1

1
Tema 1
ADN recombinante
Manipulacin in vitro de cidos nucleicos (ADN)
Enzimas que actan sobre cidos nucleicos: protenas purificadas extradas de bacterias. De manera
natural forman parte del ciclo celular normal.
- ADN polimerasas: sintetizan ADN
- Nucleasas: cortan o degradan
- Enzimas de modificacin de extremos: para conseguir residuos concretos
- Ligasas: unen fragmentos de ADN
Nucleasas
Enzimas que degradan ADN y/ o ARN rompiendo los enlaces fosfodister entre nucletidos. Se
clasifican segn su actividad:
- Exonucleasas: eliminan nucletidos de los extremos hacia el interior de la molcula. No ataca a
molculas circulares.
- Endonucleasas: cortan en medio de la molcula o cadena
Pueden ser especficas de ADN o ARN, de cadena simple (ss) o doble (ds)
Ejemplos:
Exonucleasa del fago : ADN ds 5 3
Exonucleasa III: ADN ds 3 5
Nucleasa Bal31: exonucleasa 3 5 especfica de ADN ds. Tambin es endonucleasa sobre
ARN ss
Nucleasa S1: endonucleasa de ss, tanto ADN como ARN. Tambin corta la segunda cadena
de molcula ds cuando hay una muesca
DNasa I: especfica de ADN. Corta preferentemente en pirimidinas (C y T). Uso en
produccin de muescas y mapeo de unin de protenas. Endonucleasa
RNasa A: especfica de ARN ss. Elimina ARN presente en preparaciones de ADN y la
cadena de ARN en un hbrido ADN: ARN
RNasa H: actividades endonucleasa, exo 5 3 y exo 3 5 sobre ARN presente en
hbridos hbrido ADN:ARN
Endonucleasas de restriccin o restrictivas
Catalizan el corte de molculas de ADNds en sitios especficos. Los fragmentos obtenidos son
especficos y se denominan fragmentos de restriccin.
Reconocen una secuencia corta bicatenaria: sitio o diana de restriccin
2
2
Forman parte de los sistemas de restriccin-modificacin (RM) bacterianos, no ataca al ADN
bacteriano porque est metilado. Defensa /proteccin frente a la entrada de ADN extrao.
Sistemas RM
Desempean, en la clula bacteriana, una funcin de proteccin gentica, dirigida a impedir el
establecimiento en su interior de material gentico exgeno que pudiera codificar productos capaces de
alterar la vida celular.
El sistema incorpora dos actividades enzimticas ambas con una misma especificidad de secuencia.
- Metilasa: metil-transferasa (M). la metilacin protege al ADN en sitios especficos
- Endonucleasa (R): cataliza la rotura de las dos hebras de ADN si no se encuentra metilada al
menos una de ellas.
El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por las dos
hebras
Hay tres tipos de sistemas RM:
9 Sistemas RM tipo I: tienen tres subunidades (metilasa, restrictasa y especificidad). Reconocen y
metilan una secuencia, pero el corte se produce fuera de la diana de reconocimiento y en secuencia
no especfica
9 Sistemas RM tipo III: tienen dos subunidades: metilacin /especificidad y restriccin. El corte se
produce fuera de la diana de reconocimiento.
9 Sistemas RM tipo II: Actividad restrictasa y metilasa en protenas distintas. Reconocen y actan
sobre la misma secuencia (diana de reconocimiento). Rotura en sitios especficos y definidos.
Tipos I y III Tipo II


Endonucleasas de restriccin tipo II
Son de una gran especificidad, actan sobre una diana concreta
Nomenclatura: EcoRI
- 3 primeras letras indican gnero y especie de donde se aisl
- 4 letra indica cepa
- Nmero romano indica orden de aislamiento
Dianas
- Secuencia ADNds: cataliza la hidrlisis simultnea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no
acta sobre estructuras monohebra.
- Entre 4-8 bp (pueden ser ms). Constituida por una secuencia especfica de algunos pares de bases.
- Generalmente palindrmicas
Punto de rotura simtrico respecto del eje de la diana, uno en cada hebra. Pueden producir
extremos:
- Romos: rotura en enlaces enfrentados
- Cohesivos (5 protuberantes o 3 protuberantes): rotura en enlaces no enfrentados
3
3
Romos Cohesivos
5 protuberantes 3 protuberantes
4
4
Isosquizmeros
Reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta, comparten el sitio de
restriccin.
Ambas enzimas reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta. SmaI
rompe por puntos enfrentados, por el enlace central de la diana, y XmaI rompe entre la primera y la
segunda C.
Endonucleasas de especificidad relajada. En alguna posicin de la diana no requiere base
especifica, sino que acepta ms de una. La relajacin de la especificidad aumenta la probabilidad de
aparicin de la diana, por tanto el tamao medio de los fragmentos obtenidos sern ms pequeos.
Anlisis y separacin de fragmentos de ADN mediante electroforesis
Migracin de molculas de ADN a travs de un soporte reticulado (matriz) dentro de un tampn por
accin de un campo elctrico. El comportamiento de una molcula viene definido por su movilidad
electrofortica, que depende de la carga, el tamao y la forma de la misma.
Matriz
Soporte reticulado a travs del cual se desplazan las molculas que se analizan. El entramado
tridimensional forma poros cuyas dimensiones deben permitir el paso de las molculas. Un entramado
denso produce poros pequeos y las molculas de tamao similar o mayor encuentran gran resistencia y se
retrasan .
Agarosa: polisacrido de estructura lineal, derivado de algas. Insoluble a temperatura ambiente, pero
soluble a 100 C. Cuando se enfra gelifica. Por sus poros pueden desplazarse molculas con dimensiones
medias (hasta 40-50 kb)
Poliacrilamida: polmero formado por acrilamida y N, N-metilbisacrilamida. La concentracin de
ambos reactivos define el grado de reticulacin del gel. Son estables qumica y mecnicamente en un
Enzimas que producen extremos compatibles
CCCGGG
GGGCCC
CCC
GGG
GGG
CCC
SmaI
C
GGGCC
CCGGG
C
XmaI
CYCGRG AvaI
CCSGG CauI
WGGCCW HaeI
GCNNNNGC BspCI
Y: pirimidina (C/T)
R: purina (A/G)
S: G/C
W: A/T
N: cualquiera
5
5
amplio rango de pH y temperatura. Polimeriza mediante agentes qumicos. Presenta mayor poder de
separacin al permitir una mayor densidad de reticulacin, una red ms tupida y unos poros menores. Se
suele aplicar al anlisis de fragmentos pequeos (5-500 pb), por ejemplo el aislamiento y purificacin de
pequeos fragmentos de ADN amplificados y de secuenciacin. Permite separar fragmentos de cidos
nucleicos que se diferencian en 1 nucletido.
Tampn
Ofrece una conductividad apropiada en el medio, mediante la aportacin de una concentracin
moderada de iones, y para mantener un valor constante de pH a lo largo de todo el proceso asegurando
una carga constante en las molculas que se estn separando. Mantienen la temperatura que aumenta por
el paso de la corriente y de la resistencia presentada por el medio y el soporte, y puede afectar al soporte
(matriz) y a la estructura de las molculas.
Varios tipos que puede afectar a la movilidad de las molculas.
ADN es cido, por tanto tiene carga negativa y migrar hacia el polo positivo. Se colocarn las
muestras siempre en el polo negativo.
Preparacin de muestra
Muestra disuelta en tampn de carga: compuesto de alta densidad
(glicerol o ficoll), para que la muestra no flote en el gel, ms uno o dos
colorantes, para separar tamaos de molculas. De color oscuro sern las
molculas pequeas y de color claro las grandes. El colorante permite
seguir la marcha del proceso.
Marcadores de tamao: patrn conocido de tamaos, se
obtienen comercialmente. Mezcla de fragmentos de tamao
conocido.
Visualizacin del gel: Tincin con bromuro de etidio que se intercala entre las bases, emite
fluorescencia (naranja intensa) con luz ultravioleta. Cuando las molculas de cido nucleico estn
saturadas de etidio la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de cido nucleico, lo que permite
disponer de un procedimiento alternativo para su cuantificacin.
Factores que influyen en la separacin
Tamao fragmentos: a mayor tamao, menor distancia recorrida
- Agarosa: 50 bp- 40 kb
- Poliacrilamida: 5-500 bp
Concentracin de agarosa/ poliacrilamida: grado de reticulacin del gel
Conformacin/ topologa de las molculas: importante en
plsmidos (molculas circulares)
- Forma circular: migran ms rpido sufren superenrollamiento
facilitando su movimiento a travs de la matriz. A mayor
superenrollamiento mayor ser su movilidad.
- Forma circular abierta: migran ms lento, no presentan
superenrollamiento.
- Forma lineal: intermedia, serpentean a travs de los poros y avanzan
segn su tamao.
FC
FL
FCA
6
6
ADN polimerasas
Enzimas que sintetizan ADN
ADN polimerasa dependiente de molde: requieren una hebra molde que dirija la seleccin del dNTP
que ha de ser incorporado. Necesitan un cebador o primer de oligonucletidos.
Actividades de las polimerasas
- Sntesis 5 3
Exonucleasa 3 _ 5 : corrige errores
Exonucleasa 5_ 3: degrada por delante si se encuentra una cadena y sintetiza por detrs.
9 ADN polimerasas utilizadas en investigacin
ADN polimerasa I E. Coli. Temperatura ptima 37C
5 3 sntesis
3 5 exonucleasa
5 3 exonucleasa
7
7
Posee las 3 actividades. Rellena huecos en un ADN ds que los contenga, es la base de participacin en
sistemas de reparacin in vivo. Degrada los extremos 5 fosforilados de un ADN ds o un hbrido ADN:
ARN.
Aplicaciones:
- Uso en marcaje de ADN: se hace una muesca en una hebra y se ceba con nucletidos marcados
radiactivamente.
Klenow polimerasa: fragmento grande de ADN polimerasa I de E coli
Carece de actividad 5 3 exonucleasa
Uso en marcaje de ADN y relleno de extremos.
Aplicaciones:
- Relleno de extremos de ADN ds con terminales 3 retrados formando terminales romos.
- Marcaje de extremos 5 protuberantes, solamente
Taq polimerasa
ADN polimerasa de Thermus aquaticus
Termoestable, temperatura ptima 72 C. Soporta hasta 95 C
Presenta:
- Actividad ADN polimerasa 5 _ 3 sobre un ADN ss cebado.
- Actividad exonucleasa 5 _ 3 dependiente de la actividad polimerizadora
Aplicaciones:
- Secuenciacin de ADN
- Amplificacin de regiones especficas de ADN mediante PCR
Retrotranscriptasa
Transcriptasa reversa, dependiente de ARN. Utiliza ARN como molde. Sntesis de ADNc (copiado)

Aplicaciones de las ADN polimerasas: PCR
Polymerase Chain Reaction o Reaccin en cadena de la polimerasa. Amplificacin directa y dirigida
de un fragmento de ADN ARN.
Tenemos que conocer la secuencia o parte de ella del fragmento a amplificar, estas regiones son
utilizadas como cebadores
Objetivos:
- Amplificar cantidad ADN disponible
- Detectar secuencia nica
- Obtener molculas de ADN bicatenario para obtener una secuencia concreta, se precisan dos
cebadores
La reaccin de amplificacin consiste en la repeticin de un ciclo integrado por tres etapas:
- Desnaturalizacin del ADN molde mediante la elevacin de la temperatura para conseguir la
unin de los cebadores.
- Hibridacin de cebadores: reduciendo la temperatura se induce su unin a las zonas
complementarias del ADN desnaturalizado. Tras la unin de cada cebador a su secuencia
complementaria, se forma una estructura monocatenaria cebada, sustrato de las polimerasas.
- Elongacin: llevando la disolucin a una temperatura adecuada y en presencia de un gran exceso
molar de los cuatro dNTPs, la polimerasa elonga el sustrato cebado.
5
5
3
3
5 3
5 3
8
8
Para realizar la PCR se necesita:
Molde de ADN que se quiere amplificar
Cebadores: oligonucletido monocatenario de secuencia idntica a una corta regin de
cada una de las dos hebras, localizadas en los extremos de la regin que se quiere
amplificar.
Polimerasa
Tampn con Mg
2+
, imprescindibles para el funcionamiento de la polimerasa
Ciclo 1

Se aumenta la temperatura Los cebadores reconocen los extremos Polimerizacin, temperatura
a 94C. temperatura ptima 50-60C. ptima 72C, la de la enzima.
Depende del porcentaje de G/ C. 1000 pb /m
Ciclo 2 Ciclo 3
Aumenta exponencialmente
20 ciclos 10
6
copias
Se consigue el fragmento exacto que se quiere
amplificar
Paso 1: Desnaturalizacin Paso 2: Hibridacin
Paso 3: Polimerizacin
9
9
El producto mayoritario es un fragmento de ADNds cuyos extremos corresponden a los terminales 5
de los cebadores y cuya longitud est definida por la posicin de stos en la secuencia del ADN original.
Durante la reaccin se producen otras molculas ms largas cuya concentracin en la mezcla no aumenta o
lo hace de forma lineal. nicamente la concentracin del segmento limitado por ambos cebadores crece de
manera exponencial, con lo que, tras varios ciclos de amplificacin, este producto es mayoritario.
La temperatura es el parmetro esencial a controlar, que ha de ser muy alta en la primera etapa para
asegurar la desnaturalizacin, se reduce en la segunda para permitir la unin a los cebadores y la ms
adecuada para el buen funcionamiento de la polimerasa sin que se afecte la integridad del molde cebado
en la ltima etapa.
10
10
11
11
Caractersticas de las polimerasas a emplear en PCR:
- Termoestable
-
Fidelidad:

Tasa de error Taq polimerasa 10

-4

Tasa de error Pfu polimerasa 10

-6
Limitaciones de la PCR:
- Tenemos que conocer la secuencia a amplificar o las regiones flanqueantes
- Lmite de tamao del fragmento a amplificar: unas 5-10 kb. Funciona mejor con 5 kb
Diseo de cebadores
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3
3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5
La longitud de los oligonucletidos cebadores suele ser del rango de 15-30 . cuanto mayor sea su
tamao, mayor es la probabilidad de que se asocien a secuencias no perfectamente complementarias y
conduzcan a la amplificacin de productos no especficos. Cuanto ms corto sea el cabador, ms perfecta
tiene que ser su complementaridad con el molde y ms especfica ser la amplificacin, aunque su unin
al molde es ms dbil y con menor rendimiento.
La composicin de bases de los cebadores es importante por el efecto que tiene sobre la estabilidad del
hbrido; lo ideal es que tengan un 50% de GC. Si el porcentaje es inferior interesa una mayor longitud,
para evitar una baja temperatura de fusin.
Deben evitarse secuencias con bases repetidas (ms de 3-4 seguidas) para dificultar uniones no
correctas.
Hay que reducir la posibilidad de formacin de estructuras bicatenarias no productivas :
- Intramoleculares: cebadores con estructura secundaria
- Intermoleculares: cebadores parcialmente complementarios entre s.
Desnaturalizamos
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3
3-CACGACTGGGCAACG-5
3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5
5-GATTTTGCAATCGGC-3
Polimerizacin
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3
3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3
3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5
Los cebadores han de estar presentes en la reaccin a una concentracin adecuada.
Para la amplificacin de secuencias especficas se utilizan cebadores especficos derivados de regiones
conocidas que flanquean a la secuencia blanco. Cuando la secuencia es desconocida se utilizan cebadores
arbitrarios. Los cebadores solapantes se emplean para reducir la presencia de productos de amplificacin
inespecficos; el resultado de una primera reaccin es utilizado como sustrato de una segunda con
cebadores ms cortos de secuencia idntica e incluida en la de los primeros.
12
12
Aplicaciones de la PCR
Obtencin de grandes cantidades de un fragmento determinado de ADN
Deteccin de una secuencia concreta de ADN en diferentes muestras y /o en muestras
contaminadas
Diagnstico de enfermedades: Deteccin de mutaciones, deleciones, inserciones y genes
concretos. Las deleciones o inserciones pueden deducirse de variaciones de tamao de los
productos amplificados.
Deteccin de patgenos:
- Anlisis de muestras microbiolgicas basado en la deteccin de secuencias especficas de
microorganismos utilizando cebadores especficos.
- Deteccin de infecciones basado en la amplificacin selectiva de ciertas secuencias.
Produccin de sondas
Reconstruccin y amplificacin de ADN a partir de muestras degradadas, para realizar estudios
evolutivos. Los fragmentos degradados sirven como cebadores para la PCR.
Amplificacin de secuencias largas a partir
de fragmentos de degradacin cortos.
La PCR es capaz de regenerar piezas del
ADN original de tamao mucho mayor.
Teniendo en cuenta que los fragmentos de la
muestra, resultado de la degradacin del ADN
original, solapan unos con otros, las etapas de
desnaturalizacin e hibridacin inducir la
formacin de hbridos con extremos 3 retrados
que podran ser elongados por la polimerasa
para generar fragmentos de mayor longitud.
Este mecanismo se repite varios ciclos y el
resultado es la recuperacin de largas molculas
de bicatenarias a partir de pequeos fragmentos
iniciales.
As se han conseguido preparar grandes
trozos de ADN de especies extinguidas, a partir
de muestras de fsiles, permiten un estudio de la
evolucin molecular.
Construccin de un ADN sinttico con cebadores
solapantes
ADN sinttico que incorpora las secuencias
de los 6 cebadores iniciales
Se puede construir un gen sinttico mediante
ciclos sucesivos de PCR a partir de oligonucletidos
sintticos y solapantes, que se van aadiendo
ordenadamente a la reaccin, actan como
cebadores.
Fragmento de ADN
13
13
Introduccin de modificaciones en las secuencias de ADN
En los extremos (promotores, dianas de corte,)

Cambios en los extremos de la molcula
Se introducen cebadores que incluyan en su extremo
5 la secuencia de una diana de restriccin ausente en la
regin que se quiere amplificar. Aunque esta regin no
hibride con el molde (como una pequea cola), la
presencia de bases no apareadas en el extremo 5 no
afecta a la capacidad de olignucletido para cebar la
polimerizacin, en los siguientes ciclos de PCR la
secuencia extra resulta incorporada y se crean
molculas de doble hebra que contienen las nuevas
secuencias dianas en sus extremos.
Para expresar el gen en otro organismo se colocan
promotores en el gen.
- Mutaciones en puntos interiores (mutagnesis
dirigida).
Se trabaja con 4 cebadores, 2 terminales y 2
internos. Los dos cebadores internos son dos
oligonucletidos sintticos, complementarios, que
contienen en su interior la alteracin (sustitucin,
delecin o insercin) que se desea incorporar. Su
hibridacin sobre la hebra molde no es perfecta, pero
la reaccin funciona.
En la primera amplificacin se utilizan uno de los
cebadores extremos y el interior de la hebra
complementaria, generndose un fragmento que nace
en un terminal de la regin y finaliza en la zona que
incluye mutacin. En una segunda, la PCR se lleva a
cabo sobre el molde cebado con el otro oligonucletido
interno (portador de la mutacin) y el procedente del 2
extremo del DNA blanco; se consigue un 2 fragmento
desde la zona central mutada hasta el segundo extremo
de la secuencia blanco. Se purifican los fragmentos
amplificados y se eliminan los cebadores y se mezclan
ambos productos que se unen por la secuencia central
mutada, presentan 3 retrado que puede ser elongado
por la polimerasa hasta completar el molde. Finalmente,
una tercera reaccin de PCR con los dos cebadores
terminales conduce a la amplificacin de la secuencia
portadora de la alteracin deseada,
14
14
- Modificacin de la secuencia: Deleciones

Amplificacin de de una parte de una secuencia del ADN
mediante la utilizacin de cebadores de la regin interna, no
terminales. Y de una manera ms amplia, en un conjunto de
reacciones de PCR cebadas por una serie de oligonucletidos
progresivamente desplazados (solapantes), se puede generar un
conjunto de mutantes de delecin perfectamente definidos.
Un cebador en una cadena y varios solapantes en la otra, tres
cebadores que hibridan en tres regiones diferentes
Obtencin ADN monocatenario - PCR asimtrica
Permite la produccin de grandes cantidades de una
determinada secuencia monocatenaria, para secuenciar.
Se utilizan 2 cebadores a distinta concentracin (difieren
en un factor de 100) la reaccin produce inicialmente
fragmentos de ADNds, pero llega un momento en que el
cebador limitante se agota; el segundo contina cebando la
sntesis de una de las hebras. El resultado es la amplificacin
de una secuencia de ADN ss en cantidad suficiente para el
anlisis de su secuencia. El producto no sirve de molde y no
se consigue tanto.
Amplificacin secuencias desconocidas - PCR inversa
En los siguientes ciclos se amplifica

15
15
Se realiza una digestin del ADN origen con una enzima de restriccin que no presente dianas en la
regin conocida, ligado (ligasa) intramolecular de los fragmentos producidos para que formen crculos. A
partir de ah se realiza PCR utilizando dos cebadores diseados a partir de la regin de secuencia conocida
y apuntando hacia las regiones adyacentes. La polimerasa acta sobre la molcula circular que contiene la
regin conocida y amplificar un fragmento lineal con origen y final en dicha zona y que incluye las
secuencias que la flanqueaban en el ADN original. La unin entre estas ltimas queda marcada por la
presencia de un sitio de restriccin para la enzima usada en la digestin.
Los dos fragmentos obtenidos se amplifican con PCR.
RT-PCR: amplificacin de secuencias de ARN por
retrotranscripcin y PCR.
Deteccin de molculas de ARN, clonaje de ADNc de un
mensajero, construccin de bibliotecas de ADNc, obtencin de
material para anlisis de secuencia.
Amplificamos usando como molde ARNm
Mtodo 1: Uso de oligo (dT), se une a la cola poli (A) de la
mayora de los mensajeros eucariotas, se consigue la amplificacin
de la secuencia completa de los ARNm que lleven la cola poli (A).
Se construye una cadena de ADN. Hbrido ARN : ADN
Amplificacin de todos los ARNm de una mezcla
Se aade ribonucleasa H que degrada ARN, dejndola actuar un
tiempo sin que destruya todo el ARN para as tener cebadores con
los que la polimerasa pueda sintetizar la cadena complementaria.
Mtodo 2: Uso de oligo especfico, permite la amplificacin de
un ARNm especfico entre una mezcla. No hbrida en cola poli (A),
sino ms adelante, no hace falta RT-PCR. Se construye un cebador
del ARNm la polimerasa elonga cadena de ADN, se consigue un
hbrido ARN-ADN que se desnaturaliza y en el 2 ciclo se tienen los
dos cebadores especficos para las dos cadenas. No se degrada el
ARN, no molesta, se amplifica el ADN bicatenario. La cantidad de
producto por PCR es proporcional a la cantidad de ARNm que hay.
Aplicaciones de las ADN polimerasas: Secuenciacin
Determinacin de la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN
Partimos de ADN1c (unicatenario). Dos mtodos. Obtencin de coleccin de fragmentos que
comparten un mismo extremo 5, pero difieren en su extremo 3
16
16
Mtodo de Maxam y Gilbert (rotura qumica del ADN)
Marcaje de la cadena a secuenciar. Se tienen muchas copias de las cadenas que se quieren secuenciar,
que se marcan radiactivamente en extremo 5. Se preparan cantidades en alcuotas y se someten a cuatro
tratamientos qumicos:
En cada muestra se elimina una determinada base, y luego se produce hidrlisis, la molcula se rompe
por el lugar donde se produce la modificacin. El marcaje radiactivo se observa en 5. Se realiza
electroforesis en gel de poliacrilamida, en calles distintas. Aparece la primera banda, fragmento ms
grande en G+A pero no en G por tanto el nucletido es A. Se sigue secuenciando.
Mtodo de Sanger
(amplificacin
enzimtica del ADN)
G
G + A
C + T
C
17
17
Sntesis enzimtica del ADN
Secuenciamos la cadena
complementaria
Uso de ddNTPs: paran la reaccin,
la polimerasa los reconoce y los coloca
en la cadena sin problemas y ya no
plimeriza ms.
Se marcan radiactivamente.
4 reacciones: mezcla de 4 dNTPs ms
una pequea cantidad de ddATP. Cada
vez que entra un ddATP la cadena se
para y como est marcada
radiactivamente se puede detectar.
Este mtodo es el ms utilizado y
ha permitido la automatizacin.
ojo! Est escrita al revs, se lee de 5
a 3
Automatizacin
Marcaje de cada ddNTP con un fluorforo distinto, dar colores distintos en un detector de
fluorescencia. Se hace una sola reaccin con los 4 ddNTPs, la cadena acaba en un color que representa
una base.
Se realiza una electroforesis capilar, que se coloca delante del detector de fluorescencia, se transfieren
los datos a un ordenador que dar un cromatograma.
Se mezcla el molde con el cebador, ddNTPs, y polimerasa. Se hacen varios ciclos de PCR y se
amplifica una sola cadena.
Enzimas de modificacin de extremos
Aaden o eliminan grupos de los extremos 5 3
18
18
Fosfatasa alcalina
Eliminacin del grupo fosfato 5 en ADN y ARN
Usos:
- Eliminacin de fosfatos en 5, para su sustitucin por fosfatos marcados con
32
P mediante
reaccin con quinasa.
- Eliminacin de restos fosfato de los terminales 5 de fragmentos de dsADN, para impedir su
dimerizacin, polimerizacin o circularizacin.
Polinucletido quinasa T4 (PNK)
Cataliza la transferencia de un fosfato del ATP a un extremo 5 de ADN y /o ARN
Se usan en:
- Eliminacin / adicin de fosfatos dependiendo de las necesidades de clonacin
- Sustitucin del fosfato 5 por grupo fosfato marcado (P
32
): Marcaje de ADN y/ o ARN
Transferasa terminal o desoxinucleotidil terminal
tranferasa
Cataliza la transferencia de dNTPs al extremo 3-OH de
molculas de ADN (ss ds). Similar a la polimerasa pero NO
COPIA MOLDE, aade nucletidos al azar. No se considera una
polimerasa.
Se utiliza en:
- La obtencin de homopolmeros en los extremos de una
cadena para generar extremos cohesivos de secuencia
conocida. Contando el tiempo de reaccin se puede conocer
los nucletidos aadidos.
- Marcaje de los extremos 3
Poli(A) polimerasa
Incorpora residuos de A a partir de ATP al extremo 3 de un
ARNss, creabdo una cola poli(A)
Se utiliza en:
- Marcaje de ARN y en adicin de colas poli(A) a mensajeros
como paso previo a la obtencin de ADNc
Ligasas
Enzimas que catalizan la unin entre dos extremos de ADN. Requiere energa en forma de ATP
NAD. Requiere Mg
2+
Papel in vivo: unin de muescas (replicacin /reparacin)
- Una molcula lineal se puede unir quedando circular
- Dos molculas lineales con extremos compatibles se unen formando una sola molcula
- Unin de muescas durante la replicacin /reparacin, une covalentemente dos nucletidos
Ligasa de T4
19
19
Cataliza la unin de extremos compatibles de dos molculas de ADN o de los extremos de una misma
molcula.
Ms difcil, las molculas deben chocar y Se forma un apareamiento no permanente,
encontrar la ligasa porque queda una muesca en cada cadena, la
ligasa la encuentra. Es ms fcil, ms eficiente
y ms rpida.
Requisitos:
Extremos compatibles
Extremo 5 a unir debe estar fosforilado por lo menos en una de las cadenas, solo es necesaria la
fosforilacin en una cadena
Si la molcula es grande se puede hacer circular y para evitarlo se alteran los extremos 5 conservando
los fosfatos en una de las molculas y eliminando los de la otra. Se desfosforila la molcula ms grande
para evitar que se circularice.
9 Extremos de los fragmentos a unir
- Extremos cohesivos generados con la misma enzima
Recuperamos la diana de corte.
- Extremos cohesivos generados con enzimas diferentes
No siempre recuperamos la diana de corte
- Extremos romos
No siempre recuperamos la diana de corte
9 Modificacin de extremos para generar extremos compatibles
- Conversin de extremos cohesivos en romos
Eliminacin de regin monocadena: exonucleasas especfica de cadena sencilla que
elimina nucletido a nucletido hasta llegar a la zona de cadena bicatenaria. No se
recupera la diana de corte.
Relleno de extremos: polimerasas + dNTPs. Sintetiza lo que falta. Slo si tenemos 5
protuberantes!. Se recupera la diana de corte.
- Conversin de extremos romos en cohesivos:
consiste en la construccin de una regin
homopolimrica en los extremos 3 de un ADNds
Homopolmeros terminales: Transferasa
terminal. Se forma una cola poli(G) y otra
poli( C )
Extremos romos
Extremos
cohesivos
20
20
Linkers: cortas secuencias ADNds de extremos romos con dianas para enzimas de
restriccin que producen extremos cohesivos. Se pueden sintetizar y tener grandes
cantidades. Una gran concentracin facilita la unin. Se requiere cortar con enzimas
de restriccin.

Adaptadores: Piezas cortas de ADNds con extremos cohesivos correspondientes a
dos enzimas diferentes. No requiere corte
Pueden fabricarse con dos oligonucletidos
Pueden fabricarse uniendo dos linkers y cortando despus
Modificacin de extremos para favorecer /evitar la ligacin
Fosforilacin de extremos 5
- Polinucletido quinasa
- Unin de linkers /adaptadores construidos con oligonucletidos sintticos
- Ligacin de productos de PCR
Desfosforilacin de extremos 5
- Fosfatasa alcalina
- Evitar autoligacin de los extremos de una misma molcula de ADN
Dos extremos cohesivos
GATCCGGCCG
GCCGGCTTAA
EcoRI
BamHI
Un extremo romo y otro cohesivo
GCCGGCTTAA
CGGCCG
CCGGATCCGG
GGCCTAGGCC
Linker
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
Linker
CCGGATCCGG
GGCCTAGGCC
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
GATCCGGCCG
GCCGGCTTA
A
EcoRI
BamHI
21
21
Clonacin de ADN recombinante
Clon: conjunto de clulas derivadas de una nica clula progenitora y, por lo tanto, poseedoras de
idntico contenido gentico. Clonar un ADN significa aislar y disponer de una clon de clulas portadoras
de una misma molcula de ADN recombinante.
Aplicaciones:
- Aislamiento y amplificacin de secuencias gnicas
- Estudio de regiones genmicas medias y grandes, y de genomas completos
- Produccin de protenas y otros compuestos
La secuencia que interesa clonar se corta
con la enzima de restriccin adecuada o se
amplifica con PCR. Luego se una a un vector
que es el que permite integrar el inserto en otro
organismo. El vector es el ADN recombinante.
Luego se cultivan las clulas y se obtienen
muchas copias del inserto.
Para recuperar el ADN recombinante se
rompen las clulas hospedadoras.
Las clulas hospedadoras ofrecen todos los
sistemas genticos y bioqumicos y actan como
un laboratorio especializado donde se lleva a
cabo el proceso diseado.
La clonacin implica:
Mantenimiento dentro de la clula
Transferencia a la descendencia
Amplificacin (aumento del n de copias), en cada clula puede haber cientos de copias del ADN
recombinante
Expresin del ADN clonado, que se pueda transcribir y traducir el gen clonado
Tres elementos clave en clonacin:
Inserto (ADN a clonar)
Vector
Clula hospedadora
Inserto o ADN pasajero
Puede ser un nico fragmento o una coleccin de secuencias, forman parte de las genotecas. Se
obtiene:
- Por digestin con endonucleasas de restriccin
- Digestin con endonucleasas de restriccin
- Producto de PCR
- ADNc, en eucariotas a partir de un mRNA
22
22
Clula hospedadora
Debe aceptar la molcula recombinante sin afectar su integridad, y permitir que se mantenga estable
en sus descendientes.
La clula ms utilizada es Escherichia coli, es un organismo modelo, se han realizado mucos estudios
y se conoce casi perfectamente; tiene fcil y rpido crecimiento, los medios de cultivo utilizados son
sencillos (Carbono, Nitrgeno y sales). Se divide cada 30-40 minutos. Existe una gran coleccin de
mutantes.
Nos interesan mutantes deficiente en restrictasas y recombinacin para que no destruyan el vectory
para evitar que el vector se integre en el cromosoma bacteriano y no pueda manipularlo.
Tambin se utilizan otras bacterias (gram-positivas y gram-negativas). A veces interesa expresar el
gen en el mismo organismo del que se extrae el inserto.
En eucariotas se utilizan levaduras, Saccharomyces cerevisiae, simple y unicelular, se divide cada 3
horas.
Plantas, clulas aisladas o plantas completas.
Lneas celulares animales (cultivos in vitro), tiles para trabajo con genes de organismos superiores y
terapia gnica.
Embriones animales, fuente para la obtencin de individuos transgnicos, de inters para el
conocimiento de la biologa de organismos superiores.
Mtodos de introduccin de ADN en las clulas
9 Transformacin
Captacin de ADN desde el medio extracelular
Tratamiento con compuestos qumicos para alterar la envuelta, provoca poros, se da choque trmico, la
temperatura aplicada depende del organismo receptor.
Las clulas tratadas qumicamente alterando su envuelta se denominan clulas competentes.
Si se introduce ADN procedente de virus (sin encapsidar) hablamos de transfeccin
9 Infeccin
Usamos un virus (partcula vrica) para introducir el ADN dentro de la clula, normalmente animales.
9 Electroporacin
Uso de descargas elctricas para alterar la envoltura
9 Transfeccin con ADN precipitado con fosfato de calcio
Forma clsica de introducir ADN en clulas eucariotas en cultivo, el ADN est unido al precipitado y
la clula lo endocita.
9 Lipofeccin
ADN en solucin se acompleja con vesculas formadas por lpidos catinicos (liposomas). Los
liposomas se fusionan con la membrana plasmtica.
Se usa en clulas animales en cultivo, protoplastos (clulas sin pared) de levaduras o clulas vegetales
9 Microinyeccin
Usamos un aguja /pipeta muy fina para inyectar el ADN directamente dentro del ncleo, normalmente
en ovocitos de anfibio y embriones
9 Biolstica
Bombardeamos las clulas con pequeos proyectiles de oro o tungsteno que tienen adherido el ADN.
Eficaz en clulas de pared o envoltura fuerte (clulas vegetales), para no destruir el tejido.
Vector
Molcula de ADN, generalmente de pequeo tamao, con caractersticas (y /o secuencia) conocida y
capacidad de replicacin autnoma. Generalmente basados en plsmidos bacterianos o genomas vricos.
Capaces de recibir al inserto y en el interior celular es capaz de hacer que el hospedador lo replique y de
que sus copias se repartan correctamente entre las clulas descendientes.
23
23
Se puede dividir en dos grandes grupos:
Vectores de clonacin /propagacin: solo mantienen y propagan el inserto de inters.
Vectores de expresin: poseen los elementos /seales necesarios para la transcripcin y
traduccin del inserto en la clula hospedadora. Estos elementos deben ser funcionales.
- Podemos clasificarlos segn:
Origen (procariota /eucariota)
Tipo de molcula (plsmido, virus, cromosoma artificial, etc)
Tamao del inserto que puede incorporar
Tipo de clula donde puede replicarse y /o expresarse
Tipo de marcador de seleccin
Caractersticas de un vector
- Origen de replicacin: debe tener un origen de replicacin (regin ori) que sea activo en la
clula hospedadora. Permite la replicacin dentro de la clula husped y el correcto reparto de
copias entre las clulas hijas o su propagacin por infeccin (caso de los virus). Define el
organismo /s utilizable /s como clula hospedadora.
- Marcador de seleccin. Permite distinguir/ seleccionar las clulas que contienen el vector. Los
ms utilizados son genes de resistencia a antibiticos. Confiere una cualidad especial a la clula.
- Sitios de clonacin mltiple (MCS o polylinkers). Cortas secuencias que contienen mltiples
dianas de restriccin de corte nico en el vector, donde se coloca el inserto.
- Marcadores de seleccin adicionales. Que permitan la deteccin/ seleccin de los recombinantes.
- Seales de transcripcin y /o traduccin. En el caso de vectores de expresin. Deben ser
funcionales en la clula hospedadora.
Tipos de vectores
- Derivados de plsmidos (bacterianos, de levaduras, de plantas)
- Derivados de virus (bacterianos, animales o de plantas)
- De origen mixto, compuestos por piezas de diferente origen. Con ms de un origen de
replicacin
- Cromosomas artificiales
Vectores para el clonaje en Escherichia coli
Vectores plasmdicos
Los plsmidos son estructuras adaptadas al entorno celular, disponen de las seales precisas para que
la maquinaria celular lleve a cabo su replicacin y particin y la expresin de sus genes. La posibilidad de
introducir en su molcula un fragmento de ADN extrao de manera que no se vean afectadas esas
funciones esenciales permite disponer de un vehculo de clonaje en bacterias.
Plsmido es una molcula circular de ADN bicatenario de pequeo tamao. En bacterias y algunos
eucariotas. Admiten insertos de unas 10-15 kb. Utilizan la maquinaria celular para replicarse.
- Replicn: regin donde se producen las interacciones con los elementos replicativos, y es
responsable del mantenimiento del plsmido en la clula hospedadora. Normalmente los plsmidos
presentan un nico replicn. El replicn incluye el origen de replicacin (ori) y los elementos de control
que actan en cis.
El tipo de replicn define:
Grupo de incompatibilidad: Plsmidos con replicones idnticos o relacionados son
incompatibles
N de copias del plsmido:
- Plsmido de replicacin estricta: 1-5 copias clula
- Plsmido de replicacin relajada: 15-20 copias clula
Rango de hospedador: especie /s donde puede replicarse
24
24
pBR322:
Tiene 4363 pb, le da buena capacidad de transporte,
ms de 10 pb.
Contiene genes de resistencia a ampicilina (amp
R
) y a
tetraciclina (tet
R
)
No tiene MCS
Contiene otras dianas de restriccin repartidas,
algunas dentro de los genes de resistencia. Esto
permite una inactivacin de la resistencia por
insercin de un fragmento de ADN en esa zona.
Unas 20 copias por clula.

Permite inactivacin por insercin, Si introducimos un inserto en una diana interna de uno de los genes
de resistencia, se pierde la resistencia correspondiente.
Si se inserta en el gen tet
R
las clulas obtenidas podrn ser tet
S
-amp
R
y tet
R
-amp
R
. Si se siembran en
cultivo con ampicilina crecern todas las clulas que hayan sido transformadas. Si se hacen crecer estas
colonias en un medio con tetraciclina solo crecern las tet
R
, y se pueden recuperar de la placa con
ampicilina. La incorporacin del inserto en el sitio BamHI del vector lineal inactiva la funcin de
resistencia a tetraciclina, pero si la ligasa los une y recirculariza el gen tet
R
se recompone y las clulas
transformadas sern resistentes.
25
25
Vectores serie pUC
El rendimiento conseguido en la transformacin de un cultivo bacteriano es inversamente proporcional
al tamao del ADN que se intenta introducir. Cuanto menor sea el vector mayor espacio queda para el
inserto. Por ello se eliminaron secuencias superfluas.
Eliminacin de secuencias superfluas: Menor tamao del vector (2,6-3,2 kb), Mayor tamao del
inserto (ms de 12 kb)
Poseen un MCS, permite elegir entre diferentes enzimas de restriccin y permite realizar clonacin
direccional. El clonaje direccional, donde el vector tiene MCS asimtrico, le permite recibir insertos con
diferentes tipos de extremos, incluso haciendo uso de dos dianas, se puede lograr la insercin del ADN
extrao en una orientacin nica y forzada al mismo tiempo que se evita la posible recircularizacin del
ADN vector.
9 Deteccin de recombinantes mediante color (identificacin cromognica)
Esta serie de vectores se ha dotado de un sistema gnico que permite distinguir clones transformados
por ADN recombinante de los que han sido transformados por vector recircularizado. Este sistema es el
Opern lac.
El opern lac de E. coli es el responsable del catabolismo del disacrido lactosa. Es una unidad
transcripcional compuesta por tres genes estructurales (lacZ, lacY y lacA).
LacZ codifica la enzima -galactosidasa, cataliza la hidrlisis de glucosa y galactosa de la molcula de
lactosa; tambin es capaz de hidrolizar anlogos como X-gal, compuesto incoloro pero su hidrlisis
conduce a un producto de color azul.
El sistema presenta una regulacin negativa inducible por su sustrato (lactosa o anlogos, como
IPTG). La regin reguladora del opern est compuesta por un promotor (P
lac
) para la unin de la ARN-
polimerasa, y un operador (O
lac
) secuencia que solapa con el promotor y a la que se une la protena
represora codificada en el gen lacI.
En ausencia de sustrato, la protena represora se une al operador e impide la accin de la ARN-
polimerasa; pero el sistema se induce por la presencia de un sustrato que se une a la protena represora
inactivndola y permitiendo la transcripcin del opern.
En una estirpe normal de E. coli, el anlogo IPTG induce la sntesis de -galactosidasa, por lo que
cuando crece en un medio con X-gal produce colonias azules.
lacZ (-galactosidasa)
Degrada lactosa en glucosa + galactosa
26
26
Hay estirpes mutantes incapaces de degradar lactosa porque el gen lacZ no se expresa o porque su
producto no manifiesta actividad -galactosidasa, estas estirpes producen colonias blancas cuando crecen
sobre X-gal. Una de estas mutaciones (M15) presenta una delecin en lacZ
En presencia de un pptido () procedente de la
expresin de los primeros codones del gen lacZ,
idntico a la regin N-terminal de la protena
completa, la protena defectuosa recupera su
actividad -galactosidasa. Ambos polipptidos se
unen para formar un complejo enzimticamente
activo.
El sistema incorporado a la serie pUC es un fragmento de ADN del cromosoma de E.coli que contiene
el comienzo del opern lac, las regiones reguladoras (promotor y operador) y el comienzo del gen lacZ (la
regin codificadora del pptido ). Inducido por IPTG se expresar pptido que lleva a cabo la
complementacin sobre -galactosidasa defectuosa. Cuando las cepas mutantes lacZM15 son
transformadas por un ADN que contenga este sistema, crecern en un medio con IPTG y X-gal formando
colonias azules.
Se expresa en C-terminal
-galactosidasa inactiva
Expresin fragmento N-terminal lacZ
Mutantes M15
Complementacin
-galactosidasa activa
Degradacin de X-gal:
color azul!
27
27
Complementa mutante M15
MCS est dentro de lacZ
Deteccin plsmido pUC
Resistencia a ampicilina
En medio con X-gal: Color azul!!!
Colonias azules: vector sin modificar
Colonias blancas: plsmido recombinante
Vectores basados en bacterifagos
9 Fago
ADN bicatenario de 49 kb. Infecta a E. coli
Dos tipos de ciclo:
- Ciclo ltico: replicacin del fago, lisis y
liberacin de partculas vricas
- Ciclo lisognico: el ADN se integra en el
cromosoma de la bacteria y permanece
dormido hasta induccin de ciclo ltico
En las calvas de lisis hay ADN que se purifica

Formas del ADN de :
- Forma lineal (dentro de la cpsida): en las regiones terminales presenta extremos 5 protuberantes,
formados por secuencias de 12 nucletidos, monocatenarias y complementarias entre s, son
cohesivos; son sitios cos
- Forma circular cerrada (forma integrativa) debido a la asociacin de los sitios cos.
Concatmeros lineales (tras replicacin; sustrato para empaquetar el ADN)
Se empaqueta cualquier fragmento de 37-52 kb de ADN flanqueado por secuencias cos.
Organizacin del genoma de : los genes que codifican funciones relacionadas se encuentran
agrupados y se transcriben simultneamente. Para el ciclo ltico completo solo es necesario la regin de
las protenas de la cpside y la regin de protenas de regulacin. La regin de integracin puede ser
sustituida por el ADN que se quiere clonar.
Calva de lisis
Regin no esencial
28
28
Vectores de insercin
Hemos eliminado parte de la regin no esencial. Los puntos
de corte generan dos fragmentos llamados brazos
Introducimos un sitio nico de corte. Puede realizar el ciclo
ltico. Tamao del inserto: unas 8 kb como mucho
Seleccin fagos recombinantes:
- Punto de corte en gen cI (gen represor de lisis). Si se
coloca el inserto en medio de cI siempre realizar el
ciclo ltico, calvas claras. Si ni se rompe cI se vern
calvas turbias, porque realiza el ciclo lisognico y
ltico. Recombinantes producen clavas ms claras.
- Fragmento lacZ con sitio de corte. En X-gal dar
calvas azules
Vectores de sustitucin
- Sustituimos toda la regin no esencial por un ADN
de relleno
- Cambiamos el ADN de relleno por nuestro inserto
- Podemos incluir sistemas de seleccin dentro del
ADN de relleno
- Tamao del inserto de hasta 22 kb
- No pueden producir lisogenia ni integrarse en el
genoma, pero tampoco nos interesa
Uso de la forma circular cerrada
Igual que si fuera un plsmido.
Transfeccin, una vez en la clula se
comporta como un virus.
Uso de la forma lineal
Se corta el ADN vrico y se coloca el inserto, se forman
concatmeros, se introducen las protenas de la cpside y la
purificada. Empaquetamiento in vitro. Se selecciona el tamao
para el empaquetamiento, ste se har cuando haya brazo
izquierdo-inserto-brazo derecho. Una vez empaquetado se infecta
la clula.
29
29
Csmidos
Vectores derivados del fago . Combina caractersticas de plsmido,
replicn mnimo para la replicacin de copias, y de fago las secuencias
cos para empaquetar. El empaquetado es necesario para introducirlo en
la bacteria, porque es un plsmido muy grande.
Plsmido que contiene sitios cos de . Necesarios para la
encapsidacin.
Empaquetamos in vitro con cpside de y producimos infeccin.
Dentro de la bacteria se comporta y replica como un plsmido
Ojo: Aislamos colonias, no calvas!!!!
Podemos clonar en ellos hasta 46-47 kb, pero para encapsidarlo no
puede tener ms de 37-52 kb
Seleccionamos en funcin de los marcadores
que tengamos en el plsmido
9 Vectores basados en M13
M13 es un fago filamentoso de E. coli. ADN monocatenario. Infecta a travs de los pili. El ADN es
lineal dentro de la cpside pero una vez dentro de la bacteria se hace bicatenario y circular, es la forma
infectiva, es la que sintetiza las protenas de la cpside, solo copias de una cadena, luego sale de la clula,
no provoca lisis, la clula ralentiza su crecimiento.
El tamao no es restrictivo en este fago: a mayor cantidad de ADN, mayor se hace la cpside. Insertos
de 8-10 kb pueden ser inestables.
Podemos aislar la forma replicativa y manipularla como si fuera un plsmido. No podemos eliminarle
genes, ya que todos son imprescindibles. Introducimos inserto en regin intergnica II-IV III-VIII.
La volvemos a introducir en la bacteria y prosigue el ciclo. El ADN que podemos obtener de la clula
es bicatenario, si lo conseguimos una vez que el fago ha salido el ADN ser monocatenario.


