CITOMETRIA DE

FLUJO
Manuel Oviedo Martínez
Hematología
372
UABC
Consiste en una placa gruesa de cristal en
forma de porta, cuya porción central está
dividida en tres bandas perpendiculares al
eje longitudinal de la cámara.
 De ellas, las dos laterales se hallan

sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la

central, y en esta última hay grabado un
retículo cuadrangular.
 La banda central puede estar, a su vez,
subdividida en dos semibandas idénticas y
separadas por un surco paralelo al eje
longitudinal de la banda.
 En cada una de estas dos semibandas hay

grabado un retículo idéntico.

 Lectura y ajuste de concentración celular: Como se
cuentan los linfocitos presentes en 4 cuadrados grandes
del retículo, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el
recuento, para calcular el número de leucocitos que hay
en 1 cuadrado grande.

Como la longitud de cada uno

de los lados de los cuadrados
grandes es de 1 mm, y la longitud
del espacio comprendido entre
éstos y el cubre es de 0´1mm;
hay que multiplicar por 10 el
resultado anterior, para
determinar el número de
linfocitos existentes, no en 0
´1mm3 , sino en 1mm3 .
 En definitiva, para su cálculo puede
emplearse la siguiente fórmula:
 RL= L/4 x 10 x D
 RL= Recuento de linfocitos (número de

linfocitos por mm3 de la suspensión

celular).
L = Linfocitos contados en 4 cuadrados
grandes.
D= Factor de dilución.
 Es una técnica de
análisis celular
multiparametrico 
 Es una tecnología
(proceso) que permite
la medida simultánea
de múltiples
características físicas
de una sola célula.
 Estas medidas son
realizadas mientras las
células (partículas)
pasan en fila, a una
velocidad de 500 a
4000 células por
segundo, a través del
aparato de medida en
una corriente de fluido
 Fluidos
 Optica
 Electrónica
 para introducir y
restringir las
células para
análisis
 fuente de excitación
 un sistema colección.
 Para convertir las señales ópticas en
señales electrónicas proporcionales y
digitalizarlas para análisis
computacional.
 Identificar y enumerar subpoblaciones
celulares únicas y definidas.
 Seleccionar y separar físicamente

subpoblaciones de células deseadas

 Medir capacidad funcional de

subpoblaciones celulares definidas

 Un fluorocromo es una  molécula
química que absorbe la luz a una
determinada longitud de onda
(ENERGIA ) energía de excitación y
emite a una longitud superior (MENOR
ENERGIA)
 Interacciona con
la luz de
excitación
procedente de el
láser. Se utiliza
unido a
anticuerpos
específicos
(monoclonales )
para antígenos
de la célula. La
cantidad de
fluorescencia con
la cual una célula
se tiñe es
proporcional a la
cantidad de
sitios de unión.
 Unión de sitios específicos con
anticuerpos marcados con
fluorocromos El fluorocromo absorbe
energía del láser El fluorocromo libera
energía absorbida por : Vibración y
disipación del calor. Emisión de
fotones a una mayor longitud de onda
llamada  fluorescencia (1,2,3).
 El citómetro de flujo detecta como las
células interactúan con un rayo láser
en términos de cómo la célula :
 desvía la luz incidente (parámetros

FSC y SSC)
 emite fluorescencia (parámetros FL1.

FL2. FL3)(1).
 Fase pre-citometría: preparación de los
reactivos, preparación de las células,
diseño del protocolo y coloración de las
células con los reactivos fluorescentes.
 Fase de citometría de flujo : involucra
el procesamiento de las células
marcadas y la recolección de los datos
para cada una de las medidas
(parámetros) realizados en cada célula
individual.
 Fase de análisis: análisis de los datos
recolectados
 La mezcla de células
teñidas con diferentes
fluorocromos es
forzada a pasar a
través de una aguja
creando una delgada
fila de líquido que
contiene las células.
 A medida que cada
célula pasa en frente
del láser, desvía el
rayo incidente y las
moléculas teñidas
unidas a la célula van a
ser excitadas y emiten
 Tubos fotomultiplicadores detectan
tanto la luz desviada y las emisiones
fluorescentes, la información es
digitalizada y procesada por el
computador.
 Los resultados son presentados a

manera de histogramas o "dot-plots"

 Hematología : tipificacion y conteo de
células , reticulocitos y análisis de medula
ósea .
 Farmacología :estudios de cinética celular
 Inmunología :subpoblaciones de linfocitos
,tipaje tisular
 Oncología :Diagnostico y pronostico
,monitores de tratamientos
 Microbiología :diagnostico bacteriano y
virico ,estudios de sensibilidad a los
antibióticos
 Genética : Cariotipo y diagnostico de
portador y diagnostico prenatal.
 Análisis de un número estadísticamente
significativo de células ( 1000 a más de
100.000 células).
 Múltiples marcajes de una sola célula.
 Análisis de alto numero de partículas en corto
tiempo (5.000 eventos /seg. ).
 Alta sensibilidad y objetividad.
 Medidas separadas de cada célula (no sólo el
promedio).
 Medidas cuantitativas : discriminación de las
células según la cantidad de marcador.
 Múltiples parámetros : define subpoblaciones
complejas.
 Miles de células por segundo .
 Poca información morfológica de la
célula
 No proporciona información de la
localización celular en un tejido
 Puede analizar solamente una cantidad
limitada de material (10 millones de
células / hora)
 Necesita suspensión de células
individuales.
 Costos de la tecnología
 Método destructivo.
 Incapacidad de visualizar las células
que se analizan.
 Pipetas volumétricas
 Pipetas de Ostwald-Folin
 Pipetas graduadas
 Micropipetas
 Bulbo
 TD
 Volumen
 Tiempo de

almacenamiento
 Temperatura con gran

exactitud
 no están graduadas y

sólo permiten medir un

volumen único.
 Tubo de vidrio delgado
 Para pequeños volúmenes de sangre
 Se calibran para soplar
 Se calibran con
agua
 No son muy

exactas
 Es más exacta la

que esté más

cercana
 Se calibran con
mercurio
 Debe

enjuagárseles
con el líquido de
dilución
 Azul de Cresilo Brillante
Solución fisiológica al 0.5% para tinción de reticulocitos, la substancia
granulo filamentosa de éstos se tiñe de azul negro.
Presentación por 100 ml.

Reactivo de Turk
Solución de violeta de genciana ácido acético, lista para su uso.
Para conteo de leucocitos en Cámara de Neubauer.

Thrombo - Count
Solución de oxalato de potasio con cloruro de mercurio,
Para conteo directo de trombocitos.
Presentación por 50 ml.

Reactivo de Hayem´s
Solución de cloruro de mercurio isotónica para conteo en eritrocitos
en la cámara.
 El ácido acético contenido en la solución de
Türk hemoliza los eritrocitos y el colorante
contenido tiñe los leucocitos.
 Llenado de la pipeta
 Aspirar sangre en una pipeta de leucocitos

hasta la marca 1.0, seguidamente

 aspirar solución de Türk hasta la marca 11.

La dilución es 1:10.
 También es posible una dilución de 1: 20

(sangre hasta la marca 0.5 y

 solución de Türk hasta la marca 11).
 Mezclar cuidadosamente la sangre