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5, 1288-1296, 2009 CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE POR ONS METLICOS IMOBILIZADOS (IMAC) DE BIOMOLCULAS: ASPECTOS FUNDAMENTAIS E APLICAES TECNOLGICAS

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Igor Tadeu Lazzarotto Bresolin, Everson Alves Miranda e Snia Maria Alves Bueno* Departamento de Processos Biotecnolgicos, Faculdade de Engenharia Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6066, 13083-970 Campinas - SP, Brasil Recebido em 16/7/08; aceito em 16/12/08; publicado na web em 11/5/09

IMMOBILIZED METAL-ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY (IMAC) OF BIOMOLECULES: FUNDAMENTAL ASPECTS AND TECHNOLOGICAL APPLICATIONS. Immobilized Metal Ion Affinity Cromatography IMAC is a group-specific based adsorption applied to the purification and structure-function studies of proteins and nucleic acids. The adsorption is based on coordination between a metal ion chelated on the surface of a solid matrix and electron donor groups at the surface of the biomolecule. IMAC is a highly selective, low cost, and easily scaled-up technique being used in research and commercial operations. A separation process can be designed for a specific molecule by just selecting an appropriate metal ion, chelating agent, and operational conditions such as pH, ionic strength, and buffer type. Keywords: immobilized metal-ion affinity chromatography; purification; biomolecules.

INTRODUO Os princpios fundamentais da afinidade de biomolculas por ons metlicos so conhecidos desde o incio do sculo passado. Em 1974, Everson e Parker demonstraram que ons metlicos presentes em metaloprotenas so os principais responsveis pela adsoro dessas em resinas contendo quelantes imobilizados e exploraram esta afinidade na separao deste tipo de protenas.1 A tcnica proposta por Everson e Parker popularizou-se com o trabalho publicado por Porath e colaboradores em 1975, quando os autores introduziram o termo cromatografia de afinidade por ons metlicos imobilizados (Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography IMAC).2 IMAC explora a interao entre espcies doadoras de eltrons presentes na superfcie de biomolculas em soluo e ons metlicos quelatados imobilizados em um suporte slido. Inmeras so as aplicaes analticas, preparativas e industriais de IMAC, como a separao e purificao de diferentes biomolculas (peptdeos, protenas e cidos nuclicos), a separao de clulas a partir de extratos biolgicos e estudos de estrutura-funo de protenas. Inicialmente a tcnica de IMAC foi extensamente utilizada para purificao de biomolculas contendo naturalmente grupos doadores de eltrons em resduos de aminocidos expostos na superfcie (tais como o anel imidazol de histidina), os quais so primariamente responsveis pela interao biomolcula-on metlico. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, foi possvel a incorporao de caudas (tag) em protenas que no contm naturalmente espcies doadoras de eltrons, tal como a fuso de sequncia de seis histidinas na poro C ou N-terminal da protena alvo, conferindo mesma a possibilidade de purificao por IMAC.3,4 Apesar de na literatura existirem excelentes artigos de reviso em ingls sobre IMAC5-14, nesta reviso, devido intensa atividade neste campo, pretende-se abordar aspectos fundamentais, aplicaes tecnolgicas (escala de laboratrio e industrial) e cientficas com nfase na purificao de protenas nativas e recombinantes (com cauda de poli(histidina)). Dentre os aspectos fundamentais do mtodo, sero destacados a seleo de ons metlicos, de agentes quelantes, de matrizes cromatogrficas utilizadas como fase estacionria (desde part*e-mail: sonia@feq.unicamp.br

culas porosas a membranas), a qumica de ativao e de imobilizao e as condies operacionais (pH e fora inica da fase lquida, tipo ou composio da soluo tamponante, etc). As vantagens da tcnica de IMAC sero discutidas, bem como problemas que eventualmente surgem quando esta tcnica utilizada no processo de produo de protenas de interesse farmacutico. PRINCPIOS BSICOS DE IMAC PARA PURIFICAO DE PROTENAS A tcnica de IMAC baseia-se na afinidade diferencial que ons metlicos imobilizados em uma matriz slida apresentam por certos grupamentos expostos na superfcie de uma molcula em soluo. Esta afinidade resulta de ligaes de coordenao reversveis formadas entre um on metlico quelatado (o centro de adsoro) e certos resduos de aminocidos, tais como imidazol da histidina, tiol da cistena e indol do triptofano, os quais doam eltrons para o on metlico, ou seja, atuam como base de Lewis.5-7,11 O agente quelante acoplado a uma matriz slida por meio de ligaes covalentes. O on metlico, por sua vez, imobilizado ao agente quelante por ligaes de coordenao formadas entre o on metlico e tomos de nitrognio, oxignio ou enxofre presentes na estrutura do agente quelante.2,6,10 Protenas ou outros solutos introduzidos na fase mvel so adsorvidos principalmente pela formao de ligaes de coordenao com stios remanescentes dos ons metlicos quelatados, havendo tambm a possibilidade de outras foras envolvidas, tais como foras eletrostticas, interaes hidrofbicas e foras de van der Waals, sendo que nem sempre possvel determinar suas contribuies relativas.13,15 As molculas adsorvidas podem ser eludas por competio com outras espcies doadoras de eltrons (por exemplo, com imidazol ou com um agente quelante solvel) ou por protonao de grupos doadores de eltrons presentes na protena adsorvida (reduo de pH).2,6,10 De forma geral, ons metlicos imobilizados em uma matriz podem ser removidos pela adio de agentes competidores fortes, como o EDTA (cido etileno-diamino-tetraactico), sem que haja perda da capacidade da matriz, ou seja, ela pode ser carregada novamente (com o mesmo on metlico ou um outro). Mtodos de separao especficos podem ser desenvolvidos para cada protena alvo, com a escolha adequada do on metlico, do