F-pilus
F
DNA
M13
30
30
Fagmidos
Plsmido que posee la regin del fago M13 que contiene el origen de replicacin. Ms eficiente en la
replicacin al ser un plsmido y admite insertos ms grandes
No puede empaquetar por si solo en el interior celular, necesita de un fago M13 ayudante.
Se infecta la bacteria con las dos partculas, pero se obtienen dos partculas diferentes, unas tendrn el
inserto y otras el ADN del ayudante. Se crea un ayudante mutante, que solo produzca protenas de la
cpside .
9 Cromosomas artificiales de bacterias BACs
Basados en el plsmido F de E. coli (contienen su origen de replicacin)
Permiten clonar unas 300 kb
9 Derivados del fago P1
Similar a
Podemos empaquetar en su cpside hasta 125 kb
9 Cromosomas artificiales derivados de P1
Combinan caractersticas de los BACs y P1
Hasta 300 kb
9 Fsmidos
Similares a los csmidos. Contienen el origen de replicacin de F
Menor n de copias que los csmidos. Ms estables
En todos estos caben ms kb para clonar y tienen un origen de replicacin especial.
31
31
Vectores plasmdicos para expresin de protenas en E. coli
Vectores de clonacin que poseen seales de transcripcin y traduccin funcionales en E. coli
Transcripcin
Regin promotora: promotor +
secuencias reguladoras (5)
Terminador
Traduccin
- RBS sitio de unin al ribosoma
- Secuencia Shine-Dalgarno (SD)
- ATG: sitio de inicio, codifica Met
- Secuencia de stop
32
32
Regiones promotoras en E.coli
- Fuerza del promotor (P): depende de la afinidad por la ARN polimerasa.
- Mecanismo de regulacin (operador, op): para controlar cuando y cuanto expresamos, es muy
importante.
- Dependiendo del promotor se tendr ms o menos expresin y esto depende de la afinidad por el
mecanismo de transcripcin.
- Promotores hbridos funcionan mejor que los originales

Regulado por represor lac y CRP

Regulado por represor trp. Ms fuerte
que P
lac

Permite regulacin por T

Slo se transcribe por la ARN pol de
T7
Mutante lac no sensible a CRP
Hbridos entre P
trc
y O
lac
. Fuerte
expresin regulado por represor lac
Terminadores en E.coli
No son imprescindibles, pero mejoran la expresin. Se usan terminadores de genes conocidos (rrnB
ARNr 5S de E.coli)
Transcritos muy largos pueden afectar a la replicacin del plsmido y disminuir la expresin
Gen rrnB ARNr 5S E. coli
t
L
y t
R
de los genes tempranos de
fago
RBS sitio de unin al ribosoma
Importante para la unin rpida y
eficiente del ribosoma
Secuencia S-D: varia entre 3 y 9 pb. No
muy conservada
No esta presente en genes eucariotas
33
33
9 Tipos de secuencias a expresar
- Regiones /genes procariotas que contienen sus seales nativas
o Regin promotora, terminador y RBS propios
o Clonamos toda la unidad transcripcional en un plsmido de clonacin tpico
- Regiones /genes procariotas que tienen regin promotora mala
El promotor es muy dbil, no tenemos buena regulacin o carece de promotor y /o
mecanismo de regulacin. El inserto contiene el RBS, la ORF y el codon de
STOP
Utilizamos un vector que posee las seales de transcripcin adecuadas y un MCS
Realizamos una fusin transcripcional entre las secuencias del vector y las del
inserto
- Regiones /genes que no poseen buen RBS o carecen de RBS
El vector contiene el RBS (secuencia SD + ATG)
Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con el ATG del vector
Fusin traduccional entre las secuencias del vector y las del inserto
Regulacin de la expresin
La mayora contienen el operador del opern lac : regulacin por represor de lac (lacI)
Ojo: Tenemos el plsmido en alto/ medio n de copias : represor limitante!. En una clula normal en
estado natural, hay pocas molculas de represor, stas solo regulan una o dos copias del opern.
Dos estrategias:

Estirpes de E. coli que sobreexpresan el represor lacI

q, de forma constitutiva.
El plsmido contiene el gen lacI bajo el control de promotor constitutivo. Si tenemos un vector
con el promotor, el operador y la protena X que queremos expresar, luego tiene resistencia a
ampicilina que se lee en una direccin y el represor lacI que se lee en direccin contraria,
reprimiendo a lacI la protena se expresa.
- Control de la expresin: IPTG, es un anlogo de lactosa que la bacteria no puede degradar.
El IPTG se une al represor, pero no se degrada, por lo tanto la cantidad de protena producida es
proporcional a la concentracin de IPTG aadida.
34
34
Vectores con seales de transcripcin
Los usamos para genes que poseen un buen RBS
El plsmido proporciona la regin promotora, seguida de un
MCS y un terminador
pKK177-3

Algunos vectores posee secuencia SD justo antes del MCS: podemos clonar solo la ORF
Vectores con sitio de clonaje inmediato a un ATG
Genes que no poseen buen RBS o carecen de l (genes eucariotas)
El ATG est codificado en el vector, y el sitio de clonacin solapa con el ATG
NcoI CCATGG NdeI CATATG
Fusin traduccional
pTRC99a
Expresamos la protena nativa
Podemos usar cualquier otro sitio de clonacin, pero entonces
la protena que se exprese tendr ms aminocidos en el N-
terminal
Cuidado con la fase de lectura!!!
35
35
- Ejemplo de fusin traduccional para expresin
Queremos expresar el gen eucariota Shv en E. Coli. La secuencia del ADNc es:
Tenemos el plsmido de expresin pORF, con tres variantes que difieren en la pauta de lectura del
sitio de corte EcoRI
En qu variante tendramos que clonar el ADNc digerido con EcoRI para que se expresara
correctamente Shv?
Pauta de lectura correcta!!
Codon de STOP antes de llegar al inicio de Shv
Pauta de lectura incorrecta: se sintetiza un pptido de secuencia diferente a Shv
36
36
Produccin de protenas de fusin
- Expresin in vivo de una protena hbrida obtenida por fusin traduccional de dos ORFs
- El vector proporciona las seales reguladoras y una ORF con un MCS
- Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con la ORF presente en el vector
- Podemos tener:
ORF del vector::ORF de inters. El gen se clona en el MCS y la protena resultante
estar en N-terminal la protena del vector y en C-terminal la protena clonada.
(P-ORFvector-MCS)
ORF de inters::ORF del vector. La N-terminal estar la protena clonada y en C-
terminal la protena del vector (P-MCS-ORFvector)
Ventajas o inters del uso de protenas de fusin
Muchas protenas eucariotas son ms estables si las expresamos fusionadas a una protena de E. coli, si
no son estables las protenas degeneran o se acumulan en bloques de inclusin y no se pueden rescatar,
pero fusionadas con protenas de E.coli se vuelve estable.
La protena resultante conserva las actividades de ambas protenas: deteccin fenotpica
Facilita la purificacin de la protena de inters: cromatografa de afinidad o secrecin al medio
extracelular
Fciles de detectar e identificar en una mezcla: gran tamao y existencia de anticuerpos contra la
protena del vector.
Fusin traduccional: ojo con la pauta lectura!!
Existe una seal de proteolisis especfica en la secuencia frontera entre las dos protenas, hay proteasas
que reconocen una secuencia concreta y separan las protenas.
37
37
Purificacin protenas de fusin
Cromatografa de afinidad
Exclusin por tamao.
Esquema general de preparacin de
protenas nativas mediante la
expresin de un producto de fusin, su
purificacin por retencin por afinidad
y su rotura endoproteoltica.
Ejemplos de protenas de fusin para purificacin
Sistema del apndice /cola de histidina
Incluye un conjunto de vectores:
Derivados de Pbr322: con ori ColE1 y gen de Ap
R
Promotor fuerte que reconoce la ARN-polimerasa de E.coli
Operador lac duplicado, para asegurar una represin eficaz
RBS bacteriano
Codones de stop en los tres marcos de lectura
Dos fuertes terminadores de la transcripcin
Un MCS colocado en todos los marcos de lectura entre los distintos vectores
Secuencia codificadora de 6 residuos de histidina para la sntesis del apndice
(tag)
La protena expresada llevar un apndice de 6 histidinas en los extremos N o C-terminal. Para N-
terminal, secuencia de un vector tpico; para C-terminal, se modifica la pauta de lectura, donde codifica
prolina, para que codifique histidina.
Fusionamos nuestra protena a una secuencia de 6 histidinas,
La histidina tiene afinidad por el nquel. Purificamos con resina cargada con Ni
2+
Elumos con tampn que contenga imidazol, ste es un anlogo de la estructura de histidina
No suele afectar a la actividad de la protena y muchas veces no se elimina
38
38
Sistema de la GST
GST es la enzima glutatin S-transferasa. La
regin N-terminal de la protena de fusin
corresponde a la GST, capaz de ser retenida en
columnas de glutation-Sepharosa y eluida con
glutation reducido.
Purificamos con resina que contiene glutatin.
Elumos con glutatin reducido.
Los vectores de la serie pGEX contienen el
promotor P
tac
, la regin codificadora de la GST
con su RBS interno, la secuencia que codifica la
seal de endopeptidasa y un pollinker.
Sistema de la MBP
MBP es la protena de unin a maltosa.
La protena de fusin lleva en su mitad N-terminal la MBP;
es retenida en columnas de agarosa-amilosa y eluida con
maltosa. Purificamos con agarosa-amilosa. Elumos con maltosa.
Los vectores pMAL llevan el promotor P
tac
, el RBS y la
secuencia codificadora del gen malE que codifica a la MBP, una
regin espaciadora que codifica 10 residuos de asparagina (para
aislar conformacionalmente las dos mitades de la protena de
fusin), una secuencia que codifica una seal de reconocimiento
para una endopeptidasa y un polylinker que interrumpe el gen
lacZ (lo que permite detectar recombinantes sobre X-gal)
39
39
Algunos problemas /limitaciones de la expresin de protenas en E. coli
- Toxicidad de la protena:
Podemos trabajar con un plsmido de menor nmero de copias o integrar el gen en el
cromosoma
- Efecto del uso de codones
La frecuencia de uso de codones sinnimos es diferente en cada especie
La cantidad de ARNt para codones de baja frecuencia es limitante. Se han construidos
estirpes de E. coli con ARNt raros y son capaces de expresar protenas con codones que
normalmente no expresan.
Si aparecen codones raros baja la velocidad de la traduccin y empiezan a aparecer
fallos
- Plegamiento incorrecto de la protena:
E. coli no posee todas las chaperonas necesarias.
Si la protena no se pliega bien se forman agregados insolubles: cuerpos de inclusin,
no se pueden purificar.
Podemos disminuir la velocidad de crecimiento o inducir la sntesis de chaperonas. Al
disminuir la velocidad de crecimiento la sntesis de protenas es ms lenta y se van
plegando a medida que se van sintetizando. Hay mutantes que expresan chaperonas.
- Modificacin post-traduccional.
Algunas protenas requieren ser modificadas tras la traduccin para ser activas.
Podemos introducir los genes de las enzimas modificadoras en E. coli o bien expresar la
protena en el tipo celular adecuado
40
Vectores para clonaje en bacterias diferentes de E. coli
Bacterias de inters: Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces (antibiticos), etc
Utilidades: hay que modificarlas
- Degradacin de compuestos
- Descontaminacin de suelos
- Produccin industrial de enzimas y /o antibiticos
Dificultades:
- Poca eficiencia en la introduccin de ADN
- Falta de mutantes que carezcan de sistemas de restriccin
- Limitaciones en el n de vectores replicativos y marcadores de seleccin. El origen de
replicacin define la bacteria en al que se puede clonar el vector; no hay ningn origen de
replicacin funcional, los marcadores existentes no se expresan.
Dos opciones:
- Plsmidos de amplio espectro, capaces de replicarse en cualquier bacteria
- Vectores derivados de plsmidos naturales especficos
Ejemplo de plsmido de amplio espectro: RSF1010
- dos genes de resistencia a antibiticos, Su
R
(sulfonamida) y Sm
R
(estreptomicina)
- dos orgenes de replicacin:
oriV, vegetativo
oriT o nic: dirige la transferencia del plsmido por conjugacin
- tres genes que codifican protenas de replicacin: repA, repB y repC
- genes para la movilizacin: mob
- sitios nicos para endonucleasas de restriccin
Este plsmido se puede construir y mantener en E.coli, y por conjugacin transferirlo a otras
bacterias.
9 Pseudomonas
Estas bacterias son capaces de metabolizar compuestos orgnicos y llevar a cabo reacciones de
destoxificacin con metales pesados, por ello es de gran inters por su aplicacin en biodegradacin y
biorremediacin.
Se utilizan vectores derivados del plsmido natural pVS1 de amplio espectro
Resistente a la mayora de antibiticos: se usan genes de resistencia a Hg y a Amp (carbenicilina)
9 Bacillus
Muy fcil de transformar: competente natural, como respuesta a una limitacin de nutrientes. Las
molculas de ADNds son absosrbidas por la superficie de la clula competente, capta fcilmente el
ADN.
Vectores derivados de plsmido natural o del fago 105, muy similar al fago . Tiene seales de
transcripcin /traduccin especficas propias: factor sigma, SD y codones de inicio diferentes (UUG,
GUG y CUG). Para expresar las protenas hay que usar los sistemas de la bacteria.
Vectores para clonaje en levaduras
9 Saccharomyces cerevisiae
Levadura unicelular no patgena que se reproduce por gemacin y crece en medios simples. Se
considera organismo modelo para otros eucariotas, de rpido y fcil crecimiento en laboratorio, existen
mutantes disponibles. Tiempo de generacin 3 horas, temperatura ptima 30C. Son fcilmente
transformables. Permite expresar protenas que necesitan modificacin pos-traduccional.
Como marcadores de seleccin son poco usados los genes de resistencia a antibiticos se utilizan:
- Neo
R
resistencia a G418, aminoglucsido capaz de impedir el crecimiento de las clulas
eucariotas por inhibicin de la sntesis de protenas
41
- Marcadores nutricionales: complementacin de auxotrofas. Existe un gran conjunto
de cepas auxtrofas, mutantes en rutas biosintticas de aminocidos, genes implicados en
sntesis de aminocidos (histidina, leucina, triptfano...) o de nucletidos (UMP), y de los genes
de levadura que los complementan (HIS3, LEU2, TRP1, URA3...), aislados y purificados, lo que
permite utilizar estos genes como marcadores de seleccin sobre las cepas auxtrofas
correspondientes.
El gen LEU2, sintetiza leucina. El mutante
leu2
-
necesita medio con leucina para no
morir, si se introduce un plsmido con el
gen LEU2, la clula ya no necesita leucina
en el medio, puesto que la sintetiza el
plsmido.
Para seleccionar a la transformacin, se
cultivan en un medio sin leucina, las clulas
transformadas sobreviven.
Vectores plasmdicos para levaduras
9 Plsmidos integrativos (YIPs)
Bsicamente son plsmidos bacterianos con un gen de levaduras
(LEU2). Se integran por recombinacin homloga, ya que no
pueden replicarse en levaduras.
Si la copia del cromosoma est mutada, podemos utilizar el gen
de levaduras como marcador de seleccin de los recombinantes.
El plsmido no se replica porque no tiene origen de replicacin
para levadura.
Necesitan leucina
Las clulas que llevan
el plsmido sobreviven
en medio sin leucina
Gen de levaduras
pBR322
Recuperamos gen URA3 funcional!!!
42
9 Plsmidos replicativos (YRPs)
Poseen una secuencia ARS (secuencia de replicacin autnoma)
Son inestables: no segregan correctamente al dividirse la clula,
se distribuyen mal y tienden a quedarse asociados a la clula
madre. Se pierden al cabo de varias divisiones.
Presenta un nmero moderado de copias, son tiles para ensayos
de complementacin y se recuperan fcilmente, excepto si se ha
integrado en el cromosoma.
9 Minicromosomas o plsmidos ARS/CEN
La inestabilidad de los vectores YRP se corrige incorporando
la regin centromrica de algn cromosoma, CEN (especfica
para cada especie de levadura). Estos nuevos vectores, YCp,
muestran una segregacin equitativa en la divisin celular, se
comporta de forma anloga a un minicromosoma.
De menor nmero de copias. La recuperacin de la secuencia
clonada es difcil por la poca concentracin en la que se
encuentra.
Siguen siendo inestables: se pierden!!!
9 Plsmidos derivados del plsmido de 2m
Plsmido natural de S. cerevisiae. 50-100 copias por clula
haploide, representa 2-4 % del ADN celular total. Sin funcin
conocida.
Secuencias clave para la replicacin: ori y REP1/REP2
Se comporta como un minicromosoma circular.
Funciona como un plsmido bacteriano.
Se ha utilizado para construir plsmidos lanzadera.
Plsmidos lanzadera E. coli-S.cerevisiae
Origenes de replicacin de pBR322 (E. coli) y 2m
(S. cerevisiae), permite la seleccin de transformantes
de ambos tipos celulares. Se alcanza una frecuencia de
transformacin muy alta, se mantiene en forma de
plsmido multicopia. Fcil recuperacin.
Tiene marcadores de seleccin, Ap
R
para E.coli y y un
gen de levadura con alguna auxotrofa.
Se realiza la construccin /seleccin de colonias Ap
R
del ADN recombinante en E. coli y luego se introduce
en levadura. Hay que trabajar con mutantes
delecionados, que el gen no se encuentre en el
cromosoma para que el plsmido no se integre, as se
obtienen mayor nmero de copias.
Si tenemos copia del marcador en el cromosoma
podemos tener integracin (como los YIPs)
43
Cromosomas artificiales de levaduras
9 YACs
Contiene centrmero y telmeros, mantienen la estabilidad del cromosoma.
Lo construimos /mantenemos en forma de plsmido de 10-12 kb. Se puede mantener en E.coli y
levaduras.
Para el clonaje, se preparan los brazos del vector a partir de un vector lanzadera mantenido como
plsmido en E.coli.
Tiene ADN de relleno, secuencias centromricas, marcadores de seleccin y origen de replicacin.
Los cromosomas de levaduras tienen entre 250-1700 kb
Los YACs nos permiten clonar fragmentos de 600-1400 kb
Clonacin en un YAC
Podemos incorporar un gen marcador en la secuencia que sustituimos para comprobar que la
clonacin se ha hecho bien.
Se corta el ADN circular de forma que queden los dos brazos, cada brazo lleva un marcador de
seleccin y, en su extremo, un telmero. El inserto se une a los dos brazos quedando un ADN lineal.
Se ponen marcadores de seleccin, el gen Trp y el gen URA3.
44
Vectores para expresin en levaduras
Los promotores son diferentes de los de bacterias
Necesitamos activadores transcripcionales y regiones reconocidas por ellos
Esquema de la regin promotora de un gen tpico
de levadura.
- La caja TATA: inicio de la transcripcin, donde se une la polimerasa
- Regin iniciadora o de inicio de la transcripcin
- Secuencias activadoras y represoras anteriores: UAS y URS
- Secuencias activadoras y represoras posteriores: DAS
Promotores ms usados:
- ADH1 alcohol deshidrogenasa: inducible por glucosa, expresin constitutiva
- Promotores genes GAL: promotor fuerte, inducibles por galactosa
Vectores para clonaje/ expresin en plantas
9 Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
A.tumefaciens infecta a travs de heridas
produciendo tumores. Es capaz de transferir ADN
desde su citoplasma al interior de clulas de
plantas, de forma natural. Solo infecta algunas
dicotiledneas.
Plsmido Ti de unas 200 kb, es el agente inductor del proceso. Es un ADNds circular, grande que
codifica lsa funciones de virulencia y tumoracin. Posee numerosos genes implicados en la infeccin,
en el crecimiento del tumor y en determinar la especificidad del husped.
ADN-T: fragmento de 15-30 kb que se integra en el genoma de la planta de forma estable. La
integracin ocurre de forma aleatoria, si se integra en medio de un gen lo inactiva. Tiene oncogenes.
45
Introduccin de genes en plantas utilizando el plsmido Ti
Sistema binario de transferencia: uso de dos vectores
Transferimos el ADN-T de un miniT utilizando un plsmido Ti accesorio sin ADN-T. Ambos se
introducen en A.tumefaciens, las protenas codificadas en el grande permiten que se integre el ADN
del miniT.
Sistema de cointegracin
Introducimos por recombinacin homloga un plsmido
de E. coli en el plsmido Ti.
El plsmido recombinante resultante transfiere la regin
ADN-T que incluye ahora el plsmido de E. coli
9 Vectores lanzadera E. coli-plantas basados en Ti
El ADN-T solo precisa de dos repeticiones de 24 pb en los extremos para transferirse al genoma de
la planta.
En el vector de E.coli se clona el inserto, se necesita un plsmido accesorio. En le genoma de la
planta se integran las secuencias que hay entre los extremos.
Solo se modifican las clulas afectadas.
Si infectamos protoplastos, podemos regenerar plantas completas que posean el ADN transferido en
todas sus clulas.
MiniT
Plsmido Ti
accesorio
46
9 Plsmido Ri de Agrobacterium rhizogenes
Similar al psmido Ti
A. rhizogenes induce aumento del nmero de races adventicias, solo en algunas dicotiledneas
distintas de las que infecta A.tumefaciens.
Problemas con Ti y Ri
Agrobacterium slo infecta a dicotiledneas
Transferencia directa de genes
Empleamos un plsmido de E. coli (pBR322)
Incubamos protoplastos con el plsmido y polietilenglicol
Plsmido se adhiere a la membrana de la clula y se induce la
endocitosis. Poco eficiente.
Integracin al azar por recombinacin no homloga
Marcadores de seleccin en plantas
- Neo /apt: Resistencia a kanamicina, G418 o neomicina
- Dihidrofolato-reductasa: Resistencia a metotrexato
- hyg : Resistencia a higromicina
Vectores vricos para plantas
La mayora de virus de plantas son de tipo ARN. Difcil manejo/ manipulacin. Son muy
especficos.
Vectores de ADN:
9 Caulimovirus
- Tiene restriccin de tamao para empaquetar, como lambda
- Podemos generar vectores tipo fagmido
- Problema: infecta a muy pocas especies
9 Geminivirus
- Infecta a monocotiledneas
- Problema: su ADN sufre deleciones y reorganizaciones durante la infeccin
Vectores para clonacin en clulas animales
Se utilizan lneas celulares en cultivo.
Mtodos de transferencia de ADN: transfeccin
- Precipitacin con fosfato clcico
- Liposomas
- Microinyeccin
- Electroporacin
Marcadores de seleccin
- Resistencia a antibiticos: no suelen usarse, pero se utiliza el gen neo modificado de E. coli,
confiere resistencia a G418, anlogo de kanamicina
- Rutas metablicas biosintticas de precursores de ADN:
Rutas de novo: parten de compuestos simples (glicocola, aspartato) para construir las
molculas de los desoxinucletidos pricos y pirimidnicos
Rutas de recuperacin: utilizan el conjunto de bases nitrogenadas y el de mononucletidos,
alimentado por procesos degradativos de cidos nucleicos, para la construccin de la
estructura nucleotdica.
47
TK timidina quinasa: es uno de los marcadores ms utilizado. El gen codifica una enzima (timidina
kinasa) con actividad implicada en una de las rutas de biosntesis de desoxinucletidos. La timidina se
convierte en dTTP en una reaccin catalizada por la timidina kinasa.
Se han podido aislar mutantes defectivos en actividades de las rutas de recuperacin:
- APRT
-
: defectivas en adenina-fosforribosil-transferasa, enzima que convierte la adenina en AMP)
- HGPRT
-
: defectivas en hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa, enzima que transforma la
hipoxantina en IMP y la guanina en GMP
- TK
-
: defectivas en timidina-kinasa
Xantina-guanina fosforribosil-transferasa (XGPRT): esta enzima de E.coli es anloga de la enzima
hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa de mamferos. Sintetiza GMP a partir de xantina. Utiliza
como sustratos hipoxantina, guanina y xantina. Un fragmento de ADN que exprese la actividad XGPRT es
capaz de convertir clulas de mamfero HGPRT
-
en HGPRT
+
y permitirlas crecer en un medio HAT
(hipoxantina, aminopterina, timidina).
Seales de transcripcin /traduccin
Esta seal la proporciona el vector para
permitir incorporar la cola poliA al ARNm
El tipo de promotor determina el nivel de expresin y en que tipo de clulas se expresa
48
Esquema de unidad transcripcional
- Regin promotora: necesita la unin de protenas activadoras, factores generales de transcripcin.
Cada promotor dice donde y cuando se va a expresar el gen. La mayora tienen secuencias de
reconocimiento:
La caja TATA, para la correcta ubicacin de la ARNpolimerasa II
Elementos anteriores (upstream promoter elements): antes de la caja TATA y son
responsables de la velocidad del proceso de iniciacin de la transcripcin
- Seales de terminacin y poliadenilacin: el transcrito primario (pre-mRNA) es modificado en su
estrmo 3, y una rotura por un punto intermedio y la sntesis de una cola poliA en 3 creado tras la
rotura
- seales del procesamiento interno del transcrito primario: los genes eucariotas estn interrumpidos
por intrones, que son transcritas y luego eliminadas segn un mecanismo de unin (splicing) de
exones.
- Seales para la traduccin del mRNA: los mensajeros eucariotas son minocistrnicos. Tras la fase
de maduracin son transportados al citoplasma para su traduccin por el ribosoma. ste entra en
contacto con el mRNA por 5 que acta como sitio de unin al ribosoma. La lectura de tripletes
procede desde el primer AUG hasta el codn stop. Este mecanismo no hace necesaria la inclusin
de seales para la traduccin en el vector.
- Casetes de expresin para clulas eucariotas: incorporan seales de iniciacin de la transcripcin
(promotor y potenciadores), un sitio de clonaje para el pasajero que se quiere expresar, un intrn y
la seal de poliadenilacin.
Vectores vricos para clonacin en clulas animales
La mayora de los vectores son bastante especficos en cuanto al tipo celular (clulas permisivas). Se
puede trabajar con plsmidos y todas sus seales pero, la clula animal tarda mucho en dividirse, aunque
la protena en cuestin se expresa, el plsmido se pierde al dividirse la clula. En clulas animales no se
habla de transformar sino de transfectar.
Vectores derivados de SV40.
SV40 es un virus del grupo del papiloma, produce infeccin ltica en clulas de mono. Virus que infecta
a primates.
Genoma de 5243 pb, circular, muy bien aprovechado. Se emplean en cultivos de clulas de rin de
mono verde africano. Slo empaqueta 5300 bp, se usa para secuencias pequeas.
Se pueden obtener 2 tipos de vectores, dependiendo de las funciones del virus que retienen:
Vectores transductores o de reemplazamiento:
Realizan el ciclo vrico completo: replican y empaquetan el genoma. Tiene poca capacidad de
transporte, que se resuelve con el empleo de dos derivados defectivos del virus que no son capaces de
replicar por s mismos, pero si lo hacen en una infeccin conjunta.
Mantenemos el origen de replicacin, las secuencias necesarias para empaquetar el genoma y un tamao
entre 3,9-5,3 kb. Eliminamos genes de replicacin o de encapsidacin, reemplazamos por inserto.
Necesitamos un virus ayudante para replicar/ empaquetar.
Un vector de reemplazamiento de los genes tardos, no tiene capacidad de encapsidar pero si de replicar,
la clula infectada puede lisar pero no se consiguen partculas vricas. Un vector ayudante defectivo en
genes tempranos, no puede replicar pero si encapsidar. Una transfeccin conjunta agrupa en la clula
todos los genes que dirigen el ciclo completo (complementacin).
49
Se puede utilizar como virus ayudante a un mutante
que codifica una protena T termosensible. Tras la
infeccin mixta el cultivo crece a temperatura
restrictiva:
- las clulas transfectadas por el ADN mutante no
producen copias, no se produce la lisis.
- solo las clulas transfectadas por ambos ADN
propagarn la infeccin.
- Las clulas que tienen el ADN recombinante no
encapsidan
Podemos usar clulas COS
Hay vectores de reemplazamiento de la regin temprana, han sido sustituidos por el ADN pasajero. Este
ADN no se puede replicar porque carece de la protena T necesaria para el proceso, pero hay clulas
capaces de aportar esta protena, son clulas COS. Tienen en el cromosoma insertado un SV40 defectivo,
pero que produce la protena T necesaria para la replicacin.
Podemos empaquetar los vectores de reemplazamiento de genes de replicacin y tener slo virus
recombinantes.
Vectores no infectivos o plasmdicos
Sin capacidad infectiva pero con capacidad para
transportar pasajeros sin lmite de tamao. son
pocos los tipos celulares que pueden ser
infectados por el virus (clulas permisivas) pero
son muchas las clulas que pueden ser
transfectadas eficazmente por su ADN y en las
que se alcanza gran nivel de expresin a partir de
las seales virales.
Constan de:
- Slo contienen el origen de replicacin de
SV40
- Promotor de amplio espectro
- Seal de poliadenilacin
- Intrn de la protena T de SV40
- Un MCS
- Marcador de seleccin
Pueden replicarse en clulas de mono, pero no empaquetarse.
Si tenemos marcador de seleccin los mantenemos como si fueran plsmidos (10-100 copias)
Con frecuencia de 10
-3
-10
-5
tenemos integracin en el genoma. Se pueden construir vectores lanzadera.
Vectores derivados de BPV: virus del papiloma bovino
Papilomavirus: produce verrugas. Especie especfico, solo infecta a vacas pero es capaz de producir una
morfologa transformada en clulas de roedor in vitro, pero no de propagarse en cultivo de tejidos. En
estos sistemas celulares, el virus no produce viriones, su ADN replica dentro de la clula como un
episoma pero no se propaga. Slo se obtienen virus maduros de las clulas epidrmicas de las verrugas.
50
Puede replicarse en otras clulas bovinas y de roedores (en cultivo):
- No se integra en el genoma
- 10-100 copias por clula
- no necesita marcadores de seleccin
- Se transmite a la descendencia
- Tiene la capacidad de transformar las clulas de un cultivo en tumorales.
- Los transformantes crecen en foco o colonia
Podemos construir vectores lanzadera E. coli-BPV que usamos como si fueran plsmidos.
Retrovirus
Poseen un genoma RNA, su ruta replicativa pasa por una
fase en la que su informacin gentica aparece en forma de
ADNds. Necesita obtener un ADNc para replicarse,
insertarse en el genoma y expresar protenas. Slo infectan
clulas en divisin. No provocan lisis celular, sino que
funcionan como M13
Su genoma posee secuencias importantes para:
- Retrotranscripcin: R, U3,U5, P y Pu
- Procesamiento de intrones: S
- Encapsidacin:
- Integracin en el genoma: LTR (repeticiones
terminales largas). Provoca la expresin excesiva de
lo que va detrs.

