A lactato desidrogenase (LDH) uma enzima presente em uma ampla variedade de organismos.

. LDH em exame diagnstico Os danos em tecidos elevam os nveis de LDH. Desta forma, a medio de LDH em exame indica hemlise, que pode ocasionar anemia hemoltica. Outros problemas de sade que provocam elevao de LDH incluem cncer, meningite, encefalite, pancreatite aguda e AIDS. LDH e hemlise Na medicina, LDH freqentemente usado como marcador para danos em tecidos, j que ele abundante em clulas vermelhas e pode funcionar como marcador para hemlise. LDH tambm pode ser usado como marcador de infarto do miocrdio. Aps um infarto do miocrdio os nveis de LDH atingem um pico em 3 a 4 dias e permanecem elevados por at 10 dias. Desta forma, nveis elevados de LDH podem ajudar a determinar se o paciente teve infarto do miocrdio caso ele v ao mdico vrios dias depois de um episdio de dor no peito. LDH e cncer Outros usos de LDH so para a medio de danos aos tecidos em geral, quando no h outros indicadores de hemlise. Isso utilizado como acompanhamento de pacientes com cncer (especialmente linfoma), uma vez que as clulas cancerosas tm maior taxa de renovao com as clulas destrudas ocasionando elevao de LDH. LDH, meningite e encefalite A enzima LDH tambm encontrada em fluido crebro-espinhal, onde seus altos nveis esto freqentemente associados meningite bacteriana. Altos nveis de LDH tambm podem ocorrer em casos de meningite viral, geralmente indicando a presena de encefalite. LDH e AIDS LDH freqentemente usado em pacientes com AIDS como marcador no-especfico para pneumonia decorrente de Pneumocystis jiroveci. LDH e disgerminoma Nveis elevados de LDH freqentemente o primeiro sinal clnico de disgerminoma, um tipo de tumor de clulas germinativas que geralmente ocorre no ovrio. Nem todos os disgerminomas produzem LDH e esse geralmente um achado no-especfico. A hiperlacticidmia observada em doentes spticos/traumatizados habitualmente relacionada com hipxia/hipoperfuso e consequentemente com a gliclise anaerbica, mesmo em situaes em que os habituais indicadores da perfuso tecidular como a presso arterial, dbito cardaco e dbito urinrio so normais ou em margem clinicamente aceitvel. Como a hiperlacticidmia nem sempre se correlaciona com os habituais indicadores de perfuso nem diminui com o aumento do transporte de oxignio (DO2), devero existir outros mecanismos para a sua formao, inclusiv em tecidos bem oxigenados. Na spsis existem evidncias de que a acumulao de lactato no o resultado da falta de O2.

A acidose lctica pode ser classificada em dois tipos: a de tipo A associada com evidncia de deficiente perfuso ou oxigenao tecidular, enquanto que a de tipo B no se relaciona com m perfuso ou oxigenao. Lactato: O lactato um produto final da gliclise anaerbica que ocorre em tecidos hipxicos. Contudo, tecidos bem oxigenados podem em certas condies gerar lactato atravs da gliclise aerbica. A produo normal de lactato de 1 mmol/Kg/hora. Ocorrem principalmente no msculo esqueltico, intestino, crebro e glbulos vermelhos; estudos em animais e humanos mostraram que o pulmo pode ser uma fonte importante de lactato no contexto de leso pulmonar aguda. O lactato formado pode ser captado pelo fgado e ser convertido em glicose (neoglicognese) ou ser utilizado como combustvel (fonte de energia). O metabolismo anaerbico da glicose produz apenas 47 Kcal de energia por mole de glicose, enquanto que o metabolismo aerbico gera 673 Kcal por mole de glicose. A oxidao do lactato produz 326 Kcal por mole de lactato e como 1 mole de glicose produz 2 moles de lactato, a energia produzida a partir da gliclise anaerbica ser aumentada para 625 Kcal (2 x 326) esta via utilizada durante o exerccio e pode ocorrer nas fases iniciais do choque (quando o msculo esqueltico torna-se anaerbico o lactato gerado pode ser utilizado como fonte de energia por outros rgos vitais que ainda esto em aerobiose, como o corao e o S.N.C.). Gliclise anaerbica: Glicose + 2 ATP + 2 H2PO4 2 Lactato + 2 ADP + 2H2O Hiperlacticidmia: Em repouso a concentrao normal de lactato no sangue inferior a 2 mmol/L e aumenta at 5 mmol/L durante o exerccio. Um nvel superior a 2 em repouso considerado anormal. Contudo pequenas elevaes do lactato (2 a 4mmol/L) podem no se acompanhar de acidose. Causas de aumento do lactato: Hipxia a causa mais importante de acidose lctica a deficiente oxigenao celular no choque (hipovolmico, cardiognico ou sptico). Nestes doentes, a severidade da hiperlacticidmia foi relacionada com o prognstico. Quando superior a 10 mmol/L, so escassas as hipteses de sobreviver: Lactato (mmol/L) Terminologia clnica Mortalidade associada (%) < 2,5 normal -2,5 4,9 ligeira 25 - 35 5,0 9,9 moderada 60 75 > 10 severa > 95 Segundo um estudo realizado por JL Vincent, para alm do valor dos nveis de lactato, tambm a durao da hiperlacticidmia tem importante valor prognstico no choque sptico.