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agente quelante e das condies cromatogrficas tais como pH, fora inica, tipo de tampo, velocidade superficial etc.5,7,11 A estabilidade dos quelatos em uma ampla faixa de temperatura e condies da fase lquida uma vantagem da tcnica, pois, alm de significar estabilidade operacional desejada em aplicaes rotineiras (analtica e larga escala comercial), propicia tambm a reutilizao dos mesmos, sem que haja perda de desempenho.16 A seguir sero discutidos os cinco principais aspectos envolvidos em IMAC, a qumica de coordenao, os ons metlicos, os agentes quelantes, as matrizes cromatogrficas usadas para imobilizao dos agentes quelantes e as condies de adsoro, eluio e regenerao em processos de purificao e estudos de estrutura-funo de biomolculas. Qumica de coordenao em IMAC Em meio aquoso, os ons metlicos so solvatados por molculas de gua, atuando como cido de Lewis (aceptor de pares de eltrons) e a gua como base de Lewis (doadora de pares de eltrons).17 Contudo, quando a molcula de gua substituda por uma base mais forte, forma-se um complexo de coordenao. Quando esta base contiver um nico par doador de eltrons, ou seja, for um ligante monodentado, esta coordenao resultar na formao de um complexo metlico. Por outro lado, se a base contiver dois ou mais tomos doadores de pares de eltrons, haver a formao de um quelato metlico.5-7,11,12,16 O termo quelato tem origem do latim chela ou do grego khl, que significa pina. Neste caso, a molcula doadora de eltrons passa a ser chamada de agente quelante. Quando um agente quelante imobilizado em uma matriz slida por ligaes covalentes, um on metlico que venha a ser quelatado origina um centro de adsoro, apresentando stios livres para interao com biomolculas.2 De acordo com Wong e colaboradores,7 estas interaes ocorrem devido polarizabilidade das espcies envolvidas, eletronegatividade, estado de oxidao, tamanho, tipos de ligaes (inica ou covalente) e disponibilidade do doador de eltrons. A reversibilidade da interao da biomolcula em questo com o on metlico imobilizado fruto do carter cido-bsico dos ons metlicos utilizados em IMAC e, nas protenas e peptdeos, principalmente dos tomos de nitrognio aromtico. Estudos desenvolvidos sobre complexos de coordenao mostraram que a associao de um cido e de uma base de mesmo carter, segundo o princpio dos cidos e bases duros e moles (HSAB Hard and Soft Acids and Bases), resulta em compostos estveis.18 O princpio HSAB assume que h trs tipos principais de cidos e de bases: duros, intermedirios e moles. ons metlicos tais como K+, Mg2+, Ca2+ e Fe3+ so classificados como cidos duros e coordenam estavelmente bases duras (principalmente tomos de oxignio, nitrognio aliftico e fsforo), enquanto que os ons metlicos Ag+ e Cu+ so classificados como cidos moles e coordenam de maneira estvel bases moles (principalmente tomos de enxofre). Por sua vez, ons metlicos de transio (Cu2+, Zn2+, Ni2+ e Co2+) so classificados como cidos intermedirios e formam ligaes de coordenao estveis com bases intermedirias (principalmente tomos de nitrognio aromtico) e moles (principalmente tomos de enxofre).7,13 Quando quelatados, os ons metlicos apresentam variaes na afinidade por biomolculas, resultante de diferenas de interao que ocorrem entre quelatos metlicos e espcies doadoras de eltrons expostas na superfcie dessas (interaes que podem ser preditas pelo princpio de HSAB). A escolha adequada do on metlico a ser utilizado de fundamental importncia no processo de purificao de biomolculas por IMAC.

ons metlicos utilizados em IMAC De modo geral, qualquer on metlico que apresente a capacidade de interagir com protenas pode ser utilizado em IMAC, porm, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Al3+ e Ca2+ so os ons metlicos mais comumente empregados devido ao carter cido intermedirio discutido anteriormente. Os ons metlicos Cu2+, Ni2+, Co2+ e Zn2+ so utilizados na purificao de protenas que possuam resduos de histidina, triptofano e cistena, em que os ons metlicos interagem com o nitrognio aromtico dos grupamentos imidazol, indol e com o enxofre do grupamento tiol, respectivamente, de cada aminocido.6 Os ons metlicos Fe3+ e Al3+ ligam-se a fosfato e fosfosteres primrios, podendo ser utilizados para separar fosfoprotenas,19,20 e o on Ca2+ coordena de maneira estvel o tomo de oxignio presente em grupos carboxlicos dos resduos dos aminocidos cidos asprtico e glutmico, podendo ser utilizado para purificao de protenas ricas em grupamentos carboxlicos, tais como fibrinognio e calmodulina.21 Sulkowski6 demonstrou que o par de eltrons presente no nitrognio do anel imidazol da histidina o principal contribuinte na interao entre a protena e ons metlicos de transio (quando quelatados ao cido iminodiactico, IDA) e que a presena de mltiplas histidinas expostas na superfcie da protena a ser separada aumenta o grau desta interao. Aminocidos aromticos, como o triptofano, tambm so importantes na reteno de protenas. Contudo, a contribuio de um resduo de triptofano pode ser considerada pequena quando comparado ao efeito que a histidina apresenta na reteno de protenas em IMAC (Tabela 1).6,13,22 A cistena tambm afeta a reteno de protenas em IMAC, no entanto, este resduo ser ligado somente se estiver na forma reduzida (Tabela 2). Tabela 1. Predio da afinidade protena-IDA-Me2+ (onde Me2+ vem a ser Cu2+, Ni2+, Zn2+ ou Co2+) baseado em resduos de histidina e triptofano acessveis na superfcie de protenas Ocorrncia de resduos His ou Trp na superfcie de protenas Ausncia de His ou Trp 1 His > 1 His Cluster de His Vrios Trp, ausncia de His Reteno de protenas nos quelatos IDA-Me2+ no h Cu2+ Cu2+, Ni2+ Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ Cu2+

