EXPERIMENTUL 2 Steroizii anabolici androgeni sunt derivai sintetici ai formonilor masculini endogeni primari din categoria testosteronului.

Efectul anabolic al steroizilor androgeni (AAS) ajut corpul s rein proteinele din nutrimente, contribuind la creterea muchilor, oaselor i pielii. Proprietile androgene ale AAS includ activarea sistemului reproductiv masculin i dezvoltarea caracterelor sexuale secundare, cum ar fi distribuia pilozitii i configuraia musculo-scheletal. AAS se dezvolt n glandele cu secreie intern masculin i au fost folosii iniiali n tratamentul disfunciei hipogonadale, ncepnd cu pubertatea la brbai. Datorit efectelor anabolice AAS au devenit foarte folosii de ctre sportivi n special n atletism. Ei au ca efect creterea masei musculare striate, a forei i rezistenei muchilor. Totui, mecanismele exacte prin care acioneaz AAS sunt puin nelese. S-a confirmat prin studii localizarea receptorilor androgenici n nucleii celulelor satelit (SC). Activarea SC de ctre AAS se face prin mecanisme care conduc la hipertrofia muchilor striai. Steroidul numit nandrolon decanuat este unul dintre cele mai populare i frecvent folosite substane steroide anabolice. i datoreaz popularitatea faptului c prezint un efect anabolic semnificativ cu efecte secundare reduse. Aceasta l face s fie foarte bine tolerat i folositor pentru tratamentul unei largi varieti de boli clinice, cum ar fi bolile obstructive, pulmonare cronice, osteoporoza i osteopenia i , de asemenea, pentru HIV. La pacienii cu HIV , nandrolonul a prezentat efecte sigure n creterea masei musculare a acestor pacieni. Doza terapeutic recomandat pentru nandrolon este de o,4 mg/kg i pe zi la om. Totui, dozele pot varia larg n funcie de boal i severitatea sa. Nandrolonul este cel mai folosit steroid de ctre sportivi n special n culturism. Pn de curnd nu au existat studii care s detecteze efectele directe asupra distribuiei SC i mionucleilor de ctre steroizi de tipul nandrolon. Experimentul examineaz efectele nandrolonului decanuat asupra numrului i distribuiei SC i morfologiei fibrelor musculare scheletice la muchiul tibial
1

anterior (TA) la obolan. Se testeaz ipoteza c administrarea de steroizi duce la creterea masei musculare i a diametrului fibrelor musculare n muchiul TA de obolan. n plus exist ipoteza c ar determina o mai mare frecven i concentraie a celulelor satelit (SC) la animalele tratate cu steroizi fa de grupul martor. obolanii au fost mprii n dou grupe: primul grup a primit nandroloni injectabili n timp ce al doilea grup a primit soluie de ser fiziologic (grupul martor). S-au calculat numrul de SC i mionuclei n interiorul fibrelor musculare prin tehnici de morfometrie comparat. S-a nregistrat o cretere semnificativ (P< 0,01) n diametrul fibrelor musculare tratate cu nandroloni decanoat. De asemenea, frecvena i concentraia SC au fost semnificativ mai mari (P<0,05) la subiecii tratai cu steroizi dect la cei din grupul martor. Studiul indic faptul c administrarea steroizilor poate induce hipertrofie muscular scheletic corelat cu creterea numrului de SC. Material i metod obolani femeli din rasa Sprague Donan au fost selectai de la aceeai mam i crescui n condiii identice n biobaza Facultii de Biologie din Universitatea Piteti, la temperatur constant i n aceleai condiii de via i hran. La vrsta de 63 de zile s-au administrat injectabil n muchiul TA la membrul posterior drept patru injecii timp de o sptmn la lotul de experiment. Pe aceeai durat lotul martor a fost injectat cu o soluie clorur de sodiu N/1. Ambele soluii au fost n doz de 300 ml nandroloni decanuat respectiv ser fiziologic. Tibialul anterior (TA) este un muchi reprezentativ i de aceea, a fost ales pentru studiul morfometric. Prepararea i secionarea esutului Trei eantioane de esut muscular au fost excizate din regiunea median a TA de la obolani pentru fiecare animal din loturile martor, respectiv de experiment. Fiecare prob a avut dimensiunile aproximative: 0,5 x 0,5 x 2 cm. Axul longitudinal al fiecrei probe era paralel cu direcia fibrelor musculare striate. Fiecare prob a fost inclus n OCT i imediat ngheat n 2-metilgutan
2

rcit cu azot lichid. Probele au fost apoi stocate la o temperatur de -80C . Seciuni transversale seriate de 10 microni grosime au fost realizate la 20 C folosind un criostat. Dou seciuni seriate au fost folosite din fiecare prob pentru examen microscopic pe lam. Microscopul folosit a fost un nikon eclipse 600 cu soft de analiz de imagine instalat (LUCIA-NET). Analiza imaginilor i colectarea datelor Cinci cmpuri microscopice diferite au fost analizate i capturate folosind videomicroscopul menionat, fiecare imagine fiind apoi prelucrat i stocat digital i analizat morfometric din punct de vedere al structurilor histopatologice. Imaginile rezultate au fost comparate ntre loturile de experiment i martor. Prelucrarea digital a luat n considerare profilele morfologice pe unitate de suprafa i volum, fiecrui profil fiindu-i analizate dimensiunile, forma i coloraia. Imaginile referitoare la lamina bazal au fost folosite pentru msurarea axei eliptice minime a fiecrei fibre musculare n parte. Programul de morfometrie poart numele SCION. Numrul de nuclei ai celulelor satelit i de mionuclei a fost numrat pentru fiecare din cele 200 de fibre musculare luate n calcul pentru fiecare animal n parte. Frecvena celulelor satelit a fost calculat pentru fiecare animal folosind formula: frecvena = (SCN/SCN + MN) x 100 %, unde SCN = numrul de nuclei ai celulelor satelit iar MN = numrul de mionuclei. Valorile medii ale frecvenei SC pe fiecare grup au fost obinute la patru animale din grupul experimental respectiv la patru animale din grupul martor. Numrul de SC i mionuclei pe unitatea de lungime a fibrei a fost calculat folosind formula lui Catillo de Maruenda i Franzini Armstrong (1978). Aceast formul este N=A/(Ln + N) unde N = numrul de celule pe unitatea de lungime a fibrei , A = numrul mediu de nuclei pe profil de fibr, Ln = diametrul mediu al nucleilor iar M = grosimea seciunii esutului. Aria de suprafa a sarcolemei pe unitatea de lungime a fibrei a fost calculat folosind
3

