BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Lic. en Qumico Farmacobilogo

Facultad

BIOQUIMICA II
PRACTICA 1:

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA

Conceptos
ES POSIBLE OBSERVAR LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA MEDIANTE UNA REACCION COLORIMETRICA?

Metodologia
MATERIAL DESARRROLLO EXPERIMENTAL OBSERVACIONES DISCUSION DE RESULTADOS CONCLUSION

ENZIMAS

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMATICAS CICLO DE KREBS. ETAPA DE LA OXIDACION DEL SUCCINATO EN EL CICLO DE KREBS. HIGADO.

ENZIMAS
Las enzimas son catalizadores muy potente y eficaces, quimicamente son protenas. Como catalizadores, los enzimas actan en pequea cantidad y se recuperan indefinidamente. No llevan a cabo reacciones que sean energticamente desfavorables, no modifican el sentido de los equilibrios qumicos, sino que aceleran su consecucin. La caracterstica ms sobresaliente de los enzimas es su elevada especificidad. Esta es doble y explica que no se formen subproductos

EPECIFICIDAD DE SUSTRATO:El sustrato (S) es la molcula sobre la que el enzima ejerce su accin cataltica. ESPECIFICIDAD DE ACCION: Cada reaccin est catalizada por un enzima en especfico.

 La accin enzimtica se caracteriza por la formacin de un complejo que representa el estado de transicin.
El sustrato se une al enzima a travs de numerosas interacciones dbiles como son: puentes de hidrgeno, electrostticos, hidrfobos, etc. En un lugar especfico, el centro activo. Este centro es una pequea porcin del enzima, constituido por una serie de aminocidos que interaccionan con el sustrato.

1. Algunas enzimas actan con la ayuda de estructuras no proteicas. En funcin de su naturaleza se denominan: 1. Cofactor. Cuando se trata de iones o molculas inorgnicas. Coenzima. Cuando es una molcula orgnica. Aqu se puede sealar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas; y realmente las deficiencias producidas por la falta de vitaminas responde ms bien a que no se puede sintetizar un determinado enzima en el que la vitamina es la coenzima.

 El conjunto de enzima + cofactor o coenzima se denomina holoenzima, mientras que la parte proteica propiamente dicha se conoce como apoenzima. Las enzimas tienen una estructura tridimensional sin la que no pueden desarrollar su actividad. Las enzimas son esenciales para la vida ya que, de otra forma, las reaccioneS en las clulas se daran con poca rapidez. Una mala funcin en una enzima, provocada poR una sobre produccin o subproduccin, mutacin etc. , puede provocar enfermedades como la fenilcetonuria.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACIONES ENZIMATICAS.

Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 450 C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 370 C. pH: El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin.

CICLO DE KREBS
El ciclo de Krebs es una serie de reacciones qumicas de gran importancia, que forman parte de la respiracin celular en todas las clulas aerobias, es decir que utilizan oxgeno. En organismos aerbicos el ciclo de Krebs es parte de la va catablica que realiza la oxidacin de hidratos de carbono, cidos grasos y aminocidos hasta producir CO2 y agua, liberando energa en forma utilizable (poder reductor y ATP). El metabolismo oxidativo de hidratos de carbono, grasas y protenas frecuentemente se divide en tres etapas, de las cuales el ciclo de Krebs supone la segunda. En la primera etapa los carbonos de estas macromolculas dan lugar a molculas de acetil-CoA de dos carbonos, e incluye las vas catablicas de aminocidos, la beta oxidacin de cidos grasos y la glucolisis. La tercera etapa es la fosforilacin oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2) generado se emplea para la sntesis de ATP segn la teora del acomplamiento quimiosmtico. El ciclo de Krebs tambin proporciona precursores para muchas biomolculas tales como ciertos aminocidos. Por ello se considera una va anfiblica, es decir, catablica y anablica al mismo tiempo.

ETAPA DE LA OXIDACION DEL SUCCINATO EN EL CICLO DE KREBS.

Esta etapa es catalizada por la enzima "Succinato deshidrogenasa", una oxidoreductasa que utiliza FAD como coenzima. El FAD es de mayor poder oxidante que el NAD+, y es utilizado en esta clase de proceso oxidativo, donde es necesario producir una insaturacin en una cadena hidrocarbonada. Es posible producir la insaturacin entre los carbonos a y b, debido a que los grupos carboxilo contiguos a stos, debilitan los enlaces C-H. Tipo de reaccin: Oxidacin: Deshidrogenacin Enzima: Succinato deshidrogenasa. Esta enzima utiliza FAD como coenzima. Sustrato: Succinato Producto: Fumarato G = 0.0 kcal/mol

Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2O cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa. La enzima succinato deshidrogenasa es una flavoprotena que participa en el ciclo de Krebs y al ser una protena integral de membrana mitocondrial interna se considera que forma parte de la cadena respiratoria como complejo II. La succinato deshidrogenasa cataliza estereoespecficamente la deshidrogenacin en trans del cido succnico hasta cido fumrico y contiene a FAD como grupo prosttico pero el verdadero aceptor de electrones en la reaccin es la ubiquinona QH2. Esta enzima se inhibe por malonato y maleato, que son anlogos estructurales del succinato.