A acessibilidade dos resduos de histidina e a sequncia de resduos adjacentes de aminocidos podem alterar significativamente a reteno de protenas em IMAC. Resduos que no se ligam a ons metlicos podem contribuir indiretamente para a coordenao, por proporcionarem uma geometria local adequada (Tabela 2).16,22 Esses fatores em conjunto podem influenciar nas ligaes de coordenao formadas, ou seja, dois ou mais resduos de aminocidos podem se ligar a um nico on metlico (coordenao polidentada) ou pode ocorrer interao multipontos, onde uma nica protena contendo vrios resduos de aminocidos pode se ligar a vrios ons metlicos.16,23 Alm dos resduos de aminocidos, o grupo NH2 da extremidade N-terminal das protenas tambm participa diretamente na interao com o on metlico imobilizado, no entanto, essa contribuio significativa somente a valores de pH acima de 8,0, quando o nitrognio do grupo amino se encontra desprotonado (Tabela 2). Poucas so as protenas que naturalmente contm resduos de histidina localizados na superfcie, uma vez que estes resduos possuem um carter ligeiramente hidrofbico e se localizam, mais frequentemente, no interior da molcula. As interaes em IMAC podem ser mais eficientes quando protenas so geneticamente modificadas para conter caudas (tag) de resduos de histidinas consecutivas (normal-

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mente 6 resduos) ou separadas por alguns aminocidos (His-X-His) na poro N- ou C- terminal ou contiverem histaminilpurina, no caso de DNA.3,4,12,23 Esta cauda confere protena a possibilidade de interao multipontos com os ons metlicos Ni2+, Cu2+, Zn2+ ou Co2+ imobilizados, facilitando a purificao da protena alvo, tendo sido relatados muitos processos de purificao em uma nica etapa.12-14,24 Alm disso, a cauda pouco imunognica, no carregada em pH fisiolgico e raramente interfere na estrutura ou funo da protena alvo.3,4,25,26 Finalizada a etapa de purificao, caso seja necessrio, a ligao entre a cauda e a protena alvo pode ser rompida empregandose mtodos qumicos ou enzimticos que preservem a estrutura e a atividade da protena de interesse. Tabela 2. Contribuio de resduos de aminocidos na reteno de protenas em IMAC Ocorrncia de resduos de amino cidos na superfcie de protenas His Cys* Asp, Glu Lys, Arg Trp, Tyr, Phe NH2 terminal Reteno de protenas nos quelatos ++++ ++++ + + ++ Mecanismo de interao Direta Direta Indireta Indireta** Indireta Direta

e o quarto tercirio.15 De acordo com a Sigma-Aldrich Technical Service, a diferena de ponto isoeltrico tambm significativa: 10,5 para o TREN e entre 2,0 e 4,0 para o CM-Asp e o NTA.

* Cys liga-se somente se estiver na forma reduzida. ** Torna-se direta em pH alcalino. Agentes quelantes em IMAC As propriedades do centro de adsoro dependem fortemente do agente quelante utilizado. De modo geral, quanto mais polidentado for o agente quelante, mais estveis so os complexos formados com os ons metlicos, porm menor quantidade de stios permanece disponvel para a ligao com a biomolcula e, consequentemente, a mesma mais fracamente adsorvida.5,27 Muitos compostos so empregados como agentes quelantes em IMAC, sendo que o mais utilizado o cido iminodiactico (IDA, Figura 1). O IDA um agente quelante tridendado (possui um tomo de nitrognio e dois tomos de oxignio para a coordenao), isto , quelata o on metlico ocupando trs stios de coordenao. No caso de ons metlicos hexacoordenados, com trs stios ocupados, h disponibilidade para a biomolcula interagir com os outros trs stios remanescentes. As constantes de dissociao do IDA, pK1 e pK2 so 1,73 e 2,73, respectivamente28 e, de acordo com dados da Sigma-Aldrich Technical Service, apresenta ponto isoeltrico entre valores de pH 2,0 e 3,0. A baixos valores de pH, a protonao do nitrognio do IDA torna esse tomo menos disponvel para coordenao, enquanto que a capacidade de coordenao do oxignio menos afetada.11 De acordo com Porath,5 a estabilidade dos quelatos formados entre IDA com alguns ons metlicos decresce na seguinte ordem: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ > Co2+ >> Ca2+ Mg2+. Agentes quelantes tetradentados como, por exemplo, o cido asprtico carboximetilado (CM-Asp), o tris-2(aminoetil)amina (TREN) e o cido nitrilotriactico (NTA) ocupam quatro stios de coordenao, quando quelatam ons metlicos hexacoordenados, deixando apenas dois stios livres para a ocorrncia da ligao com a biomolcula (Figura 1). Uma diferena entre eles que o CM-Asp e o NTA possuem um tomo de nitrognio e trs tomos de oxignio para a coordenao, enquanto o TREN possui quatro tomos de nitrognio disponveis para a ligao com o metal, dois dos quais so primrios, e um secundrio

Figura 1. Estrutura proposta de alguns agentes quelantes polidentados complexados com ons metlicos: (a) IDA; (b) CM-Asp; (c) TREN; (d) NTA; (e) TED. Adaptado das refs. 12 e 29

O agente quelante tris(carboximetil)etilenodiamina (TED, Figura 1), por ser pentadentado, apresenta uma elevada estabilidade nas ligaes de coordenao, principalmente quando quelatando os ons Ni2+ e Fe3+.29 Porm, como este agente quelante disponibiliza apenas um nico stio de coordenao do on metlico com a biomolcula, a capacidade de adsoro do complexo TED-Me2+ bastante reduzida. Recomendase o uso deste agente quelante em situaes em que biomolculas apresentem tendncia de retirar o on metlico da coluna.30 Estudos indicaram que as constantes de formao de quelatos metlicos, quando os agentes quelantes esto imobilizados em suportes slidos, so da mesma ordem de grandeza das constantes obtidas para compostos anlogos em soluo.11 Porath e Olin29 apresentaram uma representao da capacidade de adsoro e seletividade para alguns agentes quelantes e ons metlicos imobilizados (Figura 2). Chaga11 mostrou que cerca de 50% das protenas oriundas de fontes biolgicas poderiam ser retidas em Cu2+ imobilizado, ao passo que esse nmero tende a cair significativamente se Ni2+, Co2+ ou Zn2+ so utilizados. Sharma e Agarwal15 apresentaram um estudo comparativo das caractersticas de coordenao de on metlicos Cu2+ e Ni2+ nos agentes quelantes IDA (tridentado) e TREN (tetradentado) imobilizados em gis de agarose. Estes autores observaram que as capacidades de quelao para os ons metlicos Cu2+ foram maiores que para os ons metlicos Ni2+, para ambos os agentes quelantes estudados. Porm, partindo-se do pressuposto de que quanto mais polidentado for o agente quelante, maior

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a estabilidade do quelato, pode-se inferir que os quelatos TREN-Me2+ poderiam ser mais estveis se comparados aos quelatos IDA-Me2+. Contudo, os autores mostraram que esta afirmao no vlida para todas as condies, uma vez que parmetros como natureza do tampo, pH, fora inica e concentrao do metal na soluo alimentada na coluna, alm de caractersticas intrnsecas dos tomos doadores de eltrons nos agentes quelantes, desempenham um importante papel no que diz respeito estabilidade dos quelatos metlicos e capacidade mxima de adsoro.