formula: S = EU, unde S = suprafaa arei sarcolemale pe unitatea de lungime a fibrei, E = axa eliptic minim iar U = unitatea de lungime a fibrei (1 mm). Dup aceasta , aria sarcolemal a fibrei musculare pentru fiecare SC a fost determinat mprind aria suprafeei msurate la numrul de SC pentru fiecare animal de experien. Domeniul mionuclear a fost calculat ca dimensiune pentru fiecare obolan prin mprirea volumului citoplasmei la unitatea de lungime a fibrei prin calculul numrului de mionuclei din acea unitate de lungime. Volumul citoplasmei pe unitatea de lungime a fibrei (V) a fost calculat folosind formula V = (E/2)2 U. Statistic Probele au fost mprite n dou grupe (lotul martor i lotul de experiment, tratat cu nandrolon decanuat). Testul LEVENE pentru egalizarea parametrilor de variaie a fost aplicat n scopul determinrii omogenitii varianei. Datele au fost apoi evaluate prin teste independente de tipul testului t cu nivel de semnificaie 5%. Toate analizele statistice s-au fcut de ctre specialiti din catedra de statistic a Facultii de Matematic - Informatic din Universitatea Piteti. Rezultate 1.Greutatea muscular Masa muchiului TA a fost semnificativ mai mare (P<0,01) la lotul de experiment tratat cu steroizi dect la lotul martor care a primit soluie de clorur de sodiu. Media greutii muchiului TA abaterea standard la grupul martor a fost de 53,8 1,13 g , n timp ce la grupul de experiment aceast valoare a fost de 65,5 0,93 . 2.Dimensiunea profilului fibrelor Axa eliptic minim a muchiului TA a fost semnificativ mai mare (P< 0,01) la grupul de experiment tratat cu nandroloni dect la grupul martor. Axa eliptic minim abaterea standard la grupul de experiment a fost de 39,28 1,57 microni, n timp ce la grupul martor a fost de 31,59 0,82 microni.
4

3.Numrul de SC pe unitatea de lungime a fibrei Numrul de SC pe un milimetru de fibr a fost semnificativ mai mare (P< 0,01) la grupul de animale de experien dect la grupul martor. La grupul martor media SC pe milimetru de segment de fibr abaterea standard a fost de 5,67 0,32, n timp ce la grupul de experiment valoarea sa a fost de 8,38 0,4. 4.Concentraia SC A fost nregistrat o arie de suprafa a plasmalemei/SC semnificativ mai sczut (P<0,05) n cazul animalelor de experiment tratate cu nandroloni fa de lotul martor. Aria de suprafa medie/SC abaterea standard la lotul martor a fost de 17,6 704,47 microni2. Aceast valoare a sczut la 14,7 568,33 la grupul de experiment tratat cu nandrolon. Aceste rezultate arat c exist o mai mare concentraie de SC la grupul experimental fa de grupul martor. 5.Numrul de mionuclei pe unitatea de lungime a fibrei Numrul de mionuclei pe milimetru de lungime a fibrei musculare a fost mai mare la grupul de experiment dar nu difer semnificativ fa de valorile grupului martor (P = 0,062). Numrul de mionuclei n medie pe milimetru de segment de fibr abaterea standard la grupul martor a fost de 81,39 2,21. La grupul tratat cu nandroloni aceast medie abaterea standard a fost de 92,8 4,45. 6.Dimensiunea domeniului mionucleilor Dimensiunea domeniului mionucleilor (volumul de citoplasm aferent unui mionucleu) a fost msurat pentru fiecare grup n parte. Domeniul mionucleilor s-a dovedit semnificativ mai mare (P<0,01) la grupul tratat cu nandroloni fa de grupul de control. Media dimensiunii domeniului mionucleilor la grupul martor abaterea standard a fost de 10,8 511,53 microni3. Valoarea medie a dimensiunilor domeniului mionucleilor a fost de 14,2 488,16 microni3 la grupul de experiment. Discuii

Studiul a demonstrat efectele steroizilor anabolici (nandrolon decanuat) asupra distribuiei SC . El arat c administrarea de steroizi pe o perioad relativ scurt (4 sptmni) poate crete semnificativ frecvena i concentraia SC n muchiul TA de obolani. Acest rezultat a fost nsoit de o cretere n dimensiunea fibrei (hipertrofie). Alt descoperire este observarea apariiei de fibre gigante la grupul de obolani tratai cu steroizi. Este stabilit c administrarea steroizilor poate duce la o cretere masiv a masei musculare. La sportivii tratai timp de 10 sptmni cu substane din grupa AAS combinat cu un program de exerciii intensive poate duce la o cretere semnificativ a masei musculare la muchii braelor (biceps i triceps brasial) sau la muchii membrelor inferioare (muchiul cvadriceps). Dozajul diferit al steroizilor administrai la persoane voluntare fr asocierea cu exerciii de for a determinat totui o cretere a masei musculare dependent de doz. Mecanismele exacte prin care administrarea de steroizi duce la creterea masei musculare nu sunt complet nelese, din cauz c exist mai multe efecte fiziologice combinate a acestor substane asupra fibrei musculare striate. Creterea numrului de mionuclei din interiorul fibrei musculare demonstreaz legtura ntre modificrile structurale i cele funcionale pe care le determin administrarea acestor substane la grupurile de experiment folosite. Dimensiunea domeniilor mionucleilor a fost semnificativ mrit la grupul de experiment fa de grupul martor. Aceste rezultate subliniaz efectul benefic de hipertrofie i regenerare al acestor substane pe fibra muscular striat. Pe msur ce dimensiunea i numrul mionucleilor crete i capacitatea funcional a muchiului n totalitate este crescut. n concluzie experimentul de fa arat c administrarea steroizilor este benefic n dezvoltarea i regenerarea muchiului striat. Steroizii anabolizani au rol n recrutarea i proliferarea celulelor precursoare musculare ducnd la o recuperare morfologic i funcional mai rapid la persoanele tratate cu astfel de substane.
6

EXPERIMENT 3 Tehnica zdrobirii muchiului i a orientrii pieselor de biopsie se face pe seciuni transversale cu marker de sudur (x). Seciuni transversale la trei regiuni separate au fost luate n discuie: regiunea superficial (S), regiunea intermediar (I) i regiunea profund (P). Acestea au fost determinate pe linia median a zonei de regenerare. Fiecare regiune reprezint un cmp microscopic mrit de 400 de ori. Leziunile observate au fost mai frecvente n zona esutului conjunctiv liber, caracterizate printr-o mpachetare dens a miotubilor fa de alte zone analizate. Miotubii la grupul martor au fost mai mici (10 30 gm n diametru), fa de grupul experimental la care dimensiunile au fost ntre 20 60 gm n diametru). n aria superficial i profund frecvena mionucleilor a fost asemntoare la cele dou grupuri, iar cantitatea de esut conjunctiv a fost similar. n schimb s-a nregistrat o proporie crescut n zona superficial fa de zonele profund i median. Aceasta permite concluzia c miotubii se aglomereaz pe unitatea de suprafa n regiunea superficial la lotul de experiment comparativ cu lotul martor. Analiza cantitativ morfometric ia n considerare densitatea miotubilor pe unitatea de volum n cele trei zone: superficial, intermediar i profund la nivelul zonei lezionale. Reproductibilitatea leziunilor a fost confirmat prin tehnica de morfometrie. Analiza statistic s-a fcut prin testul student care ia n considerare parametrii de variabilitate analizai prin testul t. Cele dou loturi au fost comparate i s-a nregistrat o diferen semnificativ (P< 0,05) la lotul experimental n ceea ce privete densitatea mionucleilor pe unitatea de volum, comparativ cu lotul martor. Datele nregistrate au fost mai semnificative n regiunea superficial fa de regiunile intermediar i profund a ariei de seciune luat n studiu. Densitile medii ale miotubilor abaterea standard au fost luate n calcul la 10 animale pentru fiecare grup (experimental respectiv martor).
7