A Hipoxmia e a Anemia raramente se acompanham de Acidose Lctica. Doentes com DPOC ou ARDS, sem choque, podem apresentar hiponmia severa sem que haja acidose lctica. Na anemia apenas quando o hematcrito inferior a 10 que surge diminuio da oxigenao tecidular (at este valor o aumento da extrao de O2 ajuda a manter constante o consumo de O2 pelos tecidos). Adrenalina a hiperlacticidmia persistente observada em doentes traumatizados e spticos mas hemodinmicamente estveis pode ser devida gliclise aerbica estimulada pela adrenalina. Nestes- doentes, as concentraes sricas de adrenalina encontram-se muito aumentadas e correlacionam-se com os nveis de lactato srico, sugerindo ser reflexo da gliclise aerbica. A adrenalina tendo a capacidade de estimular a bomba de Na+-K+ ATPase estimula a produo de lactato. O uso de perfuses de adrenalina encontra-se relacionado com o aumento dos nveis de lactato e com a acidose lctica, como foi demonstrado por Richard Totaro, em doentes submetidos a bypass cardiopulmonar e por Nicholas Day em doentes com spsis severa e com malria severa a falciparum. Este fenmeno no ocorre com perfuses de noradrenalina, pelo que a acidose lctica poder ser um fenmeno b2-mediado. Endotoxmia as toxinas produzidas pelas bactrias Gram negativas tm a capacidade de inibir a piruvato desidrogenase, conduzindo a um aumento do lactato no citoplasma das clulas sem que haja dficit da oxigenao celular. Dficit de Tiamina a Tiamina um co-factor da piruvato desidrogenase, pelo que o seu dficit pode-se fazer acompanhar de hiperlacticidmia. O dficit de Tiamina pode ser freqente em doentes de Cuidados Intensivos por variadas razes: 1) os depsitos so escassos (bastam 10 dias de privao para que surja depleco); 2) o consumo aumenta em situaes de hipercatabolismo e em doentes submetidos a suporte nutricional rico em hidratos de carbono; 3) a excreo urinria aumenta nos doentes medicados com furosemido. Por estas razes, h que contar com o dfice de Tiamina nos doentes com hiperlacticidmia inexplicada. Alcalose a severa alcalose (respiratria ou metablica) pode aumentar os nveis de lactato devido ao aumento da actividade de enzimas pH-dependentes da via glicoltica que promovem a formao de lactato. Quando a funo heptica normal o fgado metaboliza o lactato extra gerado durante a alcalose e a hiperlacticidmia torna-se evidente apenas quando o pH igual ou superior a 7,6. Se a funo heptica estiver alterada, a hiperlacticidmia surge com alcalose menos severa. A teraputica alcalina para correco da acidose lctica pode conduzir a um aumento do lactato. Asma Aguda a hiperlacticidmia encontrada frequentemente na altura da admisso de doentes com crise asmtica e aumenta significativamente durante o tratamento, apesar da significativa melhoria clnica (avaliada pela frequncia respiratria, expirometria e gasimetria arterial) e na ausncia de hipotenso, severa hipoxmia ou spsis. As possveis causas para a hiperlacticidmia podero ser vrias como a produo de lactato pelos msculos respiratrios, a hipofosfatmia e os frmacos broncodilatadores (b2 agonistas). Outras causas - convulses (por aumento da produo de lactato), insuficincia heptica (por diminuio da clearance) e toxicidade do nitroprussiato (por acumulao de cianeto). Diagnstico: A hiperlacticidmia uma das causas possveis de acidose metablica no doente crtico, independentemente do anion-gap (geralmente aumentado, mas pode ser normal).