Figura 2. Agentes quelantes e ons metlicos: especificidade em funo da capacidade de adsoro. Adaptado da ref. 11 e modificado por Bresolin31 e Ribeiro32. Os sobrescritos referem-se polidentao dos agentes quelantes: tridentado (3), tetradentado (4) e pentadentado (5)

Matrizes cromatogrficas utilizadas em IMAC e qumica de ativao e imobilizao de agentes quelantes Matrizes cromatogrficas a serem utilizadas em IMAC devem apresentar as mesmas caractersticas requeridas que aquelas empregadas em tcnicas cromatogrficas para purificao de protenas. A principal exigncia que a matriz seja hidroflica, visando no favorecer a adsoro no-especfica de biomolculas.12-14 Alm disto, essencial a presena de grupos funcionais que possibilitem a modificao qumica (ativao) do material para imobilizao de ligantes. aconselhvel que a matriz apresente tambm as seguintes caractersticas: alta resistncia mecnica, rea superficial e porosidade elevadas, estabilidade em uma ampla faixa de pH e na presena de sais e solventes orgnicos.5,11,13,14,29,31-33 Nas tcnicas cromatogrficas de baixa presso, que vm a ser a maioria dos casos de IMAC, as matrizes mais comumente utilizadas so gis de agarose, celulose ou dextrana reticulada. Estes gis so compressveis e seu emprego restrito a operaes que requerem baixo fluxo, sendo pouco utilizados em nvel industrial, devido baixa produtividade.12,14 Na maioria dos trabalhos publicados de IMAC, a ativao destas matrizes foi realizada com epicloridrina ou bisoxiranos (por exemplo, 1,4 butanodiol diglicidil ter), produzindo suportes com grupos epxido (Figura 3). Quando necessrio, braos espaadores, ou seja, molculas acopladas covalentemente fase estacionria com objetivo de distanciar o ligante da matriz (por exemplo, amino-hexil), podem ser utilizados para evitar que ocorram problemas de impedimento estrico durante a adsoro da biomolcula alvo. Os agentes quelantes so ligados covalentemente fase estacionria ativada ou ao brao espaador atravs de seu grupo amino (Figura 3). Quando o processo requer alto fluxo e alta produtividade, podem ser empregados adsorventes inorgnicos, como slica, pois apresentam excelentes propriedades mecnicas. As desvantagens da slica residem na adsoro no especfica de protenas, no requerimento de equipamentos de alta presso e na sua instabilidade em meio alcalino (pH > 8,0), limitando, assim, seu uso em IMAC para purificao de protenas.12-14 Quando empregados em IMAC, este suportes so, na maioria dos casos, ativados com epoxissilanos e a ligao do agente quelante realizada pelo terminal amino.21,29

Figura 3. Esquema de ativao por epicloridrina, acoplamento do agente quelante e imobilizao de on metlico em matrizes polimricas

De modo a superar as desvantagens apresentadas pelos gis de polissacardeos, cromatografia em leito expandido e cromatografia em membranas adsortivas apresentam-se como uma alternativa, podendo ser empregadas em larga escala. Na cromatografia em leito expandido, um fluxo ascendente de fase mvel na coluna promove a expanso do leito - distanciamento das partculas de adsorvente (gis especiais, por exemplo, Streamline Chelating, Amersham Pharmacia) de velocidade terminal diferente, devido fora de arraste que, desta forma, pode receber alimentao com particulados sem que haja colmatao (entupimento) do leito.25 Na cromatografia em membranas, o transporte das molculas da soluo at o interior dos poros regido, sobretudo, pela conveco e no pela difuso (como ocorre nos gis). Este transporte convectivo facilita o acesso da biomolcula ao stio de fixao do ligante. Alm disso, altas vazes podem ser obtidas com presses moderadas, sem necessidade de uso de equipamentos de alta presso.34 Membranas de diversos materiais

