BAB 9 ENZIM ENZIM PADA PROSES REKOMBINASI

Analisis

genetik

mengungkap

enzim
+

yang

berperan

pada

rekombinasi,umumnya pada E.coli. Sel sel F

E.coli yang sudah mengalami

mutasi dengan teknik replica plating memungkinkan orang mengidentifikasi mutan pada cawan yang mulanya tidak membentuk rekombinansetelah berkonjugasi dengan sel Hfr. Mutan tidak bisa berekombinasi berkaitan dengan adanya tiga gen, recA, recB, recC.

A. Enzim enzim yang dikode gen recA, recB, recC Protein recA adalah enzim yang berperan pada rekombinasi umum maupun pada perbaikan DNA (Ayala,dkk., 1984). Gen recA dibutuhkan untuk rekombinasi umum pada E.coli. Pada kondisi in vitro protein yang dimurnikan mengkatalisasi pembentukan struktur Holliday (Ayala,dkk.,1984,

Watson,dkk.,1987). Protein recA berikatan pada molekul DNA unting ganda atau tunggal. Kemudian menggunakan energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP untuk membuka DNA unting ganda, memungkinkan terjadi perpasangan dengan DNA unting tunggal. Hal ini memungkinkan terjadi sinapsis molekul DNA yang memiliki urutan pasangan nukleotida yang mirip. Protein recA juga

mengkatalisasi transfer unting berikutnya sehingga terbentuk suatu jembatan silang( struktur Holliday) diikuti migrasi jembatan silang tadi. Bukti bahwa rekombinasi E.coli berlangsung di plasmid ditunjukkan pada hasil pemotongan palsmid Col E1 pada tapak restriksi dengan bantuan enzim EcoR1. Bentukan molekul serupa angka delapan sebelum terpotong enzim endonuklease EcoR1, sama sekali tidak ditemukan pada preparat DNA plasmid yang berasal dari sel sel E.coli yang memiliki gen recA. Ini menunjukkan bahwa bentukan serupa angka delapan merupakan perantara rekombinasi yang dikatalisasi oleh protein recA antara molekul - molekul plasmid. Bentukan serupa angka delapan sebaliknya ditemukan pada preparat DNA yang berasal dari sel E. Coli yang memiliki gen recB atau recC. Jadi disimpulkan bahwa produk kedua gen baru bekerja setelah protein recA bekerja. Dalam hal ini recB
+ +

dan recC

mengkode dua subunit suatu nuklease yang tergantung ATP. Diduga nuklease berperan sebagai suatu resolvase yang memotong jembatan silang pada struktur Holliday untuk menyempurnakan proses rekombinasi. Protein recA berperan dalam perbaikan DNA. Protein recA memiliki suatu aktivitas proteolitik yang distimulasi DNA unting tunggal. Aktivitas ini

memotong sekurang kurangnya dua macam molekul reseptor profag lamda, yang menyebabkan induksi profag. Molekul reseptor lain adalah suatu produk dari gen lex A. Represor kedua ini mengatur tingkat ekpresi gen recA maupun sejumlah gen yang terlibat pada mekanisme perbaikan DNA fungsi survival yang disebut fungsi SOS. Berkenaan dengan fungsi SOS, dalam keadaan normal represor lexA hanya mengkondisikan ekpresi gen A pada tingkat rendah tapi menghasilkan cukup protein recA yang dibutuhkan untuk rekombinasi. Di lain pihak, bilamana sel terancam mengalami kerusakan DNA, maka aktivasi proteolitik protein recA diaktivasi menghancurkan represor lexA. Aktivitas kedua dari enzim recBC (aktivitas nuklease) yang bekerja atau berfungsi selama enzim tersebut membuka lilitan DNA sangat penting (vital) fungsinya bagi rekombiasi. Eksperimen genetic menunjukkan bahwa enzim reBC paling sering mendorong terjadinyarekombinasi pada DNA yang mengandung suatu tapak yang disebut sebagai Chl, telah diketahui bahwa tapak tersebut mempunyai urutan-urutan 5-GTCGGTGG-3. Dalam hubungan ini pada DNA yang sedang terbuka lilitanya, suatu aktivitas nucleus spesifik dari enzim recBC memotong unting tunggal DNA didekat tapak Chl yang sedang terbuka. terputusnya DNA itu menyebabkan unting tunggal DNA tidak melilit kembali pada saat enzim recBC bergerak menyusuri molekul DNA (perhatikan gambar 9.2). sebagai akibatnya terbentuklah suatu untaian unting tunggal berujung bebas maupun suatu celah dan justru pada celah serta pada ujung bebeas unting tunggal DNA itulah kemudian recA berikatan dan mulai mendorong terjadinya pertukaran unting DNA dengan suatu urutan-urutan yang homolog. Sebenarnya DNA E.coli mempunyai sekitar 1000 urutan-urutan Chl atau sekitar suatu tapak Chl per limagen. Kenyataan tersebut memperlihatkan bahwa sebenranya enzim recBC memiliki banyak peluang memotong unting tunggal DNA. Di pihak lain dalam E.coli yang ormal biasanya tidak demikian. Seperti

diketahui pada E.coli yang normal molekul DNA tidak memiliki ujung-ujung bebas. Tapak-tapak Chl itu justru berfungsi pada saat konjuasi. Dalam hal ini pada saat konjugasi itu suatu ujung DNA dimasukan oleh bakteri jantan dan selanjutnya diduga bahwa enzim recBC kemudian bergerak menyusuri DNA yang diinfeksi dan memotong pada tapak Chl. Akibat selanjutnya adalah terjadinya rekombinasi antara DNA yang diinjeksi dan DNA sel resipien. Disamping recA, recB dan recC ada jugabeberapa gen lain yang produknya dibutuhkan untuk terjadinya rekombinasi yang efisien sekalipun fungsi khususnya belom diketahui. Satu enim lain yang ikut berperan pada proses rekombinasi yang homolog adalah enzim nuclease maupun beberapa protein yang diperlukan dalam sintesis DNA (Watson, dkk., 1987). Enzim nuclease memotong sambungan Holliday sehingga memisahkan molekul DNA rekombinan.

