BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos cromatográficos I
 CROMATOGRAFIA
Conjunto de técnicas utilizadas para la separación de mezclas de
solutos, basada en la diferente solubilidad (afinidad) de los solutos
por dos solventes (fases) inmiscibles.

Se la clasifica según los criterios físico-químicos responsables de

la separación.

Se desarrolló en Inglaterra en la década del ‘40 para la separación de

sustancias coloreadas (de allí su nombre: cromatografía).

El fundamento de todas las formas de cromatografía es el “coeficiente de

partición” (Kd ) que describe la distribución de un compuesto en las dos
fases inmiscibles:

concentración en la fase A
Kd = ---------------------------
Las dos fases de todo sistema cromatográfico se denominan:

- Fase estacionaria o fase fija: un sólido, un gel, un líquido.

- Fase móvil: un líquido o un gas, que fluye sobre o a través de

la fase fija.

Se escoge las fases de modo que los coeficientes de partición de los

componentes de la mezcla sean lo más distintos posible.
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA

Se los clasifica de acuerdo al principio físico-químico que permite la

separación:

ADSORCION: equilibrio entre una fase fija sólida y una fase móvil
líquida. (Ej: cromatografía de adsorción; cromatografía de interacción
hidrofóbica).

PARTICION: equilibrio entre una fase fija líquida y una fase móvil
líquida o gaseosa. (Ej: cromatografía en fase reversa; cromatografía
gas-líquido; cromatografía de contra-corriente).

INTERCAMBIO IONICO: equilibrio entre un intercambiador iónico

fijo y una fase móvil con electrolitos. (Ej: cromatografía de intercambio
iónico; cromatoenfoque).
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA (continuación)

EXCLUSION: equilibrio entre un líquido atrapado en los poros de una

fase fija sólida y un fase móvil líquida. (Ej: cromatografía de filtración
molecular).

AFINIDAD: equilibrio entre un ligando inmovilizado (fase fija) y un

ligando en solución (fase móvil). (Ej: cromatografía de afinidad;
cromatografía de inmunoafinidad; cromatografía de ligando-colorante).

En la práctica, es común que dos o más de estos tipos de equilibrio

operen en forma simultánea en una determinada cromatografía.
En el ejemplo se agregan 32 mg de una sustancia en 1 ml de fase móvil
y se supone un coeficiente de partición igual a 1. Al cabo de un número
de equilibrios el compuesto se distribuye en una banda simétrica. ¿Qué
ocurre si tenemos además otro compuesto con coeficiente 100?
PARAMETROS DE RENDIMIENTO CROMATOGRAFICO

En cromatografía, dos tipos de procesos afectan el comportamiento

de los analitos y con ello el éxito de la separación:

1.- Mecanismos físico-químicos básicos que definen el proceso (p.

ej., partición, adsorción, intercambio iónico, etc.).

2.- Procesos que tienden a oponerse a la separación, p. ej. difusión,

que producen bandas más anchas y “tailing”.
 ALGUNAS DEFINICIONES:

- Tiempo de retención (tr): tiempo requerido por un analito para

emerger de la columna.

- Volumen de elución (Ve): volumen de fase móvil requerido para

eluir el analito.

-Velocidad de flujo (Fc) de la fase móvil (ml/min). Influenciado por

las dimensiones de la columna, la característica física de las partículas,
y la viscosidad de la fase móvil.

Ve = tr x Fc
 UN CROMATOGRAMA:

Se grafica la respuesta del detector en función del tiempo de retención

(o volumen de elución).
La asimetría de un pico puede tener distintas causas: aplicación de un
exceso de analito, mal empaque de la columna, deficiente aplicación de
la muestra, etc.
El éxito de una cromatografía se mide por su capacidad de separar
(resolver) completamente un analito de una mezcla.

La resolución de dos picos A y B (Rs) depende de las propiedades

de éstos:

2 (trB - trA)
Rs = ---------------- donde: trA y trB son los tiempos de retención
wA + wB de A y de B.
y wA y wB el ancho de la base de los picos
respectivos.

Valores de Rs de 1,0 corresponde a una separación del 98 %, lo que

es adecuado para análisis cuantitativo.
 Se considera que las columnas cromatográficas consisten de un
conjunto de zonas adyacentes donde hay suficiente espacio para que
los solutos logren un equilibrio completo entre las fases fija y móvil.
Cada una de estas zonas hipotéticas se denomina un "plato teórico" y su
altura en la columna es la "altura del plato" (H).

Una columna es más efectiva mientras más platos teóricos tenga.

El número de platos teóricos (N) involucrados en la elución de un

analito determinado está dado por:

N = 16 (tr/w)2 o N = 5,54 (tr/wh)2

Donde w es la anchura de la base de cada pico, wh la anchura del

pico medida a la mitad de su altura y tr el tiempo de retención.

