西北国防医学杂志 　 (M ed J NDFNC ) 　2005 　Oct.

; 26 ( 5 ) 325

・论著 ・
抗肝癌 hdsFv融合 hEDN 重组免疫毒素对体外培养的
人肝癌细胞的杀伤作用
1 2 3 3 3 3 1
付 　勇 , 苏雪梅 , 刘彦仿 , 杨守京 , 赵 　君 , 李锴男 , 邹赛英
( 1. 兰州军区乌鲁木齐总医院病理科 ,新疆 乌鲁木齐 　830000; 　2. 解放军第 15 医院妇产科 ; 　3. 第四军医大学基础部病理
学教研室 )

摘要 : 目的 : 探讨重组免疫毒素 hdsFv - hEDN 在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化 , 观察其体外杀伤作用 。方法 : 利用 IPTG诱

导 hdsFv - hEDN 免疫毒素在大肠杆菌中的表达 。诱导转化菌经超声碎菌 、
离心 、N i - NTA Agarose亲合层析等步骤纯化 ,并通
过 SDS - PAGE和 W estern - blot进行分析及检测 。采用 M TT比色法观察其对人肝癌细胞的杀伤作用 。结果 : IPTG诱导后 ,
hdsFv - hEDN 在大肠杆菌中获得了可溶性表达 ,表达量为 8% 。表达产物纯化后 , 纯度达到基本均一 。M TT结果表明 , 其对
人肝癌细胞具有一定的杀伤作用 。结论 : 本研究实现了 hdsFv - hEDN 重组免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化 ,获得
了具有一定杀伤作用的抗肝癌重组免疫毒素 。
关键词 : 肝细胞癌 ; 　免疫毒素 ; 　单链抗体 ; 　人嗜酸性细胞神经毒素
中图分类号 : R 735. 7 　　　文献标识码 : A 　　　文章编号 : 1007 - 8622 ( 2005 ) 05 - 0325 - 04

K illin g effect of the recom b inan t imm unotox in hdsFv fusin g hED N aga in st hepa tocellular carc in oma cell
in vitro

FU Yong, SU Xue - m ei, L IU Yan - fang, et a l. (Departm ent of Pathology, U rumchi General Hosp ital, Lanzhou
Command, PLA , 830000, China )

Abstract:O bjective: To exp ress in soluble form and purify the recom binant immunotoxin hdsFv - hEDN against
HCC, and observe its killing effect on hum an hepatocellular carcinom a cell. M ethods: The p rokaryotic exp ression
vector containing the recombinant imm unotoxin fusion gene of hdsFv - hEDN against HCC was transformed into E.
coli BL21 (DE3 ) p lyS and exp ressed in the p resence of IPTG. The E. coli was lysed by ultrasonication and was cen2
trifugated. Supernatant of the lysate was purified by N i - NTA Agarose affinity chromatography. The exp ressed and
purified p roducts were analyzed and confirm ed by SDS - PAGE and western - blot analysis. M TT colorim etry was
used to detect its killing effect on hum an hepatocellular carcinom a SMMC - 7721 grown in vitro. Results: The
recom binant immunotoxin hdsFv - hEDN against HCC was successfully induced to exp ress in soluble form by IPTG
at 28 ℃ for 4 h. The exp ressed fusion p rotein accounted for 8% of the total bacterial p rotein. The results of M TT
showed the recom binant immunotoxin hdsFv - hEDN has killing effect to som e extent on SMMC - 7721 cells, but
has no influence on norm al liver cells. Conclusion : The recombinant imm unotoxin hdsFv - hEDN against HCC,
which m ay have some potential value in the treatm ent of hepatocellular carcinoma, has been successfully exp ressed
in soluble form in E. coli and purified. This study lays a foundation for the further study of targeting therapy on
HCC.
Key words: Hepatocellular carcinoma; 　 Immunotoxin; 　Single chain Fv; 　 hEDN

