You are on page 1of 6

Artigo

Comparao das Metodologias de Elisa (Enzimaimunoensaio) e HA (Hemaglutinao) frente aos Anticorpos Anti-ENAs (Antgenos Nucleares Extraveis)
Aurilene P. S. Maelaro1, Karine R. M. Jimenez1, Mitiko Sugiyama2, Odair Casado Virtos Jnior2 1 - Laboratrios Leader Diagnsticos e Apoio - SP 2 - Farmacuticos-bioqumicos

Resumo
Os auto-anticorpos anti-ENAs so utilizados para auxiliar no diagnstico de Lupus Eritematoso Sistmico (LES) e da Doena Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC), bem como para excluir outras doenas reumticas. Os ENAs so constitudos de: Sm, RNP, SS-A (Ro), SS-B (La), Jo-1 e Scl-70. O objetivo do trabalho foi comparar as metodologias de Elisa e HA nas determinaes de anti-ENAs. Foram testados soros de 61 pacientes num perodo de dois meses, de agosto a setembro de 2007, no Laboratrio Leader, SP. Foram utilizados os kits da marca Hemagen para as duas metodologias para cada frao de ENA, alm dos kits de Screening para ambas as metodologias. Os resultados apresentaram correlao de 100% entre as duas metodologia, em todas as fraes de ENAs testadas. Palavras-Chave: Auto-imunidade, ENAs, hemaglutinao e Elisa

Summary
Comparision of methods of evaluation of anti ENAs antibodies: hemmaglutination and Elisa The anti ENA antibodies are useful to diagnose SLE and other rheumatic diseases. The ENAs are: Sm, RNP, SS-A (Ro), SS-B (La), Jo-1 and Scl-70. The objective was to compare two methods of evaluation of anti ENAs antibodies: hemmaglutination and Elisa. 61 samples were tested during 2 months using kits of both methods. The kits are manufactured by Hemagen and these tests were evaluated at Leader Laboratories in So Paulo-SP. The tests results showed a 100% correlation between both methods in every ENA fraction tested. Keywords: Autoimmunity, ENAs, hemmaglutination, ELISA

Introduo Introduo
Enzimaimunoensaio (Elisa) Princpio do Teste: Esta tcnica utilizada para deteco de anticorpos presentes no soro. Os antgenos purificados so ligados superfcie interna de cada microcavidade das microplacas. Durante a incubao inicial, os anticorpos contra os ENAs (Antgenos Nucleares Extraveis), presentes no soro do paciente, ligam-se especificamente ao antgeno imobilizado e assim permanecem aps a primeira lavagem. Um segundo anticorpo, conjugado enzima peroxidase, que reco-

nhece as cadeias leves e pesadas da IgG humana, liga-se aos anticorpos do paciente presentes aps a primeira incubao. Nas cavidades em que o conjugado permanece ligado, a enzima cataliza uma reao colorimtrica no substrato TMB. Aps o bloqueio da reao enzimtica, a colorao amarela lida fotometricamente. Esta metodologia apresenta alta sensibilidade e especificidade. Hemaglutinao (HA) Princpio do Teste: A utilizao de eritrcitos humanos associados aos mtodos atuais de preparao antignica e liofilizao possibilita

o desenvolvimento de numerosos ensaios de terceira gerao para a deteco de auto-anticorpos. Atravs da reao celular com o anticorpo especfico no soro, os eritrcitos aglutinam. ENAs Anticorpos (Acs) antinucleares so aqueles dirigidos contra constituintes moleculares normais do ncleo celular. Seu reconhecimento teve incio com Hargraves que, em 1948 observou leuccitos polimorfonucleares com capacidade de ingerir grandes corpsculos de incluso amorfos basoflicos.

