BAB II METODE PERCOBAAN

II.1. Alat dan Bahan

II.1.1. Alat 1. Object glass dan cover glass yang bersih 2. Bak pewarna 3. Kertas serap 4. Kertas lensa 5. Mikroskop 6. Minyak celup (immersion oil) 7. Pipet tetes 8. Pembakar piritus 9. Botol semprot II.1.2. Bahan 1. Biakan Bacillus thuringiensis dalam Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) berumur 1 hari yang ditanam tanggal 23 Februari 2012 2. Biakan Staphylococcus aureus dalam Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) berumur 1 hari yang ditanam tanggal 23 Februari 2012 3. Biakan Pseudomonas putida dalam Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB) berumur 1 hari yang ditanam tanggal 23 Februari 2012 4. Biakan Acetobacter aceti dalam Nutrient Agar (NA) berumur 1 hari yang ditanam tanggal 23 Februari 2012 5. Seperangkat pewarnaan gram: a. Ungu kristal b. Larutan iodium gram c. Alkohol 95% (C2H5OH) d. Safranin e. Aquades 10. Pinset 11. Kawat ose

17

18

II.2.

Cara Kerja

II.2.1. Penyiapan Olesan Bakteri 1. Dibersihkan kaca obyek dengan baik sehingga bebas dari lemak dan kotoran sebagai berikut: a. Dilakukan pembersihan ditempat cuci. b. Dibasahi telunjuk dan jari tengah kanan dengan kaca obyek di tangan kiri. c. Digosokkan kedua jari yang basah pada sabun pembersih. d. Digosokkan kedua permukaan kaca obyek dengan kedua jari yang bersabun, lalu dibilas dengan air sampai tidak ada lagi sabun yang tersisa. e. Bila kaca obyek yang dibersihkan bekas diwarnai, maka diulangi langkah 1c dan 1d. f. Diteteskan beberapa tetes alkohol 95% pada kedua permukaan kaca obyek. g. Ditiriskan kaca obyek untuk membuang kelebihan alkohol lalu diseka dengan kertas serap yang disediakan. h. Setelah bersih, dipegang kaca obyek pada pinggirnya,

permukaannya jangan disentuh agar lemak pada jari tidak mengotori. 2. Dituliskan nama, kelompok, dan nama organisme yang dioleskan dengan spidol OHP pada sisi kaca obyek. 3. Dalam pembuatan olesan, digunakan teknik aseptik: a. Bila yang dipindahkan adalah biakan dalam media cair, maka dikocok biakan tersebut dengan baik tanpa membasahi sumbat tabung, lalu dipindahkan 1-2 ose. b. Bila yang dipindahkan adalah biakan dalam media padat, maka ditetesi kaca obyek dulu dengan 1-2 ose air suling, lalu biakan dipindahkan 1-2 lup penuh. 4. Dibiarkan olesan tersebut kering di udara.

19

5. Setelah olesan betul-betul kering, dilalukan kaca obyek beberapa kali di atas api sampai kaca obyek terasa agak panas apabila diletakkan pada punggung tangan. II.2.2. Pewarnaan Gram 1. Disiapkan olesan bakteri pada kaca obyek. 2. Setelah difiksasi panas, diletakkan kaca obyek di atas rak pada bak pewarna. Prosedur pewarnaan gram adalah sebagai berikut: a. Digenangi olesan bakteri dengan pewarna primer, yaitu ungu kristal selama 1 menit. b. Dengan menggunakan pinset ataupun penjepit lain, dimiringkan kaca obyek di atas bak pewarna untuk membuang kelebihan ungu kristal, lalu olesan dibilas dengan aquades. c. Ditiriskan kaca obyek dan dikembalikan ke atas rak pada bak pewarna. d. Digenangi olesan dengan iodium gram selama 2 menit. e. Dimiringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan iodium lalu olesan dibilas sengan aquades. f. Dicuci olesan dengan etanol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna ungu kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca obyek. g. Dicuci segera dengan aquades, lalu ditiriskan dan dikembalikan ke rak pada bak pewarna. h. Digenangi olesan dengan safranin selama 30 detik. i. Dimiringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan safranin, lalu olesan dibilas dengan aquades. j. Ditiriskan kaca obyek dan kelebihan air pada olesan diserap dengan menekankan kertas serap hati-hati ke atasnya. 3. Diamati masing-masing preparat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x.