Datele sunt cuprinse n tabelul de mai jos: Interpretare Diferenele semnificative n densitatea miotubilor la lotul de experiment a fost mai mare n zona superficial fa de zona intermediar i profund (P< 0,01) n timp ce n zonele intermediar i profund diferena nu a fost semnificativ diferit. Studiul de fa arat c zonele de regenerare sunt situate cu preponderen n poriunea superficial fa de cea intermediar i profund la ambele grupe (de experiment respectiv martor). Testul ANOVA biunivoc a indicat diferene semnificative ntre cele dou loturi martor i de experiment n care s-a nregistrat o preponderen a frecvenei mionucleilor la lotul de experiment fa de cel martor (P<0,05). Discuii Se consider c metoda de analiz morfometric luat n studiu a furnizat date suficiente pentru investigarea diferenelor n regenerarea muchiului striat. Astfel, s-a demonstrat o mai bun capacitate regenerativ n cazul administrrii factorilor de cretere fa de lotul martor. Analiza cantitativ morfometric a subliniat cantitatea suplimentar de fibre musculare, celule satelit i mionuclei pe unitatea de volum n cazul lotului de experiment fa de lotul martor. Diferenele statistice ntre cele dou grupuri au fost nalt semnificative, indicnd c administrarea factorilor de cretere accelereaz vindecarea, recrutarea i proliferarea celulelor satelit i previne fibroza muscular. Analiza seciunilor transversale s-a dovedit mai revelatoare fa de cele longitudinale deoarece favorizeaz o mai bun numrare a miotubilor i o analiz cantitativ mai detaliat. Reperul minim de diametru luat n considerare este de 10 gm. La acest nivel se pot distinge precursorii miogenici de alte celule mionucleare prin analiza caracteristicilor lor morfologice. n cazul celulelor mai mici de 10 gm n diametru a fost dificil clasificarea acestora cu ajutorul microscopului optic.

n particular o cretere a numrului de celule satelit s-a nregistrat prin recoltarea de probe la 10 zile dup lezarea muchiului fa de alte intervale mai lungi. Urmnd analiza n cele trei zone distincte de leziune, cea mai important regenerare a fost observat n cazul regiunii superficiale. Din zona intermediar au pornit mugurii de regenerare ctre suprafaa muchiului, demonstrnd similariti cu zonele aflate la suprafaa muchiului n cazul lezrii acestuia la oameni. Aa cum era de ateptat , densitatea miotubilor a fost mai mare la grupa tratat cu factori de regenerare fa de lotul martor. Se pare c regenerarea muscular n zonele intermediar i superficial apare independent de aportul vascular i nu este influenat de reparaia prin esut fibros , ci numai pe baza potenialului miogenic al celulelor satelit. Diferenele cantitative ntre cele dou grupe : martor i experimental poate fi pus doar pe seama aciunii factorilor de cretere, din moment ce am exclus ali factori de eroare legai de motenirea genetic, ceea ce a dat o mare acuratee rezultatelor tehnicii propuse. Analiza statistic a exclus rezultatele care puteau introduce erori de interpretare. Clasificarea eficienei regenerrii musculare s-a fcut n funcie de doza i durata administrrii factorilor de cretere. Potenialul regenerativ este acelai la cele dou loturi din punct de vedere genetic dar este stimulat sub influena factorilor de cretere. EXPERIMENTUL 4 Metodele Treizeci i cinci de animale din raza Sprague Done de sex feminin, cntrind 200 gr au fost mprite n mod aleatoriu n trei grupe. S-a ales muchiul tibial anterior ca fiind un muchi flexor plantar al piciorului, astfel nct acesta nu suport n mod direct greutatea corpului animalului. Muchii tibiali anterior (TA) de la obolanii primului grup au fost injectai cu soluie ser fiziologic steril n concentraie de 0,9% pe durata a trei sptmni (n=5) respectiv 2 sptmni (n=5). La al doilea grup administrarea a constat din somatomedin I (IGF I) n doz de 0,9 micrograme pe zi timp de trei
9

sptmni (n=10). La al treilea grup s-a administrat IGF I 1,9 micrograme pe zi timp de dou sptmni (n=5). La alte dou grupe suplimentare, cinci obolani din fiecare au fost alei pentru a li se administra local injectabil hormoni de cretere (GH) n doz de 1,9 micrograme pe zi respectiv factori de cretere fibroblastic recombinant 2 (FGF 2) timp de dou sptmni. Tehnica administrrii injectabile Dou doze de IGF I au fost selectate pentru a avea un efect ateptat de inducere a creterii i regenerrii muchiului striat la obolan. Fiecare injecie de IGF I a fost bine dozat i calculat la nivelul de 0,9 micrograme pe zi , ceea ce reprezint echivalentul unei doze sistemice de aproximativ 2,5 micrograme/kg i pe zi n funcie de greutatea animalului respectiv. Administrarea de substan clorur de sodiu s-a realizat printr-un cateter ataat la o pomp miniosmotic model Alzet 2002 timp de 14 zile sau model 2004 timp de 21 de zile. Pompele miniosmotice au fost umplute n condiii aseptice, conform cu instruciunile de la productor. Toate soluiile au fost n prealabil sterilizate nainte de a fi umplute n pomp. S-au folosit catetere de 12 cm cu tuburi flexibile implantabile. Aceste tuburi au fost folosite pentru a furniza eliminarea excesului de dozaj n interiorul fasciei musculare. Tuburile prezint din loc n loc fenestraii realizate cu ajutorul unei sonde din metal. Pentru implantarea cateterelor, obolanii au fost anesteziai n prealabil cu ketamin n doz de 2 miligrame/kg iar inciziile au fost fcute la nivelul tegumentului de acoperire al muchiului tibial anterior la distan de 4 cm fa de inseria acestuia. S-au realizat dou mici tieturi la nivelul straturilor superficiale, ndeprtnd fascia de nveli a muchilor cu ajutorul unor foarfeci chirurgicale. Una dintre seciuni s-a fcut ctre captul proximal al muchiului, n timp ce cealalt s-a fcut la captul distal n apropierea tendonului. Poriunea flexibil a

