SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS DE JUGO DE FRUTOS POR CROMATOGRAFA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA

INTRODUCCIN La Cromatografa es un mtodo de separacin, analtico o preparativo, en el que los componentes de una mezcla o solutos, se separan por su distribucin diferencial a travs de un medio poroso o fase estacionaria, la cual es ocasionada por el flujo de un disolvente o fase mvil. Cromatografa en plano bidimensional: En este caso la muestra se coloca en una de las esquinas de una placa cuadrada y se realiza el desarrollo en direccin ascendente con el disolvente A. A continuacin se elimina este disolvente por evaporacin, y se gira la placa 90 grados, realizando ahora el desarrollo ascendente con el disolvente B. Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los componentes con un reactivo de revelado, tipo ninhidrina, y las manchas originadas se identifican comparando sus posiciones con las de los estndares.

Figura 1. Cromtograma y los puntos de aplicacin de las diferentes muestras.

En la cromatografa en capa fina, se utiliza una placa (generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser almina o silica gel, en la cual se presentara un fenmeno de adsorcin selectiva. La fase mvil ascender por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o tambin llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografa son: solido-liquido, las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin entre los componentes de la fase mvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria ser ms polar que la fase mvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamao de la partcula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografa bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases mviles distintas en diferentes direcciones.

Figura 2. Relacin de Frentes: Distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por el solvente

El Rf, se entiende como:

El valor de este depender de las condiciones en las cuales se corre la muestra como la fase mvil o estacionaria usada, las condiciones de la placa, entre otros. Los aminocidos son derivados aminados de cidos carboxlicos, en los 20 aminocidos comunes, los grupos amino y carboxilo estn unidos al mismo tomo de carbono (Carbono adems que ), en este se unen sustituyentes diferentes. Los aminocidos los podemos clasificar de diferentes maneras; una de las ms comunes es separarlos en base al sustituyente que tenga en la cadena lateral. FUNDAMENTO En la cromatografa, en general se fundamentan en las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se quieren separar, que estn gobernadas por sus solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar. En un solo paso de separacin cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de particin (es una constante de equilibrio definido) .Para n sistema de solventes y un tipo de papel determinado, cada sustancia tiene un valor de Rf caracterstico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma en papel usa la cromatografa bidimensional en papel. Basada en el principio anterior, con la diferencia en la tcnica , la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90 y se realiza una cromatografa paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla de componentes.

OBJETIVOS Separar los aminocidos presentes en el jugo de frutos para la cromatografa bidimensional.

 Identificara los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con la solucin de aminocidos. Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con el de la unidimensional.

RESULTADOS

Fig. 1. Cromatograma I unidimensional. Fase mvil: cloroformo-metanol-amoniaco. Se observa de izquierda a derecha los aminocidos tipo (Tyr, Trp, Pro,Phe, Met, Lys, His, Glu, Gly, Arg, y Problema)

Fig 2. Cromatograma II unidimensional. Fase mvil: metanol-etanol-agua-urea. Se observa de izquierda a derecha los aminocidos tipo (Tyr, Trp, Pro,Phe, Met, Lys, His, Glu, Gly, Arg, y Problema)

Fig 3. Cromatograma III bidimensional de aminocidos tipo. Fase mvil I: cloroformo-metanol-amoniaco. Fase mvil II: metano-etanol-agua-urea. Se observa que fase mvil I corre en direccin vertical y la fase mvil II corre en direccin horizontal.

Fig 4. Cromatograma IV bidimensional del problema. Fase mvil I: cloroformo-metanol-amoniaco. Fase mvil II: metano-etanol-agua-urea. Se observa que fase mvil I corre en direccin vertical y la fase mvil II corre en direccin horizontal.

Resultados obtenidos a partir del cromatograma I y II unidimensionales, reportando los Rf de cada uno de estos aminocidos apoyndonos y comparndolos entre si ya que nuestro cromatograma 1 corri de ms el disolvente cost trabajo pero se lograron identificar, comparndolo con otros cromatogrmas que emplearon la misma muestra de estudio, a saber, jugo de naranja.
Tabla 1. . Cromatografa Unidimensional tipo, desarrollada en las dos fases mviles.