O lactato pode ser medido no plasma ou em sangue total. Se a medio imediata no for possvel, a amostra de sangue dever ser colocada em gelo. Concluso: As causas de hiperlacticidmia so variadas. Os mecanismos que conduzem acidose lctica podem ser hipxicos, conduzindo a um estado de isqumia generalizada, como nos casos de choque, e no hipxicos como so, por exemplo, as alteraes do clearance do lactato (disfunes heptica ou renal), as disfunes da piruvato-desidrogenase (devido a spsis, endotoxmia, dfice de tiamina, nveis elevados de catecolaminas) e a gliclise aerbica acelarada (secundria a spsis, convulses, neoplasias). Daqui se poder inferir que vrios mecanismos podero estar presentes no mesmo doente, pelo que, no caso de spsis/trauma os nveis de lactato no devero ser considerados sinnimo de deficiente perfuso tecidular. Aplicaes de enzimas nas anlises clnicas e na teraputica Enzimas como trombina e plasmina, associadas ao processo de coagulao sangnea, bem como lipoprotena lipase, envolvida com o processamento dos quilomicrons; so exemplos de enzimas especficas do plasma e por isso so encontradas em concentraes mais elevadas. Nas doenas de tecidos e rgos pode haver alteraes na permeabilidade da membrana, ou morte celular e com isso, enzimas dos tecidos difundem-se para o plasma. Essas enzimas, normalmente esto presentes em baixas concentraes e no tm nenhum papel funcional no plasma. No diagnstico do envolvimento de um rgo especfico numa doena, seria ideal se as enzimas particulares para cada rgo pudessem ser identificadas. Isso improvvel porque os processos metablicos de vrios rgos so muito semelhantes. Embora existam poucas enzimas especficas para um determinado rgo ou tecido, como a lcool desidrogenase do fgado e a fosfatase cida da prstata, o estudo da cintica do aparecimento e desaparecimento de enzimas particulares no plasma, permite que o diagnstico do envolvimento de um rgo especfico seja feito. Estudos da cintica de liberao de enzimas cardacas no soro, aps um enfarte do miocrdio, permitem estabelecer quando o ataque ocorreu e se o tratamento efetivo. A concentrao plasmtica de creatina fosfocinase (CPK), aumenta cerca de seis vezes, entre o primeiro e o segundo dia aps o enfarte; enquanto a lactato desidrogenase (LDH) e a a-hidroxibutrico desidrogenase (HBDH), aumentam cerca de duas vezes, de forma mais lenta, mas permanecem elevadas por mais tempo. Entre as enzimas utilizadas com freqncia no diagnstico de doenas podemos relacionar, alm daquelas citadas acima, fosfatase alcalina, amilase, lipase, aspartato e alanina amino transferases, tambm conhecidas como transaminase glutmico oxaloactica (TGO) e transaminase glutmico pirvica (TGP), respectivamente. O reconhecimento dos metablitos que se acumulam em fluidos biolgicos, tem um papel importante na identificao de possveis defeitos na produo ou na atividade de enzimas. Como exemplo, temos a acidria ortica hereditria, devida deficincia enzimtica dupla na via de biossntese de pirimidinas, levando ao acmulo de cido ortico. A hiperuricemia um outro exemplo de aumento de metablito, devido a deficincia na produo da enzima hipoxantinaguanina-fosforribosiltransferase.

Enzimas so utilizadas como reagentes qumicos em analisadores clnicos portteis. Dosagem de colesterol, triacilgliceris, glicose, podem ser realizados em poucos minutos, usando 10mL de plasma. A qumica clnica moderna tem se beneficiado da unio entre a qumica e a imunologia. Anticorpos especficos contra um antgeno proteico so acoplados a uma enzima indicadora, como peroxidase de raiz forte (horseradish), gerando um ensaio muito especfico e sensvel. Esse ensaio conhecido como ELISA (enzyme-linked immunoadsorbent assay). Um exemplo de sua utilizao demonstrado por um ensaio para identificao dos antgenos proteicos da capa do virus da imunodeficincia humana (HIV), que gera a sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS). A identificao de isoenzimas enzimas que catalisam a mesma reao, mas migram diferentemente em um campo eletrofortico tambm tem sido usada para diagnstico clnico. Exemplos de isoenzimas que tm ampla aplicao clnica: 1) Creatina fosfocinase um dmero com dois tipos de subunidades, M (muscular) e B (cerebral). No msculo esqueltico as duas subunidades so do tipo M. No crebro as duas unidades so do tipo B. Somente no miocrdio se encontra a isoenzima contendo as duas subunidade M e B. Nos outros tecidos so encontradas quantidades variveis de isoenzimas MM e BB. De acordo com a mobilidade para o nodo, na eletroforese, essas isoenzimas so denominadas CPK1 (BB), CPK2 (MB) e CPK3 (MM). 2) Lactato desidrogenase, uma enzima tetramrica contendo apenas duas subunidades diferentes: H, para o corao e M, para o msculo esqueltico. So identificadas cinco formas dessas isoenzimas: LDH1 (HHHH) e LDH2 (HHHM), encontradas no miocrdio e nos eritrcitos; LDH3 (HHMM), no crebro e rim; LDH4 (HMMM) e por fim LDH5 (MMMM), encontrada no fgado e msculo esqueltico. Estreptocinase, uma mistura de enzimas obtida de um streptococcus, utilizada para a remoo de cogulos sangneos, atravs da ativio do plasminognio, a forma inativa da plasmina, no plasma. Uma outra aplicao de enzimas como agentes teraputicos a utilizao da asparaginase, em alguns tipos de leucemia em adulto, com o objetivo de inibir o crescimento de clulas tumorais, reduzindo os nveis plasmticos de asparagina do hospedeiro. Com o avano dos conhecimentos na rea da biologia molecular, as enzimas so pea fundamental no diagnstico e na cura de doenas relacionadas com alteraes genticas. Enzimas Temas: Propriedades Gerais Cintica Enzimas so protenas com atividade cataltica envolvidas em quase todas as reaes qumicas que mantm a homeostase animal. A natureza protica torna as enzimas sensveis variao de pH e de temperatura. Cada enzima apresenta sua atividade mxima, em pH, temperatura e tempo especficos. Propriedades Gerais