Muchos retrovirus son oncognicos. 2 mecanismos:
Incorporacin al genoma de oncogenes: el virus transporta un gen implicado en regulacin del
ciclo celular, pero mutado
Alteracin de la regulacin de los genes adyacentes: las secuencias de LTR tienen promotores
muy activos que transcriben hacia afuera
Uso de vectores derivados de retrovirus
Dejamos las secuencias LTR, necesarias para su integracin en el genoma, y las , dirige el proceso de
ensamblaje del virin, y sustituimos el resto por el inserto y el gen marcador.
Los genes virales, gag, pol, env, son dispensables ya que las funciones que codifican pueden ser
aportadas por otro provitus. As se han construido vectores de reemplazamiento.
Se insertan en el genoma y se quedan estables en cultivo, en forma de provirus.
Si le damos las protenas del virus, podemos producir partculas vricas infectivas.
51
La construccin del recombinante se suele hacer
en E.coli y con vectores bacterianos, mediante la
unin de las secuencias retrovirales adecuadas y el
ADN pasajero. Mediante transfeccin se
introduce en la lnea celular que adems es
coinfectada con un virus ayudante. La
transcripcin de la secuencia de ADN viral
recombinante da lugar a un mRNA recombinante
que entra en el ciclo replicativo retroviral como
RNA genmico, pudiendo ser empaquetado o
convertido en provirus. La expresin de los genes
retrovirales conduce a la aparicin de una mezcla
de partculas virales infectivas que continan la
infeccin. El ayudante es el que marca la
especificidad de hospedador.
Realizan ciclo completo: obtenemos progenie de virus.
Obtenemos las protenas que necesita de profago ayudante: progenie mixta
Si el profago es mutante en que impide el
ensamblaje de su RNA viral, las clulas producen
todas las protenas necesarias para el empaquetado,
son clulas empaquetadoras. Cuando las clulas de
esta lnea son transfectadas con un DNA proviral
recombinante, defectivo, se producen partculas
virales recombinantes infectivas y puras, sin mezcla
de ningn virus ayudante, tenemos progenie pura
del retrovirus recombinante.
Vectores derivados de otros virus
Adenovirus
- No se integran en el genoma
- Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos
Adenoasociados
- Requieren coinfeccin con un adenovirus o virus herpes
- Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos
Herpes
- Genoma muy grande (difcil manejo)
- Citotxico
Baculovirus
- Para introduccin y expresin de genes en cultivos de clulas de insectos
52
Genotecas
Conjunto de clulas ( o virus) que albergan, fragmentado e incorporado en un vector, todo el contenido
gentico (ADN) de un cierto organismo.
2 datos siempre importantes:
Tamao de la genoteca: nmero de clones que la forman. Depende del tamao del ADN de
partida y del vector a utilizar (tamao medio del inserto)
Representatividad: porcentaje de las secuencias originales que est presente en los clones de la
genoteca. Es una medida de la calidad de la genoteca
Objetivos:
- Conservacin del ADN de una estirpe, especie o individuo.
- Aislamiento de secuencias y genes.
- Estudio de grandes regiones genmicas y genomas completos.
- Inicio de los proyectos de secuenciacin
Tipos en funcin del ADN pasajero mixto que contienen:
Genotecas genmicas: Contienen el genoma completo de una especie, en forma de fragmentos
clonados.
Genotecas parciales o bancos de genes: Contienen las secuencias de un ADN ms simple, como
un megaplsmido bacteriano o un cromosoma eucaritico aislado (genoteca cromosmica)
Genotecas de ADNc: Proceden de la clonacin de los ADNc obtenidos de un tipo celular
concreto. Contienen las secuencias que han sido expresadas en la clula original. Utilizadas en
para el aislamiento de genes expresados en tejidos especficos y para el estudio de los
mecanismos que regulan esa expresin. Son secuencias carentes de intrones, permite su
expresin en sistemas procariticos.
Genotecas genmicas
Contienen, fragmentado, todo el material gentico (genoma) de una especie. Nos interesa que los clones
sean solapantes
Cualidades /caractersticas de la genoteca a tener en cuenta:
- Representatividad: Debe contener todas las secuencias presentes en el ADN de partida. Debe
mantenerse y no disminuir durante la conservacin y amplificacin de la genoteca.
- Complejidad (o tamao): nmero mnimo de clones que debe tener la genoteca para que todo el
ADN de partida est representado.
- Tamao medio de los insertos: Importante si queremos aislar genes completos de genomas
eucariotas, para lograr el aislamiento de un gen completo, la biblioteca debe contener insertos
suficientemente grandes. El tamao de la genoteca depende de la relacin que existe entre la
longitud del material inicial y el tamao medio de los insertos. En la prctica, necesitamos un
nmero de clones independientes mayor del terico para asegurarnos la representatividad de la
genoteca:
N = ln (1-P) / ln (1-1/n)
N: nmero de recombinantes independientes
P: probabilidad de hallar un inserto dado
n: tamao ADN original /tamao medio insertos
Se aconseja la construccin de genotecas con pasajeros grandes porque son ms manejables al estar
formadas por un menor nmero de clones y ofrecen ms facilidad en el aislamiento de genes
completos. A ms nmero de clones mayor fiabilidad.
Pasos clave en la construccin de la genoteca:
9 Mtodo de fragmentacin del ADN de partida
Define la complejidad de la genoteca, su representatividad y la facilidad de clonacin de los insertos.
Digestin con endonucleasas: en teora, se puede anticipar el tamao promedio de los fragmentos, pero
no es real. Dependiendo de la posicin de las dianas en relacin con la secuencia de un gen, puede que la
digestin con una enzima rompa al gen en varias piezas impidiendo que aparezca completo en la genoteca.
53
Fragmentacin por mtodos fsicos: ultrasonidos. Produce una rotura al azar, por sitios no especficos.
Los fragmentos resultantes requieren algn tratamiento para reparar sus extremos. La rotura al azar
presenta una heterogeneidad mayor, aumenta la probabilidad de aislar un determinado gen completo y
disminuye la probabilidad de que se pierdan secuencias por estar localizadas en fragmentos grandes no
clonables. Muchos fragmentos solaparn entre s.
Digestin parcial con una endonucleasa de diana corta (4 pb). Controlando las condiciones de digestin
se pueden conseguir fragmentos de mayor tamao. produce fragmentos solapantes, aumentando las
posibilidades de clonaje de cualquier secuencia y permitiendo el desplazamiento por el genoma
9 Seleccin del vector de clonacin
Depende del tamao de los insertos a clonar. Determina la conservacin y facilidad de anlisis de la
genoteca
Vectores usados en construccin de genotecas genmicas:
Genomas pequeos: Plsmidos o derivados de (reemplazamiento)
Genomas grandes: BACs o YACs
Esquema para construir una genoteca con . Obtencin del ADN. Fragmentacin. ADN . Ligacin
entre ambos. Empaquetamiento, en cada fago habr un fragmento de la genoteca. Amplificar la genoteca
mediante cultivos, se consiguen calvas de lisis con . Para conservar la genoteca se puede congelar, en
E.coli se debe aadir un agente criognico; se pueden hacer diluciones.
Digestin total con enzima A (corte
poco frecuente; diana 6 bp)
Fragmentacin por mtodos
fsicos (inespecfica)
Digestin parcial con enzima B
(corte muy frecuente; diana 4 bp)
Fcil unir los insertos
Insertos de tamao heterogneo
Representatividad media
Clones no solapantes
Difcil unir los insertos
Insertos de tamao homogneo
Representatividad alta
Clones solapantes
Fcil unir los insertos
Insertos de tamao homogneo
Representatividad alta
Clones solapantes
54
Conservacin y amplificacin de la genoteca
Importante que la viabilidad de la genoteca y su representatividad no se pierda durante el
almacenamiento y /o amplificacin. Los vectores derivados de se pueden almacenar ms tiempo sin
prdida de viabilidad y pierden menos representatividad al amplificar la genoteca.
Genotecas de ADNc
Se obtienen al clonar los ADNc obtenidos a
partir de los ARNm purificados de un cierto tipo
celular. Refleja los genes que se estn expresando
en ese tejido o momento del desarrollo. Permite
identificar genes especficos. Tiene menor
complejidad que las genotecas genmicas.
Representatividad:
No todos los ADNc estn igual de
representados, ya que depende de la abundancia
de los ARNm. A la hora del aislamiento de un
clon es necesario tener en cuenta la concentracin
de su ARNm en el sistema de partida.
Enriquecimiento:
Podemos enriquecer la genoteca en el ADNc de inters mediante fraccionamiento por tamaos de los
ARNm o uso de cebadores especficos en la obtencin de los ADNc.
Genotecas de expresin
Se construyen con un vector de expresin, aporta las seales necesarias para que el inserto pueda ser
transcrito y traducido en la clula hospedadora. Permite que la genoteca pueda ser analizada a travs de
los productos codificados en los pasajeros y de su posible actividad, alternativa para la deteccin y
aislamiento de clones. El pasajero se inserta en un sitio localizado dentro de un gen presente en le vector,
de manera que la expresin conjunta de ambos puede conducir a la sntesis de una protena mixta.
Interesante que sea promotor inducible. As evitamos que se pierda la deteccin de clones que
codifiquen para protenas txicas.
G. de expresin genmicas
En procariotas: poco ADN no codificante
Representatividad puede ser menor: sobretodo las obtenidas por digestin
Necesitamos nmero mayor de clones.
Tener en cuenta la pauta de lectura.
Usar vectores que difieran en la pauta de lectura.
G. de expresin de ADNc
En eucariotas: mucho ADN no codificante.
Podemos expresar esas protenas en E. coli.
El diseo de los cebadores nos permite que todos los ADNc se clonen en la pauta de lectura adecuada.
Anlisis /escrutinio de la genoteca
La utilidad de una genoteca es funcin de un mtodo que permita identificar, entre el conjunto de clones
o fagos recombinantes, a aquel que contenga el inserto deseado. Deteccin y aislamiento del clon que nos
interesa.
Tres estrategias fundamentales:
Hibridacin con una sonda marcada. Es la ms utilizada y la ms general. Nos permite analizar
cualquier genoteca. No requiere que el gen a identificar se encuentre completo en el mismo clon
ni que se exprese la protena codificada en el ADN.
55
Anlisis con anticuerpos (inmunoscreening). Solo en genotecas de expresin, dado que el
anticuerpo reacciona con la protena no con el ADN. Dependiendo del tipo de anticuerpo
utilizado requiere que la protena se exprese entera o no.
Anlisis por deteccin de la actividad del producto codificado (Anlisis fenotpico). Slo en
genotecas de expresin, y en casos concretos. Se requiere que la protena se exprese completa y
/o que retenga su actividad.
Anlisis por hibridacin con sondas marcadas
Suele ser el mtodo ms utilizado y es el ms fiable. Detectamos la presencia de una secuencia concreta,
por lo que no necesitamos que la genoteca sea de expresin
Sonda: Hebra de cido nucleico (ADN ARN) monocatenaria y de secuencia complementaria a la que
estamos buscando
9 Sondas de ADN
Si tenemos la secuencia de inters clonada en un vector, la podemos cortar con enzimas y
purificar. Necesitaremos desnaturalizar antes de usar
Podemos amplificar la secuencia que buscamos (o parte de ella) por PCR. Si realizamos PCR
asimtrica, ya la tenemos en forma de monohebra y no necesita desnaturalizacin
Sondas sintticas (oligonucletidos). Si no conocemos la secuencia del gen de inters, pero s la
de la protena podemos disear sondas degeneradas. Las sondas degeneradas son una coleccin
de sondas obtenidas a partir de una secuencia de aminocidos con todas las combinaciones de
tripletes posibles. Tambin podemos incorporar inosina en los residuos que puedan variar. Este
residuo puede aparear con cualquiera de las cuatro bases; se reduce el nmero de molculas a
sintetizar y se puede alargar su longitud.
9 Sondas de ARN
Tambin llamadas ribosondas. Transcripcin del inserto de inters, clonado en un vector especial. La
secuencia buscada, con promotor, se expresa y se utiliza el ARN.
Secuencia protena
56
Marcaje de las sondas
Empleo de radiactividad, es el mtodo ms sensible.
El istopo ms usado es el P
32
, aunque tambin pueden usarse otros como S
35
. podemos marcar las
sondas de diferentes maneras:
- Incorporando dNTPs radiactivos a la reaccin de PCR o de sntesis de oligos
- Traslado de mella: creamos mellas en el ADN utilizando la DNasa I. Empleamos las
actividades exonucleasa 5 3 y polimerasa de la ADN polimerasa I (de E.coli) para sustituir
parte de las bases por dNTPs radiactivos. Ligasa para unir la mella que queda detrs. Se obtiene
las misma molcula pero marcada radiactivamente.
- Relleno de extremos: Si la sonda tiene extremos cohesivos, podemos rellenarlos con Klenow
utilizando dNTPs radiactivos.
- Empleo de la tranferasa terminal o la poliA (solo ATP) polimerasa para incorporar dNTPs
radiactivos a los extremos de la sonda.
- Adicin de grupos fosfato con P
32
en los extremos 5 usando la polinucletido quinasa. Primero
se utiliza una fosfatasa para quitar fosfatos, luego se utiliza la quinasa que aade fosfatos.
Detectamos la presencia de la sonda realizando una autorradiografa.
Otros marcajes:
- dNTPs marcados con fluorocromos. Detectamos con: Fluorimetra
- Biotina: Aadimos protena detectora (avidina) conjugada con fluorocromo o enzima. la biotina es
la sonda en el ADN, la avidina es afn a la biotina. Detectamos con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica
de la enzima.
- Digoxigenina: Aadimos anticuerpo especfico conjugado con fluorocromo o enzima. Detectamos
con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica de la enzima
Ensayo de hibridacin de la genoteca en soporte slido
Cultivo de E.coli y fagos en placa. Cada calva corresponde a un clon
diferente de la genoteca.
Transferimos las calvas /colonias a un filtro de nitrocelulosa
Tratamos con lcali para lisar las colonias y /o desnaturalizar el ADN
Podemos fijar el ADN al filtro con luz UV. El ADN se queda pegado a
la nitrocelulosa.
Incubamos con la sonda marcada, solo se unir a las secuencias
complementarias de la genoteca.
Lavamos el exceso de sonda que no ha hibridado.
Revelamos el filtro para detectar en que calva /colonia ha hibridado la
sonda.
Rescatamos la calva /colonia de la placa original para aislar el inserto.
57
Hibridacin Southern
Combina la separacin de fragmentos de ADN (genmico total) mediante electroforesis con su
transferencia a una membrana y su hibridacin con una sonda. Es una de las tcnicas de anlisis de ADN
ms usada a partir de muestras biolgicas (sangre, esputo, tejidos, etc).
Las bandas del gel (agarosa) se transfieren a una membrana de nailon. El ADN se queda pegado a la
membrana.
La transferencia del ADN desde el gel a la membrana puede realizarse por capilaridad o por
electrotransferencia.
Se obtienen bandas, la sonda hbrida con la banda complementaria. La banda nos da relacin del tamao
del ADN, no de la sonda.
Las condiciones en las que se realice la hibridacin determinar si la sonda se puede unir slo a su
secuencia completamente complementaria o puede unirse a secuencias parcialmente complementarias. La
temperatura es importante para que la sonda se una solamente a la hebra complementaria; si la
temperatura es inferior a la ptima la sonda se hbrida a secuencias parcialmente complementarias.
Tcnicas relacionadas con la hibridacin Southern
Hibridacin Northern
Tcnica similar a la anterior, pero en este caso transferimos ARN. Permite estudiar la transcripcin de
un gen, ya que podemos usarla para detectar /cuantificar un ARNm concreto. Se separa por electroforesis,
se transfiere a una membrana de nailon y se hbrida con la sonda.
Hibridacin Western
En este caso lo que transferimos y detectamos son protenas. No usamos sondas, sino anticuerpos
especficos contra la protena que pretendemos estudiar. El gel utilizado en la electroforesis es de
acrilamida.
Combinando las tres tcnicas podemos estudiar un gen/ protena a varios niveles:
Southern Northern Western
Secuencia ADN ARNm Protena
Presencia del gen Transcripcin Traduccin
En eucariotas un gen se puede estar transcribiendo pero no traduciendo, se puede detectar ADN, ARN
pero no la protena.
Pueden dar pistas sobre la regulacin de un gen.
58
Anlisis con anticuerpos (inmunoscreening)
Tcnica similar a la hibridacin con sondas, pero usamos un anticuerpo contra la protena que queremos
detectar. Necesitamos que la genoteca sea de expresin.
Tras la siembra de clulas transformadas, el material de
las placas es transferido a un soporte slido para fijar las
protenas en l. El filtro es tratado con un anticuerpo contra
la protena codificada por el recombinante buscado. La
identificacin de una reaccin positiva se consigue
mediante tratamiento con un segundo anticuerpo, dirigido
contra los eptopos especficos del primero; este segundo
anticuerpo va unido a una enzima cuya actividad se detecta
con facilidad.
Los anticuerpos primarios pueden ser:
- Ac. policlonal: no necesitamos que la protena est completa ni que retenga su actividad. Mayor
ruido de fondo. Reconoce varios eptopos, aumenta la posibilidad de que reconozca un clon que
exprese tan slo un fragmento de la protena, aunque produce un fondo muy alto debido a las
reacciones contra otros antgenos.
- Ac. monoclonal: Menor ruido de fondo. Podemos perder la deteccin de algunos clones. El nmero
de recombinantes que reconoce es menor. Slo reconocen una secuencia de la protena. No se
pueden detectar protenas fragmentadas.
Anlisis por deteccin de la actividad del producto codificado
Slo en casos en que la protena que buscamos tenga una actividad de fcil ensayo. Requiere que la
protena se exprese y que est completa y /o retenga su actividad.
Complementacin de mutantes bacterianos, aislamiento de genes de resistencia, protenas que podamos
medir mediante ensayos colorimtricos
9 Aislamiento de genes por complementacin de mutantes bacterianos. El uso de una extirpe
auxtrofa, mutante deficitaria en alguna actividad implicada en una ruta biosinttica, como
hospedadora para la construccin de una genoteca obliga a utilizar un medio de cultivo
complementado con el producto que no puede sintetizar. La genoteca no crece cuando se siembra en
placas con medio mnimo, pero si el recombinante de alguna de sus clulas portara un pasajero capaz
de expresar una actividad que complementara el defecto de la cepa hospedadora, sta s crecera en
ese medio dando lugar a una colonia detectable. Se trata de una seleccin. El procedimiento requiere
que el inserto se exprese utilizando una genoteca de expresin o trabajando con una que contenga
fragmentos de tamao suficiente para que contenga completo el gen y las seales activas
responsables de su expresin.
59
Tema 2
Mapas genticos y fsicos
Mapa de un genoma: Representacin grfica de la ordenacin y la posicin de genes y marcadores
genticos dentro del genoma.
Estas representaciones, sobretodo en genomas de gran tamao y alto contenido en secuencias repetidas,
son de gran ayuda para el posterior ensamblaje de las secuencias obtenidas en los Proyectos Genoma.
La obtencin de mapas previos al inicio de un proyecto de secuenciacin nos sirve como gua para
situar correctamente los fragmentos que se van secuenciando. Dependiendo de la estrategia utilizada para
posicionar los diferentes marcadores, se pueden obtener mapas fsicos o genticos.
Secuencia de un genoma: mapa del genoma realizado al nivel ms detallado.
Obtencin de mapas:
- Dependientes de la disponibilidad de marcadores genticos (alelos)
- Dos tipos de mapas dependiendo de cmo se obtienen y se miden las distancias
Tipos de mapas
Mapas genticos (clsicos)
Basados en frecuencias de recombinacin de alelos (frecuencias fenotpicas).
Basados en la frecuencia de recombinacin entre los marcadores utilizados, por lo que la medida de la
distancia entre marcadores se expresa en forma de distancias genticas (unidades de mapa).
Los primeros marcadores utilizados fueron los propios genes. El empleo exclusivo de marcadores
genticos da lugar a la obtencin de mapas pocos precisos, dada la baja proporcin de genes en los
diferentes organismos cuyos fenotipos asociados son distinguibles visual o bioqumicamente.
60
Mapas fsicos: se obtienen mediante tcnicas de biologa molecular (restriccin con enzimas,
tcnicas de hibridacin, PCR) y son ms precisos que los genticos. La utilizacin de paneles de
lneas celulares somticas hbridas o lneas celulares hbridas por radiacin permite asignar
marcadores a un cromosoma o regin cromosmica concreta. Las diferentes variantes de
hibridacin in situ (FISH) permite posicionar marcadores con resoluciones que varan entre 1Mb
(baja resolucin) y 10 kb (alta resolucin).
Los mapas de restriccin permiten posicionar dianas de reconocimiento para diferentes
endonucleasas, y pueden aplicarse a diferentes tipos de fragmentos de ADN , desde insertos
clonados a fragmentos genmicos o cromosomas bacterianos completos.
Basados en la secuencia, obtenidos con tcnicas de ingeniera gentica. Medido en pares de
bases.
Marcadores polimrficos: implican un polimorfismo poblacional (ocurrencia en un locus de numerosos
alelos alternativos identificables)
Mapas genticos y fsicos
Los mapas fsicos son ms precisos
En el cromosoma hay puntos calientes donde la recombinacin es ms frecuente, se cree que los
marcadores estn ms alejados. Hay zonas (telmeros) donde apenas ocurre recombinacin, se cree que
los marcadores estn muy juntos.
Mapas genticos
- Medida de distancia: unidades de mapa
- Medimos la frecuencia de recombinacin entre los loci: analizamos la herencia de los
marcadores seleccionados
Marcadores que podemos usar:
Marcadores gnicos: los propios genes. Debe tener dos formas (alelos) alternativos que
proporcionen fenotipos distinguibles
- Genes que producen fenotipos visualizables
- Genes que producen fenotipos distinguibles de forma bioqumica
Marcadores no gnicos: marcadores moleculares
- Son secuencias de ADN
- Deben tener al menos dos alelos distinguibles
- En el caso de humanos, cuanto ms polimrficos sean, mejor
Distancias fsicas
Secuencia de bases entre los
marcadores moleculares
Distancias genticas
Entrecruzamientos entre los
marcadores genticos
61
Marcadores moleculares de ADN
Se basa en la existencia de variacin a nivel molecular entre diferentes individuos (polimorfismos
moleculares), que permiten su uso como marcadores genticos
POLIMRFICOS
- RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin. Pueden formar parte de
una secuencia codificante.
- SSLP: Polimorfismo de Longitud de Secuencia Sencilla. Repeticiones de secuencias. No
son codificantes. Es interesante que tengan muchos alelos. La diferencia entre alelos es el
nmero de repeticiones.
VNTR: Repeticiones en Tndem de Nmero Variable. Entre 25-40 pb. Minisatlites.
SSR /STR: Repeticin de Secuencia Sencilla /Repeticin en Tndem corta (Short).
Pocos pb. Microsatlites.
- SNP: Polimorfismo de Nucletido Sencillo. Variacin de un nucletido dado dentro de la
poblacin. Pueden ser secuencias codificantes o no.
NO POLIMRFICOS, utilizados para mapeo fsico, diagnstico.
- STS: Sitio etiquetado (Tagged) por Secuencia. Secuencias nicas y conservadas, slo hay
un alelo.
Mediante este tipo de tcnicas se `puede establecer ligamiento entre marcadores moleculares y genes
asociados con enfermedades humanas, tiene inters para la clonacin del gen y para el diagnstico
molecular de la enfermedad correspondiente.
Marcadores moleculares polimrficos y aplicaciones:
Mapeo de genes por ligamiento
Diagnstico presintomtico y prenatal de enfermedades genticas (indirectamente)
Deteccin de portadores heterozigticos de alelos de enfermedades
Marcadores de riesgo incrementado o reducido de algunas enfermedades
- Diabetes
- Alzheimer
- Cncer
Para algunos loci, comprobacin de donantes de rganos
Aplicaciones forenses: Pruebas de identidad, parentesco
RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin
En una regin del cromosoma puede aparecer o no una diana de restriccin para una enzima concreta.
Los polimorfismos en las dianas de restriccin permiten el anlisis RFLP.

No muy polimrficos: slo dos alelos para cada RFLP
Se pueden distinguir diferentes alelos.
ACAGCAGAATTCAACTAC
Ejemplo: diana de restriccin
62
Deteccin de RFLPs
9 Transferencia Southern:
Se extrae todo el ADN, se corta con
enzima de restriccin. Se hace
electroforesis y se traspasa a la
membrana de nailon. Una sonda que
hibride en el sitio de corte. Se hace
autorradiografa, el nmero de bandas
depende de donde hibride la sonda.
PCR
Se trata el ADN con enzima de restriccin y se
realiza PCR con cebadores. Se realiza electroforesis
en gel de agarosa, aparecern bandas dependiendo de
los alelos que haya. Es un proceso ms rpido.

SSLP: Polimorfismo de Longitud de Secuencia Sencilla

Altamente polimrficos. Secuencias repetidas, tantas
repeticiones como alelos
9 STR o microsatlites: se encuentran a lo largo de
todo el cromosoma. Se usan ms como marcadores.
nRepeticiones de 2-3 pb
9 VNTR o minisatlites: se usa menos porque el tamao
de la repeticin es muy grande y difcil de ampliar por PCR.
Suelen estar en los telmeros. nRepeticiones de unas 25-60
pb.
Deteccin de SSLPs por PCR
Los minisatlites se usan menos, dado que aparecen ms
frecuentemente cerca de los telmeros y su tamao mayor hacen
ms difcil su deteccin por PCR.
Los oligos se fabrican antes y despus de las repeticiones.
SNP: Polimorfismo de Nucletido Sencillo
Sitios donde vara una nica base que no pertenece a una diana
de restriccin (sera un RFLP). En unos individuos aparece una
base, en otros otra. En teora puede haber 4 alelos, pero en
realidad solo existen 2, de cada SNP.
63
Los SNP se generan por mutacin y se fijan, no tienen efecto drstico en el organismo, se mantienen y
se heredan. Para que aparezca un tercer alelo debera existir una segunda mutacin en el mismo sitio.
Deteccin de SNPs
Basados en la secuencia del SNP. Es una estrategia de discriminacin. Hibridacin con oligonucletidos
especficos.
- Deteccin mediante hibridacin con sonda: especificidad de la hibridacin
Ajustando las condiciones de la hibridacin y /o el lavado podemos ajustar el nmero y tipo de
secuencias que detectamos.
Variando la concentracin de sales o la temperatura hacemos las condiciones ms o menos restrictivas a
la hibridacin. La temperatura de hibridacin depende de la longitud y porcentaje de G/ C de la sonda.
a 65C se hbrida la hebra 100% complementaria
a 50C reconoce secuencias que varan en 1-3 bases
a 35C la sonda se une a secuencias que se parecen
pero no son 100% complementarias.
Se disean oligos 100% complementarios a uno de
los alelos y se somete a condiciones restrictivas.
Se preparan los dos oligos y se hace un ensayo por
separado.
9 Hibridacin en solucin
Se aade en un extremo del oligonucletido una sustancia
fluorescente y en el otro extremo un quenching (apagador, no emite
fluorescencia); se aaden los SNP y cuando Hibridan al 100%
emiten fluorescencia.
+ Restrictivas
Slo queda unida a la
secuencia idntica
- Restrictivas
Se une a ms bandas que
poseen cierta homologa
64
9 Chip de ADN
Cristal donde tenemos unidos diferentes oligos. El cristal tiene muchas celdillas
Marcamos el ADN que queremos detectar, con fluorescencia o radiactividad. Se aade la mezcla de
ADN al chip. Se lava el chip y se detecta la hibridacin.
Podemos analizar al mismo tiempo diferentes SNPs con la misma muestra de ADN.
Obtencin de mapas genticos
Basados en el anlisis de ligamiento entre dos loci. Dos genes /marcadores localizados en el mismo
cromosoma se heredan juntos: estn ligados.
A veces durante la meiosis ocurren entrecruzamientos que hacen que los alelos ya no se hereden juntos.
El porcentaje de veces que se produce recombinacin entre dos loci depende de la distancia entre ambos
loci: nos permite establecer distancias genticas entre ambos
- Tres situaciones /estrategias:
Cruces dirigidos: en organismos donde podemos realizarlos, parentales con genotipos
conocidos.
rboles genealgicos: en humanos y otros eucariotas con ciclo de vida largo donde no
podemos realizar cruces dirigidos.
Otro sistema de estudiar la recombinacin: en bacterias, donde no tenemos meiosis.
- Organismos donde podemos realizar cruces dirigidos
La mayor parte de los eucariotas: mosca, levaduras, roedores...
Analizamos la descendencia obtenida en cruces entre parentales de genotipo conocido
para los loci a estudiar.
En levaduras y otros eucariotas inferiores, podemos crecer los gametos producidos
como clulas haploides, lo que facilita el anlisis.
En otros casos, podemos analizar los gametos (esperma), que son haploides.
Si analizamos la descendencia diploide, hay que tener en cuenta que proceden de dos
meiosis independientes
65
Mapas genticos humanos: anlisis de rboles genealgicos
No podemos realizar cruces programados con parentales de genotipo conocido. Este mtodo es tambin
aplicable a organismos con ciclos reproductivos muy largos (algunas plantas y animales). Se estudia la
familia hacia atrs, si existen muestras de ADN se analizan y se establece el rbol genealgico.
Usamos marcadores moleculares conocidos y mapeados en humanos, se analiza la herencia de un gen
con esos marcadores:
10
5
RFLPs
6,5 x 10
5
microsatlites
>10
6
SNPs
M
i
: datos del genotipo del marcador seleccionado, alelos para
el marcador polimrfico. stos pueden ser STR o VNTR.
Hiptesis 1: alelo M
1
ligado a la enfermedad, alelo M
2
ligado a individuo sano.
Hiptesis 2: alelo M
2
ligado a enfermedad, alelo M
1
ligado a individuo enfermo.
Si la hiptesis 1 es correcta, todos los afectados tienen que tener el alelo M
1
y los que lo heredan son
parentales, si est afectado y no tiene el alelo M
1
ese es el recombinante. Tenemos 5 individuos con
combinacin parental, frecuencia de recombinacin 1/6 = 167%, el alelo y el gen estn ligados entre s.
En la hiptesis 2 apareceran 5 recombinantes y un solo parental. Frecuencia de recombinacin 5/6=
833%, no estn ligados.
El marcador no produce la enfermedad, la produce el gen, pero establece el ligamiento.
Nos faltan datos para establecer la hiptesis correcta, pero si se rescata el genotipo de la abuela muerta,
nos permite establecer que la hiptesis 1 es la correcta. Presenta el alelo M
1
y adems un quinto alelo M
5
.
est claro que el alelo ligado a la enfermedad es M
1
, porque ningn descendiente presenta el alelo M
5
.
66
Ejemplo 2: la diana de corte corta al alelo 1, pero no al 2
Establecemos ligamiento entre gen D y RFLP
Naranja: enfermos
Padre homocigoto d/d y homocigoto
del alelo 2
Madre heterocigoto D/d heterocigoto
tiene alelos
La hija 8, padece la enfermedad y es
homocigoto para alelo 2, es
recombinante.
Las frecuencias de recombinacin
confirman el ligamiento entre D y 1.
A partir de la hija 8 se pierde la pista del alelo 1, puesto que no lo tiene y sus descendientes que
padezcan la enfermedad no se sabr que alelo tiene ligado al gen.
Mapas genticos en Bacterias
Las bacterias no realizan meiosis. Inducimos cruzamiento entre fragmentos homlogos:
- Copia cromosmica
- Copia introducida
Podemos introducir esa copia extra por diferentes mtodos. Usamos siempre marcadores bioqumicos
El alelo silvestre o dominante confiere una caracterstica bioqumica a la clula:
- Resistencia a antibiticos, compuestos txicos,
- Sntesis de algn compuesto esencial
- Uso de diversas fuentes de carbono
Marcador RFLP
Alelo D ligado a RFLP-1
Recombinacin materna en el hijo 8
Alelo D ligado a RFLP-2
67
9 Uso de conjugacin
Medimos la distancia en funcin de los minutos que tardan en
transferirse los marcadores. La conjugacin se puede parar a diferentes
tiempos. El mapa est medido en minutos.
9 Uso de transduccin o transformacin
Los marcadores deben estar muy prximos
El ADN lineal se integra en el genoma.
Se mide en funcin de la frecuencia con la que
se cotransducen o se cotransforman.
Limitaciones de los mapas genticos
- Resolucin: distancia mnima o mxima para detectar el ligamiento, depende de:
del nmero de marcadores que tengamos localizados para cada organismo
nmero de datos disponibles para calcular la frecuencia de recombinacin
E. coli: 1400 marcadores, 1 marcador cada 3,3 kb. Tamao del genoma 4 Mb
Humanos: Difcil detectar, frecuencias de recombinacin muy bajas, las familias no son muy largas. Los
marcadores lejanos pueden mapear en la misma posicin. 1% = 1 cM = 1 MB
- Exactitud: existencia de puntos calientes de recombinacin.
La clula donadora es
portadora del alelo
silvestre
La clula receptora
tiene el alelo
recesivo
Detectamos la
adquisicin del alelo
silvestre
68
Mapas fsicos
Nos permiten obtener las distancias fsicas entre marcadores (en pb) o localizar fsicamente los
marcadores en la secuencia de ADN. Diversas estrategias o mtodos con los que obtenemos mapas de
diferente escala o nivel de resolucin:
Mtodos /mapas de baja resolucin: Nos permiten asignar un marcador /gen a un cromosoma o
regin cromosmica (varias Mb)
Mtodos /mapas de alta resolucin: Nos permiten localizar el marcador en una regin de hasta
unas 25 kb
Mtodos /mapas de mxima resolucin: Secuencia de nucletidos
Mapas fsicos de baja resolucin
- Paneles de lneas celulares somticas hbridas:
Fusionamos in vitro clulas de diferentes especies, por ejemplo clulas
humanas y de ratn/ hamster. Se consiguen heterocariontes.
Los heterocariontes son inestables, pierden cromosomas. El resultado
son lneas celulares estables que contienen todos los cromosomas de
ratn y algunos humanos. Realizamos cariotipo para determinar que
cromosomas humanos tenemos en cada lnea celular.
Ensayamos presencia/ ausencia del marcador
Paneles de lneas celulares somticas hbridas
Podemos obtener hbridos monocromosmicos. Obtenemos
microclulas que contienen un cromosoma aislado cada una.
Fusionamos cada microclula a una clula de ratn para obtener los
hbridos.
Para aumentar la resolucin podemos trabajar con hbridos que
contengan fragmentos de cromosomas en lugar de cromosomas
completos.
Usamos colecciones de cromosomas con deleciones o
traslocaciones.
Podemos asignar el marcador a una regin cromosmica ms
reducida
NO
SI
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
SI
SI
SI
SI
SI
SI
Clon 1 Clon 2 Clon 3 Clon 4
Crom. 1
Crom. 2
Crom. 3
Crom. 4
Crom. 5
Nos permite asignar el
marcador a un cromosoma
concreto
69
Paneles de lneas hbridas obtenidas por radiacin
Para obtener clulas hbridas que contengan regiones ms reducidas de los cromosomas usamos
radiacin. A mayor radiacin, fragmentos ms pequeos.
Tratamos con rayos X las clulas humanas y despus las fusionamos con las clulas de hamster sin
irradiar. Los fragmentos se integran en los cromosomas de hamster al azar. Se constituyen diferentes
lneas celulares.
Se detectan los marcadores que hay en cada hbrido y se ensaya la presencia /ausencia del gen de inters
en cada hbrido.
Las distancias frente a un marcador se calculan en funcin de la probabilidad de que la rotura se
produzca entre el marcador y el gen. Cuanto ms cerca estn marcador y gen, menor probabilidad de que
estn en fragmentos (hbridos) diferentes. A ms frecuencia mismo cromosoma; a menor frecuencia
mismo hbrido diferente cromosoma.
Hibridacin in situ (FISH)
Observamos directamente donde se encuentra el marcador dentro del cromosoma gracias al empleo de
una sonda marcada con un fluorocromo. Preparacin de clulas en metafase (cromosomas condensados),
ADN parcialmente desnaturalizado. Aadimos la sonda marcada. Observamos al microscopio de
fluorescencia. Identificamos previamente los crosomomas mediante cariotipado. Podemos detectar varios
marcadores usando sondas marcadas con diferentes fluorocromos. Detectamos marcadores /sondas
separadas en algo ms de 1 Mb. Si dos seales se solapan emiten un color diferente de los fluorocromos
usados, estn mezclados, se suponen muy cerca en el cromosoma a menos de 1 Mb.
70
Si la sonda es demasiado grande, puede tener secuencias repetidas. Hibridacin inespecfica con
secuencias repetidas. Bloqueamos con una pre-hibridacin:
- Se purifica el ADN de secuencias repetidas con columna de cloruro de sodio
- Se Hibridan las secuencias repetidas, se desnaturaliza el ADN y se ponen oligos con las secuencias
repetidas, se quedan como bicadena
- Las secuencias nicas estn en monocadena, pueden hibridar con la sonda
Mapas fsicos de alta resolucin
Hibridacin in situ (FISH) de alta resolucin
- Uso de cromosomas metafsicos extendidos artificialmente. Tienen unas 20 veces su tamao normal
en metafase y an son reconocibles, estn parcialmente descondensados. La resolucin aumenta y
permite detectar seales separadas en 200-300 kb.
- Uso de cromosomas interfsicos. Cromosomas no empaquetados. Permite discriminar seales
separadas unas 25 kb. Problema: la conformacin al azar de los cromosomas nos impide determinar
el orden de los marcadores en la secuencia de ADN.
- Uso de fragmentos de cromosomas purificados y extendidos artificialmente. Resolucin de unas 10
kb, si las sondas estn juntas, ms de 10 kb; si se solapan, menos de 10 kb. Mantiene el orden de los
marcadores.
Mapas de restriccin
Relacin ordenada de los sitios de corte para enzimas de restriccin concretas, indicando las distancias
entre ellas en pb. Es un esquema lineal en el que figuran las posiciones relativas de las dianas de ciertas
enzimas de restriccin.
Proceso de obtencin:
- Digestin con la/ s enzima /s de restriccin.
- Anlisis de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis y /o Southern
Ser ms informativo cuantas ms dianas para enzimas diferentes podamos posicionar en el mapa.
Estrategias:
- Uso de digestiones dobles
- Uso de digestiones parciales
Tambin podemos realizar
hibridaciones con muestras
de cromosomas aislados
mediante citometra de
flujo
71
- Uso de nucleasa Bal31 para localizar sitios de restriccin
- Empleo de sondas para discriminar fragmentos
Uso de digestiones dobles
Comparamos los resultados obtenidos en las digestiones simples con el obtenido en la digestin doble
para ir posicionando los sitios de corte.
EcoRI: tiene diana interna en BamHI
Truco: reconocer que fragmentos de la
digestin con una enzima han sido cortados
por la otra
Con los datos que tenemos no podemos discriminar cual de los dos mapas sera el correcto. Para ello se
hacen digestiones parciales, sin cortar al 100%, se consiguen diferentes trozos de diferentes tamaos.
Con estos nuevos datos sabemos que el mapa correcto es el II
Uso de digestiones parciales
En las digestiones parciales veremos bandas de diferentes intensidades en el gel. En una digestin total
los fragmentos ms grandes tiene bandas de mayor intensidad. En la digestin parcial las bandas de mayor
tamao tienen menos intesidad.
Ejemplo: un ADN lineal es digerido parcialmente con BamHI. Las alcuotas retiradas a distintos tiempos
se analizan en gel de agarosa, obtenindose un patrn de bandas.
72
0 minutos: fragmento intacto de 65 kb
5 minuto: mezcla compleja
- pieza original, 65 kb
- piezas de rotura parcial
- piezas de rotura total
- bandas de distinta intensidad
20 minutos:
- fragmentos de digestin total
- bandas de idntica densidad
- la suma es 65 kb
- 2 dianas
Se puede concluir que el tamao del ADN lineal es de 65 Kb, y que presenta dos dianas BamHI cuya
rotura produce tras fragmentos de 30 kb, 20 kb y 15 kb, nicos productos obtenidos tras digestin total
a los 20 minutos de incubacin.
De los 3 posibles mapas (a, b y c), slo el que coloca el
fragmento de 2 kb en el centro (mapa a) puede explicar la
ausencia en la imagen del gel de un producto de digestin
parcial de 45 kb. Esa disposicin permite explicar la presencia
de todas las bandas electroforticas que se visualizan:
- el fragmento de digestin parcial de 5 kb abarca los
fragmentos de 3 y de 2 kb
- el parcial de 35 kb abarca a los de 2 y 15 kb.
Vale tanto ese mapa como el simtrico.
Digestiones progresivas con Bal31
Bal31 es una exonucleasa que degrada ADN
2C
, en un proceso que comienza por ambos extremos y
avanza hacia el centro. La nucleasa va eliminando las posibles dianas de restriccin que vaya encontrando.
La toma de alcuotas a distintos tiempos de incubacin con Bal31, la posterior digestin de stas con una
enzima de restriccin y la comparacin de las bandas electroforticas permitirn descubrir la posicin de
los sitios de restriccin reconocidos por la enzima usada. Los resultados son ms fcilmente interpretados
si el anlisis se realiza sobre un ADN que incorpora una regin mapeada en un extremo (vector de clonaje,
por ejemplo); as se pueden distinguir los fragmentos de restriccin que proceden de cada extremo y
deducir el mapa de la regin desconocida.
Se incuba un ADN lineal de doble cadena con la enzima Bal31, tomndose
alcuotas a los 0, 3, 10 y 20 minutos. Tras detener la incubacin con esa
enzima, cada alcuota es incubada con la endonucleasa de restriccin HindIII
en condiciones de digestin total, tras lo cual se analizan los fragmentos
resultantes mediante electroforesis, obtenindose ese patrn de bandas.
- A tiempo 0 el ADN no ha sido cortado por Bal31, por lo que las bandas de
restriccin que aparecen tras la digestin con HindIII son las que proceden
de la molcula original intacta. Se deduce la longitud del ADN, 15 kb.
- A los 3 minutos, el ADN ha sido degradado en algn grado por los
extremos, al comparar las bandas con las del tiempo 0, se observa que la
banda correspondiente al fragmento menor ha desaparecido, que la
inmediata superior se ha desplazado, que la siguiente en tamao se ha
desplazado ligeramente y que el resto de bandas mantiene su posicin.
73
Esto indica que los fragmentos pequeos de 1 y 2 kb proceden de los extremos del ADN original.
Los fragmentos terminales aparecen con menor longitud e incluso uno ha desparecido. Esto
permite localizar dos dianas HindIII a 1 y a 2 kb de cada uno de los extremos. Se observa un
desplazamiento de la banda que originalmente tena 3 kb y como los restos del fragmento de 2 kb
an se ven, se puede concluir que el de 3 kb se encuentra contiguo al de 1 kb en el ADN de
partida.
- En las otras alcuotas se pueden encontrar variaciones en las posiciones de algunos fragmentos
que deben interpretarse como recortes de los mismos debidos a la accin de la nucleasa Bal31;
as el desplazamiento de la banda de 4 kKb permite localizarlo en posicin contigua al de 2 kb y
al fragmento de 5 kb en la posicin central, ms interna.