106

NewsLab - edio 87 - 2008

O anti-ENA no realmente um anticorpo especfico, porm um grupo de anticorpos dirigidos contra certos antgenos que consistem em RNA e protenas. O antgeno ENA extrado do timo utilizandose soluo salina tamponada com fosfatose, por conseguinte designado por Antgeno Extravel. A determinao de anticorpos antiENA leva aos seguintes anticorpos: anti-Sm, anti-RNP, anti-SS-A (Ro), anti-SS-B (La), anti-Scl-70 e o anticorpo anti-Jo-1. Registra-se a presena de anticorpos antiglicoprotena nuclear de Smith (Sm) em 30% (faixa de 20% a 40%) dos pacientes com LES (Lupus Eritematoso Sistmico) e em 8% dos pacientes com DMTC (Doena Mista do Tecido Conjuntivo), mas no em pacientes com a maioria das outras doenas reumticas do colgeno. Por conseguinte, o anticorpo anti-Sm muito especfico para o LES. Registra-se a ocorrncia de anticorpos anti-RNP (anti-ribonucleoprotena) em quase 100% dos pacientes com DMTC e em cerca de 25% dos pacientes com LES, Lpus Discide e Esclerose Sistmica Progressiva (Esclerodermia). O anticorpo antiRNP (como o anti-Sm) encontra-se associado a um padro pontilhado de FAN. Quando presente em altos ttulos, o anticorpo anti-RNP sugere a DMTC. Objetivo Os anticorpos anti-SS-A (Ro) e anti-SS-B (La) reagem contra Antgenos Nucleares Extraveis de Linfcitos B Humano (linhagem celular Wi12), que se desenvolveram em cultura de tecidos. O anti-SS-A encontrado em cerca de 70% dos pacientes com Sndrome de Sjgren e Artrite Reumatide e em 25% dos pacientes com LES. Observa-se a presena de SS-B em cerca de 50% dos pacientes com Sndrome de Sjgren na ausncia de Artrite

Reumatide, e em menos de 5% dos pacientes com Sndrome de Sjgren e Artrite Reumatide. Mas nunca em pacientes com LES ou Artrite Reumatide (AR). O auto-anticorpo anti-Scl-70 encontrado em 45% dos pacientes com Esclerodermia. O auto-anticorpo anti-Jo-1 bastante especfico das miosites. observado em 25% das Sndromes de Miosites (polimiosite, dermatomiosite) e em 35-45% dos casos de polimiosite.

Material e Mtodos
Amostragem Nos meses de agosto e setembro de 2007 foram pesquisados os anticorpos anti-ENAs em 61 pacientes no Laboratrio Leader, SP. Procedimentos Foram utilizados os seguintes kits da marca Hemagen: Hemaglutinao ENA Screening 4 HA - 64 testes Jo-1 HA - 64 testes RNP/Sm HA - 64 testes SS-A/SS-B HA - 96 testes Scl-70 HA - 64 testes Enzimaimunoensaio ENA Screening 6 Elisa - 96 testes SS-A Elisa - 96 testes SS-B Elisa - 96 testes Jo-1 Elisa - 96 testes Scl-70 Elisa - 96 testes Sm Elisa - 96 testes Sm/RNP Elisa - 96 testes Os testes de Elisa foram realizados utilizando-se a lavadora de microplacas da marca Awareness (duplo pente) e leitora de Elisa da marca Biotek. As amostras foram avaliadas, com padres previamente conhecidos, dos tipos: misto nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafsica positiva (SCL-70), padres pontilhados fino (SS-A e SS-B) e pontilhado grosso (Sm e RNP) com placa metafsica negativa e padres citoplasmticos pontilhado fino, apresentado pontos definidos em grande nmero e densidade, clulas em diviso e nuclolo nofluorescente (JO1), visualizados na metodologia de imunofluorescncia indireta (IFI) e amostras no-reagentes, foram realizadas conforme o informe tcnico presente nos kits.

Objetivo
Foram comparadas duas metodologias de determinao de parmetros imunolgicos: hemaglutinao e enzimaimunoensaio. O presente trabalho visa a comparar suas sensibilidades e especificidades nas dosagens de ENAs. A hemaglutinao passiva baseia-se na utilizao de hemcias como suporte de antgeno. A leitura se faz visualmente. O resultado positivo quando se forma uma rede homognea de hemcias cobrindo todo o poo. O resultado negativo mostra-se com a formao de um boto compacto definido no centro do poo da microplaca. O enzimaimunoensaio ou Elisa (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) baseia-se na imobilizao de um dos reagentes em fase slida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima com preservao tanto da atividade enzimtica como imunolgica. Como o substrato forma um produto colorido, a alterao de cor monitorada visualmente ou atravs de leitora (espectrofotmetro), que determina a relao entre a intensidade de cor e a quantidade do que est sendo analisado na amostra.