Devido ao seu papel na manuteno da vida, o estudo da regulao farmacolgica das enzimas tem se tornado um elemento chave no diagnstico clnico e na teraputica. As ribozimas constituem uma classe de catalisadores biolgicos que, diferentemente das demais enzimas, no so molculas proticas. As ribozimas so molculas de cido ribonuclico (RNA) que catalisam reaes de quebra das ligaes fosfodiester de outras molculas de RNA. As enzimas esto presentes em todos os tecidos e fluidos do corpo. Enquanto as enzimas intracelulares participam do conjunto de reaes das diversas vias metablicas, as enzimas presentes na membrana plasmtica regulam as reaes no interior das clulas em resposta aos sinais extracelulares. No sistema circulatrio esto presentes as enzimas responsveis pela regulao do processo de coagulao sangnea. As enzimas, como todo catalisador, aceleram reaes. Cada unidade da anidrase carbnica, por exemplo, capaz de hidratar 105 molculas de CO2 por segundo. Isso representa uma velocidade de hidratao 107 vezes mais rpida do que a reao no catalisada. A supremacia das enzimas sobre os demais catalisadores est, sobretudo, na sua especificidade tanto para as reaes que catalisam quanto para os reagentes substratos envolvidos nas reaes. O grau de especificidade no o mesmo para todas as enzimas, por isso que embora a grande maioria das enzimas estejam envolvidas com uma nica reao qumica, existem enzimas que participam de um conjunto de reaes intimamente relacionadas. Tradicionalmente as enzimas recebiam um nome proporo em que iam sendo caracterizadas. O aumento no nmero de enzimas isoladas e caracterizadas levou os pesquisadores a adotar uma nomenclatura e uma classificao sistemticas. Atualmente as enzimas esto agrupadas em seis classes funcionais, de acordo com a Unio Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (IUBMB). As enzimas tambm so classificadas com base em sua composio, que podem ser simples ou conjugadas. Existem enzimas compostas apenas de protenas, outras existem que apresentam molculas orgnicas relativamente pequenas ligadas protena. Essas enzimas so denominadas holoenzimas, onde a parte protica conhecida como apoenzima e a poro no protica, chamada de coenzima ou grupo prosttico, pode ser simples como um on metlico, ou complexo como pequenas molculas orgnicas de natureza no protica. Coenzima um composto orgnico, de baixo peso molecular e de natureza no protica (quase sempre um nucleotdeo), que participa nas reaes catalisadas por enzimas como aceitador ou doador de grupos qumicos ou de eltrons.Considerando que a coenzima sofre alteraes qumicas, devido a ao da enzima a que est ligada, comum considera-la como uma classe especial de substrato (ou segundo substrato). A coenzima, ao doar o grupamento qumico para uma molcula aceitadora, regenerada sua forma original. Essa capacidade de regenerao da coenzima e, conseqentemente, da holoenzima, justifica plenamente o conceito de enzima como um catalisador biolgico. As metaloenzimas trazem em sua composio um tomo de metal. Quando, no entanto, a enzima tem baixa afinidade por um on metlico, mas depende dele para sua atividade, ela considerada uma enzima ativada por metal. Cintica O crescimento e a manuteno das clulas nos seres vivos dependem da constante transformao de tipos diferentes de energia. Essas transformaes so feitas por molculas enzimticas, participantes de sistemas biolgicos altamente organizados. Sem a participao das enzimas nas clulas e organismos, a grande maioria das reaes ocorreria de forma to