　　目前 ,肝癌的治疗仍是肝癌研究亟待解决的重 大课题之一 。近年来 , 免疫毒素在肝癌的导向治疗

中显示出巨大的应用前景 , 为攻克肝癌这一顽疾带
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 30370810)
收稿日期 : 2005 - 06 - 21 来 了 希 望。文 献 研 究 表 明 , 核 糖 核 酸 酶
作者简介 : 付 　勇 ( 1971 —) ,男 ,博士 , 主治医师 , Tel: 0991 - 4992101 ( ribonuclease , RNase )超家族中的人嗜酸性细胞神
- 418
 326
经毒素 ( hEDN ) 对恶性肿瘤细胞具有细胞毒性 , 表
[ 1. 2 ]
现出较强的抗肿瘤作用 。在本研究中 , 我们尝
试进行了 hdsFv - hEDN 重组免疫毒素在大肠杆菌
中的可溶性表达及其纯化 , 并初步进行了其对人肝
癌细胞的体外杀伤作用的研究 。
1 　材料和方法
1. 1 　材料
1. 1. 1 　质粒 、
菌株及细胞系 : 质粒 pTIH - hdsFv -
hEDN 为作者构建 , 其中含有 hdsFv - hEDN 重组免
疫毒素融合基因 、E - tag和 6 ×H is编码基因 。大肠
杆菌 BL21 ( DE3 ) p lyS 菌株和人肝癌细胞系 SMMC
- 7721 为本室保存 。
1. 1. 2 　工具酶及主要试剂 : 核酸分子量标准 、
低分
子量蛋白质标准 、
丙烯酰胺和 N , N - 亚甲双丙烯酰
胺购自华美生物公司 。 IPTG、
硝酸纤维素膜和 M TT
购自上海生工生物工程技术服务有限公司 。 N i -
NTA Agarose 购自 Q IA GEN 公司 。 RPM I 1640 培基
和超级新生牛血清购自 GIB CO 公司 。鼠抗 E - Tag
单克隆抗体购自 Am ersham Pharmacia 公司 。 HRP
标记的羊抗鼠 IgG及 DAB 显色剂购自 Dako 公司 。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　重组免疫毒素融合基因原核表达载体的构
建 : 构建抗肝癌 hdsFv - hEDN 重组免疫毒素融合基
因原核表达载体 pTIH - hdsFv - hEDN , 构建方法见
文献 [ 3 ]。
1. 2. 2 　重组免疫毒素的可溶性诱导表达 : 将重组原
核表达载体 pTIH - hdsFv - hEDN 转化 E. coli BL21
(DE3 ) p lyS后 ,过夜菌次日按 1. 5%接种 37 ℃振荡
培养 至 A600 nm 约 为 0. 5 时 , 加 入 终 浓 度 为 0. 25
mmol/L IPTG,转入 28 ℃继续诱导培养 4 h, 离心收
集菌体 ,进行 SDS - PAGE 电泳 。
1. 2. 3 　重组免疫毒素的纯化 : 离心收集菌体 , 将菌
体重悬于 100 m l裂解缓冲液中 , 加入溶菌酶 4 ℃作
用 30 m in 后 , 在冰浴条件下以间接超声碎菌 。离
心 ,取上清在非变性条件下进行 N i - NTA Agarose
亲合层析法纯化 。纯化过程按 Q IA GEN 公司产品操
作说明进行 。纯化产物取样进行 SDS - PAGE 电泳
鉴定 ,温和复性并定量 , 4 ℃保存备用 。
1. 2. 4 　免疫印迹 (W estern - blot) 分析 : IPTG 未诱
导菌 、 诱导菌及纯化产物经 SDS - PAGE 电泳后 , 半
[3]
干转移至硝酸纤维素膜上 ,进行免疫印迹分析 。
1. 2. 5 　重组免疫毒素的杀伤活性 : 将生长旺盛的人
肝癌细胞 SMMC - 7721 细胞和正常肝细胞 HL02,按
4
1 ×10 个 /L 接种 96 孔板 , 37 ℃培养 24 h 弃去旧培
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养液 ,加入过滤除菌的不同稀释度的免疫毒素 ,进行
M TT实验 ,设立 PB S空白对照 。细胞存活率 =实验
组 A495 nm /对照组 A495 nm ×100% 。采用 SPSS10. 0 软
件进行 Probit分析 ,利用 logit模型法进行参数估计 ,
求出半数致死量 IC50 。
2 　结果
2. 1 　重组免疫毒素的可溶性诱导表达 : 与未诱导转
化菌相 比 , 含 重 组 原 核 表 达 载 体 pTIH - hdsFv -
3
hEDN 的工程菌在相对分子质量约为 45 ×10 处出
现一条新生蛋白带 , 与预期的目的蛋白分子量大小