HIGADO

Para realizar sus funciones, el hgado cuenta con una gran cantidad de enzimas con funciones oxidativas y reductivas, entre las cuales se encuentran el sistema del citocromo de la protena 450 (P-450), flavin-monooxigenasas, peroxidasas, hidroxilasas, esterasas, y amidasas. Otras enzimas tambin presentes son las glucuroniltranferasas, las sulfotranferasas, metilasas, acetoltransferasas, tioltransferasas. Todas estas enzimas tienen gran importancia en las biotransformaciones de los txicos.

ES POSIBLE OBSERVAR LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SUCCINATO DESHIDROGENASA MEDIANTE UNA REACCION COLORIMETRICA?

2 tubos de ensaye 2 pipetas de 5 ml.

Se utilizaron para colocar las muestras. tiles para medir los volmenes exactos de los reactivos a utilizar

MATERIAL

Bao mara a 50 Proporcion la fuente de calor para que se llevasen a cabo las C reacciones de las muestras colocadas en los tubos de ensaye. Pinzas para tubo de ensaye 1 mortero con pistilo 1 perilla 1 balanza 1 termmetro Instrumentos utilizados para sostener los tubos de ensaye dentro del bao Mara Se recurri a ste para moler la muestra de hgado de rata hasta formar una masa. Facilito el pipeteo de los volmenes de reactivos utilizados. til para pesar la muestra (hgado de rata) Para mantener la temperatura del bao Mara da 50C.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Pesar 1 g de hgado de una rata recientemente sacrificada. REACTIVOS TUBO 2 En el mortero molerlo con 3 o 4 TUBO 1 cido succnico hasta obtener una ml de de masa. Transferir en partes iguales a 2 tubos y proseguir segn la siguiente tabla: FENOL AL 90% 1.O ML ------AZUL DE METILENO 2.0 gotas MEZCLAR ACEITE MINERAL O.5 ML 2.0 gotas MEZCLAR 0.5ML

Incube ambos tubos 10 minutos en bao Mara a 50 C. Observar los cambios.

OBSERVACIONES

DISCUSION DE RESULTADOS

La oxidacin es una reaccin qumica un metal o un no metal cede electrones. La reaccin de qumica opuesta a la oxidacin se le conoce como reduccin es decir cuando una especie qumica acepta electrones estas 2 reacciones siempre se dan juntas es decir cuando una sustancia se oxida la otra se reduce. Una cede electrones y la otra los acepta. Segn los resultados obtenidos de las observaciones realizadas tenemos que: Tubo 1: No camio de color Tubo 2: Se presento cambio de color (azul-verde a incoloro).

CONCLUSION
Se puede concluir que el objetivo de la prctica se cumpli satisfactoriamente, ya que fue posible apreciar la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa mediante una reaccin calorimtrica en una muestra de hgado de rata. Esta resolucin solo pudo ser posible con ayuda del colorante azul de metileno, el cul tiene la caracterstica de dar el vire de color verde en forma oxidada e incoloro en su forma reducida. Esta apreciacin da como seal la actividad de la enzima SDH al formar parte de la cadena de transporte electrnico.

Cuestionario
Cu les Son los colores del azul de metileno en sus estados oxidados y reducidos? OXIDADO verde azulado REDUCIDO incoloro
1.

Enzima-FADH2 + azul de metileno oxidado Enzima-FAD + azul de metileno reducido (azul) (incoloro)
Cu l es la funcin del fenol en la reaccin? El fenol ayuda a la oxidacin del azul de metileno ya que el fenol interviene en la reaccin que se llevo a cabo en el tubo 2 entre el azul de metileno y el FADH2 . En el tubo 2 se obtuvo el colorante reducido porque acepto los electrones que transporta el FADH2 mientras que en el tubo 1 el aceptor de electrones fue el fenol lo que provoc que el colorante permaneciera en su estado oxidado.
2.

En qu va metablica esta involucrada la enzima succinato deshidrogenasa? La succnato deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de otros cidos
3.