10

cateterului a fost inserat sub fascia de nveli i fixat cu ajutorul unui plasture, astfel nct s nu poat fi mobilizat. Cealalt poriune a cateterului a fost ataat pompei de infuzie. Cateterul a fost apoi umplut cu soluiile de IGF I, respectiv ser fiziologic prin apsare pe pompele respective de la captul liber, astfel s-a pompat o cantitate suficient i echivalent din cele dou soluii n acelai interval de timp. n funcie de specificaiile scrise pe pompa osmotic , volumul de lichid care a fost administrat zilnic a fost ntre 10,8 0,48 mililitri la grupele de 2 sptmni i 5,3 0,24 mililitri la grupele de 3 sptmni. Aceast cantitate a umplut ntre 0,6 i 1,3 % din spaiul extracelular al muchiului TA n funcie de dimensiunea acestuia. Pentru a fi sigur de validarea efectului administrrii IGF I s-au ales 6 obolani din fiecare grup de experiment care au fost sacrificai la 5 zile dup administrarea factorului de cretere. Recoltarea de esut Ambii muchi TA care au fost injectai au fost ndeprtai chirurgical i secionai pe jumtate de-a lungul axului longitudinal al muchiului, separndu-i n 2 pri (superficial respectiv profund), seciunile fiind apoi ngheate cu ajutorul azotului lichid. Probele au fost stocate la temperatura de 80 C pentru analiza ulterioar. obolanii din lotul martori ca i din cei experimentali au fost apoi sacrificai la 14 zile de la implant cu ajutorul unei soluii de pentobarbital sodiu (120 miligrame/kg). Muchii tibiali anteriori de la ambele membre contralaterale au fost ndeprtai, cntrii i apoi ngheai cu ajutorul azotului lichid. i aceti muchi au fost stocai la 80 C pentru analiza ulterioar. Analiza statistic S-a luat n calcul valoarea medie a masei musculare la care s-a adugat abaterea standard. Diferenele ntre cele dou grupe au fost determinate folosind testul statistic ANOVA i testul Student folosind chituri de analiz statistic n
11

cadrul catedrei de statistic din Facultatea de Matematic Informatic a Universitii din Piteti. Rezultate Datele culese au artat o cretere substanial a masei musculare i a numrului de fibre pe unitatea de volum la lotul experimental fa de lotul martor, la care s-a administrat soluie de ser fiziologic. Nivelul de IGF I acumulat n muchi a fost de 3,629 ng/gram de muchi, datorit acumulrii sporite n zona lezional. Aceste valori reprezint un rspuns fiziologic la capacitatea regenerativ a muchiului striat datorat recrutrii i nmulirii celulelor satelit. La animale la care s-a administrat ser fiziologic regenerarea s-a fcut n proporie de 30% pe baza esutului muscular i 60% pe baza esutului fibros. S-au nregistrat i creteri ale masei musculare totale la grupul tratat cu factori de cretere n cantitate de cca.9 miligrame pe zi la fiecare din animalele de experien. n plus de regenerare s-a nregistrat o hipertrofie muscular la locul administrrii de IGF I n cazul administrrii timp de 3 sptmni a 1,9 micrograme pe zi, mai mult fa de lotul la care s-a administrat aceeai cantitate timp de 2 sptmni. Discuii Conform cu datele din literatura de specialitate peptida IGF I este crescut la muchii care sufer proces de regenerare, ct i la cei care sunt supra solicitai prin exerciii de ngreunare. Concentraia acestei peptide este mai mare la animalele care sufer leziuni musculare. Rezultatele experimentului demonstreaz c lotul care a primit IGF I sub form injectabil a suferit o regenerare crescut a masei musculare fa de lotul la care s-a administrat soluie salin. Factorii de cretere administrai nu au efect asupra masei musculare n general, dar au efect local accentuat. Doza efectiv cea mai propice pentru studiu a fost de cca.7,9 micrograme / kg pe zi i s-a obinut n urma administrrii
12

timp de 3 sptmni. Ea a contribuit la o regenerare bazat n proporie de 90% pe esut muscular i numai 10% pe esut fibros. Aceste observaii vin n sprijinul teoriei c celulele satelite particip la procesul de regenerare i hipertrofie muscular, reprezentnd precursori ai fibrelor musculare adulte. Datele prezentate n studiu sunt deschise unei mari varieti de interpretare. De exemplu, este posibil ca activarea celulelor satelit s fie stimulat de ctre procesul lezional prin el nsui. n aceast variant IGF I poate exercita iniial efecte anabolice, iar numai ulterior s stimuleze producerea i recrutarea de celule satelit prin intermediul unor factori cum ar fi de exemplu FGF-2. n plus IGF I are o aciune de reducere a producerii de esut fibros, astfel nct regenerarea s se fac ct mai aproape de structura iniial. EXPERIMENTUL 5 obolani n vrst de 2- 5 luni au fost anesteziai prin injecie intraperitoneal a 87 miligrame/kg de ketamin i 13 miligrame/kg xylazin, dup care s-a realizat o incizie de 3 mm la nivelul muchiului tibial anterior. Aceast lezare s-a fcut cu ajutorul unei foarfece chirurgicale, iar la diferite momente dup leziune animalele au fost eutanasiate folosind inhalare de CO2 , pentru ca apoi s li se ndeprteze muchii TA folosind metode de disecie standardizat. Analiz histologic Muchii izolai au fost inclui n OCT i apoi ngheai n azot lichid. Pentru analiza histologic 10 seciuni transversale n grosime de 12 14 microni au fost colectate de-a lungul ntregii lungimi a muchiului la intervale de 400 500 microni i colorate cu hematoxilin eozin (HE). Toate analizele i fotografiile au fost realizate cu un microscop Nokia Eclipse cu camer video incorporat i cu program de analiz a imaginii LUCIA NET instalat pe un PC PENTIUM 4 , inter inside.

13

n experimentele de analiz a regenerrii musculare s-au folosit metode standardizate de morfometrie. Acestea constau n analiza seciunilor ce conin cea mai mare arie de leziune muscular selectat pentru a fi msurat. Poriunea medie a acestei zone lezionale, definit ca fiind regiunea cea mai interesat, i cea mai puin regenerat a fost vizualizat la obiectivul cu mrire x 10 , iar imaginea a fost capturat pe ecranul computerului. Aria de seciune transversal (CSA) i numrul total al nucleilor centrali ai fibrelor de regenerare au fost numrate pe o suprafa reprezentnd un cmp microscopic de 0,5 0,3 milimetri2 la momente diferite dup leziunea muscular. Aceast metod de analiz este reproductibil i poate fi folosit n studii inter-observatori (n=4) folosind aceleai metode de analiz. De exemplu , ntr-una din examinri rezultatele au fost identice n 96,2% din cazuri. Din cauz c au fost folosite mai multe eantioane pentru determinarea timpilor de regenerare medii, diferenele mici nregistrate nu afecteaz rezultatele finale. Nu au existat diferene nici ntre dimensiunea ariei lezate i nici ntre procentul de celule regenerate la loturile de experiment. Pentru analiza miofibrelor CSA la muchii care nu au fost secionai, s-au folosit markeri anatomici la nivelul acelorai regiuni pe diferite eantioane folosite pentru comparaie. Fiecare seciune a luat n calcul ntre 100 i 250 de miofibre corespunztoare unui cmp microscopic de 0,3 mm2. Pentru analiza statistic s-a folosit testul Student care ia n considerare parametrul t n analiza semnificaiei diferenelor ntre valorile nregistrate. Rezultate Studiul i-a propus determinarea modului prin care se regenereaz muchiul n cazul leziunilor chirurgicale sub aciunea factorilor de cretere. Pentru aceasta am comparat regenerarea n muchii la care s-a administrat factori de cretere fa de cei la care s-a administrat soluie de ser fiziologic. Rezultatele ateptate au fost acelea c procesul de regenerare este mai accelerat i mai eficient la animalele crora li s-a administrat factori de cretere. Tabelul
14