Aminoci do His Arg Lys Pro Glu Gly Thr Tyr Met Phe

1era Fase Mvil Frente Soluto 0.4 2 2.5 5.2 5.5 5.5 6 6.5 7.2 7.5 Frente Disolvente 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 R 0.0506329 1 0.2531645 6 0.3164557 0.6582278 5 0.6962025 3 0.6962025 3 0.7594936 7 0.8227848 1 0.9113924 1 0.9493670 9 Frente Soluto 6.2 0.3 0.2 4.9 6.3 4.3 5.1 7.1 6.1 6.9

2da Fase Mvil Frente Disolvente 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 8.1 R 0.7654321 0.0370370 4 0.0246913 6 0.6049382 7 0.7777777 8 0.5308642 0.6296296 3 0.8765432 1 0.7530864 2 0.8518518 5

Resultados obtenidos a partir del cromatograma III bidimensional, reportando los Rf de cada uno de los aminocidos en las dos fases mviles utilizadas.

Tabla 2. Cromatografa bidimensional tipo, desarrollado en las dos fases mviles

No. Manc ha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1era Fase Mvil Frente Soluto 1.6 2.1 3.1 3.7 3.9 4.2 4.7 4.8 5.3 6.2 Frente Disolvente 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 8.4 R 0.1904761 9 0.25 0.3690476 2 0.4404761 9 0.4642857 1 0.5 0.5595238 1 0.5714285 7 0.6309523 8 0.7380952 4 Frente Soluto 0.2 0.3 1.1 0.8 4.5 4.7 6.1 5.4 6.6 6.2 2da Fase Mvil Frente Disolvente 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 R 0.0256410 3 0.0384615 4 0.1410256 4 0.1025641 0.5769230 8 0.6025641 0.7820512 8 0.6923076 9 0.8461538 5 0.7948717 9 Aminocid o ? Arg ? ? ? ? ? ? Pro Thr

Resultados obtenidos a partir del cromatograma IV bidimensional, reportando los Rf de cada una de las manchas de la muestra problema.

Tabla 3. Cromatograma Bidimensional problema desarrollado en las 2 fases mviles

No. Mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1era Fase Mvil Frente Soluto 0.6 1.3 2.4 2.5 2.6 2.7 3.6 3.6 4.1 4.8 Frente Disolvente 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 R 0.08 0.17333333 0.32 0.33333333 0.34666667 0.36 0.48 0.48 0.54666667 0.64 Frente Soluto 0.1 0.1 0.2 1.1 5.6 5.2 5.3 3.6 3.3 4

2da Fase Mvil Frente Disolvente 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 R 0.01470588 0.01470588 0.02941176 0.16176471 0.82352941 0.76470588 0.77941176 0.52941176 0.48529412 0.58823529

Resultados recopilados a partir de los datos anteriores (tabla 1.3) para la identificacin de aminocidos en nuestro problema analizado.
Tabla 4. Cromatograma Bidimensional Problema desarrollado en las 2 fases mviles.
No. Manc ha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R Creciente en la 1era Fase Mvil 0.08 0.17333333 0.32 0.33333333 0.34666667 0.36 0.48 0.48 0.546666667 0.64 R en la 2da Fase Mvil 0.014705882 0.014705882 0.029411765 0.161764706 0.823529412 0.764705882 0.779411765 0.529411765 0.485294118 0.588235294 Aminocido His ? Lys ? ? ? ? ? ? Pro

DISCUSIONES En base a los resultados obtenidos, se puede observar que en el cromatograma I unidimensional, se obtuvieron un total de 10 manchas que correspondan a cada uno de los aminocidos estudiados pero que corrieron muy disparejos y dispersos; sin embargo, se observaron tambin manchas pequeas, posiblemente impurezas de los reactivos o corri el problema de ms o bien el solvente peg en una orilla de la cromatoplaca al momento de colocarla en la cmara y en el soporto lo que absorbi de ms y por ende hubo apariciones de manchas no especificadas o bien son aminocidos que no se aplicaron para su identificacin. En el caso del cromatograma II, se obtuvieron de igual manera un total de 10 manchas que correspondan a los aminocidos tipo, esto debido a alguna cualidad que presentan en su estructura qumica, las diferencias que presenta con la cromatografa unidireccional, es que en este caso, la lisina, histidina y arginina se quedaron en el sitio de aplicacin, posiblemente debido a que no eran solubles en la mezcla de solventes, o bien no era una cantidad suficiente para correr o dejar claro que estn presentes en la muestra.