108

NewsLab - edio 87 - 2008

FAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 Negativo Negativo 1/160 NPG Negativo Negativo Negativo 1/640 NPG Negativo Negativo Negativo Desconhecido Negativo 1/160 PFD Desconhecido 1/2560 PG Desconhecido Desconhecido Desconhecido Desconhecido Desconhecido Desconhecido 1/160 PG 1/320 PF 1/160 PF Desconhecido Desconhecido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 1/320 Misto 1/320 PF Negativo Negativo 1/320 CEN 1/80 PF Negativo

HAI Screen4 Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo

Screen 6 Elisa Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Indeterminado Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Indeterminado

DO Screen 6 0,158 0,205 1,465 0,343 0,268 0,298 1,682 0,419 0,289 0,208 0,295 0,215 0,381 0,198 1,68 0,394 0,213 0,185 1,657 0,185 0,142 0,187 0,591 0,152 1,53 0,102 0,162 0,189 0,179 1,369 0,27 1,473 0,383 0,323 1,59 0,214 0,182 0,063 1,675 0,996

HAI RNP Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo Negativo Negativo Positivo 1/400 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Positivo 1/100 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/50 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

RNP Elisa Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Rnp 0,082 0,145 0,967 0,112 0,052 0,103 1,644 0,106 0,174 0,093 0,112 0,099 0,098 0,245 1,633 0,263 0,051 0,115 1,439 0,063 0,106 0,097 0,125 0,163 0,995 0,422 0,093 0,295 0,101 0,113 0,094 0,103 0,085 0,145 0,097 0,162 0,145 0,113 0,142 0,203

HAI SM Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/200 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo 1/400 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SM Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

110

NewsLab - edio 87 - 2008

DO SM 0,125 0,23 0,163 0,119 0,217 0,198 1,632 0,107 0,183 0,251 0,116 0,103 0,197 0,214 0,192 0,109 0,201 0,141 1,663 0,201 0,179 0,152 0,171 0,158 1,817 0,209 0,201 0,221 0,206 0,203 0,151 0,152 0,206 0,109 0,103 0,203 0,201 0,091 0,062 0,163

HAI SSA Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SSA Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO SSA 0,113 0,109 0,263 0,221 0,384 0,198 0,2 0,228 0,194 0,096 0,254 0,264 0,254 0,316 0,194 0,204 0,191 0,299 0,265 0,214 0,225 0,215 0,185 0,193 0,24 0,145 0,163 0,271 0,171 0,279 0,212 0,27 0,317 0,154 0,306 0,092 0,121 0,254 0,425 0,312

HAI SSB Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SSB Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO SSB 0,271 0,178 0,171 0,216 0,235 0,406 0,117 0,098 0,191 0,171 0,163 0,251 0,206 0,231 0,299 0,301 0,204 0,171 0,216 0,199 0,215 0,298 0,413 0,322 0,287 0,113 0,205 0,147 0,304 0,231 0,301 0,231 0,317 0,178 0,223 0,171 0,151 0,217 0,253 0,229

Scl Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Scl 0,107 0,183 0,228 0,202 0,301 0,231 0,221 0,526 0,206 0,199 0,215 0,283 0,406 0,119 0,098 0,301 0,204 0,171 0,216 0,234 0,271 0,171 0,279 0,204 0,198 0,178 0,212 0,285 0,178 0,317 0,209 0,451 0,231 0,459 0,258 0,199 0,221 0,241 0,301 0,384

JO Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Jo 0,113 0,201 0,263 0,221 0,193 0,201 0,194 0,541 0,249 0,113 0,205 0,166 0,205 0,101 0,194 0,204 0,191 0,171 0,163 0,194 0,251 0,193 0,197 0,244 0,203 0,278 0,263 0,219 0,251 0,216 0,217 0,163 0,229 0,197 0,242 0,297 0,301 0,203 0,251 0,257

Indeterminado Indeterminado 1/50 Negativo Negativo

NewsLab - edio 87 - 2008

111

FAN 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
SIGLAS NPG PFD PG PF CEN