de mai jos ofer datele statistice comparative ntre loturile martor i cel de experiment la care s-a adugat parametrul de variabilitate numit abatere standard. Regenerarea muchilor tratai cu factori de cretere este accelerat comparativ cu lotul martor n special n perioada de dup 10 zile de la secionarea chirurgical. La microscop exist o mai mare cantitate de fibre de diametru mic rezultate prin transformarea celulelor satelit n fibre musculare adulte. Cantitatea de esut fibros este mai mare cu 30% n cazul lotului martor tratat cu soluie de ser fiziologic. S-au nregistrat i modele diferite de regenerare a fibrelor musculare. Astfel, media nucleilor miofibrelor a rmas constant la lotul tratat cu factori de cretere n timp ce la lotul tratat cu soluie ser fiziologic aceast medie era diferit n funcie de regiunea aflat mai aproape sau mai departe de locul leziunii. Rata de cretere i regenerare reprezentat de numrul de fibre musculare nou formate n unitatea de timp a fost constant la lotul experimental tratat cu factori de cretere spre deosebire de lotul martor la care aceast rat a prezentat variaii de la un interval de timp la altul. Densitatea miofibrelor regenerate a fost mai mare cu cca.30% n cazul lotului experimental i n plus cantitatea de esut fibros a fost mult mai mic luate mpreun la lotul de experiment fa de lotul martor. Modificrile nregistrate se datoreaz capacitii regenerative accentuate a fibrei musculare n condiiile administrrii factorilor de cretere. EXPERIMENTUL 6 Introducere Expansiunea i proliferarea celulelor stem sunt importante pentru transplantul i regenerarea esuturilor. Exist mai multe categorii de celule precursoare ale fibrei musculare prezente n muchiul striat adult , aceste celule reprezentnd doar un mic procent din totalitatea celulelor care compun structura muchiului. n acest experiment vom examina potenialul anumitor factori de
15

cretere n stimularea i activarea celulelor satelit care regenereaz dup un model matematic unic de cretere exponenial. Cinetica creterii populaionale este influenat n prezena suplimentrii mediului celular cu factori de cretere din categorie somatomedinelor (IGF I i IGF II). Timpul de diviziune i fracia mitotic a celulelor active au fost analizate pe baza unor parametrii cheie ai regenerrii musculare care st la baza mecanismului de expansiune a populaiilor de celule stem. Experimentul a fost realizat pe celule izolate din muchiul striat proaspt rezultate prin recrutarea celulelor aflate n faza de repaus a ciclului celular n prezena factorilor de cretere. Material i metod S-a folosit un mediu de cultur pe care au fost cultivate celule derivate de la obolani din rasa Sprague Donan n vrst de 3 sptmni din muchiul tibial anterior secionai cu ajutorul unei foarfece chirurgicale. Au fost identificate i numrate celulele satelit (SC) din proba de esut recoltat, acestea au fost trecute apoi pe un mediu de cultur Dubecco modificat eagle care conine 5% ser de cal, 5 %ser fetal, 1,25 % extract de embrion de gin i 1% antibiotic (penicilin plus streptomicin 10.000 uniti penicilin i 10 micrograme la mililitru streptomicin) la 37 de grade i 5 % dioxid de carbon. Factorii de cretere folosii au fost IGF I recombinant 100 miligrame/mililitru adugat zilnic la mediul de cultur. Rezultate nregistrate Numrul de celule satelit la un anumit timp depinde de doi parametrii: unu reprezentat de fracia mitotic i doi de administrarea factorilor de cretere. Modelul de cretere celular este cel reprezentat mai jos descris de Sherley i colaboratorii dup urmtoarele ecuaii: Conform acestui model, procentul de celule mitotic active (fracia de diviziune) este notat cu , i este determinat folosind att durata ciclului celular ct i datele referitoare la creterea populaional, obinute din experiment.
16

Creterea coloniilor a fost observat la o densitate de 450 de celule pe unitatea de centimetru ptrat pe mediul de cultur descris mai sus. Factorii de cretere au fost adugai la intervale de 60 de ore n mediul de cultur. Aderarea celulelor la mediul de cultur a durat ntre 6-12 ore. Folosind analiza de imagine microscopic s-a obinut o variaie a populaiilor celulare care reprezint creterea coloniilor de celule satelit. Pentru asigurarea unei temperaturi constante s-a folosit un incubator care s asigure o temperatur constant de 37 de grade. Pentru compararea dimensiunilor s-au analizat grupe formate din patru pn la 6 celule stem. Poziiile coordonate ale cmpului microscopic au fost asigurate de programul de analiz de imaginii pentru fiecare populaie celular luat n studiu. Durata ciclului celular a fost analizat pentru 100 de celule prin intermediul observaiilor directe. Fiecare ciclu celular a fost cuprins ntre dou diviziuni celulare succesive. Fracia mitotic a fost determinat prin intermediul datelor legate de creterea populaiilor n funcie de modelul de ecuaii descris mai sus. Aproximativ ase curbe de cretere au fost nregistrate la celulele tratate cu factori de cretere i au fost analizate statistic pentru determinarea parametrului . Testele de semnificaie statistic sunt : testul Student modificat i testul t. Ciclul celular a fost analizat statistic lund n considerarea semnificaia testelor dac parametrii nregistrai erau situai la un nivel P< 0,05. Rezultate Figura 1 furnizeaz reprezentarea schematic a sistemului de cultur de celule i modul de obinere a datelor prin folosirea acestui sistem. S-a luat n calcul o sum de 575 de imagini la fiecare 10 minute. Datele prezentate proliferarea celular nregistrat sub form de informaie video. Creterea celular a fost semnificativ mai mare n prezena factorilor de cretere la 72 i 96 de ore de la administrarea acestora. Comparativ , dac n
17

mediul de cultur s-a administrat doar soluie de ser fiziologic , creterea a fost cu 25 pn la 40% mai redus. Durata ciclului celular Media duratei ciclului celular la lotul martor a fost de 15,8 3,8 ore iar pentru populaia tratat cu factori de cretere a fost de 8,5 4 ore. Fracia mitotic A fost evaluat prin examinarea parametrului , care arat proliferarea i cinetica creterii celulare n cazul celor dou populaii , dintre care evideniaz celulele mitotic active redate n fracie procentual. Numrul total de celule N la interval de 12 ore este semnificativ mai mare n cazul lotului tratat cu factori de cretere (P< 0,05) fa de lotul tratat cu ser fiziologic (lotul martor). Populaia mitotic activ a fost de 86% la lotul de experiment fa de numai 42% la lotul martor. Pe baza acestor rezultate putem concluziona c exist un mecanism de rspuns difereniat la stimularea cu factori de cretere a celulelor satelit, ceea ce duce la o activare a procesului de regenerare i la o scurtare a timpului de refacere a muchiului lezat. Metodele folosite pot fi aplicate i la subiecii umani sub forma administrrii locale de factori de cretere injectabili din categoria somatomedinelor care s exercite un rol activ n regenerarea i vindecarea muchilor striai. EXPERIMENTUL 7 Leziunile musculare sunt foarte frecvente. Factorii de cretere sunt stimulatori ale proliferrii i fuziunii mioblatilor pe medii de cultur. De aceea, am administrat aceti factori de cretere la obolani la care am realizat secionarea muchiului gastrocnemian. Regenerarea muscular a fost evaluat la o sptmn prin analiz microscopic a pieselor histologice pe baza morfometriei comparate. Refacerea muchiului a fost determinat prin creterea