一致 ,且目的蛋白表达产物部分以可溶性形式表达 ,
表达量约占细菌总蛋白的 8% 。
2. 2 　重组免疫毒素的纯化 : 将表达上清液经分离纯
化后 , SDS - PAGE 电泳可见重组免疫毒素纯度达到
基本均一 (图 1 ) 。
1: Total cell lysate of uninduced
2: Supernatant of induced
3: Total p rotein of induced
4: Precip itation of induced;
5: Purified p roduct;
6: Low molecular p rotein marker
图 1 　hdsFv - hEDN 融合蛋白可溶性表达及纯化 SDS - PAGE
Fig1 　 Analysis of exp ressed in soluble form and purified p roduct of
hdsFv - hEDN fusion p rotein by SDS - PAGE
2. 3 　W estern - blot分析 : 结果显示 , 在相对分子量
3
为 45 ×10 处出现特异性反应条带 , 分子量大小与
目的蛋白分子量大小相一致 , 而未诱导转化菌在相
应位置则无显色条带出现 (图 2 ) 。
2. 4 　可溶性表达产物的杀伤活性 : 细胞存活率结果
表明 ,重组免疫毒素对肝癌细胞 SMMC - 7721 的杀
伤率随其浓度增加而提高 , 而对正常肝细胞 HL02
的生长几乎无影响 。当重组免疫毒素浓度为 0. 038
mg /m l时 , 杀伤率为 50% 。以上结果提示 , 重组免
疫毒素 hdsFv - hEDN 对人肝癌细胞具有一定的杀
伤作用 (图 3 ) 。
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时 ,我们在重组免疫毒素融合基因 C 末端引入了 6
×H is和 E - tag标签蛋白序列 , 它通常对表达产物
的正确折叠影响较小 , 相对于 GST 等标签蛋白来
说 ,不会严重影响融合蛋白的生物学活性 ,也不必通
过酶水解去除 ,从而可作为标签蛋白用于目的蛋白
的鉴定及纯化 。为了尽可能保持重组免疫毒素的活
性 ,我们在本实验研究中利用大肠杆菌表达系统 ,通
过尝试选择合适的宿主菌及优化诱导表达条件 , 成
功进行了 hdsFv - hEDN 重组免疫毒素在大肠杆菌
中的可溶性表达 , 并通过 N i - NTA Agarose 亲合层
1: Low molecular p rotein marker
析法对可溶性表达的抗肝癌 hdsFv - hEDN 重组免
( from top to bottom: 97. 4 , 66. 2 , 43. 0 , 31. O , 20. 1 , 14 KD )
疫毒素进行了纯化 , 获得了纯度较高的且对体外培
2: Uninduced pTIH - hdsFv - hEDN
3: Induced pTIH - hdsFv Hedn 养的肝癌细胞具有一定杀伤作用的目的蛋白 。尽管
4: Purified p roduct 目的蛋白的表达量还不十分理想 , 其对肝癌细胞的
图 2 　 pTIH - hdsFv - hdsFv - hEDN 诱导表达产物的免疫印迹分析 杀伤活性有待进一步提高 , 但我们的工作初步为重
Fig2 　 Analysis of pTIH - hdsFv - hEDN by western - blot
组免疫毒素进行肝癌的导向治疗研究提供了有意义
的尝试 。
参考文献 :
[ 1 ]M atousek J. R ibonucleases and their antitumor activity[ J ].
Comp B iochem and Physiol C Toxicol Pharmacol, 2001, 129
( 3 ) : 175 - 191.
[ 2 ]付 　勇 , 刘彦仿 . 核糖 核酸酶 的抗 肿瘤作 用研 究进展
[ J ]. 国外医学生理病理科学与临床分册 , 2003, 23 ( 1) :
图 3 　重组免疫毒素 hdsFv - hEDN 的导向细胞毒作用 67 - 69.
Fig3 　 Cytotoxic effect of immunotoxin hdsFv - hEDN test [ 3 ]付 　勇 , 刘彦仿 , 赵 　君 , 等 . 二硫键稳定的人源化抗
肝癌单链抗体与人嗜酸细胞神经毒素重组免疫毒素的
3 　讨论 构建及表达 [ J ]. 西北国防医学杂志 , 2004, 25 ( 5 ) : 325
免疫毒素应用于肿瘤的导向治疗 , 在近年来的 - 328.