HAI Screen4 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Screen 6 Elisa Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Screen 6 1,654 0,203 0,201 0,071 0,082 0,081 0,188 0,152 0,263 0,214 0,105 0,124 0,168 0,383 0,071 0,164 0,182 0,128 0,099 0,079 0,253 0,213 0,171 0,188 0,082 CT pos 1.092 CT neg 0.141 Cut-off 0.543

HAI RNP Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

RNP Elisa Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Rnp 0,992 0,271 0,196 0,301 0,162 0,172 0,213 0,112 0,105 0,284 0,106 0,103 0,115 0,071 0,206 0,116 0,261 0,108 0,305 0,205 0,172 0,203 0,305 0,124 0,088 Branco 0.039 Ct pos 0.784 Ct neg 0.054 Low 0.364 Medium 0.583 High 0.930

HAI SM Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SM Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Desconhecido Desconhecido Negativo Negativo Desconhecido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

Nuclear Pontilhado Grosso Pontilhado Fino Denso Pontilhado Grosso Pontilhado Fino Centromrico

Os ensaios realizados em paralelo apresentaram correlao de 100% na reatividade, no havendo divergncias e no apresentando reaes inconclusivas. Os testes no reagentes tambm foram confirmados nas duas metodologias

analisadas, no apresentando quaisquer divergncias (Tabela de Resultados 1).

Concluso Concluso
As metodologias de hemaglu-

tinao e enzimaimunoensaio tive ra m c o n c o r d n c i a d e 1 0 0 % . Portanto, as duas metodologias de dosagens de Anticorpos Anti-ENAs possuem a mesma sensibilidade e especificidade.

112

NewsLab - edio 87 - 2008

DO SM 0,229 0,241 0,063 0,209 0,204 0,226 0,217 0,163 0,198 0,197 0,231 0,209 0,301 0,231 0,211 0,217 0,216 0,171 0,204 0,261 0,098 0,254 0,299 0,193 0,221
Branco 0.069 Ct pos1.270 Ct neg 0.082 Low 0.326 Medium 0.716 High 1.589

HAI SSA Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SSA Elisa Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO SSA 1,809 0,225 0,342 0,098 0,105 0,254 0,116 0,109 0,192 0,304 0,197 0,116 0,105 0,097 0,213 0,263 0,255 0,247 0,258 0,162 0,164 0,125 0,287 0,285 0,163
Branco 0.073 Ct pos 1.361 Ct neg 0.107 Low 0.536 Medium 1.288 High 2.187

HAI SSB Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

SSB Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO SSB 0,197 0,242 0,297 0,301 0,203 0,171 0,307 0,246 0,212 0,116 0,204 0,175 0,176 0,206 0,302 0,254 0,117 0,171 0,275 0,196 0,218 0,194 0,245 0,119 0,111
Branco 0.051 Ct pos 1.491 Ct neg 0.098 Low 0.347 Medium 1.080 High 1.946

Scl Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Scl 0,171 0,231 0,235 0,151 0,217 0,221 0,206 0,207 0,317 0,312 0,197 0,151 0,217 0,184 0,191 0,413 0,298 0,215 0,271 0,193 0,226 0,293 0,184 0,094 0,231
Branco 0.020 Ct pos 1.573 Ct neg 0.095 Low 0.596 Medium 1.208 High 1.816

JO Elisa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

DO Jo 0,299 0,211 0,221 0,196 0,231 0,251 0,207 0,325 0,215 0,197 0,241 0,302 0,33 0,371 0,281 0,093 0,152 0,119 0,251 0,224 0,305 0,109 0,251 0,284 0,392 Branco 0.038 Ct pos 1.974 Ct neg 0.133 Low 0.553 Medium 1.433 High 2.105

Referncias Bibliogrficas
Ferreira AW e Avila SLM. Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas Infecciosas e Auto-Imunes. RJ- Guanabara Koogan, 1996. Ravel R. Laboratrio Clnico Aplicaes Clnicas dos Dados Laboratoriais. RJ - Guanabara Koogan 1995. Pagana KD, Pagana TJ. Manual de Testes Diagnsticos e Laboratoriais. RJ - Guanabara Koogan 2001. Luppino RA. Dissertao de Mestrado: Comportamento dos Anticorpos Antinucleares em doenas Difusas do Tecido Conjuntivo. Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo - Orientador Prof. Dr. Alexandre Gabriel Jr. So Paulo. 1984.

NewsLab - edio 87 - 2008

113