En el caso del cromatograma III bidimensional, se observan un total de 16 manchas; al clasificarlas dependiendo de su Rf obtenido y comparando este con los dos cromatogramas unidimensionales anteriores, se pueden identificar los aminocidos que estn presentes. Una de las cuestiones que tuvimos que observar fue que la prolina y glicina presentan un color diferente cuando se les revela con ninhidrina, (color amarillo, debido a que no produce amonio al reaccionar con esta) o la glicina (color naranja), esta propiedad nos permiti identificarlos fcilmente, sin la necesidad de comparar su Rf, lo que fue de gran ayuda recurrir a la bibliografa porque pudimos identificar de estas 16 manchas tres aminocidos importantes presentes en el jugo de naranja ya que las otras manchas no son identificables con certeza, se podra suponer pero a sido difcil decir con seguridad es tal, y una de las manchas presentes si se puede decir que es una mancha de dedo por la forma que tiene, seguramente algn compaero que no tenia guantes por algn motivo logro hacer contacto. Para el cromatograma IV bidimensional en donde se aplico el problema, se observaron un total de 10 manchas, de estas se pudieron identificar 7 aminocidos, teniendo en cuenta que en un principio no se poda observar claramente por la confusin del corrimiento y en la forma en que se expresaron las manchas, sin embargo, ser rectificaron con calma las distancias respectivas y con esto y por ende en base a la comparacin de los Rf de los aminocidos tipo, llegamos a la conclusin de 7 aminocidos. Obtenindose los aminocidos: arginina, lisina, glicina, prolina, triptfano, acido glutmico, tirosina, fenilalanina, metionina, y tres aminocidos que no fueron identificados, pues no se contaba con muestras tipo de todos los aminocidos.

CONCLUSIONES Los aminocidos obtenidos e identificados a partir de la cromatografa en capa fina bidimensional de nuestra muestra problema (meln), fueron: arginina, lisina, glicina, prolina, triptfano, acido glutmico, tirosina, fenilalanina y metionina

La ventaja de la cromatografa bidimensional en capa fina es que nos da una mejor resolucin y separacin de los compuestos; hablando econmicamente, nos reduce costos al usar la misma placa para hacer dos cromatogramas.

Las ventajas de la cromatografa unidimensional en capa fina es que es fcil y se ocupa un menor tiempo para la determinacin; pero la desventaja es que la resolucin de esta es menor, adems que en las manchas puede haber una mezcla de componentes que no se lograron separar.

PREGUNTAS EXTRAS

1. Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema y compare con sus resultados y concluya.

cido asprtico, cido glutmico, alanina, arginina, cistena, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, lisina, prolina, serina, tirosina, treonina, triptfano, valina. Podemos observar que efectivamente gracias a la cromatografa bidimensional se pudo identificar la prolina, la lisina, histidina, el triptfano y la arginina como aminocidos constituyentes del jugo de toronja que fue la sustancia problema utilizada para la realizacin de la cromatografa. 2. -Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido.

3. Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique por qu. Si es posible intercambiar las fases, puesto que la separacin de las sustancias se dar en cuanto a su polaridad y no habra algn tipo de interferencia, siempre y cuando dejemos que la primera fase mvil se evapore para no causar problemas a la segunda fase mvil. Por eso no hay problema en usar primero una fase que otra. 4. Indique las posibles fuentes de error de esta tcnica. Tocar la placa cromatografca sin guantes, adicionar poca cantidad del aminocido tipo o del problema, que el fruto no se encuentre en una etapa de maduracin, ya que en dicha etapa estn presentes todos los aminocidos que puede tener, dejar mucho tiempo el saturado con el disolvente, mala preparacin de los disolventes, por capilaridad, contaminacin de reactivos, sustancias el problema a estudiar, una saturacin con respecto al volumen, el colocar los

cromatogramas en una mala posicin y se vean afectados por un mayor corrimiento impidiendo medir el Rf1 y Rf2. Marcar las lneas del cromatograma con pluma o algn color que interfiera en el corrimiento de las muestras, tocar la slica con las manos y provocar interferencias a la hora del revelado debido a los aminocidos presentes en el sudor y en la piel. La aspersin de la ninhidrina no cubra totalmente la placa y por lo tanto no se revelen alguna(s) de la separacin(es). BIBLIOGRAFA 1. Skoog, D.A. y col. (2001). Principios de Anlisis Instrumental. Quinta Edicin. Mac Graw Hill/Interamericana de Espaa, S.A.U. ISBN: 0-03-002078-6 2. http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/itp.htm 3. Esther Casanueva, Martha Kaufer, Ana Bertha Prez Nutriologa Medica. (2009) Sexta Edicin. Ed. Mdica Panamericana pag.824