UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC Centro de Engenharia, Modelagem e Cincias Sociais Aplicadas

MICROBIOLOGIA AMBIENTAL APOSTILA DE AULA PRTICA (EN 2105)

Prof. Dr. Dcio Roberto Matheus Prof. Dra. Lusa Helena dos S. Oliveira

Santo Andr, SP 1 quadrimestre/2012

PRTICA 1: Isolamento de microrganismos do solo

Roteiro de aula

1. Microrganismos do Solo
1.1. Bases Cientficas
O primeiro procedimento para determinar a microbiota de solo foi a observao em microscopia com o auxilio de corantes, porm este mtodo dificultado pelo volume de partculas que atrapalham a visualizao alm da dificuldade de separar organismos vivos de mortos. Os mtodos mais modernos incluem a tcnica de diluio em srie e plaqueamento com contagem de colnias, partindo do pressuposto que cada colnia foi formada por um nico organismo ou pequeno grupo de organismos. A semeadura mais comum neste tipo de procedimento conhecida como pour plate ou semeadura em profundidade. Neste tipo de semadura a amostra vertida na placa de petri antes do meio de cultura e depois a amostra incubada e as colnias formadas so contadas. Tira-se a mdia do nmero de colnias e multiplica-se pelo fator de diluio. O resultado expresso em Unidades Formadoras de Colnias por mL ou por grama (UFC/mL ou UFC/g).

1.2. Objetivo
Quantificar a densidade de bactrias e fungos (por UFC) em amostras de solos. Treinar a tcnica de diluio seriada e semeadura por pour plate.

1.3. Material e procedimentos

Material por grupo: o Amostra de solo, o 4 placas de petri, o 1 pipeta automtica de 1 mL, o 3 ponteiras de pipeta esterilizadas, o 4 tubos de ensaio (20 mL) com 9 mL de soluo salina (0,7% NaCl) o Luria Bertani Agar (LBA) o Meio Martin, o 1 frasco (250mL) esterilizado, com 90 mL de soluo salina o bico de Bunsen, o Estufa de incubao; o Canetas para retroprojetor (preta, verde, azul ou vermelho).

Procedimentos Coletar amostra de solo, cerca de 50 g em frasco esterilizado. Marcar as placas e os tubos para diluies com: 10-2, 10-3, 10-4. Diluir a amostra de solo (10 g) em soluo salina esterilizada da seguinte maneira: adicionar 10 g de solo (peso seco) a 90 mL de soluo salina, obtendo-se assim uma -1 diluio de 1:10 (10 ).

 Agitar manualmente o frasco de diluio 1:10 por cerca de 5min, repousar at completa semidentao e retirar, com o auxlio de uma pipeta, 1 mL da soluo e transferir para um tubo de ensaio contendo 9 mL de soluo salina, obtendo-se a -2 diluio de 1:100 (10 ). Deve-se usar uma pipeta para cada diluio. Agitar o tubo da diluio 1:100 e retirar 1 mL da soluo e transferir ao segundo tubo -3 de diluio contendo 9 mL de soluo salina, obtendo-se a diluio de 1:1000 (10 ) e -4 assim sucessivamente para obteno da diluio 1:10000 (10 ). Homogeneizar os frascos com as diluies (10 , 10 e 10 ) e obedecendo aos cuidados de assepsia, transferir 1,0 mL de cada diluio em placas de Petri como indicado na tabela abaixo (deve-se iniciar as transferncias das solues mais diludas (10-4) para as mais concentradas (10-2) ou utilizar uma ponteira para cada diluio):
-2 -3 -4

Placas com meios de cultura Soluo Diluida 10-2 10-3 10-4 LBA 1 mL 1 mL Meio de Martin 1 mL 1 mL -

Previamente, fundir cada meio de cultura e manter a temperatura de 45C. Verter aproximadamente 10 mL de meio de LBA ou Meio de Martin, sobre as diluies transferidas para a placa de Petri, conforme indicado na tabela acima, e fazer movimentos delicados em forma de oito com a placa fechada sobre a bancada. Esperar o meio solidificar, inverter as placas para evitar a formao de gua de condensao na na tampa da placa e transferir as placas de Petri para a incubao em estufa de cultura a 35C. Realizar a leitura de contagem de bactrias e fungos aps 24, 48 e72h, com auxlio de um contador de colnias. No meio LBA deve crescer mais colnias de bactrias, j no meio de Martin deve crescer mais fungos. As colnias fngicas so geralmente filamentosas (cotonosas) e as de bactrias circulares, gelatinosas, coloridas ou no. A densidade obtida multiplicando-se a mdia das contagens das colnias por placa pela diluio utilizada. O resultado expresso como Unidades Formadoras de Colnias UFC/mL. Por exemplo: se a contagem na placa foi de 180 colnias na diluio de 1:10.000 (104): 180 x 10.000 = 1,8 x 106 UFC/mL. No caso de solo, deve-se calcular a densidade por grama de solo (UFC/g de solo) Fazer uma mdia a partir dos valores obtidos nas duas diluies. Recomenda-se considerar as diluies que apresentaram contagens entre 30 e 300 colnias.

2. Relatrio: Isolamento de microrganismos do solo

Grupo: RA Nome

Local de amostragem:

Apresente os resultados de contagem na tabela e os clculos das mdias abaixo:

Discusso:
A presena de microrganismos no solo idntica em todos os ambientes amostrados. Quais fatores podem determinar a distribuio de microrganismos no solo? (Citar referncias bibliogrficas que sustentem suas hipteses).