lenta que seria invivel a manuteno da vida. Uma reao catalisada por enzima pode se processar, a 25C, 106 a 105 vezes mais rapidamente do que a mesma reao no catalisada. A velocidade de uma reao qumica definida pelo nmero de molculas de reagente(s) que so convertidas em produto(s), em um perodo de tempo especificado e depende da concentrao dos componentes qumicos envolvidos no processo e das constantes de velocidade, que so caractersticas da reao. A grande maioria das reaes que ocorrem na natureza reversvel. Cada reao qumica apresenta um ponto de equilbrio caracterstico, onde as velocidades absolutas na direo da formao de produto(s) e na direo de formao de reagente(s) so iguais. Este ponto de equilbrio descrito por uma constante de equilbrio, que corresponde relao entre as duas constantes de velocidade. As enzimas, como outros catalisadores, no interferem na constante de equilbrio das reaes, mas aumentam a velocidade das reaes qumicas, diminuindo a energia de ativao dos reagentes, necessria para transforma-los em produto. Para que haja essa transformao, os reagentes precisam atingir um estado de transio e as enzimas aceleram a velocidade da reao reduzindo a energia do estado de transio. As enzimas no somente aceleram as reaes, mas tambm acoplam reaes de maneira produtiva: Considere a energia livre (DG) necessria para transformar glicose em glicose-6fosfato: Glicose Glicose-6-Pi DG = 4,0 kcal/mol e a energia de hidrlise do ATP: ATP ADP + Pi DG = -7,3 kcal/mol

A enzima hexocinase catalisa o acoplamento destas duas reaes, gerando glicose-6-fosfato, com DG de hidrlise -3,3 kcal/mol: Glicose + ATP Glicose-6-Pi + ADP + Pi A transformao do substrato (reagente) em produto implica na interao Enzima-Substrato, conhecido como o modelo do encaixe induzido. Esse modelo prope que a interao inicial entre a enzima e o substrato relativamente fraca, mas capaz de induzir modificaes na estrutura da enzima, que atrai o substrato para o stio cataltico. Ligada enzima, a molcula do substrato sofre rearranjos que vo favorecer a transformao do complexo enzima-substrato de transio em produto. Compare o comportamento de uma reao catalisada por enzima e uma reao no catalisada utilizando o simulador 1. Observou que em altas concentraes do substrato (reagente) a velocidade da reao enzimtica quase independente da concentrao do substrato? Em 1913, Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram um modelo simples para explicar essas caractersticas cinticas. Elas propuseram que uma enzima, E, combina-se com o substrato, S, formando um complexo ES, com uma constante de velocidade k1. O complexo ES pode dissociar-se para E e S, com uma constante de velocidade k2, ou pode prosseguir formando o produto P, com uma constante de velocidade k3. Na etapa inicial da reao, antes que a concentrao de produto seja aprecivel, quase nada do produto revertido para o substrato inicial.

E + S <____> ES ___>E + P A velocidade de catlise, ou velocidade inicial (v) igual ao produto da concentrao de ES por k3: v = k3[ES] (1)

A velocidade de formao de ES corresponde a k1[E][S] A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3)[ES] No estado estacionrio ou no equilbrio estacionrio, a concentrao de ES ser constante, ou seja: A velocidade de formao de ES ser igual velocidade de quebra: k1[E][S] = (k2 + k3)[ES] (2)

Esta equao pode ser escrita de outra forma: [ES] = [E][S] / (k2 + k3)/ k1 (3)

A constante de Michaelis definida como: KM = (k2 + k3)/ k1 (4)

e a equao (2) pode, ento ser reescrita: [ES] = [E][S] / KM (5)

Considerando que a concentrao de enzima livre [E] corresponde concentrao de enzima total [ET], menos a concentrao da enzima ligada [ES], a equao (4) pode ser apresentada assim: [ES] = ([ET] - [ES]) [S] / KM ou: [ES] = [ET]( [S] / KM /(1+[S] / KM)) ou ainda: [ES] = [ET]( [S] /([S] + KM)) (8) (7) (6)

Substituindo [ES] na equao (1) temos: v = k3[ET]( [S] /([S] + KM)) (9)

Quando os centros catalticos esto saturados com substrato, a velocidade da reao mxima (Vmx). Nestas circunstncias, [S] muito maior do que KM e [S] /([S] + KM) se aproxima de 1. Dessa forma

Vmx = k3[ET] E a velocidade inicial, na equao (9), corresponde a: v = Vmx[S] /([S] + KM)) (10)