18

capacitii contractive msurate la o lun dup lezarea muchiului. S-a constatat c factorii de cretere poteneaz regenerarea muchiului n comparaie cu muchii care s-au regenerat natural. La o lun muchii tratai cu IGF I au dovedit o mbuntire a vindecrii i o semnificativ cretere a tonusului i forei musculare. Rezultatele noastre sugereaz c administrarea de IGF I accelereaz vindecarea muchiului i pot avea un efect considerabil n tratamentul leziunilor musculare. Traumatismele musculare sunt frecvente, cu o inciden de 10 55 % n cazul sportivilor. Ele se clasific n afeciuni de ruptur muscular sau distrugere a continuitii esutului conjunctiv, fiind afectate musculare. Exist trei faze ale procesului de vindecare a muchiului lezat. Faza de distrugere este caracterizat prin formarea unui hematom, necroza esutului muscular, degenerarea urmat de rspuns inflamator. Faza de reparaie include fagocitarea esutului afectat , regenerarea muchiului striat, producerea de esut conjunctiv de reparaie i cretere capilar. La finalul fazei de remodelare, muchii regenerai se maturizeaz i se contract cu organizarea esutului cicatriceal. Exist adesea o recuperare incomplet a capacitii funcionale la muchii traumatizai. Regenerarea miofibrelor ncepe cu activarea celulelor precursoare miogenice numite celule satelit, localizate ntre lamina bazal i membrana plasmatic a fiecrei fibre musculare n parte. Celulele satelit prolifereaz i se difereniaz n miotubi multinucleai i n final n fibre musculare adulte. Muli din aceti mioblati sunt capabili s fuzioneze cu fibrele musculare necrozate deja existente i pot preveni ca muchiul s se degenereze complet. n acelai timp fibroblatii invadeaz spaiul de ruptur dintre fibre i ncep s produc matrice extracelulare pentru refacerea tramei de esut conjunctiv. Rolul fiziologic al acestei populaii este de a transmite o legtur de-a lungul defectului de ruptur astfel nct membrul lezat s fie folosit nainte ca procesul
19

n aceeai msur fibrele

de reparaie s fie complet. n cazul leziunilor musculare extensive, proliferarea fibroblatilor poate duce rapid la o formare excesiv de esut cicatricial dens, ceea ce mpiedic regenerarea muchiului i determin recuperarea incomplet. Acest efect a fost observat n multe tipuri de leziuni cum ar fi alungiri, contuzii, lacerri musculare. Factorii de cretere sunt pectide mici care se leag de membranele receptorilor pentru a influena variatele etape ale creterii i dezvoltrii celulare prin intermediul unor ci de semnalizare celular. S-a mai artat c factorii de cretere sunt capabili de a stimula producerea de proteine de ctre celulele musculare striate. n timpul regenerrii musculare se presupune c exist o eliberare de substane trofice de ctre muchiul lezat, ceea ce activeaz celulele satelite i determin creterea i dezvoltarea fibrelor musculare. Muli factori de cretere au fost dovedii c intervin n rspunsul la leziunea muscular datorit capacitii lor de a recruta i accelera sinteza celulelor satelit. n studiile anterioare s-a demonstrat c factori de cretere de tipul IGF I sunt stimulatori poteniali ai fuziunii mioblatilor n mediile de cultur. Scopul experimentului este de a demonstra efectul acestor factori de cretere pe animal n cadrul regenerrii dup traumatismul muscular i evaluarea influenei lor asupra vindecrii muchiului. Materiale i metode S-au folosit obolani din rasa Sprague Donan de sex feminin de la aceeai mam crescui n biobaza Facultii de Biologie din Universitatea Piteti. S-au secionat ambii muchi gastrocnemieni de la 6 obolani la 60 % din distana de la inseria osoas pe jumtate din grosimea lor i apoi au fost suturate cu ace de sutur folosind un fir de sutur PDS 7,0. Avantajele acestui model sunt reproductivitatea sa i capacitatea de a asigura o aplicare precis a injeciilor la sediul de incizie. Severitatea leziunii a fost demonstrat prin apariia unui hematon i a unei zone de inflamaie datorate rspunsului la factorul traumatic.

20

Doi obolani au primit o injecie cu IGF I n membrul posterior drept n zilele 1, 3 i 5 dup secionare. Firul de sutur a servit ca zon de delimitare pentru injectarea factorului de cretere direct n leziune. Eliberarea factorului de cretere la sediul leziunii este important deoarece timpul de njumtire biologic ct i ndeprtarea prin curentul de snge duce la dispariia rapid a acestei substane din zona lezat. Membrul posterior stng a fost injectat cu acelai volum de soluie de ser fiziologic i a reprezentat lotul martor. Dozele de factor de cretere injectate au fost determinate n funcie de experimentele anterioare (experimentul 2 i 3). Dozele eficiente au fost de o sut de ori mai mari dect n cazul culturilor de celule. Din cauza dimensiunilor mici ale animalelor de laborator s-a ales cantitatea de nanograme pe mililitru care este de o sut de ori mai mare dect cantitatea folosit pe medii de cultur. Pe durata procesului de regenerare muscular IGF I este prezent n spaiul extracelular la 8 ore dup administrare, nregistrnd un vrf la 24 de ore, cu o descretere lent a nivelului de concentraie ntr-o perioad de o sptmn. De aceea, pentru a acoperi perioada de expresie a factorilor de cretere, injeciile au fost administrate la 1, 3 i 5 zile dup traumatism. Animalele au fost sacrificate prin inhalare de CO
2

urmat de dizlocare

cervical la 7 zile dup leziune. Muchii gastrocnemieni au fost izolai i ngheai n 2 metilbutan sub aciunea azotului lichid. Nivelul de regenerare muscular la diferite intervale dup leziune a fost evaluat prin tehnici histologice de morfometrie. Examinarea cantitativ: La o sptmn dup injecie, numrul de miofibrre regenerate la membrul injectat i la membrul de control a fost numrat prin seciuni colorate cu hematoxilin eozin i examinate video microscopic. Fiecare prob a fost numerotat , iar numrarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui sistem LUCIANET de analiz morfometric. Celulele satelite prezint nuclei situai central i reprezint fibre musculare aflate n regenerare. Nu s-au luat n considerare nucleii care nu prezentau citoplasm nconjurtoare. S-a msurat diametrul a
21