De esta manera se puede completar el mapa de los sitios
HindIII en el ADN.
Digestiones parciales con ADN marcado en un extremo
Es el proceso ms directo, pero tambin el ms laborioso y ms costoso. Marcamos el ADN a digerir en
el extremo 5 de una de las cadenas mediante un istopo radiactivo (
32
P). Realizamos digestin parcial,
electroforesis y autorradiografa. Se obtienen una mezcla compleja en la que los fragmentos marcados
comparten el mismo origen y acaban en alguno de los diferentes sitios de restriccin por los que la
endonucleasa ha roto. El revelado de las bandas y la estimacin del tamao de cada fragmento marcado
permite localizar un punto de rotura en el ADN original.
Un ADN lineal bicatenario es marcado en su extremo 5 de una de
las hebras, es sometido a digestin parcial con HpaI. Los fragmentos
son separados en gel de agarosa y se revelan con autorradiografa.
La autorradiografa presenta 5 fragmentos, cada uno de ellos
contiene el extremo 5 marcado y terminan en una diana de
restriccin de HpaI.
74
Solapamiento de fragmentos por hibridacin
Supone el aislamiento de un fragmento interno obtenido mediante restriccin con una enzima, su
separacin en gel y su extraccin a partir de la banda electrofortica. Lo marcamos y lo usamos como
sonda frente a los fragmentos obtenidos en la digestin con un segundo enzima, tras su separacin y
transferencia a papel (Southern blotting). La sonda reconocer aquellos fragmentos de la segunda
digestin que solapen con l en el mapa del ADN de partida. De esta manera se puede ir colocando el
conjunto de fragmentos resultantes de una digestin, apoyndose en el conjunto obtenido tras una
segunda, y viceversa.
En el proceso de construccin del mapa de restriccin de un ADN lineal de 6
kb, se han colocado las tres dianas EcoRI. Cuando se digiere con BamHI se
obtienen tres bandas de 1, 2 y 3 kb. Para definir la posicin de sus dianas, se
realiza una digestin doble BamHI /SalI, apareciendo slo dos bandas de 1 y 2 kb.
La desaparicin de la banda de 3 Kb, en la digestin con las dos enzimas, indica
que la diana SalI rompe ese fragmento para producir uno de 1 kb y otro de 2 kb.
Conocida la posicin del sitio SalI (3 Kb), puede decirse que el fragmento BamHI
de 3 kb proviene de la parte central del ADN original y est flanqueado por los
otros dos fragmentos; as puede haber dos posibles mapas.
Las bandas obtenidas tras la digestin con BamHI y electroforesis son transferidas a un filtro de celulosa
y sometidas a hibridacin con una sonda radiactiva construida a partir de fragmentos de EcoRI de 3 kb,
preparado mediante digestin del ADN con esta enzima, separacin en gel y aislamiento en banda. Tras la
hibridacin, el filtro se revela con autorradiografa, apareciendo dos bandas positivas de 3 y 2 kb.
Segn el primero de los dos mapas posibles, la sonda solapara, y por tanto hibridara, con los
fragmentos BamHI de 3 y 2 kb.
Segn el segundo mapa, la sonda reconocera a los fragmentos BamHI de 3 y 1 kb, sobre los que
solapara.
El resultado de la autorradiografa sustenta la primera posibilidad.
E E E
0 1 2 3 4 5 6
75
Problemas que nos podemos encontrar:
- Presencia de dos dianas muy prximas:
Dara lugar a fragmentos de restriccin muy pequeos que podramos perder en la
electroforesis.
Podemos trabajar cargando las digestiones en dos geles con diferente concentracin de
agarosa/ acrilamida, los geles de acrilamida discriminan tamaos ms pequeos
- Aparicin de dos o ms fragmentos de tamao similar:
Los veramos en el gel como una nica banda.
La intensidad de las bandas puede darnos una pista de que esto est pasando.
Mapas de restriccin de genomas completos
Limitaciones de tamao. Podemos obtener fcilmente los mapas de restriccin de fragmentos de hasta
50 kb cortando con enzimas que tengan dianas de reconocimiento de 6 pb
Puede aplicarse el anlisis de restriccin a molculas /genomas /cromosomas de mayor tamao? SI.
Tenemos requerimientos /aproximaciones especiales
9 Uso de enzimas de corte raro en el ADN:
- Dianas de 7-8 pb, cortan cada 16-65 kb.
- Dianas que contengan motivos raros en el ADN de estudio, motivo CG en humanos es
raro, porque es un sitio de metilacin y sufre mutaciones, cortar fragmentos muy
grandes:
Sma I CCCGGG
Not I GCGGCCGC
9 Uso de tcnicas especiales de electroforesis:
- Electroforesis en campo ortogonal alterno. Campo
pulsado. La reorientacin alterna a la que se someten las
molculas permite separar mejor las molculas grandes.
Intercambia el campo elctrico, las molculas grandes se
mueven en zig-zag.
Electroforesis normal
Electroforesis campo pulsado
Mapas fsicos de alta resolucin
9 Caractersticas de un mapa fsico til:
- Alto nmero de marcadores localizados.
- Fcil y rpido de obtener
Mapas de restriccin
- De fcil obtencin.
- Contienen mucha informacin.
- No pueden aplicarse a genomas eucariotas completos
76
FISH de alta resolucin
- Pueden aplicarse a genomas completos.
- Metodologa compleja y de lenta obtencin de datos
- No eficiente para mapas fsicos de eucariotas superiores
Mapas fsicos de STS
STS: Sequence tagged site. Sitio de secuencia marcada; sitios marcados nicos; secuencias de
referencia; secuencia corta y nica. Se detecta por PCR; se disean oligos.
9 Obtencin de un mapa de STS
- Partimos de una coleccin de fragmentos de ADN
solapantes que representan al genoma a estudiar
- Detectamos en cada fragmento de ADN la presencia
/ausencia de diversas STS.
- Calculamos distancias entre STS en funcin de la
frecuencia con la que estos STS no aparecen juntos en
un mismo fragmento. Si la frecuencia es muy alta se
encuentran en el mismo cromosoma.
- Frecuencia de que haya rotura entre ambos STS
9 Secuencias que pueden ser un STS
Un STS es una secuencia corta de ADN (50-500 pb) que aparece en una nica posicin en el ADN de
estudio. Deben cumplir dos criterios:
- De secuencia conocida:
Detectamos los STS mediante PCR.
Tenemos que disear cebadores especficos para detectar su presencia
- Debe ser secuencia nica en el genoma:
No debe incluir secuencias de ADN repetitivo
Secuencias de diversos tipos /orgenes pueden usarse como STS:
ETS: Etiquetas de secuencias expresadas.
- Secuencias obtenidas del anlisis de ADNc.
- Corresponden a secuencias codificantes.
- Representativas de los genes que se estaban expresando en las clulas de las cuales se
obtuvo el ADNc.
- Pueden usarse como STS si corresponden a secuencias de genes nicos
SSLPs:
- Los microsatlites pueden usarse como STS en mapeo fsico.
- En la mayora de los casos conocemos la secuencia del microsatlite
Secuencias genmicas al azar:
- Obtenidas al secuenciar aleatoriamente fragmentos de ADN genmico clonado.
- Tambin de secuencias previamente depositadas en las bases de datos
9 Qu podemos usar como coleccin de fragmentos de ADN
Paneles de clulas hbridas obtenidas por radiacin
- Detectamos la presencia de los STS en los diferentes hbridos
- Importante: el STS no debe corresponder a secuencias
homlogas presentes en las clulas sin irradiar.
77
Genotecas genmicas
- Sobretodo las obtenidas en vectores para
fragmentos grandes (>100 kb).
- Anlisis por PCR de cada clon
- Obtenemos el mapa de STS para cada fragmento
Uso de los STS para reconstruir el mapa del genoma.
El solapamiento de los mapas de STS para cada fragmento nos permite obtener el mapa de la regin
genmica que representan. Las genotecas pueden usarse directamente para secuenciar
El solapamiento nos permite reconstruir el mapa de un genoma y posicionar los STS en el cromosoma
completo
78
Tema 3
Genmica, transcriptmica y protemica
- Ensamblaje de fragmentos genmicos y Proyectos Genoma
- Organizacin de los genomas
Genomas procariotas
Genomas eucariotas. Genomas de orgnulos
Tipos de secuencias
- Genmica funcional
Expresin de los genes
Funcin de los genes
- Transcriptmica y protemica
Proyecto genoma: secuenciacin de genomas
Objetivo: obtencin de la secuencia completa del genoma de un organismo y la integracin de los datos
de los mapas genticos y fsicos en dicha secuencia.
Construccin de una genoteca de fragmentos solapantes: es
importante construir una genoteca, lo primero que hay que
hacer es clonarlo en un vector, y conseguir el solapamiento de
los fragmentos.
Las reacciones de secuenciacin nos permiten leer unas 500-
800 bp cada vez. Solapamiento permite ensamblar las
secuencias obtenidas. Tener los fragmentos clonados facilita la
secuenciacin. Se precisa de un cebador, se necesita conocer
parte de la secuencia, conocemos la secuencia del vector.
Estrategias de secuenciacin
Mtodo del shotgun-aleatorio o secuencia aleatoria
Vlido para genomas pequeos y con poco contenido de ADN
repetitivo. Podemos aplicarlo a genomas de los que no
dispongamos de mapas genticos /fsicos.
Pasos:
- Se fragmenta el genoma (500-700 pb) y se clona.
- Se secuencian todos los fragmentos
- Usamos un programa informtico para ensamblar las
secuencias
Problemas:
- En genomas eucariotas el nmero de secuencias a analizar es muy grande: problemas con los
programas informticos. No suele usarse en eucariotas porque el genoma tiene muchas secuencias
repetidas.
- Las secuencias repetidas provocan errores en el ensamblaje. Cuando hay minisatlites con la misma
secuencia en lugares diferentes, el ADN que queda entre ellos suele perderse.
79
9 Aplicacin del shotgun: el genoma de Haemophilus influenza
Tras la sonicacin, para fragmentar el ADN, se
purifican 16 kb y se clonan en un vector
adecuado, y se secuencia.
Se procura que la secuenciacin sea 2-3 veces
mayor que el tamao real del genoma.
El genoma entero no se ha ensamblado, sino que
se han generado 140 contigs.
Contig: serie de ensamblajes de las secuencias
que estn solapadas.
Problema al construir la genoteca:
- no se ha clonado todo el genoma
- las enzimas de restriccin han cortado por el
mismo sitio
- fragmentos grandes, por tanto la
secuenciacin no es completa.
Relleno de los huecos de secuencia
Bsqueda de clones que contienen extremos de dos contigs
diferentes (PCR), que hibriden hacia fuera y se hace PCR en
la genoteca original.
Secuenciacin del clon correspondiente
Relleno de los huecos fsicos Secuencias que no estn en la
genoteca.
Diseamos cebadores complementarios a los extremos de los
contigs y se buscan las secuencis que faltan en otra genoteca
distinta.
Bsqueda en una segunda genoteca PCRs en el genoma original
Clonacin:
Genoteca
Sonicacin del ADN
80
Mtodo del ensamblaje de clones contiguos: primero ensamblar, despus secuenciar.
Partimos de una genoteca de YACs o BACs (insertos de hasta 1,5Mb). Se establece como esos clones
solapan entre s.
9 Paseo cromosmico (chromosome walking)
Se subclona un fragmento del inserto grande, se usa como sonda y se hibrida con el resto de la genoteca.
Se consigue otro clon que comparte secuencia con el anterior pero ms largo. Se repite varias veces.
Variantes:
- Uso de fragmentos completos como sondas. Un inserto no muy grande se hibrida con toda la genoteca,
se avanza en las dos direcciones.
- Uso de PCR: dos cebadores que hibriden y amplifiquen un pequeo trozo de ese fragmento, se
compara con la genoteca. Los productos de PCR encajan con el fragmento, se debe de conocer parte de la
secuencia.
81
- Uso de mapas fsicos. Podemos usar los mapas de restriccin o de STS para establecer que clones
solapan entre s.
Si dos mapas de restriccin solapan
entre s, los fragmentos solapan entre s.
Si dos fragmentos comparten STS,
solapan entre s.
Mtodo del shotgun en genoma completo
Combina el mtodo del shotgun con el empleo de mapas fsicos /genticos
Con los fragmentos que tienen
informacin en el mapa, se aplica
el shotgun y se ensamblan. De las
regiones que no se conoce mucho,
se obtienen muchas secuencias, se
ensamblan y se busca algn
marcador del que tengamos
informacin.
A cada fragmento se aplica
entonces el mtodo de shotgun
para obtener su secuencia
82
Se debe trabajar con unas caractersticas especiales
Trabajamos con dos genotecas distintas
Cmo evitamos los problemas de las secuencias repetidas?
Una de las genotecas usadas tiene tamao de fragmentos mayor que el tamao mximo de las
repeticiones del genoma.
Aseguran que las secuencias repetidas son secuencias adyacentes y estn en algn inserto.
En la primera fase no secuenciamos los fragmentos de las genotecas completos, son muy grandes, slo
los extremos. Se obtienen secuencias pre-ensambladas o andamios. Luego se rellenan los huecos de
secuencia y a continuacin los huecos fsicos.
Utilizamos los marcadores presentes en estas secuencias pre-ensambladas para:
- Posicionar estas secuencias en el genoma
- Detectar posibles errores de ensamblaje
- Posteriormente vamos completando los huecos con las tcnicas que ya hemos visto
Esta tcnica es la que se est aplicando a los
genomas de Drosophila y humano
Problema: Determinar el grado de exactitud de
la secuencia generada.
La fragmentacin y secuenciacin al azar de
fragmentos producen que hay regiones ms
secuenciadas que otras.
Qu nos permite hacer la secuencia completa de un genoma?
- Identificar nuevos genes
- Identificar regiones reguladoras
- Comparar la estructura y organizacin de genomas completos
Genmica comparativa
Estudios de evolucin
83
Organizacin de los Genomas
Genoma eucaritico
nCromosomas nucleares
nCromosomas de los orgnulos
Genoma procaritico
nCromosoma (nucleoide)
nPlsmidos
Genoma vrico
nCromosoma
Tamaos genmicos y complejidad morfolgica. La paradoja del valor de C
El tamao mnimo del genoma incrementa con el filum, aumenta conforme se sube en la escala
evolutiva.
La respuesta es no, no existe correlacin entre nmero
de genes y tamao del genoma.
El tamao del genoma no es proporcional al nmero de genes
que contiene:
- S. cerevisiae: 12,1 Mb, 5800 genes
- Humanos: 3200 Mb, 30000-40000 genes
Se corresponde mayor tamao del genoma
con mayor complejidad morfolgica?
Es proporcional el tamao del genoma al
nmero de genes que contiene?
84
Estructura y concepto de gen
Gen: unidad de funcin. Segmento de ADN que se transcribe, produciendo un ARN funcional (ARNm,
ARNr, ARNt u otros)
- Inicio de la transcripcin (+1), es importante.
Partes del gen:
Zona codificante:
- Pauta abierta de lectura
Zona no codificante:
- Promotor y zonas reguladoras. (aguas arriba)
- Terminador (aguas abajo)
Los genes eucariticos son discontinuos, por tanto ms grandes. El ARN necesita madurar
Los genes aumentan de tamao en eucariotas
superiores
El nmero de genes interrumpidos en eucariotas
superiores es mayor.
El aumento de tamao de los genes es debido
principalmente a los intrones, son stos los que
aumentan de tamao; en humanos hay una media de 2
kb de intrones.
Identificacin de genes
_ El anlisis de ORFs (pautas abiertas de lectura) es una tcnica efectiva para identificar genes en
procariotas. Se analiza las posibles ORFs, simpre empiezan con un codon de inicio y acaban en uno de
terminacin.
La lnea roja es la pauta de lectura adecuada, las lneas azules son demasiado pequeas para ser una
ORF.
Estructura gnica
Un segmento de ADN tiene 6 fases de lecturapotenciales
85
En eucariotas, la presencia de intrones complica la identificacin de ORFs.
_ Los genes relacionados presentan una misma organizacin, los exones son similares tienen una
secuencia conservada. Los intrones varan en secuencia y en tamao.
Intrones: modularidad evolutiva y funcional
Un exn es un dominio completo de una protena, en muchos casos.
Los genes de la dihidrofolato reductasa de
mamferos varan mucho en la longitud de
los intrones, pero mantienen la estructura.
Los genes de las globinas pueden tener
intrones de diferentes tamaos, pero tienen la
misma estructura
86
_ Rastreo zoogico: Zoo-blot: Una secuencia exnica (o
cDNA) importante estar presente en especies relacionadas
Origen de los intrones
Modelo de los intrones tempranos: Los genes se originaron como estructuras discontnuas, y
han ido eliminando los intrones.
Modelo de los intrones tardos: Los genes se originaron sin intrones, los intrones se insertaron
despus.
Evolucin de exones e intrones
Genes que codifican ms de una protena
- Procesamiento alternativo de intrones, es un proceso regulado dependiendo del tipo celular
Eliminacin de exones
Qu estructura E /I /E.. es
anterior?
Incorporacin de distintos exones
87
- Genes solapantes
La traduccin se inicia en sitios diferentes, tienen ms de
una pauta de lectura.
Cada pauta de lectura codifica para una protena diferente.
Tpico de genomas compactados (virus, bacterias).
- Genes codificados en el interior de intrones, tpico de
eucariotas. En el ejemplo, en el interior del intrn 27 hay 3
genes.
Tamaos, genes y tipos de secuencias
Tambin aumenta el nmero de secuencias de ADN repetitivo a medida que se sube en la escala
evolutiva.
- Sitios de inicio o terminacin alternativos,
dependiendo donde empiece
-
Protenas que varan en su extremo N-terminal C-terminal
88
Tipos de secuencias
9 Estructura
Unicas: genes
Repetidas: ADN altamente y moderadamente repetido
9 Funcin
Genes
- Copia nica
- Agrupamiento de genes idnticos
- Familias gnicas
Seudogenes: familias gnicas.
Otros
Estructuras nicas: genes
- Genes idnticos: Genes ARN ribosmico: Se agrupan en cluster, en eucariotas, tienen copias
en tndem. Se estn expresando continuamente porque son necesarios. Contienen intercalados
una regin que se transcribe y un espaciador que no se transcribe. Las regiones que se
transcriben son exactamente iguales, se consigue ms producto. La transcripcin se puede
observar al microscopio, es una imagen como un abeto.
Familias gnicas: genes parecidos por duplicacin en un principio, y evolucin distinta. Cumplen
casi la misma funcin pero en momentos diferentes.
Genes de globinas: Cada uno de los agrupamientos de las familias
de genes de las globinas ( y ) contiene genes y pseudogenes ().
Aparecen en cluster, agrupamiento de genes similares.
Agrupamientos de
-globina en distintos
vertebrados.
No se conserva el
agrupamiento, pero si
las globinas.
89
- Seudogenes: copia de genes pero con mutaciones, no son funcionales; ni se transcriben ni se traducen.
ADN moderada y altamente repetitivo
9 Repeticiones en tndem: ADN satlite. Se identificaron por separacin por
densidades en cloruro de cesio, tiene en cuenta el porcentaje G/ C. Se aprecian
bandas pequeas fuera de la banda central del ADN, se llamaron bandas satlite.
stas correspondan a las repeticiones en tndem. Al tener distinto contenido en G/
C se separan de la banda principal.
Centrmeros y telmeros (satlites /minisatlites). Tienen una funcin estructural, aparecen cerca
de los telmeros y centrmeros, estn implicados en la estabilidad del cromosoma, no se conoce
su funcin.
Repeticiones de unas 25-200 bp ocupando regiones de hasta 20 kb.
Funcin estructural (replicacin y estabilidad de los cromosomas)
Microsatlites: aparecen en cualquier punto del cromosoma, no se conoce su funcin.
Repeticiones de unas 2-10 bp que ocupan regiones de 150-200 bp.
Polimorfismo: uso en identificacin
Se generan por errores en la replicacin o fenmenos de recombinacin
Distintos tipos de satlites
ADN moderadamente repetitivo. Tipos de secuencias:
Repeticiones dispersas (la mayora seudogenes)
- Retroelementos: relacionados con retrotransposones y retrovirus
Elementos LTR
Retroposones: no tienen LTR
LINE (elementos nucleares dispersos grandes)
SINE (elementos nucleares dispersos pequeos)
- Transposones de ADN: Se generan por un mecanismo distinto: transposicin. Dos
mecanismos de transposicin:
Intermediario de ARN: retrotransposicin
Sin intermediario de ARN
Satlites de Drosophila: repeticiones cortas idnticas.
Son cortos y ocupan mucho espacio.
Satlites de mamferos: unidades de repeticin mayores
y ms complejas
90
Retroelementos
Comparte similitud de estructura con los retrovirus. Contienen genes
LTR-gag-pol-env-LTR. Aparecen en genomas eucariotas, pero no en los
procariotas.
Utilizan un mecanismo de retrotransposicin para
integrarse en el ADN. Primero hacen una copia de ARN, y
luego mediante transcripcin reversa hacen una cadena de
ADNds y se intercala al azar en el ADN, originndose as
una duplicacin del retroelemento eriginal. Transcripcin
reversa de ARN.
- Elementos LTR:
Retrovirus endgenos: En vertebrados
Retrotransposones: Ms frecuentes en plantas. Pueden aparecer en forma de clusters
- Retroposones: No contienen secuencias LTR, pero si los genes que les permite saltar en el ADN.
LINE (elementos nucleares dispersos grandes):
Conservan secuencias similares a las enzimas de los
retrovirus que les permite transponerse.
LINE-1: 6 kb 516.000 copias en el genoma humano.
SINE (elementos nucleares dispersos pequeos): Utilizan
las enzimas de otras secuencias para transponerse.
Alu: 1.000.000 copias en el genoma humano
Ocurre por insercin de un retrovirus original que se ha ido
duplicando y perdiendo genes.
Transposones de ADN
No requieren intermediario de ARN. Son ms frecuentes en
procariotas. Pueden transponerse de grafa:
- Replicativa: se crea una copia que se integra en otro punto
del genoma, quedando duplicado.
- Conservativa: se escinde de la cadena y se integra en otro
punto del ADN, no se replica.
Tipos:
Simples (secuencias de insercin o IS): dos
secuencias ITR, y en medio la trasposasa
Compuestos: dos secuencias de insercin (IS) y en
medio suelen tener un gen de resistencia a
antibiticos.
Retrotransposones
Retroposones
LINE
SINE
91
Genomas de orgnulos
Tenemos genomas propios en mitocondrias y cloroplastos. Suelen ser genomas circulares, aunque se han
detectado algunos de tipo lineal.
9 Genomas mitocondriales: Variables en cuanto a tamao y nmero de genes que contienen. No se
corresponde el tamao del genoma mitocondrial con la complejidad del organismo.
Contienen genes de ARNr y ARNt y algunos de los genes de los componentes de la cadena respiratoria.
Las mitocondrias humanas tienen ms genes, genoma es ms pequeo y ms compactado, poco
interrumpido.
9 Genomas de cloroplastos: De tamao y contenido en genes mas similar de una especie a otra.
Contienen genes de ARNr, ARNt y genes de protenas implicadas en fotosntesis. Es ms grande el
genoma y tienen ms genes.
Zonas genmicas representativas
Mitocondria humana
Mitocondria de S. cerevisiae
Cloroplasto del arroz
Humano
Saccharomyces cerevisiae
Drosophila melanogaster
Maiz
92
50 kb representativas del genoma humano
- Organizacin de los genomas procariticos
Modelo clsico. Nucleoide: protenas + ADN
Cromosoma nico superenrrollado organizado en el nucleoide, anclado a la
membrana. Superenrrollamiento permite ms compactacin, ocupa menos
espacio. El superenrolamiento se mantiene por la ADN girasa y la ADN
polimersa I, tambin intervienen en el desenrollamiento necesario para la
transcripcin.
El empaquetamiento del ADN se mantiene mediante protenas tipo HU
Variaciones al modelo:
- Cromosomas lineales
- Presencia de plsmidos lineales o circulares
- En arqueas tenemos protenas tipo histonas que mantienen el empaquetamiento del ADN. Tienen
una estructura como los procariotas, pero utiliza histonas como los eucariotas.
Operones bacterianos:
Los genes bacterianos se organizan en operones. Opern: conjunto de genes contiguos en el genoma y
que se expresan como una nica unidad. ARN mensajero policistrnico
En muchos casos los genes del opern estn funcionalmente relacionados. Tambin hay operones con
genes no relacionados, se necesitan los producto gnicos para respuestas al medio.
Opern lac
Opern trp
Pero no siempre los genes presentes en un opern tienen
relacin funcional
93
Estudio funcional de los genes
9 Anlisis gentico clsico
- Observacin de un fenotipo
- Bsqueda u obtencin de mutantes afectados en dicho fenotipo
- Identificacin del gen causante del fenotipo
Aplicado a multitud de organismos, incluido organismos modelo como E. coli o S. cerevisiae.
9 Proyectos Genoma: Comparacin nmero de genes en el genoma con los genes previamente
identificados mediante anlisis gentico clsico.
E. coli: 4288 genes secuenciados. 1853 identificados previamente (43%)
S. cerevisiae: 30%
Diseo de estrategias que permitan determinar la funcin de un gen partiendo de la secuencia
9 Anlisis informtico: bsqueda de homlogos
Genes homlogos, comparten un ancestro comn, pueden ser identificados por su similitud de
secuencia. Tipos de genes homlogos:
- Ortlogos: homlogos presentes en diferentes organismos
- Parlogos: homlogos presentes en un mismo organismo. Ej: familias gnicas
Se introduce la secuencia en un programa informtico que alinea secuencias: identifica las similitudes
entre las secuencias. Hace una bsqueda en las bases de datos
Si tienen elevada similitud de secuencia derivan de un ancestro comn. Los genes homlogos poseen
/cumplen la misma funcin.
Programas ms usados: BLAST y FASTA. Comparan nuestra secuencia con todas las existentes en las
bases de datos. Nos indica cual es la ms parecida a la nuestra indicando el porcentaje de similitud.
A nivel de ADN se encuentran secuencias homlogas muy parecidas. Las diferencias se hacen ms
aparentes si alineamos secuencias de aminocidos
En los alineamientos de protenas, se analiza tambin la existencia de cambios conservativos de aas. El
residuo de aminocido ha de ser el mismo. El cambio de un aminocido puede ser conservativo o drstico.
El conservativo es a favor de la homologa.
La existencia de deleciones y /o
inserciones puede dar lugar a la
posibilidad de ms de un
alineamiento
94
Identificacin de dominios
En algunos casos no encontramos homologa a lo largo de toda la secuencia. Pero podemos encontrar la
presencia de dominios que aparecen en diferentes protenas. La identificacin de dominios en nuestra
protena no nos dice la funcin, pero puede darnos pistas del tipo de proceso en que est implicada. Un
dominio de una protena siempre tiene la misma funcin, si dos protenas comparten dominios homlogos,
ambas participan en la misma funcin. Si una protena tiene varios dominios homlogos, participa en la
misma funcin.
Ejemplo: el gen tudor de Drosophila
No sabemos la funcin exacta de tudor, pero si podemos sospechar que estar relacionada con el ARN.
En humanos se busc homologa, y se encontr que tenan funciones relacionadas con el ARN.
Identificacin de homlogos: aplicacin al genoma de S. cerevisiae
Solo el 30% de los genes identificados en el genoma tenan funcin asignada por estudios previos.
Bsqueda de homlogos para el 70% restante, para asignarles una funcin homloga:
7% de ORFs dudosas
23% de genes que no poseen homlogos en otros organismos
10% de genes con homlogos identificados, pero de funcin desconocida
30% de funcin asignada por estudios previos
30% de funcin /categora asignada por identificacin de homlogos
9 Anlisis experimental: Bsqueda de la funcin del gen
Anlisis gentico clsico. Observacin de un fenotipo. Bsqueda u obtencin de mutantes afectados en
dicho fenotipo. Identificacin del gen causante del fenotipo. Secuencia de un gen inactivacin/
mutagnesis, se puede saber en que procesos est implicado. Identificacin /estudio del fenotipo.
Mtodos para la inactivacin de genes:
Recombinacin homloga:
- Transposones
- ARN interferente
Sobreexpresin del gen
Mutagnesis puntual:
- Al azar
- Dirigida
Inactivacin de genes mediante recombinacin
homloga
El mtodo ms simple de inactivar un gen es insertarle un
fragmento de ADN. Construccin de un vector que contenga
trozos (fragmento inicial y final) del gen a inactivar
flanqueando la regin de ADN que queremos insertar,
normalmente un marcador.
Ejemplo: inactivacin de genes en levaduras mediante
recombinacin homloga. Al introducirlo en la clula hay
10 repeticiones de un mismo dominio
Transporte de ARN
Metabolismo de ARN
gen
R
95
recombinacin homloga, el gen original es sustituido por el inserto, la secuencia de alrededor no se
modifica. Lo que insertamos es una cassette con un gen de resistencia a Kam de E. coli. En la levadura
confiere resistencia a geneticina.
Obtencin de ratones knockout
Ratn es organismo modelo para el estudio de enfermedades humanas. La inactivacin y estudio de
genes implicados en enfermedades humanas se realiza en ratn. Un knockout es un ratn en el que se han
inactivado las dos copias para un gen concreto. A nivel molecular, la estrategia es similar a la aplicada en
levaduras. La diferencia es que hay que conseguir un organismo pluricelular completo a partir de unas
pocas clulas manipuladas in vitro. Solamente se activa una copia del gen pero no las dos. Se manipulan
clulas madre, a partir de un blastocito. Estas clulas tienen una copia del gen silvestre y otra modificada.
Se implantan en una hembra pseudopreada, tratada hormonalmente para producirle un embarazo, esta
hembra tendr ratones quimera. Los ratones quimera se cruzan con ratones normales y se obtienen
heterocigotos, donde todas sus clulas tienen una copia del gen insertado. Estos heterocigotos se cruzan
entre s, se obtienen homocigotos.
Ratn quimera, donde algunas de sus clulas contendrn una copia del gen inactivado
Clulas en cultivo que
contienen el gen inactivado
Manipulamos clulas madre embrionarias
(totipotentes)
Implantamos las clulas ES manipuladas en
un embrin
Cruzamos este ratn quimera hasta obtener
progenie homocigota para la copia
inactivada del gen
Quimera
Knockout
Anlisis del fenotipo
96
Problema: si la inactivacin de las dos copias del gen es letal, el homocigoto no nace. Se buscan formas
de conseguir ratones donde la inactivacin se produzca especficamente en ciertos tejidos o tipos celulares.
Inactivacin de genes mediante insercin de elementos mviles
En los retrotransposones con promotor inducible, el gen se transcribe
cuando es inducido por un producto.
Podemos usar estos elementos para transponerlos e inactivar genes.
Transposicin en respuesta a estmulos externos. Usamos promotor
inducible. Problema: la transposicin es aleatoria. Se usa ms
frecuentemente para la obtencin de colecciones de mutantes.
Podemos hacer la transposicin in vitro sobre gen clonado o PCR y
luego sustituirlo mediante recombinacin homloga; se incuba el vector
con el transposn, el transposn con el gen es integrado en el organismo
por recombinacin homloga.
Inactivacin de genes mediante ARN interferente
Hay una nucleasa que degrada el ARN bicatenario, producto de un
gen que no se expresa normalmente, se producen varios fragmentos
que son complementarios al mensajero, se produce un mensajero de
dos cadenas, las nucleasas lo degradan y el gen no se expresa.
No interrumpimos el gen. Destruimos selectivamente su ARNm.
Introducimos un ARN bicatenario copia del gen a inactivar.
Ej: aplicacin en Caenorhabditis elegans: se hace un inserto con dos promotores (T7), se transcriben
tanto la cadena codificante como la complementaria formndose dos ARNm complementarios que se
acoplan y son degradados por la nucleasa. Se descubri en plantas que desencadenan un mecanismo de
ARN interferente para destruir las protenas vricas.

Introduccin en E. coli que expresa la polimerasa de T7
Este mecanismo funciona en mltiples organismos
Mamferos aparece un problema con mecanismo de respuesta paralela a la presencia de ARN 2c:
- Disminucin de sntesis de protenas
- Muerte celular
Retrotransposones
Transposones de ADN
Transcripcin desde los promotores de T7
97
Podemos usar liposomas para introducir el ARN 2c, slo se
modifican las clulas en las que se ha introducido el ARN
interferente. Una vez que se ha inactivado el gen hay que averiguar
que cambio se ha producido.
No permite trabajar con organismos completos, dado que no
produce cambios estables que se hereden.
Problemas del anlisis de la funcin mediante inactivacin de
genes.
Lo difcil no es inactivar el gen sino determinar el cambio de
fenotipo que produce.
Categoras donde podemos asignar un gen /protena:
En animales tenemos que contar tambin con los fenotipos relacionados con el comportamiento o
encontrarnos cambios sutiles que no se detectan en condiciones normales.
Anlisis de la funcin de un gen mediante sobreexpresin
Inactivacin : Prdida de funcin
Sobreexpresin: Ganancia de funcin
La ganancia de funcin normalmente es un fenotipoo funcin
contraria al de prdida de funcin. Se deben tener en cuenta
todos los controles posibles para conocer qu produce.
Vector de expresin Multicopia Promotor fuerte (muy activo)
Podemos usar un promotor especfico de un tipo celular.
Debemos distinguir si el efecto est determinado por la
sobreexpresin de nuestra protena o por el efecto general de la
sobreexpresin de una protena o la expresin en un tejido
donde normalmente no est.
Anlisis de la funcin de un gen mediante mutagnesis
Se precisa informacin detallada sobre la actividad y posible regulacin del gen.
- Inactivacin /sobreexpresin.
- Funcin general del gen.
9 Mutagnesis
Aplicacin de la mutagnesis in vitro o dirigida.
- Estudio de la relacin estructura/ funcin.
Sntesis de ADN y ciclo celular
Sntesis de protenas
Sntesis de la pared celular y
morfognesis
Metabolismo de carbohidratos
(energa)
Desarrollo
Meiosis
Arquitectura celular
Sntesis y procesamiento de ARN
Respuesta a estrs
Transporte de metabolitos
Metabolismo de lpidos
Reparacin de ADN y
recombinacin
Estructura del cromosoma
Secrecin y transporte de protenas
98
- Ingeniera de protenas. Con la ingeniera de protenas se obtienen mutantes que funcionan mejor
que la silvestre. Aplicaciones industriales
Diferentes estrategias que nos permiten eliminar, aadir o modificar uno o varios residuos del ADN:
- Al azar: Colecciones de mutantes
- Dirigida al sitio: Cambios en residuos seleccionados
Mutagnesis al azar
Obtenemos una coleccin de mutantes puntuales en diferentes posiciones en el gen a estudio.
Mtodo qumico: Tenemos nuestro gen clonado en un vector en E.coli. Sometemos la clula que lo
contiene a tratamiento con mutgeno Extraemos los plsmidos y los analizamos
Mediante PCR: Usamos la tasa de error normal de la Taq polimerasa.
Podemos aumentar la tasa de error aadiendo ciertas sales a la reaccin o
alterando las proporciones de los nucletidos
Mutagnesis dirigida al sitio
Introducimos mutaciones en sitios /secuencias especficas de la protena que nos resulten de inters,
aprovechando los sitios de restriccin. Se puede realizar mediante:
- Cambio de casete: se realizan dos cortes, uno a cada lado de la mutacin que queremos introducir,
se quita el fragmento silvestre y se coloca el fragmento con la mutacin.
- Deleciones: se puede realizar de dos formas, cuando se conoce la secuencia del gen.
Cortando en dos sitios, sacamos el fragmento de ADN relizamos la delecin y lo colocamos
de nuevo
Cortando en un sitio, se trata con una nucleasa para que destruya bases, se bloquea por la otra
parte para que no se degrade, pretendemos degradar slo por un lado, y luego se unen
Cambio de casete Deleciones
99
- Uso de oligonucletidos
Estrategia 1: Uso de la PCR. Diseamos dos
oligonucletidos, solapantes y complementarios, que
contengan la mutacin y los usamos como cebadores para la
PCR.
a) 1
er
paso: dos PCR con los oligos mutagnicos.
Amplificamos el gen en dos trozos
b) 2 paso: PCR usando los productos de las PCR anteriores
como molde y los oligos de los extremos. Obtenemos el
gen completo con la mutacin diseada.
Estrategia 2: Mutagnesis Quick-change
El gen clnado est en un vector de E.coli. Hay enzimas que slo
cortan el ADN cuando se encuentra metilado.
Nos basamos en el diferente estado de metilacin de la copia
silvestre y mutante para seleccionar la mutante. El plsmido
parental sale de E.coli metilado.
Utilizamos dos cebadores con la mutacin, para amplificar las
dos cadenas e introducir la mutacin. Los cebadores Hibridan
con el parental, la polimerasa copia todo el plsmido.
Digerimos con una enzima que slo corta el ADN metilado
(DpnI)
Transformamos en E. coli: slo se conserva la copia mutante no
metilada. La ligasa es capaz de sellar las mellas.
El ADN silvestre se ha degradado, se utiliza el mismo plsmido.
Plsmido parental
(metilado)
amplificacin
Digestin con DpnI
Transformacin en E. coli
100
Podemos introducir diferentes tipos de cambios en el ADN /protena, con pocos pares de bases en
deleciones e inserciones, porque si no se forman bucles.
Introduccin de las variantes mutantes en el organismo original
Una vez construido el mutante, tenemos que introducirlo en el organismo original para estudiar su efecto
en el fenotipo. Se hace mediante recombinacin homloga.
Estrategia de sustitucin en dos pasos:
Determinacin del patrn de expresin de un gen
Saber dnde y cuando se expresa un gen nos aporta datos sobre la
funcin del gen.
Uso de genes testigo (reporter): Sustituimos la copia del gen por
un gen cuyo producto podamos detectar fcilmente, se clona detrs del
promotor del gen. Este gen se expresa donde y cuando lo hara el gen
original (est regulado por su promotor y secuencias reguladoras)
Sustitucin de bases
Insercin de bases
Delecin de bases
1
er
paso 2 paso
Seleccionamos clulas que adquieren el marcador
Sustitucin gen silvestre por marcador
Sustitucin marcador por mutante
Seleccionamos clulas que pierden el marcador
101
Ejemplos: lac Z se puede expresar en cualquier clula, se
ha utilizado en embriones. GFP (protena verde
fluorescente), tambin se usan otros colores de
fluorocromos.
Tcnicas de hibridacin
- Northern Blot
Extraemos ARN total de diferentes tejidos e hibridamos con el ADNc del gen a estudiar.
En cada carril de la electroforesis se coloca un ARN de un tipo celular diferente, se traspasa a
membrana, se hbrida con una sonda marcada y se observa donde ha habido hibridacin. La sonda ha
hibridado con el ARN que nosotros queremos. Vemos en que tejidos aparece el ARNm de nuestro gen.
Nos da informacin del tamao del mensajero.
Nos da informacin de la presencia de isoformas, por
procesamiento alternativo, aparece ms de una banda en
carriles diferentes o en el mismo carril.
- Hibridacin in situ
Utilizamos sondas, marcadas con enzimas, de ARN antisentido u oligonucletidos en preparaciones para
microscopio. Si hay pocas copias no se detectan
Podemos detectar cambios en la distribucin del ARNm en diferentes momentos del desarrollo
Uso de la RT-PCR
Se amplifica ADN pero usando ARN como molde. Si hay producto es porque hay ARNm en la muestra,
si no hay producto de PCR no hay ARNm.
Nos permite detectar el ARNm en muestras con poco material (ms sensible).
Tambin nos permite cuantificar el nivel de expresin.
Determinacin del inicio de transcripcin de un gen
Experimentos dirigidos para conocer el sitio exacto del inicio de la transcripcin y averiguar cuantos
promotores hay.
Primer extension (extensin del cebador)
Aislamos fragmento de restriccin que contenga la zona del promotor del gen
y ORF
Marcamos el oligo en el extremo 5
102
Si secuenciamos al mismo tiempo, podemos saber el punto exacto de inicio de transcripcin. Se
compara la secuencia con el tamao del primer.
Nos sirve tambin para estudiar regulacin del promotor y /o la presencia de varios inicios de
transcripcin/ promotores. Los distintos promotores hacen que un mismo gen se exprese en unos tejidos y
no en otros. Tambin puede haber el mismo gen en distintos tejidos pero con promotores distintos.
Esta tcnica de primer extensin sirve para detectar el inicio de la transcripcin, encontrar promotores y
averiguar la regulacin de los promotores.
Localizacin /deteccin de la protena dentro de la clula
No todos los ARNm se expresan en todo momento
La localizacin subcelular de la protena viene determinada por su secuencia de aminocidos
Western Blot
Tcnica equivalente al Northern
Utilizamos anticuerpos contra la protena en cuestin
Inmunocitoqumica
Equivalente a la hibridacin in situ
Podemos aumentar la resolucin marcando el anticuerpo con
fluorocromos u oro coloidal.
Las partes marcadas son los lugares donde se est usando la protena.
Hibridamos con ARNm total y aadimos transcriptasa reversa y dNTPs
Se amplifica
Electroforesis desnaturalizante y autorradiografa
Distancia entre el extremo 3 del fragmento de ADN cebador y el inicio de
la transcripcin
103
Identificacin de interacciones con otras protenas
Sistema del doble hbrido en levaduras
Basado en la naturaleza modular de los reguladores
eucariticos. Detecta las protenas in vivo. Dos dominios:
- AD: Dominio de activacin
- BD: Dominio de unin a ADN, reconoce y se une al
promotor.
Se separan ambos dominios, se clona la protena X en un
vector con dominio BD, se produce una protena de fusin. Se
hace lo mismo con Y y el dominio AD. Ninguna de las dos
clonaciones es funcional.
X: reconoce al promotor pero no interacciona con la
polimerasa
Y: reconoce la polimerasa pero no se une al promotor.
Si las dos protenas no interaccionan no se produce la
funcin, cuando ambas interaccionan se reconstruye la
funcin de la protena.
Clonamos los genes de inters en forma de fusiones traduccionales.
Sistema del doble hbrido
La reconstruccin del activador mediante la interaccin entre las dos protenas permite la activacin
transcripcional de genes testigo
Detectamos interaccin mediante diferentes genes testigo
Estudios globales de la expresin gnica (transcriptmica)
El uso de chips de ADN permite detectar y estudiar la expresin de todos los
genes de una clula al mismo tiempo.

Protenas de fusin a los dominios de
GAL4
Colonias que crecen His Ade y son azules en X-gal
104
Se amplifican todos los genes por PCR, se obtiene ADNc, y se fijan a la
superficie del cristal del chip. El chip tiene productos de todos los genes, el ADNc
hbrida con el chip.
Si hay hibridacin es que hay mensajero en la muestra, por tanto hay expresin.
Podemos cuantificar el nivel de expresin en funcin de la seal de hibridacin
que nos produce cada punto.
Los diferentes colores indican intensidad de la seal, por tanto cantidad del
ADNc del gen en cuestin presente en la muestra original.
Podemos comparar los datos obtenidos para dos transcriptomas
Aplicaciones:
- Expresin inducible de genes
- Expresin especfica de tejido o tipo celular
- Expresin a lo largo del desarrollo
- Expresin a lo largo de los procesos de diferenciacin
- Expresin de genes durante la formacin de tumores. Puede servir para efectuar pronsticos. Se
puede discriminar el estadio del tumor y decidir mejor tratamiento.
Estudio del proteoma
Protemica: Une dos tcnicas: eletroforesis de protenas y espectrometria de masas
Hibridamos dos chips idnticos con dos
muestras de ADNc y comparamos resultados
Hibridamos un mismo chip con dos muestras de ADNc
marcadas con diferente fluorocromo. Los diferentes
colores indican si estn en una muestra o en las dos
Electroforesis bidimensional
Los picos del espectro de masas
nos sirven para identificar la
protena en cuestin
105
Tema 4
Transcripcin y traduccin. Interacciones relevantes.
Transcripcin
Sntesis de ARN sobre una sola cadena de ADN, que
acta como molde. La secuencia del ARN es
complementaria a la cadena molde y equivalente a la
cadena codificante.
El proceso est catalizado por la enzima ARN
polimerasa. Es unidireccional de 5 a 3 o de regin
proximal a distal o de regin aguas arriba a regin aguas
abajo.
La unidad de transcripcin
Una unidad de transcripcin es una secuencia de ADN
que se transcribe a un nico ARN, empezando por el
promotor y finalizando en el terminador.
Comprende:
- Promotor, al principio del gen
- Sitio de inicio y regin que codifica
- Terminador, secuencia al final del gen
El primer nucletido que se transcribe es el punto de
referencia +1.
Fases de la transcripcin
Reconocimiento del promotor: unin de la ARN polimerasa al ADN
en un promotor
- Formacin del complejo cerrado: la ARN polimerasa
abrazada al ADN
- Formacin del complejo abierto: ADN parcialmente
desnaturalizado
Los promotores estn alineados de acuerdo a sus homologas, o
secuencias de bases similares que aparecen justo delante de la primera
base transcrita (punto de iniciacin)
Iniciacin: sntesis de los primeros enlaces nucleotdicos en el ARN.
Suele haber sntesis abortivas hasta que no hay 4-5 nucletidos, fase
crtica, no empieza la sntesis real. La fase de iniciacin termina
cuando la enzima logra elongar la cadena y abandona al promotor.
Elongacin: formacin de la cadena. Implica el movimiento de la
burbuja mediante la alteracin de la estructura del ADN, en la que la
cadena molde de la regin que se ha desenrollado se aparea con el
ARN naciente en el punto de crecimiento.
Terminacin: requerimientos distintos en procariotas y eucariotas.
Implica el reconocimiento del punto que determina el final de la
adicin de bases a la cadena.
&DGHQDFRGLILFDQWH
&DGHQDPROGH
La secuencia del ARN es
complementaria a la cadena molde
y equivalente a la cadena
codificante
&DGHQDFRGLILFDQWH
&DGHQDPROGH
La secuencia del ARN es
complementaria a la cadena molde
y equivalente a la cadena
codificante
Aguas arriba Aguas abajo
106
INICIACIN
La burbuja de la transcripcin
La transcripcin ocurre en una burbuja, en la que el ARN es
sintetizado mediante el apareamiento de bases con una cadena de
ADN en la regin desenrollada transitoriamente. A medida que la
burbuja progresa, el ADN bicatenario se vuelve a formar detrs de
ella, desplazando al ARN como una cadena nucletdica sencilla.
Durante la transcripcin, la burbuja se mantiene dentro de la
ARNpolimerasa, que desenrolla y enrolla el ADN, mantiene las
condiciones de las cadenas codificante y molde.
La burbuja de la transcripcin (dentro de la ARN
polimerasa) se desplaza a lo largo de la unidad de
transcripcin
La polimerasa es un complejo enzimtico grande y
organizado, el sitio cataltico rodea a la cadena molde.
RNA polimerasa de E. coli (Eubacterias)
La capacidad de catalizar sntesis de ARN define el componente mnimo (ncleo) de la polimerasa:
2
.
Holoenzima: complejo competente para la iniciacin:
2

Las ARN polimerasas de las eubacterias tienen 4 tipos de

subunidades: , , tienen tamaos relativamente constantes en
especies bacterianas diferentes, y es ms variable.
Las subunidades y componen el centro cataltico.
La subunidad es necesaria para ensamblar el ncleo enzimtico, importante para mantener la estructura,
interviene en el reconocimiento del promotor y en la interaccin de la ARNpol con factores auxiliares.
La subunidad interviene especficamente en el reconocimiento del promotor, slo aparece en la
iniciacin, para reconocer el ADN, se separa del complejo en la elongacin.

Cadena molde
Cadena codificante
Cadena molde
Cadena codificante
Ensamblaje de la enzima
Reconocimiento del promotor
Une algunos activadores
Especificidad del
promotor
107
Polimerasas eucariotas
Tpicamente 12 subunidades
Polimerasa I
- Sintetiza ARNr en el nucleolo
- La de mayor actividad
Polimerasa II
- Sintetiza ARNhn (heterogneo nuclear) en el nucleoplasma, que dar lugar al ARNm
Polimerasa III
- Sintetiza ARNm pequeos en el nucleoplasma (ARNt y otros)
Algunas subunidades son comunes a las tres.
RNApol II
Hay 3 polipptidos mayores muy similares a los de E.coli (, y ). La polimerasa en eucariotas es ms
compleja, puesto que el ADN tambin lo es. Hay ms posibilidades de interaccin.
Estructura de los complejos ADN-RNA polimerasa
RNA polimerasa tiene un canal para el ADN.
Dimensiones de la polimerasa de E. coli: 90 95 160
Dimensiones del ADN dentro de la
polimerasa, en la burbuja:
- 25 bases de longitud
- 9 bases apareadas
- 10 bases aguas arriba
- 10 bases aguas abajo
El ADN se retuerce en el sitio activo.
El resto de subunidades mantienen la estructura.
La RNA polimerasa II de
levaduras: 12 subunidades
108
Hay polimerasas ms simples, bacterifagos, virus, fagos. El fago T7
tiene la polimerasa con un solo polipptido, es muy rpida.