Essa equao (10) explica o comportamento da cintica de reaes catalisadas por enzimas: 1) Quando [S] muito maior do que KM, v = Vmx; ou seja, a velocidade da reao mxima e independe da concentrao do substrato e a velocidade mxima de catlise (kcat) igual a k3. 2) Quando [S] muito menor do que KM, v = [S]Vmx/ KM; ou seja, a velocidade da reao diretamente proporcional concentrao de substrato. Esta situao observada em condies fisiolgicas, onde a relao [S] / KM encontra-se em torno de 0,01 a 1,0. Neste caso, a velocidade enzimtica muito menor do que k3 porque a maior parte dos centros ativos est desocupada e depende da velocidade de formao do complexo ES. 3) Quando [S] igual a KM, v = Vmx/2. Portanto, KM corresponde concentrao de substrato em que a velocidade da reao a metade da velocidade mxima. A maioria das reaes catalisadas por enzimas pode ser analisada quantitativamente pela teoria proposta por Michaelis e Menten, que apresenta como elemento chave o KM. Em condies definidas de pH e temperatura, o KM para um dado substrato caracterstico. Essa constante pode ser calculada a partir do valor de Vmx. A determinao do valor de Vmx com o auxlio da equao de Michaelis e Menten difcil, uma vez que a curva hiperblica gerada, apenas se aproxima do real valor de Vmx. Esta equao pode ser transformada algebricamente em outras formas que se aplicam melhor no tratamento grfico dos dados experimentais. Uma transformao muito usada aquela proposta por Lineweaver e Burk. Estes pesquisadores inverteram ambos os membros da equao proposta por Michelis e Menten e obtiveram: 1/v = ([S] + KM) / Vmx[S] ou: 1/v = KM/ Vmx[S] + [S] / Vmx[S] ou, ainda: 1/v = (KM/ Vmx)(1/[S]) + 1/ Vmx No grfico gerado por esta equao, KM/ Vmx corresponde inclinao da reta, 1/ Vmx, ao intercepto no eixo 1/v e 1/ KM, ao intercepto no eixo 1/[S]. Esse grfico conhecido como grfico duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk e tem a grande vantagem de garantir uma determinao precisa do valor de Vmx. Utilizando os valores obtidos com o simulador 1, tente determinar a concentrao de substrato ([S]) que gera a velocidade mxima (Vmx) de uma reao catalisada por enzima.

Observe que, mesmo usando concentraes muito elevadas do substrato, o valor de Vmx ainda ser crescente. Utilizando a ferramenta Excel calcule os inversos de [S] e v construa o grfico e calcule, com preciso, os valores de KM e de Vmx. O grfico duplo-recproco obtido a partir dos resultados de uma reao catalisada por enzima muito til na anlise de reaes enzimticas em presena de inibidores. Cada enzima apresenta um valor caracterstico de KM e de Vmx. Para a maioria das enzimas, o valor de KM est entre 10-1 e 10-7 M. Esse valor depende do substrato em particular e tambm das condies no sistema de reao, tais como pH, temperatura e fora inica. KM corresponde concentrao de substrato em que metade dos centros ativa da enzima est preenchidos. Com isso, podemos avaliar a frao de centros ativos preenchidos (fES), com qualquer concentrao de substrato, desde que KM seja conhecido: fES = v/Vmx = [S]/([S]+ KM) Na equao (4) vimos que KM = (k2 + k3)/ k1 . Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior do que k3; isto significa que a dissociao do complexo ES em E mais S mais rpida do que a formao de E mais produto. Portanto quando k3 muito menor do que k2, KM igual constante de dissociao de ES. Em outras palavras: KM alto baixa afinidade entre enzima e substrato alta afinidade entre enzima e substrato

KM baixo

Utilizando, agora, o simulador 2 mantenha fixa [S] (cerca de 10 vezes maior do que o KM) e adicione valores crescentes de [E]. Em seguida construa um grfico da velocidade inicial (v) em funo de [E]. A poro linear da curva obtida pode ser usada para determinar a concentrao da enzima presente em uma amostra desconhecida (soro sangneo, por exemplo), a partir da velocidade inicial. Agora, utilize o simulador 3 e descubra: 1) Qual o substrato comum s duas enzimas. 2) Qual das duas enzimas especifica para esse substrato. 3) Qual das duas enzimas tem maior afinidade por esse substrato. Especificidade e afinidade da enzima pelo substrato so a mesma coisa? A maioria das enzimas pode ser inibida por certos reagentes qumicos. Essa inibio por pequenas molculas e ons especficos importante nos mecanismos de controle em sistemas biolgicos. O estudo de inibidores de enzimas, tambm se constitui em uma fonte valiosa de informaes sobre os mecanismos da ao enzimtica. Os inibidores podem ser agrupados em: Inibidores irreversveis aqueles que se ligam ou destroem um grupo funcional, imprescindvel para a atividade enzimtica. A ligao pode ser covalente ou no e sua dissociao muito lenta. O composto diisopropilfluorofosfato (DIFP), por exemplo, reage com uma serina, no stio