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(por exemplo, celulose, lcool poli(etileno)vinlico (PEVA) e fibras de vidro) e diversas configuraes (placas planas e fibras ocas) tm sido empregadas como matrizes para a imobilizao de agentes quelantes para uso em IMAC, visando a purificao de biomolculas.31,35-39 No caso de membranas e gis empregados em leito expandido, as tcnicas de ativao e imobilizao dos agentes quelantes so similares quelas utilizadas para os gis cromatogrficos tradicionais. Pesquisas recentes vm demonstrando que materiais base de outros polmeros, naturais ou sintticos, como quitosana, etileno-glicol, metacrilatos, alm de minerais como hidroxiapatita e magnetita, podem ser utilizados como matrizes para imobilizao de agentes quelantes, seja para uso em leito fixo ou expandido.40-46 Outros materiais, como capilares monolticos de slica, nanotubos de carbono e fulerenos tambm so utilizados para a imobilizao de ons metlicos na presena ou ausncia de agentes quelantes.47 Adsorventes IMAC (matriz com agente quelante imobilizado) podem ser tambm adquiridos comercialmente. As empresas disponibilizam adsorventes para uso em equipamentos cromatogrficos de baixa presso como, por exemplo, gis de agarose com IDA ou NTA imobilizado (GE Healthcare, Pierce, Sigma-Aldrich e Qiagen) e, tambm, adsorventes para uso em equipamentos cromatogrficos de mdia e alta presso como, por exemplo, matrizes de slica ou agarose altamente reticulada com IDA ou NTA imobilizados (GE Healthcare, Qiagen e Clontech Laboratoires). A empresa Sartorius disponibiliza tambm membranas planas microporosas com o agente quelante IDA imobilizado, sendo que, assim, este adsorvente pode ser empregado em cromatografias cujas amostras de alimentao possuem material particulado. Adsoro, dessoro e regenerao em IMAC A seletividade e a capacidade de adsoro em IMAC dependem, no somente dos quelatos metlicos imobilizados na matriz cromatogrfica, mas tambm da composio da fase mvel. Como mencionado, a reteno de protenas em adsorventes IMAC ocorre devido contribuio de diversas interaes fsico-qumicas, que podem ser intensificadas ou minimizadas dependendo da composio da fase mvel. Quando IMAC operado em alta concentrao de sal (0,5 a 1,0 mol L-1 de NaCl, por exemplo), predominam as ligaes de coordenao entre ons metlicos imobilizados e resduos de aminocidos acessveis na superfcie das protenas e, em menor intensidade, ocorrem interaes eletrostticas.5,10,13,14 Os efeitos eletrostticos so mais intensos quando se emprega uma fase mvel com baixa fora inica. Estes efeitos ocorrem entre protenas carregadas e as cargas positivas dos ons metlicos ou as cargas negativas remanescentes na superfcie da matriz (grupos funcionais no reagidos durante a ativao e o acoplamento do agente quelante ou grupo carboxlico residual de agentes quelantes, devido quelao incompleta dos ons metlicos).10,13,14 As interaes hidrofbicas podem ocorrer entre protenas e stios hidrofbicos presentes na superfcie da matriz ou nos braos espaadores.12,14 Os efeitos do sistema tamponante, pH e fora inica nas etapas de adsoro e dessoro sero discutidos a seguir. Condies de adsoro Sistemas tamponantes e aditivos Em princpio, todos os tampes tradicionais utilizados em cromatografia lquida para purificao de biomolculas podem ser empregados como fase mvel em IMAC, devendo-se, no entanto, evitar aqueles que possuem alta afinidade por ons metlicos como, por exemplo, tricina e citrato, pois podem remov-los do suporte. Os tampes mais empregados em IMAC so fosfato de sdio, acetato de sdio e os zwiterinicos (Goods buffers) tais como MOPS (cido

3-[N-morfolino]propanossulfnico), MES (cido 2-[N-morfolino] etanossulfnico) e HEPES (cido N-[2-hidroxietil]piperazina-N[2-etanolssulfnico]).10 Em menor extenso que a tricina e o citrato, os tampes preparados com sais de Tris (Tris [hidroximetil]aminometano) e fosfato competem fracamente com a biomolcula pelo stio metlico, tornando, em alguns casos, a adsoro mais seletiva. Esta propriedade pode tambm ser empregada na etapa de eluio, onde o aumento de concentrao de Tris ou fosfato pode favorecer a dessoro das protenas.31,35,38,48,49 Dependendo da situao, a fase mvel pode requerer a adio de outros componentes em sua constituio, que apresentem a funo de manter a integridade de protenas (inibidores de protease ou glicerol, por exemplo), de prevenir a agregao de protenas (mercaptoetanol, por exemplo) ou meramente melhorar a resoluo do processo.24,50 Vrios autores mostraram que a presena de detergentes no-inicos (como NP-40 e Tween 80), uria, cloreto de guanidina 6 mol L-1 e solventes orgnicos em baixa concentrao no interfere nos processos de purificao por IMAC.4,24,29,36,51 Quando se visa o isolamento e a purificao de protenas recombinantes presentes em corpos de incluso, ao se utilizar IMAC h a possibilidade de separao eficiente de protenas contendo cauda de histidina na presena de concentraes elevadas de agentes desnaturantes, como uria e guanidina-HCl.12 Efeito do pH Em IMAC, a ligao de coordenao favorecida quando grupos ionizveis doadores de eltrons presentes nos resduos de aminocidos da biomolcula esto parcialmente desprotonados, ou seja, quando esto em uma condio na qual o valor de pH superior ao pKa dos grupos ionizveis. Alm disso, como as ligaes de coordenao com os ons metlicos imobilizados podem ocorrer simultaneamente com interaes eletrostticas, a adsoro de protenas em IMAC dependente do pH.52 De modo geral, o pH timo de adsoro depende do on metlico e dos grupos doadores de eltrons envolvidos na interao. A adsoro favorecida numa faixa de valores de pH entre 6,0 e 8,0 para protenas que possuem resduos de histidinas e cistenas acessveis quando se utiliza Cu2+, Ni2+, Zn2+ ou Co2+ imobilizado, enquanto que, para protenas ricas em cidos carboxlicos ou grupos fosfato (fosfoprotenas), a adsoro ocorre a valores de pH mais baixos (pH 5,0), quando se utiliza Ca2+, Fe2+, Fe3+, Mg2+.12,27 A contribuio de grupos NH2 terminais e resduos de aminocidos, como arginina e lisina, na adsoro em IMAC so significativos a valores de pH acima de 8,0, quando se utiliza Cu2+ ou Ni2+, por exemplo.53 Efeito da fora inica Quando as cromatografias so realizadas em condies recomendadas por Porath e colaboradores,2 ou seja, elevada concentrao de sal e condies de pH particulares (por exemplo, pH em que os resduos de histidina se encontram desprotonados), h predominncia das ligaes de coordenao entre ons metlicos imobilizados e protenas devido diminuio ou supresso das interaes eletrostticas. Na maioria dos casos, a elevada concentrao de sal aumenta a seletividade em IMAC, uma vez que a natureza do on metlico ser o principal elemento responsvel pela adsoro. Alm disso, as protenas so estabilizadas e o processo de agregao tende a ser retardado.10,14,22,53 A utilizao de uma fase mvel com baixa fora inica (ausncia ou baixa concentrao de sal) permite que ocorram, predominantemente, interaes eletrostticas, fazendo com que o comportamento do quelato se assemelhe ao de uma resina de troca inica.13,14 No apenas a fora inica em si importante, mas a adsoro de protenas em IMAC pode ser tambm influenciada significativamente pelo tipo do sal utilizado. Porath e Olin29 mostraram que

