velocidad ptima. Cuando una bacteria se enfra rpidamente a -35C se producen cristales de hielo que provocan daos cuando la muestra se descongela. Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelacin, y el nmero de ciclos de congelacin-descongelacin. La descongelacin lenta es ms letal que la rpida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo. Aplicaciones de la congelacin:

La congelacin se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cmo se efecta tanto la congelacin como la descongelacin. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutctico: en nieve carbnica (CO2 slido), a -78C; en nitrgeno lquido, a -180C. Por ello, este mtodo es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbnica o nitrgeno lquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos enseguida, hay mtodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo. Para preservar an mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a aadir a la suspensin ciertas sustancias, como por ejemplo: Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificacin amorfa y vtrea, en lugar de la cristalizacin, evitando as la formacin de zonas intracelulares con alta concentracin de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfxido (DMSO). Materiales ricos en protena: leche, suero, extracto de carne. Protenas purificadas (p. ej., la albmina). Determinadas macromolculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.

EFECTO DEL pH
La mayora de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno ptimo prcticamente constante. Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor. Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, stas se pueden clasificar en: Neutrfilas, si crecen de modo ptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8). Acidfilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5. Alcalfilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5. La mayor parte de las bacterias son neutrfilas. Muchas bacterias neutrfilas modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente cidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan cidos, mientras otras alcalinizan el

medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminacin de aminocidos. Por otro lado, la mayor parte de los hongos y levaduras requieren pHs ligeramente cidos (en torno a 4-5). Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen ms o menos amplio de pH (alrededor de un ptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplsmico cae rpidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir. Uno de los mecanismos que, al menos en neutrfilos parece controlar el pH interior es un sistema de antiporte H+/K+: a pH cidos, el interior celular puede quedar en principio ms alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer una fuerza protn motriz que les suministre energa. Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a cidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (protenas celadoras) para corregir las protenas desnaturalizadas. Existen algunos notables procariotas cuyo pH ptimo es muy bajo (acidfilos extremos u obligados): Algunas eubacterias del gnero Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas de los gneros Sulfolobus, Thermoplasma y Ferroplasma tienen su ptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta cido sulfrico. (Sulfolobus es un Secciones un termoacidfilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran. Una arquea sorprendentemente acidfila es Picrophilus oshimae, cuyo pH ptimo es nada menos que 0.7 (aparte de que es una termfila que necesita temperaturas de ms de 60C). Las especies alcalfilas obligadas tienen ptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hbitats tpicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son tambin halfilos, como Natronobacterim gregoryi). Estos organsimos tienen gran inters industrial, porque de ellos se obtienen enzimas hidrolticas como proteasas y lipasas que se usan como aditivos en detergentes. .