cataltico da acetilcolinesterase. A inibio da enzima compromete a transmisso dos impulsos nervosos. Inibidores reversveis caracterizados por uma rpida dissociao do complexo enzima-inibidor. Podem ser de dois tipos: Competitivos em que a enzima pode ligar-se ao substrato ou ao inibidor, mas no aos dois simultaneamente. Uma vez ligado, o inibidor competitivo no sofre transformao. Esse tipo de inibio revertido pelo simples aumento da concentrao do substrato. No competitivos nesse caso o inibidor liga-se enzima em um local diferente do stio ativo, alterando a sua conformao. Nesse caso a enzima pode ligar-se simultaneamente ao inibidor e ao substrato. O aumento na concentrao de substrato, no entanto, no atenua a inibio. As inibies competitiva e no competitiva apresentam caractersticas prprias. Utilizando o simulador 4 possvel observar que a Vmx de uma reao catalisada por enzima, no sofre alterao na presena do inibidor, enquanto KM aumenta. Por outro lado, na inibio no competitiva, a Vmx sofre reduo (a concentrao efetiva da enzima diminuiu), enquanto KM permanece o mesmo, quando em presena do inibidor. Muitas enzimas apresentam propriedades cinticas que no podem ser explicadas com o modelo proposto por Michaelis e Menten. Um grupo que apresenta estas caractersticas so as enzimas alostricas, que freqentemente apresentam grficos de v em funo de [S] em forma de S (sigmides). A atividade destas enzimas pode ser alterada por molculas que se ligam a locais diferentes do stio cataltico e garantem sua regulao. Uma via metablica envolvendo vrias enzimas, normalmente tem uma etapa que limita a velocidade da reao. Essa etapa catalisada por uma enzima alostrica. Em outra classe de enzimas, envolvidas com a regulao do metabolismo, a atividade modulada por modificao covalente de algum grupo funcional especfico. Existem algumas enzimas que apresentam mltiplas formas moleculares, mas que catalisam uma mesma reao geral e so chamadas de isoenzimas. Mutaes genticas hereditrias podem gerar doenas que se caracterizam pelo funcionamento defeituoso de uma ou mais enzimas. Metabolismo de carboidratos 1 - Digesto e absoro 2 - Gliclise 3 - Gliconeognese 1 - Digesto e absoro A digesto dos carboidratos tem incio na boca. Amido e glicognio hidratados sofrem a ao da enzima alfa-amilase, presente na saliva, e so reduzidos a estruturas menores. No duodeno estes fragmentos so atacados, com maior eficincia, pela alfa-amilase presente no suco pancretico e so transformados no monossacardeo glicose, no dissacardeo maltose, no trissacardeo maltotriose e nas chamadas dextrinas alfa-limite. A alfa-amilase assim chamada, porque s quebra ligaes glicosdicas do tipo alfa-1,4. A amilopectina (uma frao do amido) e o glicognio so polissacardeos ramificados, por isso contm, em sua estrutura, ligaes glicosdicas alfa-1,6, alm das ligaes alfa-1,4.

As ligaes alfa-1,4 de unidades de glicose que servem como pontos de ramificao, no sofrem a ao da alfa-amilase, gerando as dextrinas alfa-limite, contendo uma mdia de oito unidades de glicose e uma ou mais ligaes glicosdicas alfa-1,6. A hidrlise final de di- e oligossacardeos a monossacardeos realizada por enzimas de superfcie das clulas epiteliais do intestino delgado (lactase, maltase, alfa-1,6-glicosidase, sacarase) liberando monossacardeos. Di-, oligo- e polissacardeos que no so hidrolisados pela alfa-amilase e/ou enzimas de superfcie das clulas epiteliais do intestino no podem ser absorvidos e na poro inferior do intestino so metabolizados por bactrias. O produto do metabolismo bacteriano so cidos graxos de cadeia curta, lactato, hidrognio, metano e dixido de carbono. Os monossacardeos, glicose, galactose, frutose e outros que ocorrem em menor quantidade, so absorvidos por um processo mediado por transportadores especficos. A entrada de glicose e galactose ocorre com a entrada concomitante de sdio, enquanto a entrada de frutose no dependente da entrada de sdio.

2 - Gliclise A gliclise se caracteriza como uma via metablica utilizada por todas as clulas do corpo, para extrair parte da energia contida na molcula da glicose, e gerar duas molculas de lactato. Esse processo no envolve consumo de oxignio molecular e por isso chamado de fermentao anaerbica. Na via glicoltica, como tambm chamada a gliclise, so gerados dois moles de ATP por mol de glicose, na ausncia de oxignio molecular. A gliclise se constitue na etapa inicial no processo da oxidao completa de carboidratos envolvendo oxignio molecular. A presena de oxignio nessa primeira etapa pode, de forma indireta, suprimir a gliclise. Esse fenmeno chamado efeito Pasteur. Quando a clula contm mitocndrias, a via glicoltica pode ocorrer mesmo na presena de oxignio molecular, desde que o piruvato gerado no seja reduzido a lactato. O piruvato entra para a mitocndria e a oxidado completamente a dixido de carbono e gua, gerando cerca de trinta e oito moles de ATP por mol de glicose oxidada.