Berkenaan dengan fungsi enzim nuclease dinyatakan bahwa enzim recBC diduga juga melaksanakan fungsi enzim tersebut. Contoh protein pada sintesis DNA antara lain protein SSB yang membantu fungsi protein enzim recA. Demikian pula enzim polymerase DNA yang mengisi (menyambung) bagian yang hilag akibat DNA rekombinan terpotong dan DNA ligase yang menutup celah yang tertinggal setelah enzim polymerase DNA bekerja.

Enzim pada Insersi kedalam genom E.coli yang terjadi melalui rekombinasi Fag mengkode enzim inegrase yang berperan pada saat insersi DNA fag

ke dalam E.coli. insersi tersebut terjadi melalui rekombinasi pada tapak-tapak spesifik di kedua genom DNA dan hasil insersi melalui rekombinasi itu adalah terbentuknya satu molekul sirkuler baru yang lebih besar. Selain enzim integrasi, genom fag ke dalam genom E.coli juga

membutuhkan protein IHF serta ion-ion magnesium (Watson,dkk, 1987). Tapaktapak spesifik yang menjadi tempat berlangsungnya rekombinasi dalam rangka insersi itu adalah auP (pada genom fag ) dan auB(pada genom E.coli). Berkenaan dengan peran enzim integrase itu, sudah ada pengujian yang memasukkan bahwa enzim tersebut dapat berperan pada proses penggabungan, yang akhirnya berakibat terbentuknya dua molekul DNA yang terpisah-pisah. Pengujian itu dilakukan dengan terlebih dahulu merancang terbentuknya suatu

plasmid buatan yang memiliki tapak spesifik auB maupun auP, dalam orientasi yang memungkinkan terbentuknya dua molekul DNA sirkuler yang lebih kecil (Watson,dkk, 1987) Enzim integrase pada kenyataannya dapat berperan sebagai suatu enzim topoisomerase. Dalam hal ini enzim integrase membuat suatu pemutusan, dalam posisi menyamping; jarak antara kedua tempat yang terpotong adalah sejauh 7 nukleotida. Pemutusan unting DNA itu terjadi pada tapak auP maupun tapak auB. Kajian terhadap jumlah pasangan nukleotida pada tapak auP dan auB memperlihatkan bahwa tapak auP terdiri dari 250 pasang nukleotida; sedangkan tapak auB.terdiri dari sekitar 20 pasang nukleotida (Watson,dkk, 1987). Diketahui pula bahwa baik enzim integrase maupun protein CHF berikatan pada posisi yang berbeda sepanjang tapak auP. Segmen tapak auP 250 pasang nukleotida itu tampaknya melingkari enzim integrase membentuk semacam struktur seperti suatu nukleosom yang terkondensasi dan nukleus tersebut dapat mengandung sebanyak delapan monomer integrase yang masing-masingnya berukuran 40.000 dalton. Kebanyakan daerah inti tapak auB maupun auP terdiri dari 15 pasang nukleotida. Kajian terhadap jumlah pasangan nukleotida (pasangan basa) pada tapak anP dan anB memperlihatkan tapak anP terdiri dari 250 pasang nukleotida; sedangkan tapak anB terdiri dari sekitar 20 pasang nukleotida (Watson, dkk., 1987). Dikwtahui pila baik enzim, integrase maupun protein CHF berikatan pada posisi yang berbeda sepanjang tapak anP. Segmen tapak anP sepanjang 250 pasang nikleotida itu tampaknya melingkari enzim integrase membentuk semacam struktur seperti suatu nukleonom yang terkondensasi; dan struktur tersebut dapat mengandung sebanyak delapan monomer integrase, yang masing-masingnya berukuran 40.000 dalton. Kebanyakan daerah inti tapak anB maupun anP terdiri dari 15 pasang nukleotida. Enzim integrase membutuhkan suatu homologi urut-urutan pada daerah inti, seperti halnya suatu urut-urutan khas yang merupakan tempat pengikatannya. Dalam hal ini memang belum diketahui bagaimana enzim integrase mendeteksi homologi antara unting-unting ganda sebelum dipotong dan dibuka (diurai).

Sudah diketahui juga bahwa bilamana suatu pofag

diinduksi unttuk

tumbuh, maka keadaannya yang terintegrasi akan beralih dan peristiwa itu disebut sebagai eksisi; DNA fag maupun bakteri terlepas dan bebas satu sama lain. Dalam ini profag memulai eksisi dengan cara mengekspresikan suatu protein yang

disebut eksinase (Watson, dkk., 1987). Protein enzim itu memungkinkan enzim integrase mengkatalisasi rekombinasi yang mengakibatkan tapak-tapak pelekatan hybrid dari profag. Lebih lanjut kompleks gabungan enzim integrase dan eksionase berikatan erat pada suatu tapak hybrid bakteri profag; dan keunikan yang berubah ini mendukung kemampuan enzim untuk melaksanakan reaksi yang sebaliknya (reverse).