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protenas adsorvidas na presena de 1,0 mol L-1 de cloreto de sdio podem diferir daquelas adsorvidas a uma mesma fora inica, porm utilizando-se sulfato de sdio (concentrao de 0,333 mol L-1). Normalmente em IMAC, utiliza-se uma concentrao acima de 0,1 mol L-1 de cloreto de sdio. Condies de dessoro A dessoro das biomolculas adsorvidas na matriz cromatogrfica em IMAC pode ser conduzida utilizando-se diferentes condies, entre elas: alterao dos valores de pH da fase mvel; aumento da fora inica da fase mvel; adio de agente competidor na fase mvel (por exemplo, imidazol), que possua capacidade de interagir com o on metlico; deslocamento do complexo on metlico-protena utilizando um agente quelante mais forte (por exemplo, EDTA) e, eluio isocrtica. Os mtodos mais comumente empregados so a alterao de valores de pH e a adio de um agente competidor na fase mvel da cromatografia.7,10,13,14,27 Como discutido anteriormente, o pH afeta o comportamento nucleoflico dos componentes do tampo, as propriedades dos solutos doadores e receptores de eltrons, bem como a estabilidade do quelato metlico.7,27 Eluio por diminuio do pH ocasiona a protonao das espcies doadoras de eltrons, podendo ser um mtodo eficiente para dessorver protenas que interagem com ons metlicos Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Ca2+ imobilizados. Para cromatografias realizadas com on metlico Fe3+, as protenas podem ser eludas por aumento do pH. Na eluio por alterao de pH da fase mvel recomenda-se utilizar valores de pH brandos, a fim de evitar a desnaturao e a desestabilizao da biomolcula, que pode acarretar, por exemplo, perda irreversvel da atividade. importante, tambm, realizar o monitoramento do desprendimento do on metlico do adsorvente, causado pelo enfraquecimento da interao entre o agente quelante e o on metlico imobilizado.27 A eluio por aumento da fora inica da fase mvel pode ser empregada quando interaes hidrofbicas e inicas so significativas em relao s ligaes de coordenao.10 No mtodo de dessoro por agente competidor, os agentes competitivos mais utilizados so histidina, histamina, glicina, imidazol, fosfato e Tris. A caracterstica fundamental para que um soluto seja considerado como um agente competidor que possua maior afinidade pelo stio de ligao que a molcula que est adsorvida. Isto faz com que a biomolcula seja dessorvida para o meio, enquanto o competidor permanece adsorvido na matriz.7,22 Apesar de evitar condies de baixos valores de pH, este mtodo de eluio tambm requer a introduo de mais uma etapa de processo a fim de eliminar o agente competitivo do meio contendo a protena eluda (por meio de ultrafiltrao, permeao em gel ou dilise, por exemplo). O modo de operao de eluio, seja por diminuio de pH, adio de agente competidor e aumento da fora inica ou a combinao destes mtodos, geralmente feito por gradientes linear ou degrau.10 Particularmente, o uso de gradiente linear interessante em experimentos preliminares, em que no se conhece o comportamento do perfil de eluio de uma dada biomolcula para, posteriormente, se utilizar gradiente degrau, mais reprodutvel e geralmente utilizado em processos de purificao em larga escala. A eluio isocrtica eficiente para dessoro da biomolcula adsorvida quando a interao entre o on metlico e a biomolcula fraca e esta de baixa massa molecular (menor que 30 kDa). Neste mtodo a eluio realizada em condies constantes (composio de tampo, pH e temperatura), nas mesmas condies utilizadas na etapa de aplicao da amostra.10 Neste caso, o pH e a concentrao do tampo devem proporcionar interao incompleta entre a biomolcula e os ons metlicos imobilizados. As vantagens deste tipo de

eluio resultam em aumento da resoluo da separao e na rpida regenerao da coluna, mas a protena alvo eluda em um pool com baixa concentrao. O deslocamento do complexo on metlico-protena utilizando um agente quelante mais forte como, por exemplo, o EDTA, normalmente utilizado para a regenerao da coluna aps o trmino da etapa de eluio. Entretanto, em muitos casos, a interao entre o on metlico e a protena de interesse to forte, que o nico meio de retir-la da coluna proporcionando tambm o deslocamento do on metlico. Este tipo de eluio no adequado na maioria dos casos, principalmente se a protena alvo tem finalidade teraputica, pois necessrio, nestes casos, que o on metlico seja removido da frao eluda contendo a protena.7,22 Regenerao do adsorvente IMAC Aps a etapa de eluio, normalmente se regenera o adsorvente para que este possa ser reutilizado em novos ciclos operacionais, aps nova imobilizao de on metlico.7,22 Para tanto, utiliza-se um agente quelante forte como, por exemplo, o EDTA, que ser o responsvel por promover o enfraquecimento da interao on metlico-agente quelante, permitindo que haja remoo dos ons metlicos. Em alguns casos, quando solues de EDTA no conseguem remover do adsorvente substncias como protenas desnaturadas ou lipdios, necessria a realizao de procedimentos de cleaning-inplace (CIP), envolvendo lavagem com NaCl 2 mol L-1, para a remoo de protenas fortemente adsorvidas ionicamente, NaOH 1 mol L-1, para a remoo de protenas precipitadas ou adsorvidas hidrofobicamente, ou soluo 70% etanol:30% isopropanol, para remoo de lipoprotenas ou lipdeos.54 Quando necessria a realizao de sanitizao da coluna cromatogrfica para reduo de contaminao bacteriana, aps a regenerao do adsorvente com EDTA procede-se lavagem com NaOH, seguida de lavagem com gua.55,56 EXEMPLOS DE APLICAES DE IMAC Peptdeos e protenas nativas e recombinantes produzidas por bactrias, fungos, leveduras, clulas animais, clulas de inseto e em plantas, assim como cidos nuclicos (DNA e RNA) vm sendo purificados por IMAC usando os mais variados suportes, agentes quelantes e ons metlicos.37,49,57-63 A literatura mostra que, alm destas aplicaes, IMAC foi utilizada para separao de diferentes tipos de clulas microbianas, uma vez que estas, quando possuam resduos de histidina acessveis, apresentavam a capacidade de serem adsorvidas em uma coluna monoltica de estrutura macroporosa composta por criogis de poliacrilamida com IDA-Cu2+ imobilizado.65 Protenas que contm naturalmente resduos de histidinas acessveis (recombinantes ou no) e apresentam importncia comercial no campo teraputico e diagnstico, como protenas do soro humano,29 imunoglobulinas,31,35,38,66-71 interferon,72 protena C humana,73,74 fator IX73,75 e hormnio de crescimento humano,76 foram purificadas por IMAC utilizando os metais de transio Cu2+, Ni2+, Zn2+, Fe3+ e Co2+ imobilizados. Outros ons metlicos, diferentes dos metais de transio, tais como Al3+ (metal representativo), Ca2+ (metal alcalino terroso) e Yb3+ (lantandio), foram empregados para purificao de transferrina, albumina, 2-macroglobulina e -globulinas, alcanandose elevadas seletividades, mostrando-se uma alternativa atrativa para fracionamento seletivo de protenas do soro humano.77 A tcnica de IMAC tem sido utilizada para a purificao de anticorpos policlonais e monoclonais de diversas fontes, devido, principalmente, presena de resduos de histidina acessveis na superfcie da molcula. Hale e Beidler66 descreveram uma regio rica em resduos de histidina localizada na poro Fc (prxima extremidade C-terminal da cadeia