Anlisis de interacciones ADN /protenas
Retardo /retraso en gel o cambio de banda (band shift)
Se detectan los complejos ADN- protena. En un gel de electroforesis se detecta porque las protenas
retrasan la movilidad del ADN, con lo que la banda se retrasa. Se necesita tener un fragmento de ADN
definido, que se hace por PCR.
Se puede ver por medio de una electroforesis, en el lugar de la banda aparece una banda retardada. Se
usan geles no desnauralizantes o nativos. En la prctica lo habitual es que parte de la banda se retrase
(aparecen 2 o mas bandas, si hay mas de un sitio de unin pueden aparecer 3 o mas).
Se requieren fragmentos definidos de ADN y protenas purificadas o no (extractos).
En principio no hace falta marcar el ADN, pero hay que poner suficiente para verlo a simple vista.
Cuando hay muy poca protena s se usa radiactividad.
Esta tcnica no permite identificar secuencias para las que son afines las protenas, solamente que se
unen protenas.
Requiere:
Fragmentos definidos de ADN
Protenas purificadas o no (extractos)
La regin promotora de nblA: sitios de unin a protenas (diapositiva n 13)
Estrategias experimentales para mapear interacciones con protenas
Footprinting
- Estrategias de proteccin frente a digestin o modificacin.
- Estrategias inversas: la modificacin interfiere con la interaccin.
Se usa para mapear el sitio de unin a la protena. Se basa en que si se tiene una protena unida al
ADN y se ataca a ste con endonucleasas, stas no cortan el fragmento protegido por la protena, y
puede ser detectado.
Hay estrategias inversas, que consisten en modificar la regin de inters, con lo que ahora la protena
no puede unirse.
- Ensayo de proteccin frente a nucleasas (DNAasa I) o footprinting clsico: localizacin precisa
del sitio de unin de una protena a un fragmento de ADN. Requiere geles de secuenciacin y
marcaje de ADN. Se usa ADN bicatenario marcado en un extremo. Se intenta introducir un corte
en cada cadena. Permite obtener fragmentos marcados con diferentes tamaos. Se hace lo mismo
en presencia de la protena y se vuelve a digerir con nucleasa, donde se encuentra la protena la
endonucleasa no puede cortar.
109
Una secuencia de ADN unida a la protena se digiere
parcialmente con una endonucleasa para atacar enlaces
fosfodister individuales en el cido nucleico. Bajo las
condiciones apropiadas, un enlace particular se rompe en
algunas de, pero no en todas, las molculas de ADN. Las
posiciones en las que se ha cortado se reconocen mediante
el marcaje de las molculas de ADN solamente en un
extremo de una hebra, origina un fragmento de longitud
nica. Los fragmentos digeridos se recuperan y se someten
a electroforesis. Cada fragmento que tenga un extremo
marcado produce una banda radiactiva. La posicin de la
banda corresponde al nmero de bases en el fragmento.
Se corren dos reacciones en paralelo, un control de ADN
puro y una mezcla experimental que contiene molculas de
ADN unidas a protenas. Cuando una protena unida
bloquea el acceso de la nucleasa al ADN en la mezcla
experimental, aquellos enlaces que se encuentren en la
secuencia unida no se rompern.
En el control cada enlace se rompe, generando una serie de bandas, cada una de las cuales representa
una base. En el fragmento protegido, los enlaces no se pueden romper en la regin que une la protena,
no se originan bandas que representen los fragmentos de las longitudes correspondientes.
Comparando el control y los carriles experimentales con una reaccin de secuencia que se corre en
paralelo es posible leer la secuencia correspondiente directamente, y as identificar la secuencia de
nucletidos del sitio de unin.
Hay bandas con distinta intensidad porque la ADNasa corta con cierta especificidad. Las regiones que
desaparecen son los sitios de unin a las protenas.
La tcnica permite ver zonas de unin conjunta entre dos protenas.
En ciertos casos se aprecia la disminucin de intensidad de las bandas en lugar de su desaparicin, o en
ciertos casos inclusive el aumento de la intensidad, porque la protena cambia la conformacin del ADN y
aumenta la afinidad de la ADNasa por la zona.
- Proteccin por NFAT (factores de la transcripcin)
proteccin frente a DNAsa
110
Footprinting con agentes modificadores de bases
Los puntos en los que la ARN polimerasa contacta con el
promotor se pueden identificar modificando la tcnica del
ensayo de proteccin con agentes modificadores de bases.
Permiten la rotura en el enlace correspondiente en la cadena
polinucleotdica. El sitio de rotura se puede identificar de
forma similar a la anterior.
La enzima protege al ADN contra el agente qumico.
En ciertos casos en vez de la ADNasa se usa un DMS
(dimetilsulfato), que modifica guaninas. Se generan
footprintings con menos bandas (solo las que acaban en G).
Tras el marcaje se usa piperidina, reactivo que corta detrs
Motivos de unin a ADN
Motivos: segmentos de protenas (dominios) con estructura secundaria caracterstica, que interaccionan
con el ADN. Regin corta con una estructura secundaria particular, normalmente hlices .
- HTH: hlice-giro-hlice
- HLH: hlice-lazo-hlice
- Dedos de cinc
- Cremalleras de leucina
HTH: dos hlices con un ngulo caracterstico.
- Presente en reguladores procariticos y algunos eucariticos
- Homeodominio: presente en genes hometicos, caractersticos del desarrollo animal. La
secuencia primaria de la protena es diferente pero la estructura secundaria se mantiene.
proteccin frente a dimetil-
sulfato (DMS)
111
Una de las hlices se sita en el surco mayor del ADN, hlice de posicionamiento, reconoce y realiza los
contactos con el ADN. La otra hlice es de posicionamiento, participa en colocar la hlice de
reconocimiento. Entre la hlice de reconocimiento y el ADN se establecen puentes de hidrgeno.
Homeodominio: forma parte de un dominio mayor de la protena. Tiene dos
hlices ms de posicionamiento
La hlice 3 del homeodominio se une al surco
mayor del ADN, y las hlices 1 y 2 se sitan por
fuera de la doble hlice. La hlice 3 contacta tanto
con la columna de fosfato como con las bases
especficas. El extremo N-terminal se sita en el
surco menor y realiza contactos adicionales.
El homeodominio solo es responsable de la unin
al ADN
HLH: son motivos de homo y heterodimerizacin.
Los contactos los proporciona la hlice- por medio de
aminocidos bsicos. Cada hlice anfiptica presenta una cara de
residuos hidrofbicos en un lado y de residuos cargados en el otro
lado. El motivo permite que las protenas dimericen, y una regin
bsica cercana contacta con el ADN.
Diferentes tipos de heterodmeros tienen diferente afinidad por
sitios de unin en el ADN y efectos muy distintos (activan o
reprimen) sobre la transcripcin.
Hay dos tipos de protenas HLH dimerizadas:
- bHLH: con regiones bsicas, interaccionan con el ADN
- HLH: uno de las unidades no tiene regiones bsicas, no interaccionan con el ADN.
Dedos de cinc: comprende un motivo de unin al ADN, un patrn
caracterstico de residuos de cistena e histidina. Un grupo de
aminocidos conservados se une a un in de cinc y forma un
dominio relativamente independiente en la protena.
El motivo toma su nombre del bucle de aminocidos que protuye
desde el sitio de unin al cinc.
Tipo Cys2-his2:
Secuencia: Phe y Leu son aminocidos hidrofbicos conservados
Presentes en protenas eucariotas y en protenas de unin al ARN, el motivo
puede aparecer en un nmero variable de veces. La hlice- es la que
interacciona con el ADN
Tipo Cys2-Cys2: sin histidina, forman dmeros, caracterstico de los
receptores de glucocorticoides.
Cys-X
2-4
-Cys-X
3
-Phe-X
5
-Leu-X
2
-His-X
3
-His
112
Cremalleras de leucina: secuencia de aminocidos con
un residuo de leucina en cada sptima posicin. Tpicas
de eucariotas
Una cremallera de leucina en un polipptido interacta con una
cremallera de leucina en otro polipptido para formar un dmero.
Adyacente a cada cremallera hay una secuencia de residuos con
carga positiva (bsicos), implicada en la unin al ADN. La
leucina es un motivo de dimerizacin, permitiendo mantener las
hlices juntas, une los monmeros y contina con la regin que
mantiene los contactos con el ADN.
Las dos cremalleras de leucina forman una estructura en forma de Y, en la
cual las cremalleras forman el tallo y las dos regiones bsicas se bifurcan
simtricamente para formar los brazos de unin al ADN. Esto se conoce
como el motivo estructural bZIP y explica por qu las secuencias diana para
tales protenas son repeticiones invertidas sin separacin.
Promueven la formacin de homodmeros y heterodmeros con otras
protenas, adquieren funciones distintas.
Reconocimiento del promotor en bacterias
El promotor es una secuencia de ADN que debe ser reconocida por protenas y difiere de otras secuencias
que han de ser transcritas o traducidas. La informacin que determina la funcin del promotor la
proporciona directamente la secuencia del ADN: su estructura es la seal. Ejemplo clsico de elemento de
accin en cis.
Las regiones expresadas solo adquiren significado despus de que la informacin es transferida en la
forma de otros cidos nucleicos o protenas.
La polimerasa tiene afinidad por el ADN pero no distingue secuencias
especficas, no tiene motivos de reconocimiento.
El factor sigma (polipptido ).
La transcripcin slo puede ser iniciada por la holoenzima. El factor sigma
asegura que la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de una forma
estable solamente en los promotores. El factor sigma es liberado cuando la
cadena de ARN alcanza 8-9 bases, dejando al ncleo de la enzima para que
proceda con la elongacin.
El ncleo de la enzima tiene una afinidad general por el ADN, por atraccin
electrosttica entre la protena bsica y el cido nucleico acdico. Cualquier
secuencia de ADN (al azar) que se encuentre unida a la ARN polimerasa
mediante esta unin general se denomina sitio de unin dbil.
El factor sigma introduce un cambio en la afinidad de la polimerasa por el
ADN. La holoenzima ha perdido su capacidad para reconocer los sitios de
unin dbiles, por tanto el factor sigma desestabiliza la capacidad de unir
ADN de forma general, pero aumenta la afinidad especfica por regiones
concretas que son los promotores. El factor sigma confiere afinidad por
promotores.
El promotor de E.coli
Reconoce la holoenzima cargada con
70
.
Los sitios de reconocimiento en el ADN se pueden definir como una secuencia ideal constituda por las
bases que aparecen con ms frecuencia en una posicin determinada. Una secuencia consenso es un
fragmento corto en el promotor que est conservado y es crucial para su funcin. La conservacin de slo
Las Leu en las caras hidrofbicas
de las hlices interactan entre s
bZIP
113
secuencias consenso muy cortas es una caracterstica de sitios reguladores (promotores) tanto en procariotas
como en eucariotas.
En los promotores bacterianos hay 4 elementos conservados:
- El sitio de iniciacin: generalmente una purina, la base
central de la secuencia C
A
/
G
T
- La secuencia en la regin 10. Caja TATA
- La secuencia en la regin 35
- La separacin entre las secuencias 10 y 35 (16-19
pb)
Aguas arriba del sitio de iniciacin, hay una regin de 6 pb que es reconocible en casi todos los
promotores. El centro se encuentra a unas 10 pb aguas arriba del sitio de iniciacin, secuencia 10. el
consenso es TATAAT. Los nmeros subndice representan el porcentaje de aparicin de la base encontrada
con ms frecuencia, variando entre el 45 y el 96%.
La secuencia 35 tiene el consenso TTGACA.
Cuanto ms parecido sea un promotor a la secuencia consenso, ms fcil es la transcripcin.
Anlisis de interacciones promotor- ARN polimerasa: estrategias
Moleculares:
- Proteccin
- Modificacin
Genticas: mutaciones que afectan a la actividad promotora disminuyen la frecuencia de iniciacin
- Efecto de mutaciones
- Supresiones

La polimerasa se une principalmente a una cara del ADN: cadena codificante. Tiene ms flechas en el
esquema indica que la relacin con la holoenzima es asimtrica.
Una cara del promotor contiene los puntos de contacto para la ARN polimerasa.
De los ensayos de mutacin se deduce que las regiones 35 y 10 contienen la mayora de los puntos de
contacto para la enzima. Se demuestra que son secuencias importantes porque las mutaciones en esa zona
disminuyen la eficacia de la transcripcin. (doble flecha lila)
Las mutaciones que hacen que la secuencia se aleje del consenso dan informacin sobre la especificidad
(bases concretas) en la interaccin holoenzima-ADN.
Las flechas negras sealan sitios protegidos por la polimerasa (Footprinting), hay regiones que no son
atacadas porque estn protegidas por la polimerasa, ms en la cadena codificante, hay dos bloques de
Regin 10 T
80
A
95
T
45
A
60
A
50
T
96
Regin -35 T
82
T
84
G
78
A
65
C
54
A
45
Modificaciones que impiden la unin de la
polimerasa
Sitios protegidos por la polimerasa, la
polimerasa protege de la modificacin
Mutaciones que afectan la actividad
promotora, afecta a las 2 cadenas. Las
mutaciones eliminan o reducen la actividad del
promotor
-10: conversin CC a CA
-35: formacin de CC
114
proteccin y abarca una zona ms amplia que la anterior, siendo la zona de unin a la polimerasa donde se
establecen los enlaces fuertes.
Las flechas verdes indican modificaciones que impiden la unin de la polimerasa, ensayos de
interferencia (protena unida a una secuencia especfica). La interferencia se hace aguas arriba de la regin
35, cualquier grupo qumico que se aada impedir que se forme el complejo.
Como el ADN se desnaturaliza en la burbuja: las bases desapareadas de la burbuja son susceptibles de ser
modificadas por agentes qumicos (metilacin) permitiendo definir que la caja TATA forma parte de la
burbuja y aguas abajo se encuentra el inicio de la transcripcin.
La regin 10 est implicada en la formacin del complejo abierto, conversin del complejo cerrado a
complejo abierto.
La regin 35 est implicada en la formacin del complejo cerrado y con la interaccin con la polimerasa
en el contacto inicial.
Una cara del ADN establece ms y mejores contactos con la polimerasa que la otra.

El inicio de la transcripcin es muy dependiente del grado de superenrollamiento del ADN. Enrollamiento
y desenrollamiento ocurren de forma simultnea a medida que la polimerasa transcribe el ADN. A medida
que la polimerasa empuja hacia delante sobre la doble hlice, va generando superhlices positivas (ADN
ms empaquetado), y deja superhlices negativas detrs (ADN parcialmente desenrollado); aumenta el
nmero de vueltas por delante y disminuye por detrs. La torsin negativa facilita la desnaturalizacin. La
girasa introduce hlices negativas; la topoisomerasa quita hlices negativas.
Muchos promotores mejoran la transcripcin disminuyendo el superenrollamiento, sobre todo las cajas
que tienen menos AT.
La polimerasa cambia de conformacin segn est en iniciacin o elongacin.
Cuando se encuentra en fase de elongacin se libera del factor sigma y se hace
ms compacta abarcando un menor nmero de bases.
Relacin estructura funcin en
70
Mutaciones y supresiones identifican zonas de interaccin. Los ensayos de supresin evidencian la
interaccin. Las mutaciones supresoras nos indican los sitios de contacto.
La evidencia directa de que contacta con el promotor es la presencia de mutaciones en que suprimen
mutaciones en las secuencias consenso. Cuando hay una mutacin que impide el reconocimiento por la
polimerasa en una posicin determinada del promotor, y hay una mutacin compensatoria en que permita
que la polimerasa utilice el promotor mutante, se puede decir que el par de bases de ADN relevante est en
contacto con el aminocido que ha sido sustituido.
Sin mutacin (silvestre) se establece interaccin entre aminocidos de y bases especficas del ADN, si
se muta alguna base no se produce interaccin, pero una mutacin en el aminocido se restablece la
interaccin.
115
Mapa de
70
de E.coli que identifica las regiones conservadas. Las
regiones 2.1 y 2.2 contactan con el ncleo de la polimerasa, es la parte
ms conservada de .
2.3 se requiere para la fusin y 2.4 y 4.2 contactan con los elementos del
promotor en 10 y 35.
La regin N-terminal evita que 2.4 y 4.2 se unan al ADN en ausencia del
ncleo de la enzima.
Delecionando N-terminal se produce una unin fuerte de con el ADN
en secuencias promotoras, esto sugiere que esta regin se comporta como
un dominio de autoinhibicin, por s solo no se establece la interaccin
con el ADN, precisa de la polimerasa.
2.4 y 4.2 forman -hlices en la protena, establecen contactos, puentes
de hidrgeno, con ciertas bases en la cadena que no sirve de molde en la
secuencia 10 del promotor.
Los factores sigma confieren especificidad a la polimerasa
El factor
70
es universal, hay otros factores que establecen una relacin coordinada de grupos de
genes, transcriben operones relacionados y reconocen promotores caractersticos.
Los factores sigma de
E.coli reconocen a los
promotores con diferentes
secuencias consenso.
Reguln: conjunto de operones con regulacin comn, el regulador puede ser . Se asocian en relacin a
situaciones ambientales, estrs, choque trmico, se produce la sntesis de nuevas protenas.
El factor ms comn, responsable de la transcripcin de la mayora de los genes en condiciones
normales es
70
. los factores alternativos se activan en respuesta a cambios ambientales, o para la
expresin de genes flagelares durante el crecimiento. Todos los factores pertenecen a la misma familia
de protenas (son homlogos) excepto
54
.
Induccin del factor : en la clula hay abundante
70
, pero si cambian las
condiciones ambientales la sntesis de protenas que se estn produciendo en
ese momento se para o disminuye, y se sintetiza una nueva serie de protenas,
stas son producto de genes relacionados con la alteracin ambiental.
En un choque trmico, por ejemplo, el gen rpoH es un regulador necesario
para poner en marcha la respuesta. Su producto es
32
, que funciona como un
factor alternativo que activa la transcripcin de los genes del choque
trmico.
Los factores alternativos compiten con
70
por el ncleo de la enzima
disponible, por tanto los genes que se transcriben durante la alteracin
ambiental depende del equilibrio entre .
116
Cada factor obliga a la polimerasa a iniciar la transcripcin en series de promotores determinados.
Analizando la secuencia de estos promotores se puede mostrar que cada serie se caracteriza por la
presencia de elementos reguladores nicos. La secuencia de cada tipo de promotor asegura que slo puede
ser reconocido cuando la polimerasa es dirigida por el apropiado.
Una caracterstica de los promotores para cada enzima es que tienen el mismo tamao y localizacin en
relacin con sitio de iniciacin, y que muestran secuencias conservadas slo alrededor de los centros de
las secuencias 35 y 10. las secuencias consenso para cada serie de promotores difieren unas de otras en
una o ambas secuencias 35 y 10, la transcripcin de los diferentes grupos es mutuamente excluyente.

54
, se usa en condiciones de escasez de nitrgeno, tiene una separacin de 6 pb entre las secuencias
consenso.
Factores : control temporal y espacial de la expresin gnica
Esporulacin en Bacillus subtilis
La esporulacin implica la diferencia de una bacteria vegetativa
en una clula madre que se lisa, y una espora que se libera. Es
como un proceso de minidesarrollo por expresin gnica
programada en el tiempo. Tiene ms factores . La esporulacin
es un ejemplo de cambios de factores .
El ADN se replica, se segrega un genoma hacia un extremo de
la clula y es rodeado por la capa de la espora, especializacin en
los dos polos celulares, cuando se forma el septo, con genes que
tienen que ver con diferentes procesos.
El control gnico est dirigido por diferentes que regulan
diferentes operones. Dentro del grupo de genes uno codifica un
factor alternativo.
La expresin gnica en el tiempo est controlada por . hay
genes de esporulacin tempranos y tardos, programacin en el
tiempo y diferenciacin en el espacio; cambiando se producen
cambios en el tiempo y en espacio.
La esporulacin implica cambios
sucesivos de los factores s que controlan la
especificidad de la ARN polimerasa. Las
cascadas en la protoespora y en la clula
madre se relacionan mediante seales que
se transmiten a travs del septo (flechas
horizontales).
117
Iniciacin en eucariotas
Los promotores son reconocidos por factores de transcripcin y no por la polimerasa. A la polimerasa le
encuentra encontrar los promotores, necesita de los factores auxiliares que la atraen.
- Tres ARN polimerasa.
ARN pol I: transcribe ARNr
ARN pol II : transcribe ARNm
ARN pol III: transcribe ARNt y ARNsn (nuclear pequeo), 5S
- Abundancia de factores auxiliares (TF, de transcription factor). TFIIIB, factor de la
polimerasa III.
- Abundancia de secuencias reconocibles por distintos factores.
Mayor complejidad que en procariotas.
Inicio en promotores tipo I (humanos)
La ARN polimerasa I tiene mayor actividad, reside
en el nucleolo y transcribe los genes que codifican el
ARNr.
Hay muchas copias de promotores I todos iguales, los
genes ribosmicos son iguales.
Estructura modular: el promotor tiene 2 mdulos
- Ncleo del promotor, secuencia necesaria para
iniciar la transcripcin, no hay un consenso claro,
pero cerca del inicio hay una regin rica en GC y
otra rica en AT. Rodea al punto de inicio, desde 45
a +20.
- UPE o elemento de control aguas arriba, aumenta la
transcripcin. No es un elemento esencial in vitro
pero permite niveles ms altos de transcripcin, in
vivo es necesaria.

Factores auxiliares: protenas que se unen al ADN previo a la transcripcin. La ARN pol I tiene dos:
- UBF: afinidad por UPE. Polipptido que se une a un elemento rico en GC. La unin de la
protena a la regin UPE favorece la unin de otras protenas a la regin posterior. Tiene funcin
de reclutamiento, primero atrae a SL1 y segundo atrae a la polimerasa.
- SL1: unin posterior al ncleo de la polimerasa. Por s mismo no tiene especificidad por el
promotor, pero una vez que se ha unido UBF, el SL1 se puede unir de forma cooperativa para
extender la regin de ADN que es cubierta. SL1 consta de 4 protenas, una de ellas es la TBP
(TATA bilding protein), protena de unin a la caja TATA. Factor de posicionamiento.
Una vez que ambos factores se han unido, la polimerasa se puede unir al ncleo del promotor para
iniciar la transcripcin, formando una estructura muy tupida.
La ARN polimerasa III: tiene 3 tipos de promotores. Tiene ms promotores que la polimerasa I y
menos que la II.
- Tipo 1 y 2, son promotores internos, de control interno,
ICR (internal control region). Se encuentran aguas abajo
del inicio de la transcripcin. ARNt y 5S. Tienen dos
tipos de elementos, dos secuencias cortas se encuentran
separadas por una secuencia variable:
A y C, tipo 1
A y B, tipo 2, si las secuencias estn demasiado
juntas se puede anular la funcin
TBP
118
- Tipo 3: son promotores tpicos con tres elementos:
ARNsn
Iniciacin en promotores internos de polimerasa III, tipos 1 y 2
La iniciacin a travs de los promotores internos de pol III implica a los factores de ensamblaje TFIIIA
y TFIIIC, el factor de iniciacin TFIIIB y la ARN pol III.
- TFIIIA y TFIIIC: factores de ensamblaje, permiten la unin de TFIIIB (TBP) cerca del inicio
- TFIIB: factor de posicionamiento, permite la unin de pol III en el sitio de inicio.
TFIIIA pertenece a la clase de protenas con dedos de cinc.
TFIIIB consta de TBP, que atrae a la polimerasa, y de otras dos protenas.
TFIIIC es un gran complejo protenico que contiene al menos 5 subunidades.
TFIIIC reconoce el sitio B, pero se une a una
zona ms extensa que incluyen a A y B
TIIIFA se une a una secuencia que incluye el
sitio C, el cual se requiere para la funcin de
unin de TFIIIC.
La unin de TFIIIC permite que TFIIIB se una a
una secuencia alrededor del punto de inicio.
ARN polimerasa II: iniciacin
Tiene muchos promotores diferentes, para la organizacin general de un promotor se define un
promotor genrico, que ser la secuencia ms corta posible en la cual la ARN pol II pueda iniciar la
transcripcin.
Promotor genrico contiene como mnimon:
- Caja TATA: aproximadamente en 25, hay promotores sin caja TATA
- Sitio de iniciacin: Pirimidina-A-Pirimidina, donde A es el sitio +1
Factores de transcripcin tipo II
Generales: aparato basal de transcripcin, se encuentran en casi todos los promotores
Especficos: de un tipo celular concreto, los ms abundantes e importantes es eucariotas
superiores
Inducibles: aparecen en respuesta a determinadas seales ambientales
El complejo de iniciacin: ensamblaje
El complejo de iniciacin se une a los promotores de ARN pol II en una
secuencia ordenada de asociacin de los factores de transcripcin.
1. Unin de TFIID: interacta con la caja TATA
2. Otros factores se unen en un orden determinado
3. Unin de la RNA pol II
4. Algunos factores se unen despus
119
El primer paso en la formacin del complejo es la unin del factor
TFIID a la caja TATA. TFIID tiene dos tipos de componentes, TBP
que reconoce TATA, y TAFs son factores asociados dependientes
de promotor.

TBP es un factor universal en eucariotas y comn a los tres tipos de iniciacin. Se une al ADN en la
secuencia TATA del surco menor (todas las protenas conocidas de unin al ADN lo hacen en el surco
mayor) en forma de silla de montar. Engloba al ADN, tiene una estructura simtrica, dos dominios
homlogos. Empuja en el surco menor de la doble hlice abrindolo un poco, esto provoca torsiones en el
ADN que sufre un fuerte impacto, y permite que otras protenas entren en contacto o eviten el mismo,
induce una curvatura en el ADN de 80, afectando las interacciones con otras protenas.
Las ARN polimerasas se sitan en todos los promotores mediante un
factor que tiene TBP.
TFIIIB se une junto a TFIIIC mientras que SL1 se une en conjuncin
con UBF1.
TFIID es responsable solamente del reconocimiento de promotores
para la ARN pol II.
En un promotor con un elemento TATA, TBP se une de manera
especfica al ADN, pero en otros promotores puede ser incorporado
por asociacin de con otras protenas que se unen al ADN.
Cualquiera que sea el medio de entrada en el complejo de iniciacin,
tiene el propsito comn de interactuar con la ARN polimerasa.
Liberacin de promotores tipo II


Requiere fosforilacin del extremo carboxi-terminal de la ARN pol II
Se fosforila la subunidad mayor de la polimerasa para que pueda
empezar a trabajar.
Promotores
pol II
Promotores
pol II
Promotores
pol III
Promotores
pol I
Promotores
pol III
Promotores
pol I
120
Terminacin de la transcripcin en bacterias
La terminacin implica el reconocimiento del punto que determina el
final de la adicin de bases a la cadena. Para terminar la transcripcin,
hay que cesar la formacin de enlaces fosfodister, y el complejo de
transcripcin debe desintegrarse. Cuando se aade la ltima base a la
cadena de ARN, la burbuja se colapsa porque el dplex ARN-ADN
desaparece, el ADN vuelve a su doble hlice y el ARN y la enzima son
liberados.
Los terminadores son secuencias necesarias para la terminacin.
La secuencia terminadora, 3, siempre se transcribe.
Se forman estructuras en forma de horquilla en el ARN, importantes
para la terminacin. Interactan con la polimerasa.
La polimerasa no transcribe siempre a la misma velocidad, hace
pausas, si en una de esas pausas la interaccin ADN-ARN es dbil la
transcripcin se acaba.
Paralelismos con la iniciacin:
- Secuencias en cis, son importantes en el sitio donde estn:
Promotores
Terminadores
- Rotura de puentes de hidrgeno
Iniciacin: ADN-ADN
Terminacin: ADN-ARN
- Interacciones ARN polimerasa con:
ADN en la iniciacin
ARN en la terminacin
- La terminacin es dependiente de la estructura secundaria del ARN. La estructura secundaria del
ARN, provocada por apareamientos intracatenarios, es importante para la funcin y est
relacionada con la terminacin.
Terminadores de E.coli
Los terminadores se han clasificado segn el requerimiento de
factores adicionales por parte de la ARN polimerasa para
terminar in vitro.
- Terminadores intrnsecos: la polimerasa puede terminar en
sitios especficos en ausencia de cualquier otro factor. Son
los ms abundantes. Hay terminadores ms eficientes que
otros. Tienen caractersticas estructurales, necesarias para
la terminacin:
Una horquilla en la estructura secundaria, rica en pares
G-C. hace ms estable la estructura.
Sucesin de residuos de U al final, apareamiento dbil
ARN-ADN
Terminador: AAA en el ADN, ser UUU en el ARN
Los terminadores intrnsecos incluyen regiones palindrmicas
que forman horquillas que varan entre 7-20 pb.
Regin del tallo rica en G-C
Tramo de U monocatenario
121
- Terminadores dependientes de rho: necesitan de
la adicin de un factor. Hay mutaciones que
demuestran que el factor est implicado en la
terminacin in vivo. Hay pocos terminadores
dependientes de rho en E.coli, pero si en fagos.
Rho: protena esencial implicada en la terminacin de transcritos, slo funciona en la etapa de
terminacin. No se puede delecionar el gen, se pueden hacer mutaciones puntuales que disminuyen la
funcin, pero no de prdida total.
Las secuencias requeridas para la terminacin se encuentran aguas arriba del terminador. El ARN es rico
en C y pobre en G.
Modelo de accin de rho
El factor rho persigue a la polimerasa a lo largo del ARN y
puede provocar la terminacin cuando alcanza a la enzima
haciendo una pausa en un terminador dependiente de rho.
La ARN pol transcribe el ADN. Rho se une a un sitio de
reconocimiento sobre el ARN. Rho se mueve a lo largo del
ARN siguiendo a la ARN pol. La ARN pol hace una pausa en
el terminador y rho lo alcanza. Rho desenrolla el hbrido
ADN-ARN en la burbuja de transcripcin. Terminacin: la
ARN pol, rho y ARN se liberan.
Rho tiene actividad ATPasa, dependiente de ARN, y
helicasa 5-3, causa la separacin ADN-ARN. La hidrlisis
del ATP se utiliza para proporcionar energa para la reaccin.
El ARN de procariotas es policistrnico, se transcribe y se
traduce a la vez, por tanto hay ribosomas en el ARNm y rho
no puede funcionar mientras haya ribosomas, si no hay
ribosomas rho llega al terminador y acaba la transcripcin.
Polaridad de mutaciones: sin funcin aguas abajo, hay
orientacin. Una mutacin en un codn de terminacin de
protena se traducir una protena mutante y el resto, aguas
abajo no se traduce, el ARN se acorta.
Terminador dependiente de rho dentro de la unidad de
transcripcin, antes del terminador utilizado habitualmente,
normalmente estos terminadores tempranos no se utilizan
debido a que los ribosomas evitan que rho alcance a la ARN
polimerasa. Pero una mutacin sin sentido libera a los
ribosomas entonces rho es libre de unirse o de moverse por el
ARNm, capacitndolo para actuar sobre la ARN polimerasa
en el terminador.
Terminacin en eucariotas
Terminadores reconocibles
ARN pol I
- Secuencia de 18 pb en ARN reconocible por factor de
terminacin
ARN pol III
- Poli-U4 situada en una zona rica en GC
122
El extremo 3 se genera (inicialmente) por terminacin
ARN pol II terminadores ?
El extremo 3 se genera por corte y poliadenilacin.
Es difcil conocer que extremo 3 es el que marca la terminacin.
No est sujeto a regulacin. Una unidad de transcripcin suele
contener un nico gen, y la terminacin ocurre ms all de la regin
codificadora.
En procariotas, transcripcin y traduccin estn acoplados, se afectan mutuamente, por tanto estn ms
sujetos a regulacin.
Cis: secuencias importantes per se, dependen de la situacin en le ADN, cerca del principio
Trans: mutaciones en trans afectan a las protenas, lejos del principio. Trans con relacin a la
configuracin de dos puntos se refiere a su presencia en dos molculas diferentes de ADN
(cromosomas)
TRADUCCIN
Decodificacin del mensaje gentico y sntesis de protenas. Cada aminocido se une a una molcula de
ARNt especfico de ese aminocido mediante enlace de alta energa (ATP). El proceso est catalizado por
la enzima sintetasa, hay una sintetasa para cada aminocido.
El ARNm tiene codones que interactan con los anticodones de los aminoacil-ARNt, de manera que se
incorporen las series de aminocidos en la cadena polipeptdica. El ribosoma proporciona el ambiente para
controlar la interaccin entre el ARNm y el aminoacil-ARNt.
Ribosomas
Componentes esenciales en todas las clulas. El ribosoma posee
diversos centros activos, cada uno construido a partir de un
determinado grupo de protenas que se asocian con una regin del
ARNr. Los centros activos necesitan de la participacin directa del
ARNr con una funcin estructural. Algunas funciones catalticas
necesitan protenas individuales, ninguna de las actividades se
pueden reproducir por protenas aisladas o grupos de protenas,
slo funcionan en el contexto del ribosoma.
Localizacin fsica de componentes: anlisis estructural
Protenas y zonas del ARNr con funciones concretas: anlisis mutacional.
Estructura ribosmica
Todos los ribosomas de una clula son idnticos. Constan de dos subunidades, cada una tiene un ARNr
principal y un nmero de protenas pequeas. La subunidad mayor puede tener adems ARN pequeos.
En procariotas son ms pequeos que en eucariotas y en mitocondrias son ms pequeos.
El ribosoma bacteriano (70S), la subunidad mayor (50S) tiene:
- un ARNr 23S
- un ARNr pequeo 5S
- 31 protenas
La subunidad menor (50S):
- ARNr 16S
- 21 protenas
El ribosoma eucaritico (80S), subunidad mayor (60S):
- ARNr 28S
123
- ARNr 58S
- ARNr pequeo 5S
- Unas 49 protenas
La subunidad menor (40S):
- ARNr 18S
- Unas 33 protenas
El ribosoma tiene 3 lugares de unin a ARN, uno para ARNm y tres para ARNt, un lugar P de unin al
peptidil ARNt que acoge a la molcula de ARNt unido a la cadena polipeptdica en crecimiento; un lugar
A acoge a la molcula de ARNt entrante cargada con el aminocido; un lugar E ocupado transitoriamente
por ARNt antes de abandonar el ribosoma. El anticodn del ARNt debe ser complementario del codn del
mensajero para que se establezca una unin fuerte.
Funcin ribosmica
Fases de la traduccin:
- Iniciacin: incorporacin del primer aminoacil-ARNt,
formil metionina-ARNt en procariotas; metionina-ARNt
en eucariotas.
La subunidad 30S colocada sobre el punto de unin del
ARNm se une a la subunidad 50S y a esto se une el
aminoacil-ARNt.
El primer aminoacil-ARNt entra en el sitio P, el resto de
aminoacil-ARNt entra en el sitio A.
- Elongacin: sntesis de uniones peptdicas.
El ribosoma se mueve a lo largo del ARNm y la longitud de
la cadena polipeptdica se extiende mediante transferencias
desde el peptidil-ARNt al aminoacil-ARNt.
- Terminacin: liberacin del pptido.
La cadena polipeptdica es liberada del ARNt y el ribosoma
se disocia del ARNm.
Existen diferentes conjuntos de factores accesorios que ayudan
al ribosoma en cada una de las fases. La energa se suministra en
las diferentes etapas mediante la hidrlisis de GTP.
Se han hecho estudios con inhibidores (antibiticos) para
averiguar la estructura ribosmica.
Mutaciones del ADN para protenas ribosmicas, algunas se
pueden restablecer por complementacin.
124
Iniciacin de la traduccin
En bacterias, la iniciacin necesita de la subunidad 30S y de
factores accesorios.
La iniciacin necesita de subunidades ribosmicas libres. Cuando
los ribosomas son liberados en la terminacin, se disocian para
generar subunidades libres. Los factores de iniciacin estn presentes
solamente en las subunidades 30S disociadas. Cuando las
subunidades se reasocian para proporcionar un ribosoma funcional
en la iniciacin, liberan los factores.
Factores de iniciacin (IF) en bacterias, solo en la subunidad 30S, se
liberan cuando 30S se asocia con la subunidad 50S. los factores de
iniciacin solamente estn en relacin con la formacin del complejo de
iniciacin, estn ausentes en los ribosomas 70S y no tienen ninguna funcin
en las fases de elongacin. Las bacterias utilizan 3 factores de iniciacin:
- IF-3: se necesitan para que las subunidades 30S se unan de forma
especfica a los puntos de iniciacin en el ARNm. Es necesario
para estabilizar las subunidades 30S libres capacitndolo para
unirse al ARNm. Se libera del complejo 30S-ARNm para permitir
que se unan las subunidades 50S. Al liberarse IF-3 se recicla
buscando otra 30S.
- IF-2: se une al ARNt de iniciacin (formil-metionina) y controla su
entrada en el ribosoma.
- IF-1: se une a las subunidades 30S slo como parte del complejo
de iniciacin completo, y puede participar en su estabilizacin.
Unin al sitio A, estabiliza el complejo anti-asociacin con 50S
Reconocimiento en procariotas
La iniciacin ocurre en una secuencia especial del ARNm, es el
sitio de unin al ribosoma. Es una secuencia de bases que
precede a la regin codificadora. Es el lugar donde las
subunidades se asocian sobre el ARNm para formar un ribosoma
intacto.
Los puntos de unin del ribosoma sobre el ARNm se pueden
recuperar de los complejos de iniciacin.
La subunidad 30S protege unos 30 N:
Secuencia de unin al ribosoma Shine-Dalgarno
(complementarias del extremo 3 del ARN 16S). esta
secuencia est ausente en eucariotas.
Codn de iniciacin:
AUG: el ms frecuente
GUG
UUG
125
Iniciacin en operones
En un ARNm policistrnico, la iniciacin se produce de
forma independiente en cada cistrn. Cuando la regin
intercistrnica es ms larga de lo que abarca el ribosoma,
la disociacin en el punto de terminacin se sigue de una
reiniciacin independiente en el cistrn siguiente.
En el ARNm policistrnico cada regin de codificacin
comienza con un punto de unin al ribosoma.
La naturaleza de los genes bacterianos significa que la
traduccin se lleva a cabo de forma secuencial a travs de
sus cistrones.
El ribosoma se une independientemente al comienzo de cada cistrn. Cuando termina la sntesis de la
primera protena, el ribosoma abandona el ARNm y se disocia, entonces se ensambla un nuevo ribosoma
en la siguiente regin codificadora y traducir el siguiente cistrn.
Traduccin independiente de cada uno de los genes en ARNm policistrnicos. Excepcin: acoplamiento
traduccional.
Iniciacin en eucariotas
Los ribosomas (subunidad 40S) eucariticos migran desde el
extremo 5 del ARNm hasta el punto de unin al ribosoma, que
comprende un codn de iniciacin AUG. Los ARNm son
monocistrnicos y son ms largos que lo necesario para codificar
una protena.
El codn de inicio siempre es AUG que codifica para metionina.
Los ARNm se modifican en el extremo 5 con caperuzas (cap),
metilacin que marca el extremo 5, los ribosomas reconocen el
cap y recorren una corta distancia hasta que encuentran el codn
de inicio. La unin de 40S al ARNm requiere de varios factores de
iniciacin, entre los que figuran protenas que reconocen el cap.
No hay secuencia complementaria al ARNr 18S
La subunidad 40S se une al ARNm por la caperuza (CAP) del
extremo 5 y busca la secuencia de iniciacin
Se requieren ms factores de iniciacin que en procariotas (eIF)
La Met inicial no se modifica
El ARNt iniciador: Met-tRNA
i
Los requerimientos energticos se consiguen de la hidrlisis de GTP, se consume mucho y la iniciacin
es la etapa ms lenta y tiene que ver con la etapa de error del proceso.
Elongacin
Una vez que se ha formado el ribosoma completo en el codn de
iniciacin, est dispuesto para un ciclo en el que el aminoacil-ARNt
entra en el lugar A del ribosoma cuyo lugar P est ocupado por el
peptidil-ARNt. Cualquier aminoacil-ARNt puede entrar en el sitio A
excepto el iniciador.
El ribosoma tiene varios centros activos. Se puede asociar con una
membrana. El ARNm hace un giro segn pasa a travs de los sitios A y
P, que estn angulados el uno con respecto al otro. El lugar E se sita
ms all del sitio P.
126
El punto de actividad peptidil-transferasa se encuentra en la subunidad grande, enzima responsable de la
sntesis de la unin peptdica.
El proceso de cargar un ARNt est catalizado por la enzima aminoacil-ARNt sintetasa. Existen por lo
menos 20 sintetasas, cada una reconoce un nico aminocido y todos los ARNt en los que el aminocido
pueda colocarse de forma legtima. Son importantes para la fidelidad de la decodificacin del cdigo
gentico.
Sitios del ribosoma:
- Subunidad menor: ARNm
- Subunidad grande: ARNt
- Sitio P: donador
- Sitio A: aceptor
- Sitio E: salida de ARNt descargados
El pptido se transfiere al aminocido. El ARNt tiene una estructura secundaria en forma de cruz, y una
estructura tridimensional en forma de L.
Factores auxiliares de elongacin (EF)
Son protenas importantes para asegurar que las reacciones ocurren de forma especfica y en un orden
concreto. Los EF tienen una accin secuencial. Decodificacin de mensajeros: distintos factores de
elongacin se asocian cclicamente con los ribosomas.
Son factores esenciales:
- En procariotas:
EF-Tu: entrada del aa-ARNt en A
EF-Ts: regeneracin EF-Tu
EF-G: translocacin
- En eucariotas:
eEF-1
eEF-1
eEF-2
EF-Tu acompaa al aminoacil ARNt al sitio A y luego abandona el ribosoma. Transporta un nucletido
de guanina y su actividad est controlada por el estado del nucletido de guanina:
- Cuando existe GTP el factor Tu est en su estado activo
- Cuando el GTP se hidroliza a GDP el factor se inactiva
- La actividad se recupera cuando el GDP se sustituye por GTP
El complejo EF-Tu.GTP une el aminoacil-ARNt para
formar ARNt.EF-Tu.GTP, ste se une solamente al
lugar A del ribosoma cuyo sitio P ya est ocupado por
el peptidil-ARNt.
El aminoacil-ARNt se carga en el sitio A, el extremo
del anticodn se une al lugar A de 30S, el
reconocimiento codn-anticodn provoca un cambio de
conformacin de EF-Tu, se rompe el GPT, se libera EF-
Tu-GDP, no tiene afinidad por ARNt.
EF-Ts media la regeneracin de la forma EF-Tu.GDP,
inactiva, en la forma EF-Tu.GTP, activa. Primero EF-Ts
desplaza al GDP de EF-Tu, formando el factor
combinado EF-Tu-EF-Ts. Luego el EF-Ts es desplazado
por el GTP.
127
Translocacin
La cadena polipeptdica se alarga mediante la transferencia del polipptido unido al ARNt en el sitio P al
aminoacil-ARNt presente en el sitio A. La actividad responsable de la sntesis de la unin peptdica se
llama peptidil transferasa. El ciclo de adicin de aminocidos a la cadena polipeptdica en crecimiento se
completa con la translocacin, en la que el ribosoma avanza tres nucletidos a lo largo del ARNm. El
resultado es expulsar al ARNt no cargado del lugar P, de manera que pueda entrar un nuevo peptidil-
ARNt. La translocacin necesita GTP y el factor EF-G.
El aa-ARNt cambia de sitio dentro del
ribosoma.
Direccin A-P-E
Las subunidades tambin se mueven.
EF-G est implicado en las etapas iniciales
de la translocacin del ribosoma.
Los ribosomas no pueden ligarse de forma
simultnea al EF-Tu y al EF-G, los factores se
son alternativamente ligados y liberados del
ribosoma. EF-Tu.GDP debe liberarse antes de
que se pueda EF-G; entonces ste debe
liberarse antes de que se pueda unir el aa-
ARNt-EF-Tu.GTP.
Mimetismo molecular
Similitud entre diferentes molculas, como el aa-ARNt-EF-Tu-GTP y EF-
G, compiten por el mismo sitio de unin. Hacen falta estructuras similares
para entrar en el mismo sitio, hay interacciones especficas que aseguran que
slo entra una molcula, cuando intenta entrar EF-G el anterior se mueve de
sitio. La necesidad de que cada factor se libere antes de que otro se pueda
unir asegura que los fenmenos de la sntesis de protenas se lleven a cabo
de forma ordenada. Unin alternativa y excluyente al ribosoma.
Parte del ribosoma controla que slo las interacciones ms precisas sean las que permitan continuar la
elongacin. Los aa-ARNt van entrando y si no hay suficiente afinidad salen del ribosoma.
La unin de los factores Tu y G se alternan segn los ribosomas aceptan
un nuevo aa-ARNt, forman uniones peptdicas y se translocan.
El estudio con inhibidores permite parar la traduccin:
- la kirromicina, inhibidor con estructura similar a un aa-ARNt, provoca una
terminacin temprana del pptido, no permite que se liberen los EF.
- El cido fusdico atasca al ribosoma en el estado de post-translocacin.
Se produce un ciclo de translocacin: EF-G se une al ribosoma, se
hidroliza GTP, y el ribosoma se mueve tres nucletidos, pero el cido
fusdico no permite que se libere EF-G-GDP y no se pueden aadir ms
aminocidos a la cadena.
128
Terminacin
Existen 64 codones, de los cuales 61 codifican para aminocidos, y slo 21 aminocidos, casi todos los
aminocidos estn representados por ms de un codn, excepto Met y Trp, hay tres codones de
terminacin, marcan el fin de cada gen. El cdigo gentico es universal, redundante y degenerado.
Los tripletes de terminacin:
- UAG: mbar
- UAA: ocre
- UGA: palo
Ninguno de los codones de terminacin est representado por un ARNt, son reconocidos por los
factores auxiliares de terminacin.
- Factores de terminacin (Release Factor): RF/eRF
E. coli:
RF-1 y RF-2 reconocen los codones STOP (sitio A) y activan la
hidrlisis del pptido
- RF1: UAA y UAG
- RF2: UAA y UGA
RF3: libera RF1 y RF2 del sitio A
RRF o Factor de reciclaje ribosmico
EF-G: tambin interviene en la elongacin
IF3: tambin en iniciacin, deja al ribosoma listo para un nuevo
ciclo.
RF1 y RF2 reconocen los codones de terminacin y activan al ribosoma
para hidrolizar el peptidil-ARNt, siendo el aceptor el H
2
O
Factores de elongacin, terminacin y reciclaje mimetizan al
complejo aa-ARNt-factor de elongacin acompaante.
El mimetismo molecular permite que el complejo del factor de
elongacin Tu-ARNt, el factor de translocacin EF-G y los
factores de liberacin RF1, RF2, RF3 se puedan unir al mismo
lugar del ribosoma.
El RRF acta de forma conjunta con EF-G para producir la
disociacin de las subunidades 50S y 30S. tambin es necesario el
IF3, que completa todo el ciclo, conectando la terminacin con la
iniciacin. IF3 acta para retirar el ARNt desacilado de 30S. una
vez que se han separado las subunidades, IF3 sigue siendo
necesario para impedir que se vuelvan a juntar.
Los errores ms importantes se dan en la iniciacin y en la terminacin. Cuando hay errores en aa-
ARNt, es menos drstico porque se introduce en el sitio A un aminocido similar (los aminocidos
parecidos tienen tripletes parecidos).
Las mutaciones en los genes RF reducen la eficacia de la terminacin. RF1 y RF2 slo pueden sufrir
mutaciones puntuales, la alteracin de las dosis gnicas se aumentan o disminuyen las copias de protenas.
Si disminuye RF1 se disminuye la eficacia de la terminacin aumentando el nmero de protenas. Si
aumenta RF1 se puede provocar que la protena se acabe antes. La dosis gnica es importante, alterando la
composicin relativa de los factores se altera la traduccin.
Son elementos esenciales solamente se pueden hacer mutaciones sutiles.
129
En E.coli ARNm ARNt RibosomasEF-Tu EF-Ts (G) RF aa-ARNt
sintetasa
Tipos 600 40-60 1 1 1 2 20
Copias distintas de
productos gnicos
2-3 3000 20.000 70.000 20.000 600 1000
Total 1500 180.000 20.000 70.000 20.000 1800 20.000 a
60.000
Estructura y funcin en el ARNr (16S)
Forma parte del sitio A
Anlisis mutacional con inhibidores:
La unidad 16S es esencial porque zonas concretas
participan en funciones concretas. Tambin tiene
actividad enzimtica. Se pueden identificar sitios de
interaccin ARN-ARN y ARN-protena.
Asociacin de las subunidades
Supresin de mutaciones de fin de mensaje, participa
en el reconocimiento de codones de fin de mensaje.
Unin a ARNt y a factores de traduccin
Complementariedad a ARNm (E. coli), secuencia S-D
Fidelidad, las mutaciones modifican la tasa de error.
Interacciones moleculares en el ribosoma
La fidelidad de la expresin gnica:
Se cometen ms errores en la traduccin que en la
transcripcin. La tasa de error tiene que ver con la
velocidad del acontecimiento.
Los cambios de aminocidos tiene una tasa de error de
10
- 4
, la mayora sin efecto fenotpico.
Tema 5
130
130
Tema 5
Regulacin de la expresin gnica en procariotas
Tipos de regulacin. Operones. Control a nivel de la iniciacin transcripcional. Control mediado por la
estructura del ARN: terminacin y antiterminacin. Control a nivel de la traduccin. Estrategias de
regulacin. Interacciones moleculares.
Significado biolgico de la regulacin. Genes regulados y constitutivos. En ambientes diferentes con
nutrientes diferentes, los genes que tienen los procariotas relacionados con el ambiente, y reguladores, les
permiten sobrevivir.
Niveles de control:
- transcripcin, controlada en la fase de iniciacin, es la regulacin ms importante
- traduccin
- actividad..
Tipos de control:
- segn regulador: puede ser positiva o negativa
- segn efector: pueden ser sistemas inducibles o represibles
Interacciones implicadas:
- ADN-prot,
- prot-prot,
- ADN-ARN,
- ARN-prot..
Singularidades procariticas:
- ARNm: vida muy corta e inestables (importancia del inicio de la transcripcin), si se deja de activar la
transcripcin los mensajeros desaparecen. La inestabilidad hace fcil la regulacin.
- Operones: transcripcin coordinada y secuencial de los genes, la regulacin afecta a varios genes
- Transcripcin y traduccin acopladas, estn coordinadas.
El opern lac
Los genes estructurales estn organizados en grupos que incluyen genes que codifican para protenas
con funciones relacionadas, enzimas de una ruta metablica.
Elementos (reguladores) en cis,
secuencias importantes porque
estn donde estn.
Elementos que actan en trans
(productos difusibles): Genes
estructurales y reguladores
El opern lac tiene tres genes estructurales. Los productos protenicos permiten a las clulas captar y
metabolizar -galactsidos, como la lactosa. Tiene elementos reguladores en cis asociados y el gen
regulador de actuacin en trans. Las funciones de los genes:
- lacZ: codifica la enzima -galactosidasa, hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. Gen estructural
- lacY: codifica la permeasa de lactosa, sistema de transporte al interior de la clula
- lac A: codifica transacetilasa de lactosa
- lacI: represor
Induccin del opern lac
Las bacterias necesitan responder rpidamente a los cambios del ambiente, pueden aparecer
fluctuaciones en el aporte de nutrientes, la supervivencia depende de la capacidad de cambiar la
metabolizacin de un sustrato por otro.
Tema 5
131
131
Induccin: sntesis de las enzimas en respuesta a la aparicin de un sustrato especfico.
Cuando E.coli crece en ausencia de lactosa no necesita -galactosidasa y contiene pocas molculas,
menos de 5.
Cuando aparece el sustrato adecuado la actividad enzimtica
aparece con mucha rapidez, en unos 2-3 minutos empieza a
aparecer la enzima, puede suponer el 5-10% de la protena soluble
total de la bacteria. Si se retira el sustrato del medio , la sntesis de
enzima se detiene tan rpido como haba empezado.
La adicin del inductor da lugar a la rpida induccin del
ARNm, y es seguida, tras un corto intervalo, de la sntesis de las
enzimas; la retirada del inductor es seguida por el rpido cese de la
sntesis. Se saturan.
Parte superior de la figura: el control de la transcripcin de los
genes lac responde muy rpidamente al inductor. En ausencia de
inductor, el opern es transcrito a un nivel basal muy bajo. La
transcripcin es estimulada tan pronto como se aade inductor. La
cantidad de ARNm lac aumenta rpidamente a un nivel inducido
que refleja el balance entre la sntesis y la degradacin.
El ARNm lac es muy inestable, permitiendo que la induccin sea
revertida rpidamente. La transcripcin cesa tan pronto como es
retirado el inductor y el contenido celular retorna al nivel basal.
Parte inferior: se muestra la produccin de protena, medida indirecta de la unidad de transcripcin. Hay
un corto intervalo entre la aparicin del ARNm y la aparicin de las primeras molculas de enzima.
Cuando el inductor es retirado la actividad enzimtica persiste por ms tiempo, la -galactosidasa es ms
estable.