200 de fibre musculare de regenerare pe 10 cmpuri microscopice luate la ntmplare cu ajutorul unei vize micrometrice. Numrul i diametrul mediu al fibrelor regenerate a fost calculat i comparat cu cel al membrului de control la care nu s-a administrat factori de cretere. Evaluarea factorilor de cretere n muchiul care se vindec la o lun s-a fcut astfel: ambii muchi gastrocnemieni de la 36 de obolani au fost secionai i reparai dup metoda de mai sus. S-a administrat IGF I la sediul de leziune la 12 obolani n zilele 1, 3 i 5 dup traumatism cu acelai volum de soluie de ser fiziologic administrat n membrul contralateral. La o lun dup leziune 3 animale au fost sacrificate , crora li se administrase factori de cretere, iar muchi lor au fost preparai pentru examen histologic dup metoda de mai sus. Vindecarea muscular a fost observat pe seciuni colorate cu hematoxilin i eozin. Proprietile contractile Evaluarea fiziologic a proprietilor contractile s-a fcut pe celelalte 9 animale rmase dup sacrificarea grupelor anterioare. Asupra lor s-a aplicat o tensiune extern din 20 mN. S-au obinut contracii izometrice msurate cu ajutorul unor dinamometre. Datele obinute au fost stocate pe computer folosind un program de achiziii de date. Amplitudinea stimulrii i a contraciilor consecutive s-a msurat dup 20 de minute de echilibrare n cmp electric prin intermediul a 2 electrozi poziionai la captul iniial i cel final al organului muscular. Durata stimulrii pentru fiecare muchi a fost de 0,25 ms la un voltaj maxim de 50 V. n primul rnd stimularea de 1 Hz a fost aplicat la punctul de maxim ncordare pentru obinerea unor contracii tetanice. Stimularea a durat 0,5 secunde i a determinat o scurtare a muchiului pe o treime din lungimea sa. Msurtorile obinute au fost apoi raportate pe unitatea de greutate a muchiului i exprimate n mN/g. Analiza statistic

22

Pentru studiul regenerrii diametrele fibrelor au fost comparate la muchiul experimental i cel contralateral folosind parametrii testului Student i a testului t. Analiza statistic a fost fcut pe numrul de fibre de regenerare i pe numrul de nuclei ai acestora. n ceea ce privete evaluarea capacitii fiziologice contractile , aceasta s-a fcut pe informaiile obinute n partea a doua a experimentului i datele au fost comparate cu cele din literatura de specialitate. Rezultate I.Evaluarea regenerrii musculare Muchii crora li s-au administrat factori de cretere au prezentat numeroase fibre de regenerare la locul de leziune. Acestea au fost prezente uniform pe toat suprafaa regiunii traumatizate att n zona superficial ct i n cea intermediar i profund a muchiului. La muchiul de control s-a obinut o anumit regenerare predominant localizat n regiunea profund a zonei traumatizate. n regiunea superficial a membrelor de control s-a nregistrat un infiltrat inflamator cu celule mononucleare de mari dimensiuni comparativ cu fibrele de regenerare. Analiza histologic cantitativ a luat n calcul numrul i diametrul fibrelor musculare de regenerare. Toate celulele cu nuclei centrali prezente n zona lezat au fost numrate i li s-a msurat diametrul celular. A existat o cretere a numrului de fibre de regenerare n muchii la care s-a administrat factori de cretere de 3,5 ori mai mare fa de lotul de control. Diametrul mediu al fibrelor musculare regenerate a fost de 31,3 micrometri pentru lotul de control i de 37,4 la lotul tratat cu IGF I. Evaluarea efectului factorilor de cretere pe muchiul n vindecare la o lun s-a fcut comparativ la membrul netratat n care erau prezente numeroase celule cu nuclei centrali dar i o cantitate mare de esut inflamator i conjunctiv. Superficial, exista un strat de acoperire de esut cicatricial fibroblastic care mpiedica regenerarea fibrelor musculare. n schimb, la muchiul tratat cu factor de cretere fibrele musculare regenerate au fost localizate uniform att n
23

zona profund ct i n cea superficial a muchiului. Diametrul lor a fost asemntor cu al miofibrelor normale nconjurtoare i muli dintre nucleii lor se localizaser deja periferic. Dezvoltarea esutului fibroblastic a fost redus la muchii tratai. Aceste date sugereaz c vindecarea muchiului a fost accelerat sub influena factorilor de cretere comparativ cu lotul de control. n zona superficial, miofibrele de regenerare au diametrul mai mic iar esutul fibroblastic este mai frecvent. Aceti muchi au acelai aspect histologic ca i lotul de control. Proprietile contractile La o lun dup traumatism, capacitatea contractil a fost mai crescut la muchii tratai cu IGF I. Pentru a reduce variaiile statistice ntre animalele comparate, datele au fost normalizate innd seama de parametrii variaiei ntre cele dou loturi. Fora de contracie a fost crescut la 76 Mn/g la lotul tratat cu IGF- I fa de 45 Mn/g la lotul de control. Fora de contracie tetanic variaz i n funcie de cantitatea de factori de cretere administrat , astfel nct diferena poate fi considerat semnificativ statistic. Discuie Dezvoltarea folosirii factorilor de cretere permite o recuperare mai rapid i mai complex semnificativ n comparaie cu loturile de control. Este necesar injectarea acestor factori de cretere direct la locul leziunii pentru a obine un efect semnificativ. IGF I s-a dovedit un stimulator potenial al proliferrii i fuziunii mioblatilor la animalele de laborator. Aceste date iniiale confirm studiile anterioare conform crora IGF I stimuleaz proliferarea la bovine i la pui pe medii de cultur. Mecanismele de stimulare ale proliferrii celulare sunt reprezentate de trecerea celulelor satelit din faza G0 n faza G1 a ciclului celular. Este important de recunoscut c regenerarea in vivo este un proces mai complex dect regenerarea in vitro datorit implicrii factorului circulator i factorului nervos. Anumite caracterizri preliminarii ale rolului factorilor de
24

cretere n timpul regenerrii sugereaz c efectele lor individuale sunt mai reduse dect dac aceti factori sunt asociai ntre ei. Am observat o cretere a numrului i dimensiunilor fibrelor musculare regenerate (o cretere a indexului de regenerare). De asemenea, pe modelul nostru miofibrele regenerate sunt localizate n zona superficial a suprafeei lezate numai n cazul n care aceasta este tratat cu factori de cretere, ceea ce demonstreaz potenialul lor crescut de vindecare cnd muchiul este tratat cu aceste substane. Discrepana ntre rezultatele obinute n culturile celulare fa de cele de la animale de laborator se datoreaz interveniei vascularizrii i inervrii suplimentrii de care beneficiaz esutul regenerat la animalul viu. Factorii de cretere specifici au n plus fa de capacitatea de a mbunti regenerarea muscular i o capacitate de a vindeca muchiul n ansamblu. Aceasta se observ dup o lun de tratament la animalele crora li s-a administrat IGF I , la care a fost accelerat vindecarea i recuperarea funcional comparativ cu lotul de control, n plus asociindu-se o reducere a ariilor de fibroz. Injectarea factorilor de cretere reduce formarea de esut cicatriceal n muchi, mai ales cnd este combinat cu ageni antifibrotici de tipul decorinei. mbuntirea activitii funcionale a muchilor tratai cu factori de cretere la o lun dup leziune a fost de 200 % n cazul administrrii de IGF I . Un muchi tratat va putea deci, s genereze o mai mare for muscular mai devreme dect unul netratat i s realizeze un nivel de performan mai ridicat ntr-un timp mai scurt. Rezultatele se dovedesc importante n termenii tratamentului oricrei variantei de lezare muscular i pot oferi o mai bun calitate a vindecrii esutului muscular. n ciuda capacitii regenerative crescute, rspunsul muchiului la traume majore implic n mod tipic producerea masiv de esut fibrotic dens cicatriceal ntre zona lezat i fibrele musculare normale. Prin creterea potenialului regenerativ devine posibil prevenirea cicatricelor post
25