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pesada) no anticorpo murino humanizado do isotipo IgG1. Essa regio, responsvel pela interao protena-metal, tambm ocorre em diversas outras sub-classes de IgG humana, alm de IgG de coelho, carneiro, ovelha, entre outras. Todorova-Balvay e colaboradores,71 por clculo computacional, determinaram que a reteno da IgG humana ocorre, principalmente, devido presena de duas histidinas separadas somente por um aminocido (His 433-X-His 435) que seriam as responsveis pela sua reteno em IDA-Zn2+ e IDA-Co2+. Os resultados promissores, obtidos por diversos grupos de pesquisa, fazem de IMAC uma boa alternativa aos mtodos j existentes para a purificao de IgG podendo atingir, em muitos casos, teor de pureza superior a 90%.38,66,67,71 Outras protenas sem modificao prvia, apresentando naturalmente afinidade por ons metlicos foram purificadas com xito por IMAC, podendo-se citar a quimotripsina,48 a catalase,78 o glucagon79 e a lisozima.80 Caso a protena alvo no apresente naturalmente resduos de histidina acessveis, a purificao pode ser executada por IMAC negativa. Na cromatografia negativa, a protena alvo no interage com o ligante imobilizado e se as impurezas e contaminantes presentes na alimentao interagirem fortemente e em extenso com o ligante, sendo retidos na coluna cromatogrfica, a protena alvo pode ser obtida com alta pureza nas fraes no retidas. Azzoni e colaboradores81 e Genaro e colaboradores82 purificaram, com sucesso, por IMAC negativa, aprotinina recombinante de proveniente semente de milho transgnico e aprotinina proveniente de sobrenadante de precipitao de processo de produo industrial de insulina bovina da Biobrs, MG, Brasil, respectivamente. Como mencionado anteriormente, resduos de histidina podem ser introduzidos artificialmente em protenas que no os contm naturalmente (ou os contm, mas se encontram inacessveis).3 A adio da cauda de histidina em protenas recombinantes tem sido altamente efetiva, proporcionando a purificao da protena alvo em uma nica etapa com alto teor de pureza.26 Como exemplos de protenas recombinantes com cauda de histidina purificadas por IMAC em nvel de bancada, podem-se citar pr-renina humana,83 -galactosidase e peroxidase de raiz forte84,85 e, em nvel industrial, a pr-insulina humana.86 Pr-renina humana produzida em clulas de ovrio de hamster chins (CHO), tendo uma cauda de 10 histidinas, foi purificada por IMAC, fazendo-se uso de colunas comerciais Talon-Co2+. Esta protena, que a precursora da renina, apresenta potenciais funes fisiolgicas.83 Enzimas recombinantes como -galactosidase e peroxidase de raiz forte com cauda de poli-histidina foram purificadas usando-se, respectivamente, agarose-dextrana-IDA-Zn2+ e agarose-NTA-Ni2+, alcanando elevados nveis de pureza e recuperao.84,85 A pr-insulina humana recombinante tendo uma cauda de histidina, produzida pela indstria brasileira BIOMM (Montes Claros, MG, Brasil) foi purificada por IMAC em gis de agarose-IDA-Ni2+, segundo procedimento descrito por Tikhonov e colaboradores.86 Como os custos de recuperao e purificao de produtos chegam a representar uma porcentagem significativa do custo total, a minimizao do nmero de etapas e do tempo do processo reduz enormemente o custo do produto. Com o intuito de reduzir o nmero de etapas do processo, Aquino e colaboradores propuseram a purificao de pr-insulina humana recombinante com cauda de histidina em membranas de fibras ocas de lcool (poli (etileno vinlico)) com o on nquel quelatado ao IDA, devido vantagem em relao aos gis tradicionais, de tratar grandes volumes por unidade de tempo e alimentar solues contendo material particulado. A metodologia proposta foi equivalente em termos de seletividade, porm o adsorvente apresentou capacidade menor que agarose-IDA-Ni2+.36 Uma das modificaes ps-traducionais mais abundantes em protenas a fosforilao, que consiste na adio de um grupo fosfato (PO4) a uma protena ou biomolcula para desempenhar funes de