研究中发展非常迅速 , 目前国内外已有数种抗肿瘤 [ 4 ] Bodey B , Bodey BJ, Siegel SE, et a l. Genetically engi2

[ 4, 5 ] neered monoclonal antibodies for direct anti - neop lastic
免疫毒素进入临床 Ⅰ、Ⅱ期试验 。基因重组免
treatm ent and cancer cell specific delivery of chemothera2
疫毒素分子量小 , 对实体瘤穿透力强 , 易于大量生
peutic agents[ J ]. Curr Pharm Des, 2000, 6 ( 3 ) : 261 -
产 ,在肿瘤的生物治疗中具有广泛的应用前景 。大
276.
量研究表明 ,核糖核酸酶 ( ribonuclease, RNase ) 不但 [ 5 ] Kreitm an RJ, W ilson WH , W hite JD , et a l. Phase Ⅰ trial
具有催化活性 ,而且具有细胞毒性 ,能够选择性杀伤 of recombinant immunotoxin anti - Tac ( Fv) - PE38 (BL22)
[ 1, 2 ]
恶性肿瘤细胞 。与植物或细菌来源的毒素蛋白 toward fresh malignant cells from patients w ith B - cell leu2
相比 ,细胞毒性 RNase 作为毒素弹头制备的免疫毒 kem ias[ J ]. Clin Cancer Res, 2000, 6 ( 4 ) : 1476 - 1487.
素 ,能够在一定程度上克服传统免疫毒素免疫源性 [ 6 ]Hursey M , New ton DL , Hansen HJ, et a l. Specifically tar2

较强的缺陷 ,部分已在抗肿瘤药物的临床试验研究 geting the CD22 recep tor of human B - cell lymphomas w ith
[ 6, 7 ] RNA damaging agents: a new generation of therapeutics
中取得较显著的疗效 。
[ J ]. Leuk Lymphoma, 2002, 43 ( 5 ) : 953 - 959.
研究表明 ,二硫键稳定人源化抗肝癌 hdsFv, 具
[ 8 ～10 ] [ 7 ] Thomas PB , Delatte SJ, Sutphin A , et a l. Effective targeted
有良好的导向作用 。在过去的研究中 , 我们成
cytotoxicity of neuroblastoma cells [ J ]. J Pediatr Surg,
功地构建了抗肝癌重组免疫毒素 hdsFv - hEDN 融 2002, 37 ( 3 ) : 539 - 544.
[3]
合基因原核表达载体 pTIH - hdsFv - hEDN ,表 [ 8 ]孙志伟 ,俞炜源 ,孙 　岩 ,等 . 二硫键稳定的抗肝癌人源
达质粒 pTIH 是在 pET22b ( + ) 基础上改造 ,其中增 化 scFv - hTNFα 突变体融合基因 在大肠 杆菌 中表达
加了可促进融合基因可溶性表达的 Trx 基因 。同 [ J ]. 细胞与分子免疫学杂志 , 2002, 18 ( 3 ) : 221 - 224.
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[ 9 ]张 　静 ,刘彦仿 ,杨守京 ,等 . 人源化抗肝癌单链抗体融 [ 10 ]赵 　君 ,孙志伟 , 刘彦仿 , 等 . 抗肝癌单链抗体与 PE38

合突变型 TNFα的导向作用 [ J ]. 世界华人消化杂志 , 2003, 融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达 [ J ]. 第四军医大学学
11 ( 3 ) : 285 - 288. 报 , 2003, 24 ( 10 ) : 896 - 898.

・病例报告 ・
胰腺囊 - 实性肿瘤 2 例

钱 　震 ,杨育生 ,董 　亮 ,苏勤军
(兰州军区兰州总医院病理科 ,甘肃 兰州 　730050)