contuzionale i a riscului reducerii potenialului de recdere i reapariie a leziunilor atunci cnd esutul cicatriceal este n exces. n concluzie, studiul a demonstrat c injeciile succesive cu IGF I n muchii traumatizai duc la o mbuntire semnificativ a vindecrii pe animale de laborator. EXPERIMENTUL 8 Material i metode obolani din rasa Sprague Donan n greutate de 250 300 gr i vrsta 10-12 sptmni au fost mprii n mod egal n 5 grupe de experiment i 2 grupe martor. Grupele martor includ animale netratate plus un grup tratat cu soluie ser fiziologic. S-au luat n studiu animale tinere deoarece acestea prezint un potenial mai mare de regenerare dect cele vrstnice. S-au luat n experiment animale anestiziate cu halotan dizolvat n 3 % oxigen ntr-un flux de 2 litri/minut meninut timp de o jumtate de or. Membrul inferior stng n treimea superioar a fost brbierit pentru a evidenia muchiul tibial anterior (TA) unde s-a injectat 0,3 mililitri de soluie de bupivacain prin intermediul unei seringi cu un ac de 13 mm , introdus la jumtatea distanei ntre capetele muchiului , sub un unghi de 45 de grade i avansnd proximal de-a lungul axului longitudinal al muchiului. Dup injectare acul a fost retras lent pe msur ce muchiul se expansiona . S-au recoltat probe de la muchiul injectat i cel contralateral de la animalele din grupul experimental i de control. Dup 1015 minute animalele i-au redobndit contiena. Ne-am asigurat c nu au suferit durere n timpul perioadei de recuperare. Dup 25 de zile de la administrarea injeciei animalele de experien au fost sacrificate i folosite pentru analiza morfometric i determinarea concentraiei de celule satelit. Afectarea muscular local a fost realizat prin aplicare de stimul electric. Pentru aceasta s-a aplicat curent electric de 30 Hz n zilele 1, 5 i 7 n timp ce animalele erau anesteziate. Dup aplicarea stimulului electric s-a produs marca electric nsoit de leziuni musculare. La grupele experimentale s-a administrat IGF I n
26

concentraie 0,1% la locul de aplicare al stimulului electric , iar lotul martor s-a aplicat soluie clorur de sodiu. Prepararea esutului Mostrele de esut recoltate au fost incluse n OCT i ngheate la 80 C cu ajutorul azotului lichid. Seciunile rezultate au fost colorate cu hemotoxilin eozin i trecute pe lame pentru a fi analizate la microscop. Analiza distrugerii fibrelor i reparaia acestora Protocolul folosit a luat n considerare numrarea celulelor satelit pe unitatea de suprafa i volum comparativ la lotul martor cu lotul de experiment iar rezultatele au fost analizate statistic cu ajutorul testului ANOVA i a testului Student cu parametrul t. Rezultate obinute Imaginile obinute au fost prelucrate cu ajutorul sistemului de achiziie i msurare a imaginii LUCIA-NET la un microscop Nikon-Eclipse E60 la care s-a msurat frecvena regenerrii comparative ntre cele dou loturi. Extinderea modificrilor morfologice s-a fcut pe durata a 24 de ore , msurndu-se cantitatea de esut afectat, volumul de infiltrat inflamator reactiv, i cantitatea de celule satelit de regenerare. Discuii Datele prelucrate au demonstrat c aplicarea injectabil de IGF I a dus la vindecarea muchiului ntr-un interval de 11 zile cu creterea cantitii de fibre pe unitatea de volum i foarte puin esut conjunctiv cicatriceal. Aceasta se datoreaz aciunii IGF I de stimulare a activitii celulelor satelit i de transformare a acestora n celule musculare adulte. Fa de lotul martor, unde s-a administrat soluie salin creterile au fost semnificativ mai accentuate (P<0,05). EXPERIMENT 9 Introducere Se cunoate c muchiul scheletic la mamifere este capabil de o regenerare parial dup ce a fost lezat, dar mecanismele celulare implicate sunt
27

nc subiect de dezbatere. Studii histologice care analizeaz stadiile precoce ale reparaiei dup trauma mecanic vizeaz miogeneza creterii sarcoplasmei i numrului de nuclei ai fibrelor musculare. Aceste celule multinucleate sunt intens bazofile i se numesc sarcoblaste. Acest termen este utilizat i de ctre prezenta lucrare. Dou explicaii ale modalitilor prin care se formeaz miotubii sunt n dezbatere: prima este ipoteza continu (teoria nmuguririi) care postuleaz creterea muchiului din capetele viabile secionate ale fibrelor prin intermediul mugurilor sarcoplasmatici nucleai care fuzioneaz rapid pentru a forma miotubi. A doua ipotez este teoria discontinu sau embrionar care sugereaz c n primele stadii ale regenerrii celulele mononucleate (mioblatii) apar n aria lezat unde prolifereaz i fuzioneaz pentru a forma miotubi multinucleai. Acetia nu sunt la nceput conectai cu capetele secionate ale fibrelor originale. Puine studii sublinia c miotubii s-ar forma prin ambele procese. n general susintorii teoriei continue au inclus n experimentele lor afectri mai severe ale fibrelor musculare n timp ce susintorii teoriei discontinue au inclus leziuni mai superficiale. Este posibil s existe dou feluri de reparaie relativ la severitatea leziunii. Acest experiment ncearc s stabileasc dac modalitile de regenerare continu , respectiv discontinu apar n funcie de tipul de leziune implicat n afectarea fibrelor musculare individuale i a nveliurilor lor sarcolemale. Materiale i metode obolanii aduli din rasa Wistar Arbino cntrind ntre 150-200 g au fost anesteziai i li s-a pus n eviden sub anestezie muchiul latissimus dorsi de pe partea stng . La primul grup s-a efectuat o seciune de 5 mm lungime transversal la captul superior al muchiului cu ajutorul unui bisturiu curb. La al doilea grup captul superior a fost zdrobit pentru 2 secunde cu ajutorul unui forceps aplicat asupra zonei fr a fi lezat membrana bazal i straturile profunde. La o perioad dup operaie, obolanii au fost sacrificai, 3 deodat, cu
28

cloroform. Pentru examenul la microscop ntregul animal a fost fixat n formol, eantioane din aria lezat fiind ndeprtate dup fixare. Seciune la parafin au fost colorate fie cu hematoxilin eozin , fie cu albastru de metilen. Secionarea muchiului Aria lezat a muchiului secionat n primele dou zile a fost infiltrat intens cu polimorfo nucleare i macrofage

29

30