expresso gnica e regulao do crescimento, por exemplo.87,88 Neste contexto, a tcnica de IMAC utilizada para o enriquecimento seletivo de misturas que contenham componentes fosforilados e no-fosforilados.89 ons metlicos como Fe3+ e Ga3+, por exemplo, apresentam a habilidade de identificar tanto a protena como o stio fosforilado, podendo ser utilizados neste processo de separao.90,91 cidos nuclicos (DNA e RNA) tambm vm sendo isolados e purificados utilizando-se IMAC. O trabalho pioneiro de Min e Verdine92 mostrou que cidos nuclicos com oligonucleotdeos primers contendo sequncia de seis resduos de histaminilpurina na sua estrutura molecular interagem seletivamente com o quelato NTA-Ni2+ (agarose-NTA-Ni2+) resultando num maior rendimento na purificao do produto da PCR, enquanto bases normais de DNA e RNA no participam da quelao com Ni2+. Em trabalhos mais recentes, pesquisadores mostraram que DNA plasmidial (pDNA) e genmico puderam ser separados por IMAC em agarose-IDA-Cu2+ e agarose NTA-Cu2+, bem como usando-se a coluna comercial HiTrap (GE Healthcare) com Cu2+ e Ni2+ imobilizados, aps etapas de desnaturao termoqumica seguida de renaturao, pois o DNA genmico parcialmente desnaturado seletivamente ligado aos ons metlicos imobilizados, enquanto que o pDNA renaturado no apresenta afinidade.93,94 Por sua vez, Nastasijevic e colaboradores63 mostraram que a presena de uma cauda de oligo-adenosina suficiente para conferir a ambas molculas de DNA e RNA uma afinidade mais intensa por NTA-Ni2+, permitindo sua captura e purificao por IMAC. Tan e colaboradores,95 por sua vez, utilizaram IMAC com vrios ons metlicos de transio (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) imobilizados em resinas de IMAC comerciais (IDA-Chelating Sepharose Fast Flow, Ni2+-NTA Agarose e Talon Metal Affinity Resin) para purificao de pDNA a partir de lisado celular alcalino com a remoo simultnea de RNA e endotoxinas. Alm do seu uso em purificao, IMAC tambm pode ser utilizado no estudo estrutural de protenas. O conhecimento das interaes metal-protena pode ser uma poderosa ferramenta no estudo da interao entre a protena e outras molculas, como a relao entre enzima-inibidor.7,13,14 A afinidade entre protenas e ons metlicos imobilizados pode ser tambm explorada em outras tcnicas, diferentes da cromatografia. Dentre as vrias tcnicas utilizando quelatos metlicos imobilizados, pode-se citar, como exemplos de separao de clulas, protenas e cidos nuclicos, a partio em duas fases aquosas por afinidade,96,97 a precipitao por afinidade62,95,98 e a tcnica de eletroforese de afinidade.99,100 PRS E CONTRAS DA PURIFICAO DE BIOMOLCULAS POR IMAC Como toda tcnica cromatogrfica de purificao de biomolculas, a tcnica de IMAC apresenta vantagens e desvantagens. Como j visto, IMAC tem sido uma tcnica muito utilizada para a purificao de protenas devido ao seu baixo custo, especificidade (em muitos casos apresentando purificao em uma nica etapa e grau de pureza acima de 90%), alta capacidade de adsoro e por apresentar condies brandas de eluio da protena adsorvida. O adsorvente IMAC de fcil regenerao e no apresenta degradao qumica ou microbiolgica durante a estocagem.3,4,30,101 Alm dessas vantagens, os adsorventes IMAC so muito versteis, pois diferentes ons metlicos podem ser imobilizados usando o mesmo adsorvente, aps a regenerao do mesmo com EDTA, podendo ser utilizados em mais de 100 ciclos, fato este que os tornam importantes sob o ponto de vista de aplicao industrial (ampliao de escala).

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Como tambm j discutido, mtodos de separao especficos podem ser empregados para cada tipo de biomolcula, apenas com a escolha adequada do on metlico e das condies cromatogrficas, tais como pH, fora inica, tipo de tampo, velocidade superficial etc.,7,11,13,14 pois IMAC compatvel com diferentes tampes e concentrao de sais, no afetando a estrutura terciria das protenas.5,11 Como potenciais desvantagens da tcnica, podem-se citar o fenmeno MIT (Metal Ion Transfert), as reaes de oxidao catalisadas na presena de metais e o desprendimento de ons metlicos durante a cromatografia. O fenmeno MIT ocorre quando a protena alvo captura o on metlico da coluna dentro de sua estrutura. Caso a protena alvo purificada seja utilizada para fins teraputicos, a presena de on metlico pode ser problemtica, pois muitos ons metlicos so cancergenos. Aminocidos como histidina e cistena so susceptveis a reaes de oxidao catalisadas na presena de metais (principalmente cobre) em meio contendo oxignio dissolvido, o que produz compostos intermedirios que podem alterar quimicamente a protena. Neste caso, IMAC no recomendado como mtodo de purificao.12 Em alguns casos possvel a ocorrncia de desprendimento de ons metlicos durante o processo de purificao, acarretando a necessidade de incluso de uma etapa adicional para a remoo destes ons metlicos. No caso de se estar trabalhando com a purificao de protenas para uso teraputico, a contaminao por ons metlicos pode acarretar em sua reteno pelas clulas do organismo, principalmente quando terapias de longo tempo so empregadas.14 Pode-se remediar esta situao, por exemplo, acoplando-se a jusante da coluna IMAC uma coluna com gel contendo um agente quelante pentadentado no carregado com on metlico (como TED) para captura dos ons metlicos desprendidos.12-14,30 CONCLUSO IMAC tem se mostrado uma excelente tcnica para purificao, bem como para caracterizao e estudos de estrutura-funo de biomolculas nativas, recombinantes e modificadas. IMAC possui vantagens em relao a outras tcnicas em termos de seletividade, reprodutibilidade, custo e produtividade. O procedimento qumico de preparao de adsorventes e os fenmenos de adsoro e dessoro em IMAC so, na maioria dos casos, relativamente simples e bem entendidos. O domnio, pelos biologistas moleculares, da insero de caudas de espcies doadoras de eltrons em protenas e cidos nuclicos e o desenvolvimento de novas matrizes, mais robustas do ponto de vista de aplicao em larga escala a altos fluxos, fazem de IMAC uma tcnica aplicvel em nvel laboratorial e industrial. Crescentes combinaes de IMAC com novas tecnologias aplicadas metaloprotemica, protemica e genmica contribuiro ainda mais para o sucesso de estudos de expresso, mapeamento de clulas, modificaes ps-traducionais e protemica estrutural. REFERNCIAS
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