Deteccin a distintos niveles para estudiar la regulacin:
- transcritos
- protenas
- actividades
Cuantificacin de la regulacin: puede dar detalles adicionales
- niveles basales
- niveles regulados (inducidos)
Expresin inducible, inductores: Inductores metabolizables y gratuitos
- lactosa: mejor inductor, metabolizable
- IPTG: inductor gratuito, no metabolizable, mejor inductor
- -galactsidos: algunos no se pueden hidrolizar
El represor: lacI
El componente que responde al inductor es la protena represora codificada por lacI.
Los genes estructurales son transcritos a un solo
ARNm desde un promotor localizado en 5 de lacZ.
El estado del represor determina si el promotor es
activado o no.
El gen lacI sintetiza monmeros del represor que
forman un tetrmero.
El tetrmero se une al ADN operador y bloquea la
transcripcin.
El represor mantiene el opern en forma inactiva
mediante su unin al operador.
Regulacin negativa: El represor se une al
operador impidiendo la transcripcin.
Tema 5
132
132
La adicin de inductor libera el represor y permite
que la ARN polimerasa inicie la transcripcin.
El inductor convierte al represor a una forma inactiva
que no puede unirse al operador.
La ARN polimerasa se une al promotor y transcribe el
ARNm.
El ARNm es traducido para dar lugar a las tres
protenas.
Regulacin inducible: El inductor inactiva al
represor, permitiendo la transcripcin.
El represor tiene propiedades duales:
- Puede evitar la transcripcin
- Puede reconocer la molcula inductora
El represor tiene dos sitios de unin, uno para el operador y otro para el inductor ( 1 mol/ monmero,
total 4 molculas de inductor por represor). Cuando el inductor se une en su sitio cambia la conformacin
de la protena influyendo en la actividad del sitio de unin al operador (control alostrico).
Cuando el represor est unido al operador no hay transcripcin, hay una expresin basal baja y
constitutiva. Un buen represor: niveles de protena bajos (unas 10 molculas de represor por clula).
Regulacin de lac y anlisis gentico
Consideraciones:
- Fenotipo silvestre: expresin inducible de lacZ
- Mutaciones en gen(es) regulador(es) y estructural(es)
9 Tipos de mutaciones reguladoras (cis o trans)
Constitutivas: siempre expresin de lacZ, Lac
+
!!!

No inducibles: no hay expresin, Lac

-
, no sintetizan -galactosidasa
Las mutaciones en el circuito regulador pueden o anular la expresin del opern o causar una expresin
no regulada.
Los mutantes que no pueden ser expresados son no inducibles.
La expresin continua de un gen que no responde a la regulacin se llama expresin gentica
constitutiva y los mutantes son mutantes constitutivos.
El promotor y el operador son identificados como dianas para las protenas reguladoras (ARN
polimerasa y represor) mediante mutaciones de actuacin en cis. El locus lacI es identificado por
mutaciones en trans.
- Mutaciones constitutivas cis:
Las mutaciones del operador son constitutivas (O
c
)
porque el operador es incapaz de unirse a la protena
represora, lo que permite que la ARN polimerasa tenga
un acceso no restringido al promotor.
Las mutaciones O
c
, son cis ( evidencia la existencia de
un elemento que funciona sin estar representado por un
producto difusible) ya que afectan solamente al grupo
contiguo de genes estructurales.
Los genes estructurales contiguos a una mutacin Oc
son expresados constitutivamente ya que la mutacin
cambia el operador de forma que el represor no se una
ms a l.
Un Operador constitutivo no tiene suficiente afinidad por el represor
Complementable con un opern silvestre? NO: O
c
dominantes en cis
Una mutacin en un sitio cis no puede ser asignada a un grupo de complementacin, la capacidad de
complementacin es caracterstica de genes expresados por productos difusibles.
El represor
activo no
puede unirse
al operador
mutante O
c
El opern es transcrito
y traducido
Tema 5
133
133
Cuando dos sitios de actuacin en cis se sitan cerca el uno del otro, promotor y operador, no se pueden
clasificar las mutaciones con un test de complementacin, estando limitados a distinguirlas por sus efectos
fenotpicos.
Las mutaciones en el operador pierde la afinidad por el represor.
- Mutaciones constitutivas en trans:
La ausencia de represor determina expresin
constitutiva.
Complementable con un opern silvestre? SI: lacI
-
recesivas.
Las mutaciones que inactivan el gen lacI dan lugar a
que el opern est constitutivamente expresado porque
el represor mutante no puede unirse al operador.
La mutacin lacI
-
supone la prdida de la funcin.
Cuando el represor est inactivo o ausente la
transcripcin puede ser iniciada en el promotor. Las
mutaciones en el represor que suprimen su capacidad de
unin al operador tendrn un fenotipo constitutivo.
Los tipos de mutaciones lacI pueden ser utilizados para identificar los sitios activos individuales en la
protena represora.
- El sitio de unin al ADN reconoce la secuencia del operador y se identifica por mutaciones
puntuales constitutivas que impiden al represor unirse al ADN para bloquear la ARN polimerasa.
- El sitio de unin del inductor es identificado por mutaciones puntuales que causan la no induccin
del sistema dado que el inductor no puede unirse para activar el cambio alostrico en el sitio de
unin al ADN.
Mutaciones lacI constitutivas: No siempre
recesivas: lacI
D
Mutaciones de prdida de funcin y dominantes:
Dominantes negativas /trans -
dominantes /complementacin negativa
La complementacin negativa o dominantes en
trans o dominantes negativas, sucede entre algunos
mutantes represores, como lacI
D
con lacI
+
. La
mutacin lacI
D
da lugar a la produccin de un
represor que no puede unirse al operador y es por
tanto constitutiva como lacI
-
. Lac
-
es recesiva porque
inactiva al represor respecto al tipo salvaje. Lac
D
es
dominante cuando se empareja con un alelo original.
La razn de la dominancia es que lac
D
produce una subunidad mala que es incapaz de unirse al operador
y como parte de un tetrmero, impide que las subunidades buenas se unan.
El represor mutado ha perdido afinidad por el operador, pero si hay ARNm y producto en la clula es
dominante.
Son mutaciones recesivas si son complementadas y se establece la regulacin.
Complementacin: indica mirar 2 alelos distintos, se pueden introducir alelos interesantes consiguiendo
diploides parciales, merodiploides o merozigotos, se introduce el opern con un plsmido.
El gen lacI
-
sintetiza
un represor que no
puede unirse al ADN
El opern es transcrito
y traducido
Tema 5
134
134
- Mutaciones no inducibles (cis). Operador: ganancia de afinidad por el Represor, son raras
- Mutaciones no inducibles (trans). Represor: ganancia de afinidad por el Operador, son ms
frecuentes. Las mutaciones que reprimen son siempre supresoras.
complementable con un opern silvestre?
NO: lacI
S
dominantes.
Las mutaciones que anulan la capacidad del
represor de unirse al inductor son lac
S
y son de
tipo trans. El represor est cerrado en la
forma activa que reconoce al operador y se
impide la transcripcin. La adicin del inductor
no tiene efecto ya que su sitio de unin est
ausente y es imposible convertir al represor a su
forma inactiva.
El represor mutante se une a todos los operadores lac de la clula para impedir su transcripcin y no
puede ser desactivado, es genticamente dominante.
Lac
s
(suprerrepresor), no es capaz de hacer las funciones que hace el silvestre, independizan al represor
del inductor. Mutacin en dominio de unin al inductor.
Mutaciones que no impiden la unin del inductor, pero no se produce el cambio conformacional, por
tanto se une al ADN. Ha perdido funcin. No es complementable con el opern silvestre. Es una mutacin
dominante.
Interacciones entre subunidades. Dominancia negativa en LacI
Mutacin con prdida de funcin: lacI
-
.
El represor mutado no tiene capacidad
para reprimir pero si para formar
tetrmeros, habiendo tetrmeros de varios
tipos, mixtos, son menos eficaces que el
silvestre. No hay suficiente represor para
evitar la expresin del opern.
Es un fenmeno frecuente entre
protenas polimricas: dominancia
negativa/ trans- dominancia
/complementacin negativa.
Mutantes de prdida de funcin:
- parcial: dominancia negativa
- total
Un represor silvestre ms uno mutado darn 4 tipos de mutantes, la concentracin efectiva de represor
silvestre disminuye.
Ms consecuencias genticas de la oligomerizacin de LacI complementacin intragnica de mutaciones
lacI
-
. Caracterstica de protenas multimricas.
- si dos mutaciones no se complementan, la mutacin se
encuentra en el mismo gen
- si la mutacin se encuentra en 2 alelos del mismo gen, se
complementan
lacI
S
(Superrepresor)
Unin al O independiente de inductor
Tema 5
135
135
Supresin intragnica: mutaciones en el mismo
polipptido, primera y segunda mutacin en la
misma protena, es una mutacin compensatoria,
en cualquier tipo de protenas.
No asociado a oligomerizacin.
Interacciones DNAprotena (O-LacI): Supresin intergnica
Mutaciones en operador que son suprimidas.
Las mutaciones en el represor afecta a
interacciones protena-protena y ADN-protena.
Un represor mutado puede tener afinidad por el
operador silvestre, aunque no se conoce cual es,
depende del tipo de mutacin del represor.
Relacin estructura/ funcin en lacI
El represor tiene varios dominios. Entre los dominios globulares se
encuentra el sitio de unin al inductor, es una amplia zona en la que se pueden
hacer muchas mutaciones.
Estructura de un dominio del represor.
Lac identifica varios dominios independientes
Tema 5
136
136
Localizacin de mutaciones en LacI
lacI
-
(no represoras), recesivas, las ms abundantes.
Disminuye la capacidad de oligomerizar, afectan a la estabilidad.
Hay unas mutaciones que impiden la formacin del dmero y
otras afectan a la formacin del tetrmero a partir de los dmeros.
lacI
-d
, dominante negativa. No disminuye la estabilidad pero
afectan a la unin con el ADN.
lacI
s
, localizada en el centro de la protena, en el sitio de unin
al inductor, disminuye la afinidad por el inductor.
Las mutaciones de ganancia de funcin y prdida de funcin
parcial son dominantes.
Las mutaciones que disminuyen la actividad de la protena son
recesivas.
Estructura del core tetramrico. Consiste en dos dmeros. El cuerpo del
dmero tiene una zona intermedia poco consistente entre las regiones N-
terminales del core de los monmeros, una hendidura en la cual se une
el inductor, y un core hidrofbico (arriba).
Las regiones C-terminales de cada monmero protuyen como hlices
paralelas. Los dmeros interactan para formar el tetrmero que se
mantiene unido por un haz C-terminal.
Los puntos de mutacin son mostrados por pequeas esferas en la
parte inferior de la figura. Cada esfera representa una mutacin.
Las mutaciones lacI
s
se dividen en dos grupos:
- las que afectan a la interfase de los dmeros (amarillo),
relacionadas con el cambio conformacional de la
dimerizacin.
- las que actan en la hendidura de unin al inductor (gris)
Las mutaciones lacI
-
que afectan a la oligomerizacin:
- impiden la formacin del dmero (blanco)
- impiden la formacin del tetrmero a partir del dmero
(morado), esos contactos son importantes para mantener el
tetrmero.
Interacciones ADN-represor
Efecto del inductor: la adicin del inductor anula la
capacidad del represor de unirse especficamente al operador.
Los represores unidos al operador son liberados y se unen a
sitios de baja afinidad al azar.
El represor tiene dos cabezales danzando que facilita el
encontrar el sitio especfico; la interaccin la hace el dmero
pero es tetrmero el que se desplaza. En una clula no
inducida el tetrmero est unido al operador, mientras que el
represor est unido a sitios no especficos. El efecto de la
induccin es cambiar la distribucin del represor en el ADN,
ms que generar represor libre.
Cuando el inductor es retirado, el represor recobra su
capacidad de unirse especficamente al operador. Este paso
implica movimiento desde el sitio de almacenamiento no
especfico en el ADN
Tema 5
137
137
Al unirse el inductor al represor se provoca un cambio conformacional,
perdiendo la afinidad por el operador. La interaccin es simtrica (H-giro-
H)
Cuando el inductor se une al represor la afinidad por el operador se
reduce unas 1000 veces, permaneciendo inalterada la afinidad por otras
secuencias inespecficas del ADN.
Protenas reguladoras: hay poco nmero de ellas, es importante, ser
limitante. El nmero de protenas ser mayor si el genoma es ms grande.
El operador: sitio diana para el represor protenico.
Se sita aguas abajo del promotor pero est solapado. Con
experimentos de footprinting se puede observar donde se unen las
protenas. La represin provoca interferencia con la actividad de la
ARN polimerasa. El solapamiento del operador con el represor no
impide que se unan a la vez en el ADN junto con el promotor. El
represor y la ARN polimerasa se unen en sitios que se superponen
localizados alrededor del punto de inicio del opern.
Represion: interferencia con la actividad de la ARN polimerasa.
El represor no impide la unin de la ARN polimerasa, sino que aumenta la afinidad de la polimerasa por
el promotor, se aumenta la formacin del complejo cerrado. El represor es el regulador; el operador atrae a
la polimerasa, en cuanto se separa el represor empieza la transcripcin.
El operador lac tiene una secuencia simtrica. La
simetra de la secuencia de ADN refleja una simetra en
la protena. El represor es un tetrmero de subunidades
idnticas, cada una de las cuales debe tener un sitio de
unin al ADN. Cada repeticin invertida del operador
entra en contacto de la misma forma con un monmero
del represor
El operador tienen un hallazgo comn a muchos sitios de reconocimiento de las protenas reguladoras,
es palindrmico. Cada repeticin puede ser considerada como un medio sitio para el operador.
Las mutaciones O
c
producen cambios concretos.
Disminuye la afinidad por lacI 20-30 veces, la represin no
es efectiva, ya no tienen afinidad especfica por el
operador.
Mutaciones constitutivas: estn centradas y hay asimetra,
la mitad derecha funciona mejor y por eso se puede mutar
ms fcilmente.
Hay posiciones importantes, con bases concretas. La
regin protegida por la protena es la misma pero slo unas
cuantas bases son especficas para la interaccin: zonas
protegidas.
La simetra del operador refleja la simetra del represor La simetra del operador refleja la simetra del represor
Tema 5
138
138
Los contactos son, aqu, ms simtricos, hay interacciones especficas. Las interacciones se producen en
ambas cadenas.
El represor en la regin reguladora