A via glicoltica apresenta trs etapas distintas: Na primeira etapa a glicose fosforilada sob a ao da enzima hexocinase e a glicose-6-fosfato (G6P), gerada no citosol, no pode sair da clula. Essa reao irreversvel. Quando o fgado necessita exportar glicose para outros tecidos, a G6P sofre a ao da enzima glicose-6-fosfatase, que catalisa a reao reversa daquela catalisada pela hexocinase. A G6P transformada, em seguida, no seu ismero frutose-6-fostato (F6P), por ao da enzima fosfoglicose isomerase. Finalmente a F6P recebe mais um grupamento fosfato e transformada no composto frutose1,6-bisfosfato. Esta reao tambm irreversvel e catalisada pela fosfofruto-cinase, uma enzima alostrica.

Na segunda etapa a frutose-1,6-bisfosfato sofre a ao da aldolase gerando uma molcula de diidroxiacetona fosfato e uma molcula de gliceraldedo-3-fosfato (GAP). Sob a ao da triose fosfato isomerase, diidroxiacetona fosfato convertida em gliceraldedo-3fosfato.

A terceira etapa tem incio com a produo de 1,3-bisfosfoglicerato, composto gerado pela ao da enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase sobre o GAP. Essa enzima tem como coenzima o NAD (Nicotinamida adenina di-nucleotdeo). O composto 1,3-bisfosfoglicerato um anidrido misto de um cido carboxlico e cido fosfrico, com um alto potencial energtico permitindo que, na reao seguinte, catlisada pela fosfoglicerato cinase haja produo de ATP. A outra reao onde ocorre sntese de ATP catalisada pela piruvato cinase, enzima que transforma fosfoenolpiruvato em piruvato. Esta a terceira reao irreversvel da via glicoltica.

Regulao da via glicoltica As trs reaes irreversveis se constituem nos pontos de regulao da via glicoltica: Hexocinase inibida pelo produto da reao, G6P. Esta enzima est presente na maioria dos tecidos e apresenta um Km menor que 0,1mM para a glicose presente no sangue. No fgado, alm da hexocinase est presente uma isoenzima, a Glicocinase, que tambm fosforila a glicose, utilizando ATP, mas no inibida pelo produto da reao. Esta enzima apresenta um Km cerca de 100 vezes maior para a glicose, do que a hexocinase e inibida pela frutose-6-fosfato, enquanto a frutose-1-fosfato estimula a sua atividade. Por essa razo, quando os nveis de glicose circulante esto altos, o fgado utiliza glicose a uma velocidade considervel e com isso mantem normal a glicemia. Por outro lado, tecidos como o crebro utilizam glicose mesmo quando a sua concentrao no sangue e no tecido se encontra em nveis muito baixos.

Fosfofrutocinase uma enzima alostrica e por isso, deve catalisar a reao limitante da gliclise, se consitutindo no ponto regulatrio mais importante na maioria dos tecidos. Esta enzima inibida quando os nveis de citrato esto elevados. Por outro lado APM e frutose-2,6bisfosfato atuam como efetor alostrico positivo. A piruvatocinase outra enzima regulatria da gliclise. A presena de ATP inibe a atividade da enzima, enquanto a presena de frutose-1,6-bisfosfato aumenta a sua atividade.

3 - Gliconeognese Gliconeognese a biossntese de glicose a partir de substncias que no so carboidratos, como lactato, glicerol, oxaloacetato, aminocidos; e a partir de alguns carboidratos. Este conjunto de reaes ocorre no citosol e utiliza muitas enzimas da via glicoltica, mas na direo inversa. Enquanto a gliclise gera 2 ATPs por molcula de glicose oxidada, a gliconeognese consome 6 ATPs.

Piruvato no pode ser transformado em fosfoenolpiruvato (PEP) por ao da piruvato cinase, por isso, na mitocndria, ele sofre a ao da piruvato carboxilase na presena de dixido de carbono e transformado em oxaloacetato. Este composto no atravessa a membrana interna da mitocndria, mas pode ser transformado em malato (produto da reduo do oxaloacetato), que migra para o citosol e a oxidado transformando-se em oxaloacetato. A enzima fosfoenolpiruvato carboxicinase, presente tanto na mitocndria como no citosol, catalisa a transformao de oxalacetato em fosfoenolpiruvato (PEP). As etapas de PEP at frutose-1,6-bisfosfato so etapas da via glicoltica, invertidas. Na seqncia, frutose-1,6-bisfosfatase gera F6P, que , em seguida, transformada em G6P. A ltima etapa catalisada pela glicose-6-fosfatase, com a liberao de glicose.