El número N puede, dentro de ciertos límites, ser aumentado alargando

la columna, pero también aumentan el tiempo de retención y el ancho
Efecto del número de platos teóricos en la distribución de un soluto.
Mientras mayor sea N, (y menor H) más angosto será el pico del analito.
PROCESOS QUE TIENDEN A AUMENTAR LA ANCHURA DEL
PICO DE ELUCION DE UN ANALITO

-Tiempo requerido para aplicar la muestra a la columna.

- Difusión longitudinal. El analito tiende a difundir de zonas de alta

concentración a aquellas de baja concentración.

- Caminos múltiples. El empaque de la columna es aleatorio y esto

genera muchos caminos entre las partículas para el analito y la fase
móvil.

-Tiempo requerido para el equilibrio entre las dos fases. Mientras

más pequeñas las partículas de la fase estacionaria, más rápido es
el equilibrio y menor la tendencia a la difusión.
El éxito de un sistema cromatográfico determinado se evalúa por su
capacidad de resolución y depende de los siguientes parámetros:

- Selectividad. Capacidad del sistema de discriminar entre

compuestos relacionados estructuralmente. Se refleja en los valores
de Kd. Depende de la naturaleza química de las fases fijas y móvil.
Alta selectividad muestra la cromatografía de afinidad.

- Eficiencia. Es una medida de los efectos de difusión que producen

picos más anchos y que se sobreponen. Importante el empaque de la
columna.

- Capacidad. Es un índice de la cantidad de material que puede ser

resuelto sin sobreposición de picos. La cromatografía de intercambio
iónico y el cromatoenfoque son de alta capacidad.
CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ACUERDO A LA PRESION GENERADA DENTRO DE
LA COLUMNA

Cromatografía de baja presión: presiones menores a 5 bar (0,5 MPa,

5,1 Atm).

Cromatografía de presión media: genera presiones entre 6 y 50 bar.

(FPLC ~20 - 50 bar)

Cromatografía de alta presión: presiones sobre 50 bar. Denominada

también HPLC.
 HPLC (high performance liquid chromatography):
Cromatografía líquida de alto rendimiento

La capacidad de resolución de una columna cromatográfica aumenta

con el número de platos teóricos y éstos con el largo de la columna
(dentro de ciertos límites, por la tendencia al ensanchamiento de los
picos).

El número de platos teóricos está asociado al área de las partículas de

la fase fija (mientras más pequeñas, mejor la resolución pues se reduce
el tiempo de equilibrio entre fase fija y móvil).

Al achicarse las partículas, aumenta la resistencia al flujo, y esto obliga

a aplicar altas presiones.
Isocrático: igual composición
Diferencias entre una elución isocrática y una elución por gradiente
en una cromatografía HPLC de una mezcla de 16 aminoácidos.

El sistema de bombas en una elución por gradiente es más complejo

pues requiere mezclar solventes, pero se obtiene una mejor resolución.
 COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC

Columnas: se las fabrica de acero inoxidable para que resistan presiones

de hasta 55 MPa (550 bar). Largo hasta 50 cm; diámetro: 1 a 4 mm.

Matrices (fases estacionarias): partículas esféricas de tamaño

uniforme para minimizar difusión. Tres tipos:
Microporo (5-10 μm diámetro); microporos que se ramifican
en toda la partícula.
Pelicular (porosa superficial); partículas porosas que cubren
un sólido inerte (bolitas de vidrio de ~40 μm de diámetro).
Fases unidas (bonded phases). La fase estacionaria está
químicamente ligada a un soporte inerte como sílice.

Fase móvil: solventes de alta pureza, que deben ser desgasificados.

Bombas: deben operar hasta 55 MPa, sin generar pulsos

 COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC (Continuación)

Detectores: deben ser muy sensibles (poca muestra) y estables.

Longitud de onda variable. Son espectrofotómetros de luz

ultravioleta y visible con celdas de flujo continuo.
Arreglo de diodos. Permiten detectar el espectro completo.
Fluorescentes. Alta sensibilidad. Pocos analitos fluorescentes.
Indice de refracción. Sensibilidad limitada pero responden a
cualquier analito.
Espectrómetro de masas. Detección y determinación simultánea
de la estructura del analito.
Electroquímicos. Muy sensibles. Utiles en la detección de analitos
que pueden ser oxidados o reducidos. Dos electrodos, uno de referencia y
el otro “de trabajo”, al que se aplica un potencial constante. Al fluir un
analito, éste se reduce u oxida, pasando una corriente entre ambos
electrodos, la que es registrada.
A: detector de arreglo
de diodos.

B: detector ultravioleta.