lacI es un tetrmero y puede unirse simultneamente a dos sitios en
el ADN, se forma un bucle en el ADN.
Existen dos sitios adicionales del operador en la regin inicial del
opern. El operador original O
1
, localizado en el inicio del gen lacZ
tiene mayor afinidad por el represor.
Otras secuencias ms dbiles del operador (pseudooperadores) se
localizan a los lados (O
2
, O
3
). Cuando el represor se une de forma
simultnea a O
1
y a uno de los otros provoca en el ADN un bucle.
El operador son tres sitios: operador y pseudooperadores.
La presencia de los pseudooperadores incrementa la
represin, aumenta la afinidad.
La eliminacin de O
2
o de O
3
reduce la eficiencia de la represin 2-4 veces. Si ambos son eliminados, la
represin se reduce unas 100 veces. La habilidad del represor de unirse a uno de los otros dos operadores,
as como a O
1
, es importante para establecer la represin.
Interacciones ADNrepresor en otros sistemas
Sitios de unin de protenas represoras.
La relacin fsica entre represor y opern es distinta en los diferentes sistemas, tienen diferentes
mecanismos moleculares.
Los operadores se pueden situar en distintas posiciones con
respecto al promotor.
El operador de gal est aguas arriba del promotor, tiene
interacciones indirectas.
Los sitios de unin de distintos represores varan con relacin
al promotor.
El represor trp reconoce los operadores en tres loci. La localizacin del ARNm vara segn est indicado
en el esquema por las flechas. Un represor controla varios operones.
Tipos de regulacin. Directa y mediada por molculas efectoras.
Tipo de protena reguladora:
Negativo: represor
Positivo: activador
Tipo de molcula efectora:
Inducible: inductor
Reprimible: co-represor
83 410
0
3
0
1
0
2
83 410
0
3
0
1
0
2
Tema 5
139
139
Los sistemas de control positivo y negativo estn definidos por la respuesta del opern cuando est
presente una protena reguladora. Las caractersticas de los dos tipos de control son opuestas.
Los genes bajo control negativo son expresados a menos que sean desactivados por una protena
represora. Proporciona un mecanismo de seguridad, si la protena reguladora es inactivada el sistema
funciona. Na protena reguladora negativa se llama represor.
Los genes bajo control positivo slo se expresan cuando una protena reguladora activadora est
presente. Una protena reguladora positiva que responde a una pequea molcula se llama activador.
En ausencia de protena reguladora, hay expresin?
SI, hay ms actividad: control negativo
NO, hay menos actividad: control positivo
Los operones inducibles funcionan slo en presencia de una molcula inductora.
Los operones represibles funcionan slo en ausencia de una molcula co-represora.
Los circuitos de control son verstiles y
pueden ser diseados para realizar control
positivo o negativo de la induccin o la
represin.
La induccin se logra cuando un inductor
inactiva a una protena represora: Inducible
control negativo.
La induccin se logra cuando un inductor
activa a una protena activadora: inducible
control positivo.
El opern trp es un sistema represible. El
triptfano es el producto final de las
reacciones catalizadas por enzimas
biosintticas y tanto la actividad como la
sntesis de las enzimas son controladas por
el nivel de triptfano dentro de la clula. El
triptfano funciona como un co-represor que
activa a una protena represora: represible de
control negativo. En las condiciones en las
que el triptfano es abundante el opern est
reprimido porque el complejo protena
represora-co-represor se encuentra unido al
operador. Bajo condiciones de represin los
genes estructurales continan siendo
expresados a un nivel basal o nivel
reprimido.
Las rutas de aminocidos son reprimibles
por producto.
Control positivo e inducible: la molcula efectora activa al activador
Control positivo y reprimible: el co-represor inactiva al activador. Es un sistema caro energticamente y
muy raro.
Superposicin de sistemas de regulacin en el mismo opern
El opern lac y Represin por glucosa
Glucosa: fuente favorita de carbono. Interfiere con la expresin de lac a dos niveles:
- Exclusin de inductor: la glucosa impide la entrada de lactosa (inductor de lac)
- Activacin transcripcional (indirecta) mediada por el activador CRP /CAP y AMPc o
fenmeno de represin catablica
Cuando se dispone de glucosa como fuente de energa es utilizada con preferencia respecto de otros
azcares, por tanto cuando E.coli encuentra en el medio tanto glucosa como lactosa metaboliza la primera
y reprime la segunda.
Tema 5
140
140
Uno de los activadores ms comunes es una protena que controla la actividad de un grupo de operones
en respuesta a nutrientes en relacin con hidratos de carbono.
La eleccin es llevada a cabo evitando la expresin de varios operones (lac, gal, ara). Este efecto se
conoce como represin por catabolito, representa un sistema coordinado que ejerce una preferencia por
glucosa inhibiendo la expresin de los operones que codifican las enzimas de vas metablicas
alternativas.
Exclusin del inductor: la entrada de glucosa en la clula provoca
cambios conformacionales en la permeasa de lactosa que impiden la
entrada de la lactosa.
Cuando no hay glucosa en el medio puede entrar la lactosa a la
clula por medio de la permeasa y se activa el opern lac.
Activacin transcripcional (indirecta): mediada por CAP y
AMPc. Represin catablica: un catabolito de la ruta de
degradacin de la glucosa.
- CRP (Protena Receptora de AMPc) = CAP (Protena
Activadora por Catabolito)
La represin por catabolito es puesta en marcha por la capacidad
de la glucosa de reducir el nivel de AMPc en la clula. El AMPc es
sintetizado por adenilato ciclasa. Cuando hay glucosa la actividad
de la adenilato ciclasa es baja y aumenta en ausencia de glucosa.
Correlacin inversa. La expresin de los operones regulados por catabolitos muestran una relacin
inversa con el nivel de AMPc, que acta unindose al producto del gen cap.
Glucosa y AMPc: cuando uno sube el otro baja
El efector es el AMPc.
CAP es un dmero de dos subunidades idnticas, se activa con una nica molcula de AMPc.
CAP-AMPc es el complejo activador.
Cuando hay glucosa desciende el nivel de AMPc y no se une a CAP, es una protena inactiva incapaz de
unirse a la regin de control, impidiendo que la ARN polimerasa inicie la transcripcin.
Represin catablica por glucosa de los operones activados por CRP: regulacin transcripcional
positiva (CRP) e inducible (AMPc). A nivel molecular es un sistema inducible de control positivo.
Activacin por CRP / CAP: interacciones moleculares
Localizacin de los sitios de unin al ADN e interacciones con la ARN polimerasa.
El dmero CAP se une a un sitio de unos 22 pb en un promotor
determinado.
La secuencia consenso para CAP contiene el pentmero altamente
conservado TGTGA y a veces una inversin de esa secuencia TCANA
Tema 5
141
141
La accin de CAP tiene sus sitios de unin en distintas localizaciones con respecto al punto de inicio
segn los distintos operones que regula, y el pentmero TGTGA puede situarse en cualquier orientacin.
Tipo 1: Aguas arriba del promotor (p.ejem. lac -61: sitio CAP)
Favorece que se forme el complejo cerrado (CC), recluta hacia el
promotor a la polimerasa. Sitio de unin CAP adyacente al
promotor.
Tipo 2: La interaccin se da solapando casi con el promotor
(p.ejem. gal, -41), afecta al complejo abierto.
Favorece CA (complejo abierto): se producen contactos con la
polimerasa. Sitio de unin de CAP se sita dentro del promotor.
Esto tiene que ver con que la interaccin de la polimerasa con el
promotor es en sitios determinados de la polimerasa y que la enzima
est en una cara del ADN. Las interacciones de la polimerasa con el
promotor son asimtricas.
Otras formas de interaccin con ARN Pol (p.ej. ara -92): el sitio de unin CAP se sita en direccin 5
del promotor, mucho ms aguas arriba. CAP no est en contacto con la polimerasa, no hay interaccin
directa protena- polimerasa, hay otra protena reguladora que se une entre CAP y los sitios de la ARN
polimerasa. La interaccin se produce a travs de un bucle, que acerca las protenas, las protenas
interaccionan cara a cara.
Existe un gran cambio en la organizacin de la doble hlice del ADN cuando
se une a CAP. La curvatura permite que CAP contacte con la ARN polimerasa
en el promotor.
CAP y opern ara: 2 sitios que separan e interaccionan con el promotor a
veces puede actuar como represor, activador o represor; una vez acta como una
cosa y otra vez como otra.
Puede haber ms de un sitio CAP en un promotor, por lo que en determinadas
circunstancias puede funcionar como represor. Que funcione de una forma o de
otra depende de las afinidades relativas por es tos sitios, adems de otros
factores como protenas que faciliten o impidan su unin.
Regulacin transcripcional con intermediarios: transduccin de seales
Hay sistemas donde encontramos ms de una protena reguladora. En bacterias hay sistemas de doble
componente (dos familias de protenas distintas). Muchos sitios de regulacin hay ms de una protena
reguladora.
Sistemas de dos componentes
La protena CAP puede unirse en
distintos sitios en relacin a la
ARN polimerasa
CAP provoca la aparicin
de un ngulo de ms de 90
alrededor del centro de
simetra
El componente sensor o histidina quinasa, transmite la seal en forma de
fosforilacin a un regulador de respuesta
La fosforilacin del regulador (en Asp) altera su actividad transcripcional
Dominios conservados que incluyen los sitios de fosforilacin His (fosfotransferasa) o
Asp (receptor)
Tema 5
142
142
En E-coli podemos encontrar hasta 30 sistemas de 2 componentes. Aumentan en organismos de vida
libre. Prototipo simple de sistemas de dos componentes. En E. coli hay 30 sistemas de dos componentes.
Los parsitos intracelulares apenas tienen de este tipo, pero en bacterias cambiantes s hay bastantes
sistemas de este tipo.
Los dominios conservados entonces son los aa His (en el sensor) y Asp (en el regulador de respuesta).
Dos componentes:
1) Protena sensora: recoge la seal activadora, puede estar anclada o no. Determina esa seal ,la
autofosforilacin de la propia protena, es el componente sensor o histidina quinasa. Detecta
molculas, cambios de temperatura,... Suelen estar en membrana. La deteccin provoca un
cambio conformacional en la protena que hace que se autofosforile y que interacte con otra
molcula, el regulador de respuesta.
2) Regulador de respuesta o efector que regula la respuesta (activador o represor). La fosforilacin
del regulador, siempre en Asp, altera su actividad transcripcional, aumenta la afinidad cuando
est fosforilado.
Dominios conservados que incluyen los sitios de fosforilacin His (fosfotransferasa, en el sensor) o Asp
(receptor, regulador de la respuesta)
Control de la traduccin
El sistema ms simple es en el que un factor (protena o ARN) se une a la secuencia de iniciacin,
impide el acceso de la secuencia al ribosoma e impide la traduccin. Las interacciones son por tanto ARN-
ARN o ARN-protena. El control adems suele ser autgeno (la propia protena que se transcribe es
reguladora de la traduccin).
La regulacin es fundamentalmente intrnseca (no hay seales externas, la acumulacin de esa protena
es la que reprime su propia traduccin).
Hay que tener en cuenta la estabilidad del ARNm tambin, as como su estructura secundaria (pueden
formarse bucles que impidan la traduccin). Esto provoca tambin que cuando tenemos varios genes en el
ARNm tienen ms posibilidad de traducirse los primeros genes que los siguientes
Paralelismos y diferencias con el control de la transcripcin (inicio).
Ejemplo de ello es la protena p32, necesaria en las fases tempranas de la iniciacin. Esta protena tiene
mucha afinidad por el ADN monocatenario. Cuando ya no hay ADN de cadena sencilla, la protena tiene
tambin algo de afinidad por su ARNm. Se une a este ARNm e inhibe su propia traduccin.
Este mismo tipo de interaccin se da en la produccin de las protenas ribosmicas. Estas protenas
tienen que estar en la proporcin adecuada.
Hay fenmenos de regulacin endgena de varios genes del opern. Cuando una protena ribosmica se
produce en exceso, aparte del ribosoma tambin tienen afinidad por su propio mensajero y se unen a ste,
con lo que se regula su cantidad.
Secuencias iniciadoras e interacciones ARN/ protena y
ARN /ARN
La funcin del represor es proporcionada por una protena
que se une a una regin diana el ARNm para evitar que los
ribosomas reconozcan la regin de iniciacin. Esto es
equivalente a la protena represora que se une al ADN para
impedir que la ARN polimerasa utilice un promotor.
Una protena reguladora
puede bloquear la traduccin
unindose a un sitio en el
ARNm que se superpone al
sitio de unin al ribosoma en
el codn de iniciacin.
Tema 5
143
143
Otra forma de control traduccional ocurre cuando la traduccin de
un cistrn requiere cambios en la estructura secundaria que dependen
de la traduccin de un cistrn precedente. Esto ocurre en la
traduccin de los fagos de ARN, cuyos cistrones siempre se expresan
de forma ordenada.
La estructura secundaria puede controlar la iniciacin. En el ARN
del fago solo hay un sitio de iniciacin disponible, pero la traduccin
del primer cistrn cambia la conformacin del ARN de forma que
otro sitio de iniciacin se torna disponible. El ARN del fago adopta
una estructura en la cual slo es accesible una secuencia de
iniciacin; el segundo no puede ser reconocido por los ribosomas
porque est apareado con otras regiones del ARN.
Caracterstico de protenas con afinidad por cidos nucleicos
p32: Protena implicada en reparacin, recombinacin y replicacin del fago T4, produccin de
material gentico.
R17: interaccin con ADN RegA T4: reguladora, controla genes tempranos
Control negativo y autgeno. Autgeno: propia protena traducida ser propiamente reguladora. El gen
que codifica para el producto regulador es una de las dianas de la regulacin. La regulacin autgena se
produce siempre que una protena (o ARN) regula su propia produccin. La protena reguladora inhibe la
expresin de un grupo contiguo de genes dentro del opern, siendo un ejemplo de regulacin autgena
negativa.
Regulacin intrnseca: no hablamos de seales externas, van a ser la acumulacin de ese producto
gnico lo que reprima la traduccin. La acumulacin de la protena inhibe la sntesis posterior de s misma
y de algunos otros productos gnicos.
Estructura secundaria y estabilidad del ARNm: esta estructura 2 repercute en la estabilidad del
mensajero. La estructura secundaria del ARN proporciona una regulacin en procariotas y en eucariotas.
Diferencia entre procariotas y eucariotas: se diferencia en los operones por haber varios inicios de la
traduccin
Un ribosoma est leyendo y no puede seguir por haber un apareamiento incorrecto el cual impide la
accesibilidad del ribosoma, este ribosoma puede romper ese apareamiento y puede seguir leyendo.
Polaridad en operones bacterianos: si no hay traduccin en el primer gen no habr en el segundo gen
tampoco.
Los genes aguas arriba sern ms abundantes que los de aguas abajo: se les da preferencia.
Tema 5
144
144
Protena P32
Tiene afinidad por al ADN monocatenario.
La autorregulacin negativa tiene lugar tardamente y ante el
exceso de P32.
El exceso de protena P32 se une a su propio ARNm para impedir
que los ribosomas inicien la traduccin.
No tenemos ya ribosoma ah y se inhibe la traduccin , se apaga
ese gen y as se podr seguir con su ciclo ltico (se sintetizaran las
protenas de la cpside, etc).
Cuando existe ADN monocatenario en la clula infectada por el
fago, la P32 es secuestrada por ese ADN
La afinidad relativa de p32 por distinto tipo de cidos nucleicos
explica en parte sus funciones.
La afinidad de P32 por el sitio en el ARNm debe ser
significativamente menor que su afinidad por el ADN
monocatenario.
La afinidad de P32 por el ARNm debe ser significativamente
mayor que la afinidad por otras secuencias de ADN, estando
influenciada por la composicin de bases y por la estructura
secundaria. La regin reguladora de la unin al ARNm tiene una
secuencia que carece de estructura secundaria.
Protenas ribosmicas
Regulacin autgena y coordinada para varios genes del opern.
En E. coli, esos genes estn distribuidos en operones mezclados con los de la polimerasa y los de la
transcripcin. Esta maquinaria ha de estar coordinada
Los genes para las protenas ribosmicas, factores de sntesis de
protenas y ARN polimerasa estn entremezclados en un pequeo
nmero de operones regulados autnomamente. (Las protenas en
rosa estn sujetas a regulacin)
Tema 5
145
145
Autorregulacin en funcin de la disponibilidad
de ARNr
La traduccin de los operones de r-protenas es
controlada de forma autgena y responde al nivel
de ARNr.
Cuando no hay ARNr las protenas se sintetizan
y no tienen donde ir, si no hay se van a su propio
mensajero inhiben su traduccin y as se controlan
las protenas ribosmicas en funcin del nivel de
protenas ribosmicas.
Protenas en complejos macromoleculares
Regulacin autgena por monmeros de tubulina en eucariotas
La tubulina es ensamblada en microtbulos cuando es
sintetizada. La acumulacin de tubulina libre en exceso induce
inestabilidad en el ARNm de la tubulina actuando en el sitio de
inicio del marco de lectura en el ARNm, o en la posicin
correspondiente en la protena naciente.
Se est sintetizando tubulina hasta que se acumulan los
monmeros libres, stos son los que regulan la traduccin
inhibindola. La produccin de ARNm de tubulina es controlada
por la cantidad de tubulina libre, cuando alcanza una cierta
concentracin la produccin de ms ARNm queda bloqueada, el
ARNm se degrada. Es una inhibicin de la traduccin muy
efectiva.
El sitio diana para la regulacin es un acorta secuencia al inicio
de la regin de codificacin.
La tubulina puede interaccionar con el ARNm o se puede unir
al polipptido naciente. No est claro.
El exceso de tubulina provoca que el ARNm de tubulina, localizado en los polisomas, sea degradado,
haciendo que el ARNm sea inestable.
En la regulacin autgena el parmetro crtico es la concentracin de la protena en s.
Regulacin por ARN anti-sentido
ARN como molcula reguladora de la traduccin.
El ARN antisentido tiene una orientacin contraria al ARNm y por tanto
no se traduce. Puede estar al inicio, en medio o al final del ARNm.
Interfiere con las funciones de los ARN en general: ARNi, interferente o de interferencia
- Procesamiento y transporte (eucariotas)
- Traduccin (procariotas y eucariotas)
- Estabilidad: proporciona dianas para nucleasas que atacan a ARN bicatenario
Regulacin postranscripcional por ARN
Reguladores especficos de un nico gen o reguladores de mltiples operones.
Todos los ARN pequeos (sRNA) pueden ser reguladores
Algunos tienen mltiples dianas en el ARN y /o interaccionan tambin con protenas
ARN
ARN antisentido
total o parcialmente homlogo
Tema 5
146
146
Algunos pueden activar (formacin de estructuras secundarias alternativas), no es lo normal.
Eucariotas: sofisticados y variados sistemas de regulacin, en plantas estn muy estudiados
ARNi
Interfiere con la iniciacin de la traduccin
Provoca la degradacin de mensajeros
Fenmenos de silenciamiento y cosupresin
Importancia como herramienta gentica para la inactivacin de genes
Regulacin global
La respuesta estricta
Cuando las bacterias se encuentran en malas condiciones de crecimiento, carecen del aporte de algn
aminocido, desencadenan la respuesta estricta. Se produce un reajuste total del metabolismo ante esa
situacin de estrs.
- Efector: carencia de amino cidos
- Reduccin de la expresin gentica y maquinaria (ribosomas, ARNr)
- Disminucin sntesis de ARN estable (10-20 veces)
- Disminucin sntesis global de ARNm (3 veces)
- Aumento degradacin protenas, liberan aminocidos
- Disminucin sntesis lpidos, nucletidos, carbohidratos
- Reutilizacin de protenas
- Acumulacin de alarmonas
ppGpp y pppGpp: (p)ppGpp
La respuesta estricta produce la acumulacin de dos nucletidos no habituales, tetra-guanina y penta-
guanina. Regulan de forma coordinada un gran nmero de actividades celulares. Su produccin se
controla de dos maneras:
- Un aumento drstico de (p)ppGpp es ocasionado por la respuesta estricta
- Una correlacin inversa entre los niveles de (p)ppGpp y la tasa de crecimiento bacteriano
La deprivacin de cualquier aminocido, o una mutacin que inactive cualquier aminoacil-ARNt
sintetasa es suficiente para iniciar la respuesta estricta. El hecho que inicia la respuesta es la presencia de
de ARNt no cargado en el sitio A del ribosoma, dispara una reaccin improductiva.
Los componentes implicados en la produccin de (p)ppGpp han sido identificados por la existencia de
mutantes relajados (rel), impiden la respuesta estricta.
El sitio ms comn de aparicin de mutaciones relajadas es el gen relA, que codifica una protena
llamada el factor estricto (RelA).
9
Mutantes relajados, sin factor estricto: RelA
-
, no producen
respuesta al estrs.
El factor estricto es una enzima ((p)ppGpp sintetasa) que cataliza
la reaccin de sntesis en la que se utiliza ATP para aadir un
pirofosfato a GTP o GDP.
A ruta sintetiza siempre (p)ppGpp a niveles bajos, en condiciones
normales hay sntesis y degradacin.
Cuando se produce la respuesta estricta entra una ruta de sntesis
ms potente que depende de RelA, se produce una gran acumulacin
de pppGpp que se transforma en ppGpp por distintas protenas
ribosmicas y luego en GDP.
9 Mutantes estrictos: SpoT
-
: tienen niveles elevados de ppGpp.
Se mantienen siempre estresados, tienen permanentemente
inducida la respuesta estricta. La degradacin queda bloqueada.
El gen spoT codifica una enzima que ejerce la principal actividad
cataltica de la degradacin de ppGpp. La respuesta estricta es
revertida cuando cesa la actividad de (p)ppGpp.
(p)ppGpp es el efector de la respuesta estricta.
El factor estricto cataliza la sntesis de
(p)ppGpp; las protenas ribosmicas
pueden desfosforilar pppGpp y formar
ppGpp
Tema 5
147
147
Activacin de RelA
Comparacin de sntesis normal de protenas y de la
entrada de ARNt no cargado:
En la sntesis protenica normal la presencia de
aminoacil-ARNt en el sitio A es la seal para que la
peptidil transferasa lo transfiera a la cadena polipeptdica,
esto es seguido por el movimiento catalizado por EF-G,
pero bajo condiciones estrictas la presencia de ARNt no
cargado provoca que la protena RelA sintetice (p)ppGpp
y que el ARNt salga despedido.
Elongacin con aa-ARNt: el aa-ARNt es el sustrato
para la sntesis de pptidos, seguida del movimiento del
ribosoma.
Entrada ARNt descargado que inicia la reaccin
improductiva seguida de la liberacin del ARNt.
Cuando entra un ARNt descargado se producen
cambios conformacionales activan a la enzima RelA.
La activacin de RelA se ha identificado con mutantes relC, mutantes relajados, no se pueden obtener
mutantes nulos puesto que es un gen esencial, si falta esa protena la bacteria no puede vivir. RelC, que es
lo mismo que rplk, codifica una protena (L11) de la subunidad 50S, localizada cerca de los sitios A y P.
RelA ha de estar asociada al ribosoma para sintetizar pppGpp.
Cuando hay una elevada carencia de aminocidos, en todos los ribosomas se forma pppGpp, por tanto
aumenta mucho en la clula, cuando se restablece la carencia de aminocidos el pppGpp se degrada
rpidamente.
Funciones del (p)ppGpp
Inhibe la iniciacin de la transcripcin en los promotores de ARNr. Las mutaciones en cis, en los
promotores regulados estrictamente, anulan el control estricto. Esto sugiere que el efecto requiere
una interaccin con secuencias especficas del promotor. (p)ppGpp disminuye la estabilidad de
los complejos abiertos. Repercute en toda la expresin gnica.
Interfiere con la elongacin de la transcripcin de ARNr y otros ARN. Aumenta la frecuencia de
pausas de la ARN polimerasa, aumentan las probabilidades de que la polimerasa encuentre y
reconozca otros terminadores.
Regulacin global
Tasa de crecimiento y transcripcin de ARNr (sntesis de ribosomas)
La regulacin se ejerce a nivel de promotores de ARNr y ARN
polimerasa, se forman complejos abiertos inestables. El esquema
resume los sistemas utilizados para controlar la transcripcin de ARNr
en respuesta a la tasa de crecimiento.
Bajo condiciones de privacin se produce ppGpp, ste inhibe la
iniciacin de los promotores de los loci rrn que codifican ARNr.
Segn aumenta la tasa de crecimiento, los niveles de ATP y GTP
aumentan, lo que aumenta la tasa de iniciacin de los promotores.
Los promotores rrn forman complejos atpicos con la ARN
polimerasa, siendo complejos abiertos inestables. Promotores de los
ARNr y la ARN Pol forman complejos abiertos inestables
El aumento de NTP conduce a la reaccin de iniciacin estabilizando
los complejos abiertos.
NTP y (p)ppGpp: efectos contrarios sobre la iniciacin (CA)
el aa-ARNt es el sustrato para la
sntesis de pptidos, seguida del
movimiento del ribosoma
Tema 5
148
148
Carencia: se acumula ppGpp y se inhibe la transcripcin
Abundancia: se acumulan NTP facilitando la iniciacin de la transcripcin, se acumula ARNr por tanto
hay abundancia de ribosomas y de sntesis proteica.
El nivel de ARNr controla la produccin de ribosomas, inhibiendo la produccin de protenas
ribosmicas, por tanto la produccin de ribosomas y sntesis proteica responden a niveles de ATP y GTP,
los cuales reflejan el nivel nutricional de la clula.
Regulacin de la terminacin de la transcripcin
Mecanismos de antiterminacin:
- Dependientes de factores antiterminadores
- Dependientes de la traduccin
9 Antiterminacin de pendiente de antiterminadores
Mecanismo de control en circuitos reguladores de fagos y de operones bacterianos.
Inhibicin de la terminacin en un terminador especfico.
Antiterminador: regulador especfico. Reconocen secuencias
especificas.
La transcripcin se realiza entre promotor y terminador. La
protena antiterminadora hace que la ARN polimerasa ignore al
terminador y siga transcribiendo. El antiterminador debe
reconocer secuencias especficas para asociarse a la polimerasa
y continuar transcribiendo.
Una caracterstica en el control de la infeccin del fago es
que muy pocos de los genes del fago , los genes tempranos,
pueden ser transcritos por la ARN polimerasa del husped.
Entre estos genes hay algunos reguladores cuyos productos
permiten que se exprese la siguiente serie de genes del fago.
Una protena reguladora de este tipo tendra dos tipos de accin:
- facilitar la iniciacin de nuevos promotores o
- obligar a la polimerasa a leer ms all de los terminadores del fago.
mRNA producido comparte las mismas secuencias 5
Sitio de unin del antiterminador no es el terminador
Varia de un antiterminador a otro o de un terminador a otro
La antiterminacin controla la capacidad de la enzima para
pasar un terminador y leer los genes ms all de ste. El factor
de antiterminacin regula la expresin de la regin 2.
La antiterminacin puede usarse para controlar la
transcripcin al determinar si la ARN polimerasa termina o
ignora un terminador particular para pasar a la regin siguiente.
Tema 5
149
149
Control de expresin en el fago
La ARN polimerasa del husped transcribe inicialmente dos genes, genes tempranos (fase inicial
temprana). El paso a la siguiente etapa se controla impidiendo la terminacin de los genes tempranos, se
expresan los siguientes (fase inicial tarda).
El gen regulador se identifica por mutaciones en el gen N del fago, que slo puede transcribir los genes
de la fase inicial temprana, los mutantes no siguen transcribiendo. Este es un mecanismo de control
positivo en los que se tiene que elaborar el producto de un gen temprano por parte del fago como
condicin para expresar la siguiente serie de genes.
Hay dos unidades de transcripcin de genes tempranos, que
se transcriben desde los promotores P
L
y P
R
. La transcripcin
por la polimerasa del husped se para en los terminadores t
L
y
t
R
respectivamente. Ambos terminadores dependen de rho. La
expresin de N (pN) es una protena de antiterminacin que
permite que la polimerasa pueda leer ms all de los
terminadores y entrar en la fase inicial tarda.
Se necesita un control ms para expresar los genes tardos del
fago, codifican la cpside, est regulado por el gen Q, es uno
de los genes de la fase inicial tarda, su producto, pQ, es otra
protena de antiterminacin que permite a la polimerasa iniciar
especficamente en el promotor tardo P
R
.
La ARN polimerasa interacciona con las unidades de
transcripcin de manera que un factor auxiliar puede promover
la antiterminacin especfica de algunos transcritos.
pN tiene que estar asociada a la polimerasa antes de llegar al
terminador y hace que la polimerasa vaya ms deprisa y no
reconozca al terminador.
Los sitios de reconocimiento de pN se llaman nut y se
encuentran aguas arriba del terminador, muy cercana al
promotor.
Los sitios de reconocimiento de pQ se llaman qut y se encuentra en el promotor. Es una secuencia
esencial, necesita asociarse con la polimerasa antes de iniciar la transcripcin y ejerce su funcin aguas
abajo del terminador.
9 Antiterminacin de pendiente de traduccin
- Polaridad: Mutacin fin de mensaje afecta a la expresin de genes distales o tardos. Provoca la
ausencia de ARNm correspondiente a las partes distales de la unidad. Efecto a nivel de
mensajero. Explicacin: terminadores dependientes de rho que no se usan entre los genes.
- La traduccin controla la terminacin de la transcripcin
La accin rho puede crear un vnculo entre la
transcripcin y la traduccin cuando un terminador
dependiente de rho se encuentra justo antes de una
mutacin sin sentido.
Los ribosomas empaquetan al ARNm detrs de la
polimerasa.
En el silvestre: los ribosomas impiden la unin de rho y
su movimiento. Rho se une pero los ribosomas le impiden
el movimiento. La transcripcin contina. Si hay
traduccin hay expresin de genes distales.
Mutante sin sentido: los ribosomas se disocian en el lugar
de la mutacin. Rho obtiene acceso a la polimerasa. La
transcripcin termina de forma prematura. Si para la
traduccin no hay expresin de genes distales.
Mutaciones en rho suprimen la polaridad.
Tema 5
150
150
Atenuacin
Mutaciones dominantes en cis que elevan la expresin, independientemente de la regulacin
del opern
Identificacin de un sitio de regulacin negativa
Elementos implicados
Terminador intrnseco, precedido por otro
Elemento que controla la formacin de la horquilla del terminador
Anti-terminacin: si no se forma un terminador no hay terminacin
Varios operones son regulados mediante atenuacin, un mecanismo que controla la capacidad de la
ARN polimerasa de leer a travs de un atenuador, que es un terminador intrnseco localizado al principio
de una unidad de transcripcin. Algn elemento externo controla la formacin de la horquilla necesaria
para la terminacin intrnseca. Si se permite que se forme la horquilla, la terminacin impide que la
polimerasa transcriba los genes estructurales, contina hasta el terminador y los genes son expresados.
Atenuacin en Trp: estructura del ARNm
El opern trp consta de cinco genes estructurales
ordenados en series contiguas, que codifican las tres enzimas
que convierten el cido corsmico en triptfano. Los genes
estn precedidos por una regin control que incluye un
promotor, operador, regin codificadora del pptido lder y
un atenuador.
La regin reguladora de la transcripcin: P y O
Regin reguladora de la terminacin: Pptido lder y
atenuador.
La expresin del opern es controlada por dos mecanismos
separados:
- la represin de la expresin por una protena
represora, codificada por el gen trpR, que se une a un
operador adyacente al promotor
- la atenuacin controla el progreso de la ARN
polimerasa dentro del opern, regulando si la
terminacin sucede en un sitio precedente al primer
gen estructural.
Pequeo pptido lder en el opern, con un terminador intrnseco al final de la zona codificante
El terminador impide la transcripcin cuando el pptido lder se traduce normalmente: no se
expresa el opern
Cuando el pptido lder se traduce lentamente, los ribosomas impiden la formacin del terminador:
expresin
La secuencia entre el promotor y el gen trpE:
- pptido lder: una secuencia codificadora
corta, codifica un pptido sin funcin celular.
- atenuador (terminador intrnseco): supone una
barrera para la transcripcin dentro de los
genes estructurales. Rico en G-C en la
horquilla y con una cola poli U.
Tema 5
151
151
-- La traduccin del pptido lder controla la transcripcin:
El pptido lder consta de 14 aminocidos, contiene un sitio de unin al ribosoma cuyo codn AUG es
seguido de una regin codificadora con dos codones sucesivos para triptfano (el Trp es raro en una
protena). Cuando la clula agota el triptfano los ribosomas inician la traduccin del pptido lder, pero
se detiene al alcanzar los codones de Trp, entonces no se forma el terminador y la traduccin contina. La
secuencia del ARNm sugiere que esta detencin ribosmica influye en la terminacin en el atenuador.
La abundancia de triptfano (aminoacil-ARNt)
determina la terminacin.
La terminacin en el atenuador responde al nivel de
triptfano. En presencia de cantidades adecuadas de
triptfano la terminacin es eficiente, pero en
ausencia de triptfano, la ARN polimerasa contina
su funcin en los genes estructurales.
La represin y la atenuacin responden de la misma
forma al nivel de triptfano. Cuando hay triptfano
presente el opern es reprimido y la polimerasa acaba
en el atenuador. Cuando se retira el triptfano la
polimerasa tiene acceso libre al promotor y adems
no termina prematuramente. Trp funciona como un
correpresor.
Hay factores que facilitan la velocidad de la
transcripcin, la polimerasa va despacio y hace una
pausa en un sitio concreto, facilitando la coordinacin
con el ribosoma que viene detrs, esa pausa es
importante para que el sistema funcione.
La atenuacin tiene un efecto multiplicador por 10
en la transcripcin, cuando el Trp est presente, la
terminacin es efectiva, y el atenuador permite que
slo el 10% de la ARN polimerasa proceda con su
funcin. En ausencia de Trp la atenuacin permite
que casi toda la polimerasa trabaje.
Junto con el aumento de unas 70 veces en la iniciacin de la transcripcin que resulta de la liberacin de
la represin, esto permite la regulacin del opern en un rango de 700 veces.
Estructuras alternativas del ARNm
Dos estructuras alternativas pueden formarse, dependiendo si los ribosomas se detienen o no durante la
traduccin del pptido lder. La secuencia lder puede ser escrita segn estructuras con un apareamiento de
bases alternativo. La capacidad del ribosoma para proceder a travs de la regin lder controla las
transiciones en estas estructuras, siendo la estructura la que determina si el ARNm puede proporcionar los
hallazgos para la terminacin.
La figura central muestra las cuatro
regiones que pueden aparearse.
A la izquierda est la conformacin
producida cuando la regin 1 se aparea con
la 2, y la 3 con la 4 que forman la horquilla
de terminacin que precede a la secuencia
poli U, signo esencial para la terminacin
intrnseca.
A la derecha la regin 2 se aparea con la 3,
dejando la 1 y la 4 sin aparear, la regin de
terminacin es de cadena nica, no se forma
la horquilla de terminacin.
Tema 5
152
152
Que se forme una estructura u otra depende de la velocidad de los ribosomas, si hay triptfano el
ribosoma va ms deprisa y se forma la estructura del terminador.
La posicin del ribosoma puede determinar una estructura u otra.
Cuando hay triptfano los ribosomas sintetizan el pptido lder hasta el
codn UGA, situado entre regiones 1 y 2. El ribosoma se extiende sobre
la regin 2 e impide que se apareen las bases en ella; la regin 3 se
aparea con la 4 generando la horquilla de terminacin.
Cuando no hay triptfano, los ribosomas se detienen se detienen en los
codones Trp, estn en la regin 1 y no se puede aparear con la 2; la
regin 2 y 3 se pueden aparear antes de que la regin 4 se haya
transcrito, sta se queda como cadena nica y no se forma la horquilla de
terminacin t la ARN polimerasa contina la transcripcin.
El mecanismo de atenuacin es importante en operones de sntesis de
aminocidos.
El opern de histidina slo se regula a nivel de atenuacin.
Para la terminacin: acoplamiento y estructuras secundarias del
ARNm, no se precisan protenas auxiliares.
Papel del Trp-ARNt
Cuando hay triptfano se forma terminador, no hay sntesis del
opern Trp.
Cuando no hay triptfano se impide la formacin del terminador,
hay sntesis del opern Trp.
Tema 5
153
153
Circuito complejo de regulacin en procariotas
Regulacin a distintos niveles
Integracin de distintos sistemas de regulacin
Fenmenos caractersticos de procesos de desarrollo
- Expresin programada y secuencial de (grupos de) genes
- Decisiones alternativas
Fago : lisis y lisogenia
En estado lisognico, el genoma del profago est inactivo
(reprimido). En la fase ltica, se activan (inducen) los genes
necesarios para la reproduccin del fago.
Cascada ltica
Dos reguladores: N y cro
Circuito lisogenia
cI, cII y cIII
Ambos estn conectados
Regulacin a distintos niveles
Integracin de distintos sistemas de regulacin
Fenmenos caractersticos de procesos de desarrollo
- Expresin programada y secuencial de (grupos de) genes
- Decisiones alternativas
Mapa gentico de , muestra el agrupamiento
de las funciones relacionadas.
N: codifica un factor de antiterminacin cuya
accin en los sitios nut permite que la
transcripcin proceda a travs de los genes de la
fase inicial tarda.
Cro: funcin doble
- Evita la sntesis del represor (necesario si se
va a producir el ciclo ltico)
- Desactiva la expresin de los genes de la
fase inicial temprana, necesarios en fases
posteriores del ciclo ltico
cI: represor de la lisogenia
cII-cIII: reguladores necesarios para comenzar la sntesis del represor
Q: regulador, factor de antiterminacin que permite a la polimerasa del husped progresar en los genes
tardos.
lisogenia y lisis
Organizacin del genoma de
Regin no esencial en vectores
Organizacin del genoma de
Regin no esencial en vectores
Integracin Regulacin
Tema 5
154
154
Cuando el ADN de entra en una nueva clula las vas ltica y
lisognica comienzan de la misma manera. Ambas requieren la
expresin de los genes tempranos inmediatos y tempranos
tardos. Luego divergen:
- el desarrollo ltico contina si los genes tardos son
expresados
- se pasa al ciclo lisognico si se produce la sntesis del
represor
Ciclo ltico:
- Genes tempranos inmediatos:
la ARN polimerasa del
husped transcribe N y cro
desde P
L
y P
R
- Antiterminacin: N
- Genes tempranos tardos: la
protena N permite que la
transcripcin contine una
vez pasados N y cro
- Antiterminacin: Q
- Genes tardos: la
transcripcin se inicia en P
R
,
(entre Q y S) y pQ permite
que contine a travs de
todos los genes tardos
- Lisis
El fago tiene dos unidades tempranas de
transcripcin:
- la izquierda, la cadena superior se transcribe hacia
la izquierda. Promotor P
L
. Terminador t
L
.
- la derecha, la cadena inferior se transcribe hacia la
derecha. Promotor P
R
. Terminador t
L
.
Hay dos genes N y cro. N se transcribe hacia la
izquierda y cro hacia la derecha.
En presencia pN la transcripcin contina hacia la
izquierda de N, en los genes de recombinacin, y hacia
la derecha de cro, en los genes de replicacin.
La progresin hacia la lisis depender de N y de Q.
La cascada ltica del fago est
interconectada con el circuito
lisognico
El ADN de adquiere forma
circular durante la infeccin, de
forma que los genes tardos se
agrupaen en una nica unidad de
transcripcin
Tema 5
155
155
Genes tempranos inmediatos
N y cro: transcritos por la ARN polimerasa bacteriana
P
L
. N: antiterminador. Permite que la transcripcin contine en el promotor de la izquierda P
L
.
P
R
. Cro. Impide la expresin de cI y de los genes tempranos
N acta sobre los terminadores y se extienden los transcritos de P
L
y P
R
. Se expresan los genes
tempranos retrasados y se produce la cascada ltica
Expresin temprana de
N: gen esencial, necesario para progresar en la lisis y adems tiene
funciones en la lisogenia, hay que extender los transcritos.
Cro: solamente interviene en la lisis, es el regulador transcripcional
(represor)
Control lisis-lisogenia en
Durante la lisogenia no se expresan genes.
Mutantes defectivos en lisogenia, siempre realizan el ciclo ltico. Se
buscan en calvas de lisis que son ms claras, son mutantes clear. Se
hicieron tres grupos de complementacin: cI, cII, cIII. cI resulta esencial
para la lisogenia, cuanto ms cI haya ms lisogenia habr, los otros dos
son activadores de cI.
Los promotores P
L
y P
R
se sitan a cada lado de cI. Cada promotor tiene un operador asociado (O
L
, O
R
)
al que se une la protena represora que impide la transcripcin, y evita que el fago entre en el ciclo ltico.
La secuencia de cada operador se superpone a la del promotor por lo que se describen como regiones
control P
L
/ O
L
y P
R
/ O
R
.
Mantenimiento de la lisogenia:
- el Represor cI
La protena represora es codificada por el gen cI. Los
mutantes en este gen no pueden mantener la lisogenia y
siempre entran en el ciclo ltico.
Funciones de cI:
Represin a O
L
/P
L
y a O
R
/P
R

Activacin a P
RM
Impidiendo el acceso de la ARN polimerasa a estos
promotores, el represor evita que el genoma del fago entre
en el ciclo ltico. Reprime la expresin por al iquierda y por
la derecha.
La protena represora es codificada por cI. Es un dmero y
se une a las regiones reguladoras, al ADN se unen dos
dmeros.
El paso de lisogenia a induccin ltica es irreversible.
Genes tempranos inmediatos
N Cro
Antiterminador Reg. Transcripcional
Lisis Lisogenia
Genes tempranos inmediatos
N Cro
Antiterminador Reg. Transcripcional
Lisis Lisogenia
los cultivos de salvaje forman
calvas turbias (izquierda); los
mutantes que no pueden entrar
en lisogenia forman clavas
claras (derecha).
La regin reguladora contiene un grupo de funciones que actan en
trans y elementos que actan en cis.
Tema 5
156
156
El gen cI es transcrito a partir de un promotor P
RM
(mantenimiento de la represin) que se sita en su
extremo derecho, se encuentra entre P
L
y P
R
. El represor se une de forma independiente a los dos
operadores. La protena represora unida al ADN hace que se transcriba a partir de P
RM
, por tanto se
produce ms represor. Autorregulacin positiva.
- Los operadores O
L
y O
R

Mutaciones clear en cis. Tambin son vir. Son mutaciones dominantes. Mutaciones (virulentas): afectan
a la inmunidad.
Los operadores fueron identificados por las mutaciones virulentas. Estas mutaciones impiden que el
represor se una a O
L
u O
R
, el fago entra inevitablemente en el ciclo ltico. Los mutantes vir pueden crecer
en clulas lisognicas, pues las mutaciones virulentas en O
L
y O
R
permiten que el nuevo fago ignore al
represor residente y entre en el ciclo ltico.
La presencia del represor explica el
fenmeno de inmunidad. Si un segundo
fago entra en una clula lisogenia, la
protena represora sintetizada a patir del
profago residente se unir inmediatamente
a los operadores del nuevo fago, evitando
que entre en lisis.
La regin que incluye los operadores, el gen cI y el gen cro determinan la inmunidad del fago. Todo
fago que posea esta regin tiene el mismo tipo de inmunidad, se conoce como regin de inmunidad.
El represor cI: estructura y funcin
Es un dmero
Dos dominios:
Dimerizacin
Unin al ADN y una regin conectora
La rotura (protelisis) del represor resulta en la induccin del profago
Los dos dominios del monmero estn unidos por una zona conectora,
cuando el represor es digerido por una proteasa cada dominio es liberado
como un fragmento separado, represor inactivo, induccin del profago y
entra en ciclo ltico.
El dominio de dimerizacin (C-terminal) es diferente al dominio de interaccin con el ADN (N-
terminal). La estructura dimrica del represor es crucial para el mantenimiento de la lisogenia.

Los dmeros de represor se unen al operador. La afinidad de los
dominios N-terminales por el ADN es controlada por la dimerizacin
de los dominios C-terminales.
Los monmeros estn en equilibrio con los dmeros, que se unen al
ADN.
La rotura de los monmeros altera el equilibrio, por lo que los
dmeros se disocian.
La induccin aparece bajo circunstancias adversas, como una
exposicin de la bacteria lisogenia a radiacin UV, produce la
inactivacin por proteolisis del represor.
4 fagos lambdoides (, 80, 21 y 434) tienen la misma regin de inmunidad 4 fagos lambdoides (, 80, 21 y 434) tienen la misma regin de inmunidad
Tema 5
157
157
Interacciones represor/ operador
cI interacciona mediante motivos H-T-H (hlice-giro-hlice) de unin a ADN.
El dominio N-terminal del represor contiene motivos H-T-H. La hlice 3
es responsable del reconocimiento de la secuencia diana.
La hlice de reconocimiento de cada
monmero se sita en el surco mayor de la
misma cara del ADN, y las hlices 2 de
forma cruzada respecto a l.
Una de las secuencias del operador se une
al represor.
cI y cro se unen a las mismas secuencias operadoras con distinta
afinidad. Ambas tienen una organizacin similar del motivo H-T-H.
Las hlices de reconocimiento establecen contactos especficos con las
bases del surco mayor.
Dos de los aminocidos implicados en el reconocimiento son idnticos
en represor y en Cro . las interacciones de la figura representan la unin a
la secuencia de ADN que cada protena reconoce con mayor afinidad. Los
contactos son muy parecidos pero no idnticos.
El represor realiza un contacto adicional con la otra cara del ADN.
Los brazos de cI establecen contactos adicionales y aumentan 1000
veces la afinidad por el ADN. El extremo N-terminal del represor
aumenta la afinidad por el ADN. Cro realiza contactos similares a los del
represor, pero slo se une a una cara del ADN, careciendo de brazos N-
terminales que en el represor rodean al otro lado.
Interacciones represor /operadores/ promotores
Cada operador contiene tres sitios
de unin al represor y se superpone
al promotor al cual se une la ARN
polimerasa. La orientacin de O
L
ha
sido invertida con respecto a la
situacin normal.
Los sitios de cada operador estn
numerados (O
R
1, O
R
2, O
R
3 y O
L
1,
O
L
2, O
L
3). En cada caso el sitio 1 es
el ms cercano al punto de inicio de
la transcripcin en el promotor, los
otros se encuentran ms alejados en
direccin 5.
La secuencia de los operadores
de cI es palindrmica (casi).
El represor tiene mayor afinidad (10 veces)
por O1 que por O2, O3 (en OR y OL)
La unin al segundo operador
es cooperativa (en OR y OL)
Tema 5
158
158
El represor tiene ms afinidad por el sitio 1 de ambos operones, se
apagan las transcripciones de los dos sentidos. El represor se une a
sitios consecutivos dentro de cada operador de una forma
cooperativa. La presencia de un dmero en el sitio 1 aumenta mucho
la afinidad para que un segundo dmero se pueda unir al sitio 2, pero
no por el sitio 3; con muy poco ms de represor se une al sitio 2; con
la cooperatividad el represor se hace ms eficiente sin aumentar
mucho su concentracin, el represor aumenta la afinidad por el
operador a concentraciones fisiolgicas.

La polimerasa no puede acceder a los promotores correspondientes (P
R
y P
L
); pero si puede acceder al
P
RM
, se sintetiza ms represor. El dmero de O
R
2 interacta con la polimerasa. Autorregulacin positiva.
Se acumula protena represora que se une a O
R
3 entonces acta como represor de P
RM
y deja de
sintetizarse represor. A menor concentracin de represor se activa el promotor y se sintetiza ms; cuando
la concentracin aumenta se reprime el promotor y deja de sintetizarse; se mantienen unos niveles
apropiados de represor para mantener la lisogenia. Cuando el represor est unido a :
- O
R
1: reprime a P
R
; regulacin positiva
- O
R
2: aumenta la represin de P
R
y activa a P
RM
; autorregulacin
El represor es un regulador autgeno de su propia expresin que funciona positivamente a bajas
concentraciones y negativamente a altas concentraciones.
Las mutaciones de control positivo (mutaciones que suprimen el
control positivo en cI) identifican una pequea regin en la hlice 2 del
represor que interacta de forma directa con la ARN polimerasa.
Hay mutantes capaces de unirse al operador pero no pueden estimular
a la polimerasa para que transcriba desde P
RM
. Estas mutaciones se
encuentran en la hlice 2 o en el giro entre las hlices 2 y 3
Mutaciones O
C
(vir): en O1 y O2. Pueden aparecer mutaciones virulentas en los sitios 1 y 2 de los
operadores. Las mutaciones varan en su grado de virulencia, de acuerdo con la cantidad en la que reducen
la afinidad del sitio de unin por el represor, tambin depende de la relacin del sitio afectado con el
represor. Como los sitios 3 no suelen estar ocupados no se encuentran mutaciones virulentas en estos
sitios.
Ms coperatividad: La cooperatividad aumenta la sensibilidad del sistema, facilitando la induccin
PR y PL estn alejados pero se unen en un
bucle favorecido por la unin del represor
unido a los operadores. Se establecen
contactos entre los dmeros adyacentes y los
de distintos promotores, la represin es ms
eficaz. Esa es la situacin de mantenimiento
de la lisogenia.
Cuando aumenta el represor se ocupan los sitios 3 de los operadores, tambin hay cooperatividad entre
ellos, se produce una situacin ms estable.
Los dmeros de cI en sitios adyacentes
establecen contactos, aumentando la eficacia de
la represin
Tema 5
159
159
Establecimiento de la lisogenia:
Sntesis inicial del represor cI
Cuando un ADN de entra en una clula husped,
la ARN polimerasa no puede transcribir a cI, pues no
hay represor presente que active a P
RM
. La ausencia
de represor indica que P
R
y P
L
estn disponibles, por
lo que lo primero que ocurre es que los genes N y cro
son transcritos. Entonces, pN permite que la
transcripcin se prolongue, se transcribe cIII hacia la
izquierda y cII hacia la derecha.
Entre los genes cII y cro hay otro promotor, P
RE
(establecimiento
de la represin). Este promotor puede ser reconocido por la
polimerasa slo en presencia de la protena cII.
P
RE
es estrictamente dependiente de cII.
La sntesis de represor se establece por la accin de cII y la ARN
polimerasa en P
RE
para iniciar la transcripcin que se extiende por
la cadena antisentido de cro y a travs del gen cI.
La protena cII es muy inestable, por lo que la activacin es
transitoria, en cuanto desaparece la protena se acaba la
transcripcin.
La regin codificadora de cI en el transcrito P
RE
es traducida de forma muy eficiente, el represor es
sintetizado unas 7 veces superior a la transcripcin desde P
RM
.
Se promueve la lisogenia de dos formas:
- Efecto directo: produccin de protena represora
- Efecto indirecto: transcrito antisentido de cro, se hbrida con el ARNm de cro inhibiendo
su traduccin.
Regulacin positiva de represor.
Regulacin negativa de cro.
Funciones de cII y cIII
Funciones de cII: gen temprano tardo, favorece la lisogenia en ms de un punto.
Activacin a P
RE
(+ cI, - cro, - N)
Activacin a P
int
(integracin), expresin importante y transitoria
Activacin a P
anti Q
(-Q)
Funciones de cIII
Estabiliza a cII
Secuencia temporal: N y cro se transcriben para poder sintetizar cII y
cIII, entponces se inicia la transcripcin del represor.
cII es antagnica de cro.
Las dos protenas son prescindibles si se le suministra represor a la
clula.
Los genes cII y cIII son reguladores positivos cuyos productos son
necesarios para un sistema alternativo de sntesis de represor.
Es una protena muy inestable, se degrada como resultado de l
actividad de una protena del husped (Hfla). El papel de cIII es
proteger a cII contra la degradacin.
Mutaciones bacterianas hflA, hflB (high frequency of lysogenia)
identifican proteasas que degradan a cII
E. coli: Ms proteasas de cII y ms lisis en medios ricos de cultivo
La lisogenia depende de la estabilidad de cII
Tema 5
160
160
LISOGENIA
Resumen: es necesaria una cascada para establecer la
lisogenia, pero a continuacin este circuito es
desconectado y sustituido por el circuito autgeno de
mantenimiento del propio represor.
Fase temprana inmediata: N y cro son transcritos
Fase temprana retrasada: N antitermina: se
transcriben cII y cIII
Establecimiento de la lisogenia : cII acta en P
RE
: se
transcribe cI
Mantenimiento de la lisogenia: el represor se une a
O
L
y O
R
: cI es transcrito a partir de P
RM
. Hay represin
en P
R
y P
L
.
LISIS
Resumen: la cascada ltica requiere la protena cro, que
impide de forma directa la activacin de la va de
mantenimiento a travs de P
RM
, as como desactiva la
expresin de los genes tempranos inmediatos, lo que impide de
forma indirecta, el establecimiento de la represin a travs de
P
RE
.
Fase temprana inmediata: N y cro son transcritos.
Fase temprana retrasada: pN antitermina: cII y cIII se
transcriben.
Continuacin de la fase temprana retrasada: cro se une a O
L
y
O
R
, reprime a PRM
Expresin tarda: cro reprime a cI y a todos los genes
tempranos; pQ (Q: antiterminacin de genes tardos) activa la
expresin tarda.
X
Tema 5
161
161
cro es el responsable de impedir la
sntesis de la protena represora, esta
actividad inactiva la posibilidad de entrar
en lisogenia. Tiene dos efectos:
- Impide la sntesis de represor a
travs del circuito de mantenimiento
- Reduce la expresin de los genes
tempranos a partir de P
L
y P
R
.
Cro se une a los mismos operadores que
el represor. Cada protena tiene distinta
afinidad por los sitios dentro de los
operadores.
La afinidad de cro por O
R
3 es mayor que
por los otros dos sitios, se une primero al
sitio 3. Esto inhibe la unin de la
polimerasa a P
RM
, por tanto no entra el
circuito de lisogenia.
Luego cro se une a O
R
1 y O
R
2, no existe
efecto cooperativo, e impide que la
polimerasa utilice P
R
deteniendo las fases
tempranas.
Cro reduce la expresin de los genes
tempranos, incluyendo la suya propia.
Dado que cII es inestable, la actividad de
PRE est detenida. Las dos acciones de
cro bloquean, en conjunto, toda la
produccin de represor.
La influencia de la clula husped en el nivel de cII proporciona una ruta a la bacteria para interferir con
los procesos de toma de decisiones. Por ejemplo, las proteasas del husped que degradan cII son activas
por el crecimiento en un medio rico, con lo que tiende a lisar las clulas que estn creciendo bien, siendo
ms probable que entren en lisogenia las clulas con carencia de nutrientes, faltan los componentes
necesarios para un crecimiento ltico eficaz.
Tema 6 162
Tema 6
Regulacin de la expresin gnica en eucariotas
- Niveles de regulacin adicionales
Cromatina: Dificulta la iniciacin de la transcripcin
Procesamiento: CAP, intrones, poli-A. El transcrito primario es modificado por el
recubrimiento del extremo 5 (CAP), la poliadenilacin del extremo 3 (poli-A), se deben
eliminar los intrones de los transcritos.
Transporte al citoplasma
- Niveles de organizacin adicionales
Pluricelularidad: regulacin espacial y temporal. Es importante y complejo, durante el
desarrollo
- Mayor complejidad y diversidad de interacciones
Importancia de la regulacin positiva, en eucariotas la mayora de las regulaciones son
positivas. La polimerasa necesita ms ayuda para acceder al sitio de unin con el ADN.
- TF, de Transcription Factor, en eucariotas es un activador
- RE, de Response Element (sitios de unin en el ADN)
Regiones reguladoras de los genes tipo II
Aumentadores, Potenciadores o Enhancers: responsables de la intensidad y especificidad de la
transcripcin in vivo. Son secuencias potenciadoras de la transcripcin, es otro tipo de sitio implicado en
la iniciacin.
El tpico gen transcrito por la ARN polimerasa II
tiene un promotor que se extiende en direccin 5 del
sitio de inicio de la transcripcin. El promotor tiene
varios elementos de secuencias cortas (<10pb) que se
unen a los factores de transcripcin, que estn
dispersos en >200pb.
Un enhancer (unas 100pb) contiene una serie de
elementos ms agrupados, que tambin se unen a
factores de transcripcin que pueden estar localizados
a varias kb de distancia; el ADN puede estar
enrollado u organizado de otra manera de forma que
los factores de transcripcin en el promotor y en el
enhancer interacten para formar un gran complejo
proteico.
Una diferencia significativa en la transcripcin entre el ARNm eucariota y procariota es que la
iniciacin de un promotor eucariota implica un gran nmero de factores que se unen a una variedad de
elementos que actan en cis. Los promotores se organizan en el principio de mezcla y funcionamiento.
Una variedad de elementos pueden contribuir a la funcin del promotor, pero ninguno es esencial para
todos los promotores. Ejemplos de promotores y regiones reguladoras:
Cuatro tipos de elementos se encuentran en estos promotores:
TATA, GC, CAAT y el octmero (elemento de 8 pb). Los
elementos encontrados en cada promotor individual difieren en
nmero, localizacin y orientacin; y ningn elemento es comn
a todos los promotores. El promotor transporta informacin
direccional (la transcripcin procede solamente en direccin 5),
pero las cajas GC y CAAT son capaces de funcionar en cualquier
direccin (aunque sus secuencias son asimtricas).
La caja TATA se encuentra en todos los promotores, el resto
no se relacionan pero comparten dos a dos los elementos.
Estructura modular: los mismos sitios/ factores en distintas combinaciones y posiciones.
Solo la caja TATA tiene una posicin fija respecto al inicio.
Tema 6 163
Promotor genrico / mnimo: se encuentra en la mayora de los inicios de genes
- Caja TATA
- Sitio de iniciacin (PyrAPyr)
Promotor basal: nivel mnimo de transcripcin in vivo. Es indispensable para iniciar la transcripcin.
Fueron introducidas sustituciones
individuales de bases en casi todas las
posiciones en los 100 pb en direccin 5
desde el punto de inicio. La mayora de las
mutaciones no afectan a la habilidad del
promotor de iniciar la transcripcin.
Regiones o secuencias importantes para
la transcripcin: los huecos de la grfica.
Las mutaciones lentificadoras (por
debajo de 1) suceden en tres
localizaciones, corresponden a 3
elementos cortos. Los 2 elementos en
direccin 5 tienen un mayor efecto sobre
el nivel de transcripcin que el elemento
ms cercano al punto de inicio.
Las mutaciones aceleradoras (por
encima de 1) aparecen solamente en uno
de los elementos.
Las tres secuencias cortas centradas a 30, -75 y 90 constituyen el promotor.
Caja TATA: todas las mutaciones en esta caja han disminuido al frecuencia de transcripcin, disminuye
la frecuencia de inicio de la transcripcin. Es el componente menos efectivo del promotor, no se evita la
iniciacin cuando muta pero cambia el punto de inicio de su posicin habitualmente precisa. La caja
TATA es importante para el inicio de la transcripcin.
Caja GC: a menudo mltiples copias en el promotor, puede aparecer en cualquier direccin
Caja CAAT: tiene un importante papel en la determinacin de al eficiencia del promotor.
Estas dos ltimas cajas tienen efectos ms importantes en la transcripcin, tienen que ver con el
reclutamiento de la polimerasa.
Las bases en rojo sealan sitios de unin a una protena especfica.
Los factores de transcripcin generales estn disponibles e cualquier promotor que tenga una copia del
elemento que pueden reconocer.
Potenciadores /Enhancers
No hay mutaciones que aumenten la frecuencia
de transcripcin. El histograma recoge el efecto
de todas las mutaciones que reducen la funcin
del enhancer a <75% de la funcin original.
Los sitios de unin a protenas estn indicados
debajo del histograma.
Algunos sitios /factores pueden ser los mismos
que los de los promotores.
Los enhancer se descubrieron en levaduras (ms sencillos) se llaman
U.A.S. de Upstream Activator Sequences (activador aguas arriba).
Pueden funcionar en cualquier direccin, a distancias variables en
direccin 5 del promotor, pero no pueden funcionar en direccin 3.
Enhancers y UAS: la distancia y orientacin respecto al inicio no
afectan a su funcin. En bacterias tambin hay secuencias con estas
caractersticas. Aunque los elementos se cambien de sitio seguirn
haciendo su accin de activador.
Anlisis de un promotor tpico
Cajas GC CAAT TATA
Factores Sp1 CTF NF1 TBP
Nivel relativo de transcripcin (1= normal)
Tema 6 164
El enhancer ejerce su funcin potenciadora de la transcripcin an estando lejos del promotor. El ADN
forma bucles de forma que la distancia se reduce. Si una protena unida a un enhancer situado a varios pb
de distancia (100-1000 pb) de un promotor interacta directamente con protenas unidas en la vecindad del
punto de inicio, la organizacin del ADN debe ser lo suficientemente flexible para permitir que el
enhancer y el promotor se siten uno cerca del otro. La mayora de los genes reguladores tienen estos
elementos y actan desde posiciones lejanas. En bacterias tambin hay secuencias con estas
caractersticas, el ADN tambin forma bucles.
Factores reguladores de los genes tipo II
Los FT (generales o especficos) facilitan o estabilizan el ensamblaje de complejo de iniciacin.
Factores basales: Indispensables para el ensamblaje del complejo de iniciacin. Requeridos para
los mecanismos de inicio de la sntesis del ARN en todos los promotores. Se unen a la polimerasa
para formar un complejo que rodea el punto de inicio, determinando el sitio de iniciacin.
Factores de regulacin: incrementan la frecuencia de iniciacin. Protenas de unin al ADN que
reconocen elementos especficos:
- Promotores
- Potenciadores
Activadores: Unin a elementos de respuesta. La mayora se unen al
ADN e interaccionan con otro elemento del complejo de iniciacin.
Interaccin protena-ADN.
Co-activadores: Interacciones indirectas (protena-protena). Algunos
factores de transcripcin no contactan directamente con el aparato basal
sino que son los coactivadores los que contactan con l. Son como factores
de transcripcin cuya especificidad viene conferida por la capacidad de
unirse a factores de unin al ADN.
Represores (menos frecuentes): un represor puede bloquear la
interaccin de un factor de transcripcin en direccin 5 con el aparato
basal. Los represores inhiben la funcin del aparato basal (un represor
bacteriano bloquea directamente la unin o el movimiento de la ARN
polimerasa).
Activadores: Interaccionan con
elementos del complejo de
iniciacin
Un activador tpico tiene dos dominios unidos por una regin larga y flexible, la flexibilidad permite
establecer interacciones distintas en diferentes promotores y es tpica de reguladores eucariticos. Un
dominio interacciona con el ADN y el otro con una protena.
Coactivadores: TF sin dominio o motivo de unin a ADN
Interacciona con una protena que est interaccionando con el ADN y
con otra protena.
Tema 6 165
Represores: interaccionan con elementos en cis (o trans) de promotores
y enhancers.
Efecto a travs de protenas que activan protenas que se unen a
secuencias que son reconocidas por activadores. apuntan a factores de
transcripcin y no a la polimerasa.
Caractersticas de los Factores de Transcripcin
Naturaleza modular. Funciones: interacciones con:
1. ADN (sitios especficos)
2. protenas del complejo de iniciacin
Las funciones de unin al ADN y de activacin en un factor de
transcripcin pueden implicar a dominios independientes de la
protena.
Demostracin experimental
intercambio de mdulos o dominios
Depende la activacin de un dominio particular de unin al ADN? .
Este dominio se puede cambiar para demostrar la independencia de los
dominios. Se hicieron experimentos con protenas hbridas: LexA y
GAL4. sistema de doble hbrido en levaduras, tcnica para detectar
interacciones protena-protena. Esta tcnica no permite hacer bsqueda en
genotecas de expresin, se fabrican colecciones de protenas hbridas.
Doble hbrido: aproximacin gentica al anlisis e identificacin de
interacciones protena-protena.
El represor bacteriano LexA tiene un dominio de unin al ADN que
reconoce un operador especfico; la unin de LexA a este operador
reprime al operador adyacente. Fue sustituido por el dominio de unin al
ADN de GAL4. el gen hbrido se introdujo en la levadura junto con el gen
testigo reporter que contiene el UAS o el operador de LexA.
Una protena GAL4 autntica puede activar un gen testigo o reporter
slo si tiene un UAS. El represor LexA en s, carece de la capacidad de
activar cualquier tipo de diana.
LexA: represor de E. coli
Gal4: activador de Saccharomyces
LexA: represor de E. coli
Gal4: activador de Saccharomyces
Tema 6 166
El hbrido no puede activar un gen con UAS, pero puede activar un gen con un operador LexA.
La capacidad de GAL4 de activar la transcripcin es independiente de su especificidad de unin al ADN.
Cuando el dominio de unin al ADN de GAL4 es reemplazado por el dominio LexA , la protena hbrida
puede activar la transcripcin cuando un operador LexA se coloca cerca de un promotor.
El resultado demuestra la naturaleza modular de los activadores de transcripcin. El dominio de unin al
ADN sirve para unir la protena en la localizacin correcta. La capacidad de funcionamiento de los dos
tipos de mdulos en protenas hbridas sugiere que cada dominio de la protena forma una estructura
activa independiente que no est influenciada por el resto de la protena.
Regulacin por mltiples seales: El gen de metalotioneina (MT)
Las seales: presencia de metales
pesados y diversas hormonas
Distintos elementos, en promotor o
enhancer, pueden activar
independientemente la transcripcin.
Los TF implicados pueden ser ubicuos
o especficos de tejidos.hay protenas
especficas de tejido, otras son ubicuas
porque se pueden encontrar en cualquier
tejido.
La regin reguladora de un gen de MT humano contiene elementos reguladores tanto en el promotor
como en le enhancer. El promotor tiene elementos para la induccin de metales, y el enhancer tiene un
elemento para la respuesta a glucocorticoides.
El elemento que causa que un gen responda a un factor regulador se conoce como elemento de respuesta
al choque trmico, pueden ser: elemento de respuesta al choque trmico (HSE); elemento de respuesta a
glucocorticoide (GRE); elemento de respuesta srico (SER); elemento de respuesta a metales (MRE).