关键词 : 病理学诊断 ; 　胰腺肿瘤 ; 　囊 - 实性

中图分类号 : R 446. 8 　　　文献标识码 : D

　　胰腺囊 - 实性肿瘤 ( cystic and solid tumors of the pancre2 据文献统计 CSTP好发于青年及中年女性 ,平均年龄 21. 8 ～
as, GSTP )是一种罕见的交界性或低度恶性的胰腺肿瘤 , 多 23. 9 岁 ,临床上多表现为无痛性肿物 , 少数伴腹痛或不适 。
发于青年女性 , Frantz于 1959 年首次描述该肿瘤 [ 1 ] , 本文中 胃壁外也有报道 [ 2 ] 。肉眼
肿瘤多位于胰头或胰尾 , 腹膜后 、
报道 2 例 ,以引起临床高度重视 。 观 ,瘤体多为囊实性 ,囊内含黏稠浑浊液 。病理组织学特征 :
1 　临床资料 主要为实性和假乳头两种排列方式 ,瘤细胞围绕纤维血管复
2 例均为女性 , 20 岁和 24 岁 ,均为体检时偶然发现胰腺 层排列而形成的假乳头为其特征 。肿瘤细胞形态较一致 ,核
占位性病变 ,自诉无明显不适 , 1 例 MR 诊断为畸胎瘤 , 另 1 异形性不明显 , 间质出血 、
坏死 、
黏液变性 、
胆固醇裂隙和泡
例诊断为胰腺囊腺瘤 。实验室检查 : 血糖 ,血 、
尿淀粉酶均正 沫状组织细胞是常见的继发性改变 。
常 。术中见肿瘤分别位于胰头部和胰体部 , 与周围界限清 CSTP需与下列胰腺肿瘤鉴别 : ①非功能性胰岛细胞瘤 ,
晰 ,有完整包膜 。 1 例术后随访 5 年 ,无复发和转移 。 年轻女性多见 ,但缺乏 CSTP 特征性的纤维血管为轴心的假
2 　病理资料 乳头结构 。免疫组织化学显示 NSE、CgA 均阳性 ; ②胰母细
　　肉眼观察 : 瘤体分别为 8 cm ×6 cm ×6 cm , 6 cm ×4 cm 胞瘤 , 10 岁以下儿童多见 ,组织学上可显示未分化的实性区 、
×3. 5 cm ,类圆形结节状 ,有完整的纤维性包膜 ,与胰腺界限 导管及腺泡区 ,并可见鳞状上皮岛 ,但缺乏假乳头结构 ; ③腺
清楚 ,切面呈囊实性 ,囊性区含棕褐色浑浊液体 ,实性区灰白 泡细胞癌 ,男性好发 ,腺泡细胞癌与周围组织分界不清 ,组织
灰红相间 ,质地细软 。镜下观察 : 肿瘤与正常胰腺之间有厚 学上瘤细胞呈腺泡状 、
小梁状排列 ,核分裂象多见 ,免疫组织
薄不一的纤维组织包膜分隔 , 肿瘤组织由实性区 、
假乳头区 化学染色 α - AT、CK阳性 。
组成 。实性区瘤细胞弥漫分布 , 排列成巢状或片块状 , 瘤细 CSTP生物学行为属低度恶性或潜在恶性 。绝大多数文
胞中等大小 , 呈多角形或梭形 , 细胞界限清楚 , 胞浆嗜酸性 。 献报道显示 CSTP能被完整切除而治愈 ,长期随访无复发 ,约
PAS染色肿瘤细胞浆内可见紫红色小体 , 核圆形或卵圆形 , 5%的病人可局部复发 ,极少数有淋巴结或远处转移 ,且认为
胞核中可见核沟 , 染色质细 , 可见单个小核仁 , 核分裂象偶 复发或转移可能与手术未能完整切除有关 。本文 1 例随访 5
见 。假乳头区为数层瘤细胞围绕纤维血管形成乳头状结构 , 年未见复发和转移 。 CSTP 的组织来源尚存在争议 , 有学者
部分乳头轴心内胶原纤维黏液样变性 。体积较大的 1 例有 在电镜下见瘤细胞内有膜包绕的电子致密颗粒 , 似腺泡细胞
明显出血 、
坏死 、
囊性变 、
胆固醇结晶沉积 、
泡沫状细胞聚集 。 中的酶原颗粒 ,细胞间可见中间带或桥粒样连接及含有微绒
免疫标记结果 : 2 例 CSTP 中 , 细胞角蛋白 ( CKh) 、
波形蛋白 毛 ,应为腺泡细胞分化特征 。有学者见到细胞内神经内分泌
α - AT、
(V im entin ) 、 雌激素受体 ( ER ) 、
孕激素受体 ( PR ) 均 颗粒 ,提示具有内分泌细胞分化特征 。免疫组织化学染色瘤
为阳性 ; 上皮膜抗原 ( EMA ) 和 S - 100 蛋白其中 1 例为阳 细胞雌 、
孕激素受体阳性 ,且多见于年轻女性 , 推测 GSTP 肿
性 ; 突触素 ( Syn) 、
神经原特异性烯醇化酶 ( NSE ) 、
胰岛素 、
嗜 瘤生长依赖女性激素 。支持多潜能干细胞起源学说 。
铬素 ( CgA ) 、肌动蛋白 (Actin )均见小灶性阳性区 。 参考文献 :
3 　讨论 [ 1 ]M ao C, Guvendi, Domenico DR , et a l. Pap illary cystic and
　　CSTP相当少见 ,常误诊为胰腺癌 、
胰腺囊性肿瘤和无功 solid tumors of the pancreas: A pancreatic tumor? Studies of
能胰岛细胞瘤 。囊腺瘤 、
囊腺癌 、
乳头状腺泡细胞癌等 。根 three cases and cumulative review of the world literature [ J ].
Surgery, 1995, 118 (5) : 821 - 828.
收稿日期 : 2005 - 07 - 26 [ 2 ]孟宇宏 , 虞积耀 , 康筱玲 , 等 . 胰腺囊实性肿瘤 8 例临床
作者简介 : 钱 　震 ( 1962 —) ,男 ,主治医师
病理观察 [ J ]. 中华病理学杂志 , 1999, 28 ( 6 ) : 409 - 413.