Un gen es regulado por una secuencia en el promotor o en el enhancer que es reconocida por una
protena especfica. La protena funciona como un factor de transcripcin necesario para la iniciacin de la
ARN polimerasa. La protena activa solamente est disponible bajo condiciones en las cuales el gen va a
ser expresado.
El gen MT puede ser regulado en muchos circuitos diferentes. La protena metalotioneina protege a la
clula de las concentraciones excesivas de metales pesados unindose al metal y extrayndolo de la clula.
El gen se expresa a nivel basal, pero su expresin se induce cuando aumenta la concentracin de iones
de metales pesados o por glucocorticoides,
En la organizacin de un promotor de un gen MT hay una alta densidad de elementos que pueden activar
la transcripcin. No se aprecia la diferencia entre promotor y enhancer. Todas las secuencias en cis son
importantes para la regulacin.
La caja TATA y GC son elementos constitutivos, BLE es un elemento del nivel basal se considera
enhancer; estos tres elementos son necesarios para la expresin basal.
La respuesta inductora a metales pesados es conferida por las secuencias mltiples MRE que funcionan
como elementos promotores.
La respuesta a las hormonas esteroideas es gobernada por GRE, enhancer. La delecin de esta regin no
afecta la nivel basal de expresin o al nivel inducido, pero es necesaria para la respuesta a los esteroides.
La ausencia de un elemento necesario para un modo de activacin no afecta la activacin la activacin
de otros modos.
Es un gen importante en el hgado. Las seales aumentan mucho la transcripcin y s hay varias seales
se aumenta ms todava.
Las posibilidades de combinacin en la regulacin eucariota es muy alta.
Tema 6 167
Mecanismos de activacin de los TF
La actividad de un factor de transcripcin
inducible puede ser regulada de distintas
maneras:
- Homeoprotenas: propias de factores que
regulan el desarrollo. Un factor puede ser
activo por la presencia / ausencia de una
protena. Si hay protena hay activacin.
- Modificacin qumica, fosforilacin: HSTF,
factor T de choque trmico. La protena es
activa cuando est fosforilada. Es un
mecanismo rpido.
- Modificacin qumica, desfosforilacin:
Activacin por desfosforilacin de la
protena.
- Unin a un ligando o efector: Receptores
esteroideos, la unin del ligando puede
influir en la localizacin de la protena,
provocando su transporte del citoplasma al
ncleo (cambio de compartimiento), y
determina su capacidad de unin al ADN.
Especfica de eucariotas.
- Disponibilidad de un factor: NF-
k
B se
encuentra unido a un inhibidor secuestrado
en el citoplasma, cuando es liberado el
factor se mueve hacia el ncleo. Cambio de
compartimiento e interaccin con otros
componentes celulares.
- Heterodimerizacin: HLH, Leu-Zippers. Un componente dimrico puede tener componentes
alternativos, un componente puede causar que el factor sea inactivo; la sntesis del componente
activo puede desplazar al inactivo. Hay parejas de protenas que no se unen al ADN pero si forman
un heterodmero distinto si sern capaces de hacerlo. (Prctica usada en eucariotas superiores,
interaccin protena-protena). Interaccin fsica con otros componentes celulares.
- Modificacin proteoltica: roturas que dan lugar a la activacin. Protena anclada a la membrana
nuclear que sufre una proteolisis especfica y parte de ella se libera y puede activar la
transcripcin. Ocurre en respuesta a la ausencia de esteroles. No es exclusivo de eucariotas.
Regulacin transcripcional en los cromosomas eucariticos
El genoma est empaquetado en nucleosomas y la iniciacin de la transcripcin est impedida si la
regin del promotor est organizada en nucleosomas.
Las histonas funcionan como represores generales de la transcripcin,
tambin estn implicadas en interacciones ms especficas.
La activacin de un gen requiere cambios en el estado de la cromatina.
Heterocromatina y eucromatina se asocian a regiones inactivas y activas,
respectivamente.
El sitio importa (transgenes..): la localizacin de todo gen es
importante porque si se cambia el sitioo del mismo es posible que no se
exprese. En el cromosoma no todas las regiones son iguales
(heterocromatina y eucromatina)
Los sitios desprovistos de nucleosomas en el ADN y los activos
(trancripcin, replicacin) son hipersensibles a DNAsa I.
Tema 6 168
Organizacin en dominios funcionales con secuencias que alteran la estructura de la cromatina y
delimitan zonas de regulacin. Hay regiones importantes (cis) y protenas que reconocen esas regiones
(trans).
Hay distintos elementos que favorecen o no la formacin de heterocromatina y regiones que son barrera
para su expansin.
Aisladores: Interfieren con
- Activacin de promotores a distancia (enhancers)
- Propagacin de la heterocromatina (regiones inactivas)
MAR (Matrix Attachment Region, regiones de unin a la matriz)/SAR (Scaffold, regiones de fijacin al
andamio): unin a la membrana nuclear
LCR (locus control region): facilitan la expresin de los genes del dominio
Aisladores: funciones y localizacin
Son elementos que impiden el paso de los efectos activadores o inactivadores.
Cuando un aislador es colocado entre un enhancer y un
promotor, evita que el enhancer active al promotor.
Cuando un enhancer es
colocado entre un gen activo
y heterocromatina, protege al
gen del efecto del efecto
inactivador que se disemina
desde la heterocromatina.
Los aisladores identificados tienen ambas propiedades, sugiriendo que afectan a la organizacin general
de la cromatina, constituyen una barrera a la expansin de la heterocromatina.

Una protena que se une al aislador se localiza en las
interbandas de los cromosomas politnicos de
Drosophila. La tincin roja identifica al ADN (las
bandas) en la muestra superior e inferior; la tincin
verde identifica a una protena (generalmente en las
interbandas) en la muestra superior. El color amarillo
muestra la coincidencia de las dos tinciones.
Esto sugiere que la banda es una unidad funcional, y que los elementos de las interbandas impiden que
los efectos de los activadores o inactivadores se propaguen de una banda a la otra.
Fenmenos asociados a sitios transcripcionalmente activos
Acetilacin de histonas: el estado de acetilacin de histonas se correlaciona con el estado de expresin
gnica. Parece que la acetilacin est incrementada en un dominio que contenga genes activos, y la
cromatina acetilada es ms sensible a la ADNasa I. las enzimas que acetilan las histonas se llaman
acetiltransferasas de histonas.
Cromosomas politnicos. Protenas que se unen a los
activadores en interbanda
Tema 6 169
Fenmenos asociados a sitios transcripcionalmente inactivos
Metilacin del ADN: en zonas inactivas. Asociada con la represin de la actividad gnica. Hay enzimas
de restriccin que actan sobre el ADN segn est metilado o no.
Islas CpG: son sitios de metilacin, abundantes en las regiones 5 de los genes. Asociado al
silenciamiento de genes, si est metilado la cromatina es inactiva, no se transcribe. Un 27% de las C del
ADN de clulas animales estn metilasas; la mayora en dobletes CG, dando la estructura 5
m
CpG 3 y
3 GpC
m
5. El estado de metilacin est controlado por metilasas y desmetilasas.
Metilacin: asociada a inactividad. El estado de metilacin puede cambiar en los promotores de genes
que son objeto de un control especfico de tejido. Los promotores estn metilados cuando el gen est
inactivo.
Puede afectar a cromosomas enteros, inactivacin de un cromosoma X en hembras de mamferos. La
inactivacin de X ocurre durante etapas del desarrollo temprano, cada clula inactiva uno u otro, al azar.
Ambos cromosomas X son activos en el
precursor celular.
Un cromosoma X es inactivado en cada
clula.
Expresin de color original o salvaje
Si los genes ligados a X fueran expresados por igual en ambos sexos, las hembras tendran el doble de
cada producto. La importancia de esta situacin se muestra por la existencia del mecanismo de
compensacin de la dotacin gnica. Todo el cromosoma es una diana para la regulacin. Se metila y se
inactiva. Una vez que el estado inactivado ha sido establecido es heredado por las clulas descendientes:
herencia epigentica, ya que no depende del ADN. Los cambios epigenticos dependen de la actividad de
los genes que se heredan.
Los cambios epigenticos afectan al fenotipo y no al genotipo.
En Drosophila la expresin del nico cromosoma X en los machos es el doble en relacin a la
expresin de cada cromosoma X en las hembras.
Impronta gnica (imprinting). Tipo de herencia epigentica.
La metilacin ocurre en la embriognesis, establecindose un patrn tpico de metilacin en cada sexo
durante la gametognesis. En el sexo femenino,el patrn materno se impone durante la ovognesis. Los
alelos paternos y maternos pueden tener diferentes patrones de metilacin.
El patrn especfico de los grupos metilo en las clulas germinales es responsable de la impronta gnica.
El sexo importa, las especies con dos sexos han creado mecanismos para evitar la partenognesis.
Cuando en ovocitos de ratones se introducan dos ncleos del mismo sexo se iniciaba el desarrollo pero
no era normal y degeneraba. Se producan defectos diferentes si eran dos ncleos masculinos o femeninos.
En las clulas del adulto, para un gen concreto los alelos materno y paterno tienen distintos patrones de
expresin (activo e inactivo)
Los alelos se marcan con el estado de actividad correspondiente en la gametognesis
Capa de color
mutante
Tema 6 170
En el embrin precoz el alelo paterno no est metilado y se expresa,
y el alelo materno est metilado y permanece silente. Cuando el ratn
forma gametos, si es macho, el alelo hace que el esperma aparezca
como no metilado, independientemente de si originariamente lo
estuviera o no. Por ello, cuando el alelo materno se transforma en
esperma, debe ser desmetilado. Si es hembra, el alelo contribuye a que
el vulo se metile, por lo que si originariamente era paterno, se metila.
Durante la gemetognesis se borran las marcas y el individuo pone
su propia marca.
La metilacin del ADN se mantiene tras las divisiones celulares y
con ella se hereda el estado de actividad de los genes correspondientes.
Puede ocurrir que la madre inactiv unos pocos alelos, y por tanto se heredan inactivos, y el padre hace
lo mismo con otro grupo de alelos. Si se heredan los dos alelos inactivos se produce enfermedad.
Casos en los que se tiene el mismo genotipo pero diferente fenotipo.
La descendencia femenina inactiva, normalmente, los mismos genes que la madre, si es masculina se
activan. Macho y hembra normalmente inactivan genes distintos. Por ello, para un determinado grupo de
genes se necesita heredarlo de ambos parentales.
Regulacin a nivel del procesamiento del ARNm
El transcrito primario tiene la misma organizacin que el gen, pre-AENm. La eliminacin de los
intrones deja un mensajero tpico (22 kb). El proceso por el que se eliminan los intrones se llama corte de
intrones y empalme de exones o splicing.
El procesamiento de intrones solamente ocurre en
eucariotas, y slo sucede en el ncleo.
El ARN se modifica en el ncleo por adiciones en los
extremos 5 y 3 y mediante el empalme para eliminar los
intrones.
El empalme necesita una rotura de las uniones exn-intrn
y la unin de los extremos de los exones.
El ARN maduro es transportado a travs de los poros
nucleares hasta el citoplasma donde setraduce.
El proceso se realiza en el ncleo en el spliceosoma. Consta
de una partcula ribonucleo-proteica de 50-60 S. Contiene 5
ARN nucleares pequeos (ARNsn U) y unas 40 protenas.
Actividad cataltica e interacciones:
En el transcurso del fenmeno de empalme se producen varias reacciones de
emparejamiento entre ARNsn y ARN sustrato, estas interacciones son
importantes para la actividad cataltica. Hay una gran precisin, si fallara en
una base se cambiaria la pauta de lectura. Tienen que reconocer secuencias
concretas.
Tema 6 171
Secuencias necesarias en el ARNm:
Es posible asignar un extremo especfico
a cada intrn por la conservacin de las
uniones exn-intrn. Se alinean para
formar la secuencia consenso. Hay una
alta conservacin en las uniones, la
secuencia de un intrn genrico:
GU......AG. Regla GU-AG, es
imprescindible.
Las secuencias consenso estn implicadas como los sitios reconocidos en el pegado y empalme.
Eliminacin ordenada pero no secuencial de intrones. Utilizando
northern se pueden identificar ARN nucleares que representan productos
intermedios de los que se han eliminado algunos intrones. Existe una serie
discreta de bandas, sugiere que el corte y pegado se produce por una va
definida. Si los intrones se eliminaran de forma aleatoria se veran
muchsimos precursores, no se veran bandas discretas.
Suele existir una va preferida.
La conformacin del ARN influye sobre la accesibilidad de los puntos de
empalme. Segn se eliminan intrones la conformacin cambia, y quedan
disponibles nuevas parejas de sitios de empalme.
Procesamiento de intrones (splicing) alternativo
Hay genes que pueden tener ms de un producto final, donde un intrn puede ser exn para otro
producto del mismo gen.
Las formas alternativas de empalme pueden generar una variedad de
productos protenicos a partir de un gen individual. El cambio en los
puntos de empalme puede introducir codones de terminacin o cambios en
las fases de lectura abiertas.
Un gen y varias protenas por cambio de uso de los sitios de
procesamiento o fronteras Exn / Intrn
Varios sitios 5 a un mismo 3, consecuencias:
Incorporacin /eliminacin codn terminacin
Incorporacin /eliminacin de exones adicionales
Cambio de fase de lectura
Un sitio 3 a varios 5:
Incorporacin /Eliminacin codn terminacin
Las protenas Tra son inactivas en los machos de
Drosophila
Tema 6 172
Los antgenos de SV40 T/ t empalman dos puntos 5 a un punto 3 comn. El punto 5 utilizado para el
antgeno T elimina un codn de terminacin que est presente en el ARNm de t. El transcrito t (estndar)
es mayor que el de T (alternativo, se cambia la frontera 5).
El adenovirus E15 empalma puntos 5 variables a un punto 3 comn. En el caso de los transcritos del
adenovirus E15, uno de los puntos 5 se conecta al ltimo exn en una fase de lectura diferente
(alternativa), haciendo un cambio significativo en el extremo C-terminal de la protena.
En Drosophila melanogaster TRA empalma un punto 5 constante a puntos 3 alternativos. La va de
determinacin sexual comprende interacciones entre una serie de genes en los que los fenmenos
alternativos de empalme distinguen machos y hembras. La protena Tra solamente aparece en las hembras,
es un regulador de empalme.
Las distintas protenas pueden producirse simultneamente o no:
- Distinto sexo
- Distinto tipo de clula o compartimento celular
- Distinto momento del desarrollo
En clulas de hembras, la protena Tra acta como un regulador
especfico que dirige el procesamiento de intrones. Promueve un
patrn alternativo diferente en los machos.

Tema 7 173
Tema 7
Control gentico del desarrollo
Drosophila como sistema modelo
Establecimiento de los ejes en el embrin y generacin de
diferencias a lo largo.
El desarrollo temprano determina la formacin de los ejes antero-
posterior y dorso-ventral.
Los gradientes del huevo se traducen en segmentos en el eje
antero-posterior, y en estructuras especializadas en el eje dorso-
ventral de la larva, y ms tarde en las estructuras segmentadas de la
mosca adulta.
- El huevo: se establecen polaridades a lo largo de los ejes
antero-posterior y dorso-ventral.
- La larva: las partes de la boca estn en la zona anterior, las de
la cola en la zona posterior. Desde el lado ventral se
distribuyen bandas de dentculos (pequeos pelos), que
identifican las unidades de segmentacin a lo largo del eje
antero-posterior.
- Mosca adulta: la estructura segmentada tiene 3 segmentos
torcicos y 8 abdominales.
Los productos de los genes maternos establecen gradientes en fases
tempranas de la embriognesis.
Durante la oognesis se establece una asimetra en el oocito de la mosca. Un oocito tiene una superficie
externa de clulas foliculares que envuelve a las clulas nodriza que estn en contacto con el oocito. Las
clulas nodriza se conectan entre s y con el extremo anterior del oocito a travs de puentes
citoplasmticos. Las clulas foliculares son somticas; las clulas nodriza y el oocito pertenecen en origen
a la lnea germinal.
El material citoplasmtico, tanto protenas como ARN, pasa de las clulas nodriza hasta el oocito; la
acumulacin constituye una parte considerable del volumen del huevo. Las conexiones citoplasmticas
tienen lugar en un extremo del oocito, que pasa a ser el extremo anterior del mismo. Los genes que se
expresan dentro de la mosca madre son importantes para el desarrollo temprano. Se identifican mediante
mutaciones que no afectan a la madre pero son necesarios para tener descendencia. Ponen huevos que no
se desarrollarn como adultos, los embriones tienen defectos en el patrn cuticular y mueren durante el
desarrollo.
Los genes maternos se expresan antes de la fertilizacin. Se dividen en dos grupos:
- Somticos: se expresa en las clulas somticas de la madre que influyen sobre el desarrollo del
huevo. Actan sobre el oocito
- Germinales: se expresan en la lnea germinal y actan sobre las clulas nodriza.
Establecimiento del eje A-P
Genes maternos: Esenciales en las etapas ms tempranas. Sus productos se acumulan en el ovocito
Las clulas nodrizas transportan ARNm que forman complejos con protenas (ribonucleoprotenas), se
localizan en posiciones concretas del oocito.
Tema 7 174
bicoid y oskar son ARNm que hay que localizarlos en lugares
concretos, si no se dirigen a su sitio el desarrollo se queda
bloqueado.
Para la produccin y localizacin de
morfgenos hacen falta varios productos
gnicos maternos.
Morfgeno: protena cuya concentracin
(o actividad) local hace que la regin vecina
adquiera una estructura o destino
determinado. El morfgeno es un regulador
transcripcional o conduce a la actividad de
un factor de transcripcin en dicha regin.
Los morfgenos se determinaron con mutantes. Se determinaron cuatro grupos de genes relacionados
con el desarrollo. Los genes de cada grupo se pueden organizar en una va que refleja su orden de
actuacin.
Cada uno de los sistemas maternos que funcionan en el huevo se inician fuera del mismo. La va se
transporta al interior del huevo, donde cada va tiene un producto concreto, el morfgeno. El compuesto
final es un factor de transcripcin que acta sobre dianas del cigoto que son responsables de las siguientes
etapas del desarrollo.
Los genes somticos maternos actan primero, los de la lnea germinal actan despus.
Morfgenos: tienen concentraciones y localizaciones caractersticas
Sistema anterior: bicoid (mensajero para factor de transcripcin)
Sistema posterior: nanos (mensajero para factor de transcripcin)
Sistema terminal: torso (receptor de membrana)
Sistema dorso-ventral: toll (receptor de membrana)
Bicoid: acta sobre componentes de diversa localizacin y todo lo que se
requiere para desencadenar la formacin de las estructuras anteriores es la
existencia de una concentracin adecuada del producto bicoid.
Este producto establece un gradiente desde su origen (de mxima
concentracin) en el extremo anterior del embrin. El gen bicoid se transcribe en
las clulas nodriza, el ARNm se transporta al oocito por los puentes
citoplasmticos. El ARN se sita en la punta anterior pero no se traduce durante la
oognesis. La traduccin empieza poco despus de la fertilizacin. Posteriormente
la protena establece un gradiente a lo largo del embrin.
Un gradiente dbil origina segmentos anteriores parecidos a las estructuras
posteriores.
Un gradiente fuerte da lugar a que las estructuras con caractersticas anteriores
alcancen zonas ms alejadas del extremo anterior del embrin.
La protena bicoid se comporta como un morfgeno que determina la posicin
antero-posterior en el embrin mediante un mecanismo dependiente de la
concentracin.
Tema 7 175
Nanos: determinante posterior, controla el desarrollo abdominal. El ARNm
materno (producto de nanos) se coloca en el polo posterior. La protena nanos
se difunde desde el lugar de traduccin para formar un gradiente que se
extiende a lo largo de la regin abdominal.
Fotografa superior: hibridacin in situ. Muestra el ARN tenuamente
marcado en el embrin muy temprano (3 divisin nuclear).
Fotografa inferior: inmnohistoqumica. Muestra la dispersin de la protena
nanos durante la 8 divisin nuclear.
Drosophila: Etapas tempranas en citoplasma comn
El desarrollo inicial del huevo tiene lugar en un citoplasma comn o
sincitio, el huevo no crece.
El huevo fertilizado: tiene dos ncleos. Ambos se encuentran el plasma
polar. Productos transportados o activados por las clulas nodriza o las
foliculares.
Los ncleos se dividen en el citoplasma comn. Los ncleos del plasma
polar (en rosa) se transforman en precursores de las clulas germinales, son
ncleos determinados que han adquirido su destino.
Blastodermo sincitial: los ncleos migran a la periferia y se dividen; se
producen 4 divisiones ms, no existe una perfecta sincrona. Se traducen los
ARN maternos.
Blastodermo celular: las membranas envuelven a los ncleos para formar
una monocapa. Se transcriben los ARN cigticos.
Un ncleo determina su posicin en el embrin en funcin de los
gradientes antero-posterior y dorso-ventral, y se comporta de acuerdo a eso.
Los productos maternos activarn los genes cigticos.
Tema 7 176
Los genes cigticos permiten establecer la segmentacin
El desarrollo de Drosophila avanza a travs de la formacin
decompartimentos que determinan parasegmentos y segmentos.
En el blastodermo celular se determina el destino de cada regin,
separados por sombras de estras.
Embrin de 10 horas, se han desarrollado los segmentos.
Mosca adulta se han desarrollado 3 segmentos torcicos y 8 abdominales.

Segmentacin
Existen 3 grupos de genes cigticos implicados en la segmentacin. Los genes maternos y cigticos
actan progresivamente sobre regiones ms pequeas del embrin.
Los genes maternos establecen gradientes desde los polos anterior y posterior.
Genes gap: existen cuatro genes gap
involucrados en la formacin de los
principales segmentos del cuerpo.
Definen 4 regiones amplias en el cuerpo.
La mutacin produce prdida de
segmentos adyacentes. Ocurre en etapas
tempranas del desarrollo (< 11
divisiones nucleares).
Genes pair rule o regla par: definen 7
bandas, cada banda es un par de
segmentos. La mutacin presenta
delecin de alguna parte del patrn en
cualquiera de los dems segmentos,
pueden ser pares o impares. (11-12
divisiones nucleares).
Genes de polaridad segmentaria:
definen 14 bandas, cada banda es un
segmento. Los mutantes presentan
reemplazamiento de partes de los
segmentos por sus imgenes especulares,
orden no correcto de segmentos. (13
divisiones nucleares).
Los patrones de expresin de los genes coinciden con las regiones de actuacin. Este hecho se ha
estudiado en mutantes.
Las regiones que faltan es donde deberan
expresarse los mutantes.
En cada etapa se usan protenas reguladoras
maternas, gap o de regla par de un modo combinado
para especificar el patrn de expresin gnica
concreta del embrin

Tema 7 177
Protenas Gap: activadores y represores de los genes de la regla de los
pares (Pair-rule)
Distintas combinaciones de protenas GAP producen el mismo nivel de
expresin en distintos sitios (expresin en bandas). Se pueden estudiar los
distintos segmentos y se pueden observar las distintas concentraciones de
genes.
Genes Pair-rule: Regiones reguladoras con varios sitios de unin a protenas
Gap
Protenas Pair-rule: activan a los genes de la polaridad (se expresan en las
fronteras)
Establecimiento de la identidad de los segmentos
Los genes de polaridad del segmento controlan el patrn dentro de cada uno de ellos.
Los genes hometicos establecen el programa que determina la diferenciacin propia de cada segmento.
Sus mutaciones transforman una parte del cuerpo en otra; las clulas de un compartimento desarrollan el
fenotipo de otro compartimento celular diferente. Algunos mutantes hometicos transforman parte de un
segmento o uno completo en otro tipo de segmento.
La posicin de los genes en el genoma dan una informacin espacial.

En muchos de los genes hometicos y de segmentacin se encuentran motivos preservados, el ms
frecuente es homeobox (180 pb). La secuencia protenica codificada por homeobox se llama
homeodominio (60 aminocidos).
Agrupados en dos complejos:
- Antenapedia (ANT-C). Estructuras anteriores
- Bithorax (BX-C). Estructuras posteriores
ANT-C
Fenotipos de prdida de funcin:
- lab: afecta a la cabeza
- pb: estructuras labiales reemplazadas por antenas
- Dfd: delecin de segmentos mandibulares
- Scr: transforma T1 en T2
- Antp: transforma T2-T3 en T1
Tema 7 178
BX-C
Una serie de mutaciones reguladoras afectan a segmentos
sucesivos de la mosca. Las posiciones de las mutaciones
reguladoras muestran las regiones en las que las deleciones,
inserciones y translocaciones le confieren un determinado
fenotipo.
Mutaciones de prdida de funcin:
- abx: transforma T2P / T3A en T2
- bx: transforma T3A en T2A
- bxd: transforma A1A en T3A
- iab6: transforma A6 en A5
- iab5: transforma A5 en A4
- iab4: transforma A4 en A3
- iab3: transforma A3-6 en A2
- iab2: transforma A2A en A1
Mutacin triple, caso extremo de transformacin hometica,
convierte T3A, que porta halterios o balancines, en T2, que porta alas,
con lo que se crea una mosca con 4 alas en lugar de 2.

Los genes que contienen homeoboxes estn involucrados en la regulacin de la embriognesis en una
variedad de especies. Los genes individuales de los mamferos se llaman genes Hox. Un grupo de genes
Hox puede ocupar de 20-100 pb y tener hasta 10 genes.
Los genes Hox estn conservados en animales. Los
mamferos tienen 4 complejos Hox (A-D) por duplicacin
del existente en el ancestro comn.
El ordenamiento de los genes refleja las regiones en las
que se expresan en el eje antero-posterior. Los genes Hox
se alinean con los genes de la mosca en funcin de su
homologa, que es fuerte en los grupos 1, 2, 4 y 9.
La comparacin de los patrones de expresin de ANT-C y HoxB de muestra
que los productos gnicos comparten una localizacin de su expresin
progresivamente ms posterior en el animal a medida que se avanza en el
grupo de genes de izquierda a derecha.
Los patrones de expresin muestran las regiones de transcripcin en la
epidermis de la mosca a las 10 horas, y en el sistema nervioso central en el
embrin del ratn a los 12 das.
Tambin se mantiene la relacin entre localizacin de los genes en los complejos y sitio de actuacin en
el embrin.
Comparacin de genes Hox de ratn y hombre
con los de la mosca
Tema 8 179
Tema 8
Aspectos genticos del cncer
Sistemas de control en organismos celulares
- Ciclo celular
- Dependencia de anclaje: se necesita una superficie slida o firme para que las clulas se adhieran a
ella.
- Inhibicin por densidad: las clulas nicamente crecen hasta una densidad limitada, ya que el
crecimiento se inhibe, quizs mediante procesos que implican contactos clula-clula.
- Mortalidad tras un nmero de divisiones
- Apoptosis o suicidio celular inducido
- Sistema inmune
Procesos relevantes: tres tipos de cambios que tienen lugar cuando una clula se vuelve cancerosa:
Inmortalizacin: crecimiento indefinido, prdida de controles.
Transformacin: fallo de observacin de los lmites normales del crecimiento. Las clulas
transformadas llegan a ser independientes de los factores que normalmente necesitaban para el
crecimiento celular. Se dividen y forman colonias.
Metstasis: la clula cancergena desarrolla la habilidad de invadir el tejido normal, movindose
desde el lugar de origen y estableciendo una nueva colonia en cualquier parte del cuerpo. Ha
perdido casi todos los controles, se acumulan mutaciones.
Clulas primarias: el cultivo se divide en diversas divisiones
El crecimiento de las clulas es restringido por las propiedades del
tejido.
Crisis: la mayora de las clulas muere; pocas clulas continan
creciendo.
Inmortalizacin: las lneas celulares establecidas se dividen
indefinidamente, pero las clulas continan adheridas al sustrato,
requieren suero y se inhiben por contacto.
Transformacin: las clulas transformadas son independientes de la
adhesin, el suero, e inhibicin por contacto; cambian la forma, se
redondean y crecen en un foco.
Las clulas transformadas pueden formar tumores slidos.
Metstasis: ahora totalmente tumorgenas, las clulas son mviles, y
pueden migrar para dar lugar a nuevas colonias.
Se forman tumores en nuevas localizaciones.
Cncer y mutaciones somticas
- Oncogenes y protooncogenes: genes aceleradores del crecimiento. Mutaciones dominantes
- Supresores de tumores: genes inhibidores del crecimiento, anti-oncogenes. Mutaciones recesivas
- Mutadores: implicados en la estabilidad genmica. Mutaciones recesivas
Fenmenos epigenticos en cncer: genes mutados o mal-regulados, patrones de metilacin.
Oncogenes y protooncogenes
Los oncogenes fueron identificados inicialmente como genes transportados por virus que causan
transformacin de sus objetivos celulares. Uno de los principales tipos de oncogenes virales tienen
homlogos celulares que estn implicados en funciones celulares normales, son los protooncogenes.
Tema 8 180
En ciertos casos la mutacin o activacin aberrante de los protooncogenes se asocia con la
formacin de un tumor.
9 Identificacin de oncogenes. Los oncogenes/ protooncogenes* inducen la transformacin de clulas
en cultivo.
El ensayo de transfeccin permite aislar oncogenes directamente probando
en el ADN de las clulas tumorales su habilidad para transformar clulas
normales en clulas tumorales.
Extraccin de ADN y transferencia a las clulas normales
El gen transformador se integra en la clula
Colonia aislada de clulas transformadas
Aislamiento de ADN especfico adquirido por las clulas transformadas.
Un oncogn puede ser un protooncogen mutado, o activado.
Fenotipo seleccionable: se da por la activacin de un protooncogn.
9 Induccin de cnceres por virus: la actividad transformante de un virus cancergeno reside en un gen
o genes particulares que forman parte del genoma viral. Un oncogn inicia una serie de
acontecimientos que se ejecuta por las protenas celulares. El virus libera un mecanismo regulador
que cambia las propiedades de crecimiento de la clula diana.
Virus de ADN: portadores de genes especficos virales (oncogenes). Especifican protenas,
productos gnicos propios, que desactivan supresores de tumores.
Retrovirus:
Retrovirus transformantes: portadores de genes celulares (protooncogenes). los oncogenes
transportados por retrovirus se derivan de genes celulares y por tanto pueden imitar el
comportamiento de ganancia de funcin en protooncogenes. Incorporan en su genoma un
protooncogen (estimulador del crecimiento de la clula husped) y lo modifican como oncogn.
Un retrovirus transformante contiene una copia de una secuencia
celular en lugar de algunos genes propios. Un retrovirus captura un
gen celular mediante el intercambio de parte de su propia secuencia
por una secuencia celular.
Productos gnicos
propios
Productos gnicos prestados. Oncogenes de algunos
retrovirus.
Cada retrovirus transformante contiene un oncogen
derivado de un gen celular.
Versiones oncognicas / virales (v) de genes celulares (c)
Tema 8 181
9 Proto-oncogenes
Mutaciones de ganancia de funcin (prdida de una de varias funciones) los convierten en oncogenes:
activacin de proto-oncogenes en cnceres (de origen retrovrico o no).
Mecanismos de activacin de protooncogenes:
Mutaciones puntuales
ganancia de funcin: constitutivamente activa (ej: genes RAS). RAS, protooncogn que
ms cncer provoca, es una protena de transduccin de seales. Un cambio en un solo
aminocido la mantiene permanentemente activa, ese cambio deja a la protena bloqueada
en la conformacin activa.
Reordenaciones genomicas diversas
Amplificaciones
- Aumento de la dosis gnica, las protenas reguladoras se mantienen en dosis justa.
El protooncogn no est mutado pero no est controlado porque no hay suficiente
protena reguladora. Suele ocurrir en clulas del sistema inmune, reorganizan su
genoma muy a menudo, es ms fcil que se produzcan errores que amplifiquen
protooncogenes (tumores de clulas sanguneas, leucemias...)
Translocaciones cromosmicas
- Fusiones proteicas: protenas hbridas, distinto producto gnico
- Fusiones gnicas: adquisicin de promotores fuertes delante de un protooncogn
(leucemias)
Efectos cualitativos y /o cuantitativos sobre la expresin gnica
Estn implicados en transduccin de seales y proliferacin celular.
Los oncogenes podran codificar protenas de secrecin, de
membrana, citoplasmticas o nucleares.
La parte izquierda de la figura agrupa a los oncogenes segn
la localizacin de sus productos.
Los recuadros de la derecha aportan detalles sobre los
correspondientes proto-oncogenes.
Genes que se han visto mutados en diversos tipos de cncer:
- Protenas secretadas por una clula que acta en otra.
Comunicacin por secrecin.
Factores de crecimiento
- Protenas transmembrana que se activan por la unin de un
ligando extracelular. La oncogenia puede resultar de una
activacin constitutiva, ligando independiente.
Receptor de factores de crecimiento
Protenas G
Protenas de transduccin de seales (Ras)
- Asociadas a membrana
Tirosina quinasas intracelulares
- Citoplasmticas: aumentan o activan constitutivamente las
actividades quinasa
Serina / treonina quinasas
Reguladores de seales
- Nucleares
Fectores de transcripcin
Tema 8 182
Genes supresores de tumores
Genes cuyos productos se necesitan para el funcionamiento normal de la clula, y cuya prdida de
funcin causa tumores. Los genes de esta clase mejor descritos codifican protenas RB (retiniblastoma) y
p53.
El efecto comn de los oncogenes en la gnesis tumoral es que el aumento o la alteracin de la actividad
del producto del gen resulta oncognica. Ya sea el oncogn introducido por un virus o el resultado de una
mutacin en el genoma, es dominante sobre su protooncogn allico. Una mutacin que activa a un nico
alelo es oncognica. La gnesis tumoral, por tanto, se debe a una ganancia de funcin.
Herencia dominante de la predisposicin a padecer cncer. A nivel celular, enfermedad recesiva: los dos
alelos deben ser inactivados
Pedigr de una familia con sndrome de Li-Fraumeni
I-2: cncer de mama bilateral a los 40;
II-1: tumor cerebral a los 35;
II-3: sarcoma a los 19, cncer de mama a los 33;
II-5, cncer de mama a los 32
III-3: osteosarcoma a los 8;
III-4: leucemia a los 2;
III-5 sarcoma a los 3.
La mutacin de p53 es la causa del sndrome, es una
forma rara de cncer. Los individuos afectados muestran
cnceres en diversos tejidos.
Son heterocigotos que han sufrido mutaciones sin sentido en un alelo.
Estas mutaciones se comportan como negativos dominantes, superando la funcin del alelo silvestre.
Esto explica la aparicin de la enfermedad como un dominante autosmico.
Retinoblastoma
Enfermedad humana dela infancia, tumor en la retina. Se asocia con deleciones del gen Rb. Surge
cuando ambas copias del gen estn desactivadas. En la forma heredada del tumor, un cromosoma parental
porta la alteracin. Un cambio somtico en las clulas retinianas que determine la prdida de la otra copia
del gen causa el tumor. En la forma espordica, los cromosomas parentales son normales; ambos alelos se
han perdido a causa de cambios somticos (individuales).
Rb inhibe el ciclo celular, por interaccin protena-protena. El
ciclo celular se bloquea cuando Rb est fosforilado (en el ciclo
normal) o cuando ha sido secuestrado por un antgeno oncognico
(en una clula transformada).

Es blanco de oncogenes virales. Determinados antgenos virales
cancergenos se unen especficamente a la forma no fosforilada de
Rb (antgeno T de SV40, el mejor descrito).
Rb no fosforilado previene la proliferacin celular; esta actividad
se suprime para continuar con el ciclo celular, es cual se consuma
por fosforilacin cclica. Cuando es suprimido por un antgeno
cancergeno, por secuestro de Rb no fosforilado, el complejo Rb-
antgeno no se une a E2F, ste se encuentra permanentemente libre
para permitir la entrada en fase S.
La sobreexpresin de Rb impide el crecimiento celular.
Tema 8 183
Rb y p53 y otros TS juegan papeles clave en la inhibicin del ciclo celular
Mediante la aparicin de mutaciones desactivadoras en
tumores se han identificado como supresores de tumores a
diversos reguladores.

p53
El supresor de tumores ms importante es p53. la mayora de los cnceres humanos han perdido el p53 o
presentan mutaciones. Es una fosfoprotena nuclear. Participa en la inhibicin del ciclo celular.
Multiplicidad de funciones para p53, el guardin del genoma, potente inductor de la apoptosis.
Recibe mltiples seales: acortamiento de telmeros, radiaciones
Interacciones: proteasas, quinasas que regulan su actividad.
Un dao en el ADN activa a p53. El resultado depende de la
fase del ciclo celular. Al comienzo del ciclo, p53 activa un
punto de control (checkpoint) que previene la progresin hasta
que el dao haya sido reparado.
Si es demasiado tarde para ejecutar el punto de control, p53
desencadena la apoptosis.
Diferentes dominios son
responsables para cada
actividad de p53.
- Es una protena de unin al ADN que reconoce un motivo
palindrmico
- Activa la transcripcin en promotores que contienen copias
de ese motivo
- Puede unirse al ADN daado
- Es un tetrmero
- Tiene mltiples sitios de interaccin, tambin de oncogenes virales
Mutaciones dominantes?
Tema 8 184
9 Mecanismos de inactivacin de p53 en tumores
Directos (p53): la mayora de los cnceres
Indirectos: algo interacciona con p53 y provoca
- Aumento de actividad de antagonistas de p53 (protooncogenes)
- Eliminacin de actividad de activadores de p53 (supresor de tumores)
Activador = inhibidor de inhibidor
Genes mutadores
El control de la integridad del genoma. Implicados en la reparacin del ADN.
Los genes mutadores tiene homlogos en E. coli El sistema MutHLS de E. coli: reparacin de
emparejamientos incorrectos su inactivacin incrementa la tasa de mutacin
Las mutaciones en genes mutadores (y la accin de los mutgenos /carcingenos) facilitan la
adquisicin de mutaciones en protooncogenes o genes supresores.