BAB I PENDAHULUAN

I.1. Tujuan Percobaan 1. Mahasiswa mampu melakukan penyiapan olesan bakteri dengan baik sebagai prasyarat berbagai macam pewarnaan. 2. Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan gram. 3. Mahasiswa mampu melakukan pengamatan bakteri dengan

menggunakan mikroskop. I.2. Tinjauan Pustaka I.2.1. Bakteri Bakteri adalah suatu organisme yang jumlahnya paling banyak dan tersebar luas dibandingkan dengan organisme lainnya di bumi. Bakteri umumnya merupakan organisme uniseluler, prokariotik, tidak mengandung klorofil, serta berukuran mikroskopik.

Gambar I.1. Bakteri (Anonim, 2011) Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat seperti di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia. Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 m. Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan). Beberapa jenis bakteri

bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel. (Wikipedia, 2012). I.2.2. Struktur bakteri Struktur bakteri dibagi menjadi dua yaitu struktur dasar dan struktur tambahan. Berikut ini adalah uraian dan gambar mengenai struktur bakteri

Gambar I.2. Struktur Dasar Bakteri

Gambar I.3. Struktur Tambahan Bakteri (Mustahib, 2011)

1.

Struktur dasar a. Dinding sel tersusun dari peptidoglikan yaitu gabungan protein dan polisakarida (ketebalan peptidoglikan membagi bakteri menjadi bakteri gram positif bila peptidoglikannya tebal dan bakteri gram negatif bila peptidoglikannya tipis). b. Membran plasma adalah membran yang menyelubungi sitoplasma tersusun atas lapisan fosfolipid dan protein. c. Sitoplasma adalah cairan sel. d. Ribosom adalah organel yang tersebar dalam sitoplasma, tersusun atas protein dan RNA. e. Granula penyimpanan, karena bakteri menyimpan cadangan makanan yang dibutuhkan.

2.

Struktur tambahan a. Kapsul atau lapisan lendir adalah lapisan di luar dinding sel pada jenis bakteri tertentu, bila lapisannya tebal disebut kapsul dan bila lapisannya tipis disebut lapisan lendir. Kapsul dan lapisan lendir tersusun atas polisakarida dan air. b. Flagelum atau bulu cambuk adalah struktur berbentuk batang atau spiral yang menonjol dari dinding sel. c. Pilus dan fimbria adalah struktur berbentuk seperti rambut halus yang menonjol dari dinding sel, pilus mirip dengan flagelum tetapi lebih pendek, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun dari protein dan hanya terdapat pada bakteri gram negatif. Fimbria adalah struktur sejenis pilus tetapi lebih pendek daripada pilus. d. Klorosom adalah struktur yang berada tepat dibawah membran plasma dan mengandung pigmen klorofil dan pigmen lainnya untuk proses fotosintesis. Klorosom hanya terdapat pada bakteri yang melakukan fotosintesis. e. Vakuola gas terdapat pada bakteri yang hidup di air dan berfotosintesis. f. Endospora adalah bentuk istirahat (laten) dari beberapa jenis bakteri gram positif dan terbentuk didalam sel bakteri jika kondisi tidak menguntungkan bagi kehidupan bakteri. Endospora mengandung sedikit sitoplasma, materi genetik, dan ribosom. Dinding endospora yang tebal tersusun atas protein dan menyebabkan endospora tahan terhadap kekeringan, radiasi cahaya, suhu tinggi dan zat kimia. Jika kondisi lingkungan menguntungkan endospora akan tumbuh menjadi sel bakteri baru. (Mustahib, 2011)

I.2.3. Morfologi Bakteri Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu: 1. Kokus (Coccus) dalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut: a. Monokokus Bentuk sel bakteri yang berupa sel bakteri kokus tunggal b. Diplokokus Bentuk sel bakteri yang berupa dua sel bakteri kokus berdempetan c. Tetrakokus Bentuk sel bakteri yang berupa empat sel bakteri kokus berdempetan berbentuk segi empat d. Sarkina Bentuk sel bakteri yang berupa delapan sel bakteri kokus berdempetan membentuk kubus e. Streptokokus Bentuk sel bakteri yang berupa lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan membentuk rantai. f. Stapilokokus Bentuk sel bakteri yang berupa lebih dari empat sel bakteri kokus berdempetan seperti buah anggur.

Gambar I.4. Bentuk Bakteri Kokus (http://gurungeblog.wordpress.com)

2.

Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut: a. Monobasil Bentuk sel bakteri yang berupa sel bakteri basil tunggal b. Diplobasil Bentuk sel bakteri yang berupa dua sel bakteri

basil berdempetan c. Streptobasil Bentuk sel bakteri yang berupa beberapa sel bakteri basil berdempetan membentuk rantai

Gambar I.5. Bentuk Bakteri Batang (http://gurungeblog.wordpress.com) 3. Spiral (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut: a. Spiral yaitu bentuk sel bergelombang b. Spiroseta yaitu bentuk sel seperti sekrup c. Vibrio yaitu bentuk sel seperti tanda baca koma

Gambar I.6. Bentuk Bakteri Spiral (http://gurungeblog.wordpress.com)

I.2.4. Klasifikasi Bakteri Berdasarkan struktur selnya bakteri dapat dibedakan menjadi dua yaitu: 1. Bakteri gram-positif Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenisbakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. (Anonim, 2011). Berikut ini adalah contoh bakteri gram positif:

Gambar I.7. Staphylococcus epidermidis (http://web.uconn.edu) 2. Bakteri gram-negatif Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak

mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gramnegatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tipe ini bakteri berguna ini untuk

mengklasifikasikan

kedua

berdasarkan

perbedaan struktur dinding sel mereka.Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka

berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gramnegatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin). (Anonim, 2011). Berikut ini adalah contoh bakteri gram negatif:

Gambar I.8 Salmonella sp (Wikipedia, 2011) I.2.5. Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri Kondisi lingkungan yang mendukung dapat memacu pertumbuhan dan reproduksi bakteri. Faktor-faktor lingkungan yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi bakteri adalah: 1. Suhu Berdasarkan kisaran suhu aktivitasnya, bakteri dibagi menjadi 3 golongan: a. Bakteri psikrofil, yaitu bakteri yang hidup pada daerah suhu antara 030 C, dengan suhu optimum 15 C. b. Bakteri mesofil, yaitu bakteri yang hidup di daerah suhu antara 1555 C, dengan suhu optimum 2540 C. c. Bakteri termofil, yaitu bakteri yang dapat hidup di daerah suhu tinggi antara 4075 C, dengan suhu optimum 5065 C 2. Kelembaban Pada umumnya bakteri memerlukan kelembaban yang cukup tinggi, kira-kira 85%. Pengurangan kadar air dari protoplasma

menyebabkan kegiatan metabolosme terhenti, misalnya proses pembekuan dan pengerian 85%. 3. Cahaya Cahaya sangat berpengaruh pada proses pertumbuhan bakteri. Umumnya cahaya merusak sel mikroorganisme yang tidak berklorofil. Sinar ultraviolet dapat menyebabkan

terjadinya ionisasi komponen sel yang berakibat menghambat pertumbuhan atau menyebabkan kematian. Pengaruh cahaya terhadap bakteri dapat digunakan sebagai dasar sterilisasi atau pengawetan bahan makanan. Jika keadaan lingkungan tidak menguntungkan seperti suhu tinggi, kekeringan atau zat-zat kimia tertentu, beberapa spesies dari Bacillus yang aerob dan beberapa spesies dari Clostridium yang anaerob dapat mempertahankan diri dengan spora . Spora tersebut dibentuk dalam sel yang disebut endospora. Endospora dibentuk oleh penggumpalan protoplasma yang sedikit sekali mengandung air. Oleh karena itu endospora lebih tahan terhadap keadaan lingkungan yang tidak menguntungkan dibandingkan dengan bakteri aktif. Apabila keadaan lingkungan membaik kembali, endospora dapat tumbuh menjadi satu sel bakteri biasa. Letak endospora di tengah-tengah sel bakteri atau pada salah satu ujungnya. I.2.6. Penyiapan Olesan Olesan bakteri harus disiapkan sebagaimana mestinya adalah olesan yang tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis dan bila difiksasi dengan panas akan tahan pencucian satu kali atau lebih selama proses pewarnaan sehingga organismenya tidak hilang tercuci namun bentuk sel-selnya tidak berubah ataupun menyusut. Olesan yang tebal akan menyebabkan sel-sel bakteri bertumpuktumpuk sehingga sukar untuk menentukan bentuk sel secara individu. Olesan yang terlalu tipis akan menyulitkan ditemukannya (Anonim, 2011)

sel-sel tersebut pada pengamatan mikrokospik. Hal ini cenderung terjadi pada olesan yang dibuat dari biakan dalam medium cair. Kaca obyek yang dipakai tidak boleh tergores dan harus bersih betul. Meskipun kaca obyek yang digunakan pada penyiapan olesan itu tidak steril, namun hendaknya digunakan teknik aseptik. Olesan bakteri harus betul-betul kering udara sebelum difiksasi dengan panas. Fiksasi dengan panas dilakukan secukupnya dan tidak berlebihan untuk menghindarkan terjadinya salah satu bentuk atau penyusutan sel. Bila mediumnya berupa cairan (kaldu, susu, air liur, air seni, dan sebagainya) maka penyiapan olesan dimulai dengan

menaruhkan satu atau dua lup penuh biakan cair tersebut langsung pada kaca obyek. Bila organismenya diambil dari medium padat (agar miring, agar cawan atau bagian-bagian tubuh) maka perlu ditaruh satu atau dua lup penuh biakan cair atau air steril yang kemudian langsung diberikan satu lup biakan dari medium padat pada kaca obyek. Kesalahan yang seringkali terjadi ialah kecenderungan untuk mengambil biakan terlalu banyak pada jarum inokulasinya. Untuk mengatasinya maka digunakan jarum

inokulasi yang lurus dan bukan lup inokulasi pada langkah pembuatan olesan medium padat. I.2.7. Mikroorganisme Yang Diamati Pada Percobaan I.2.7.1. Pseudomonas putida Pseudomonas putida merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang dan tidak memiliki spora yang metabolismenya secara aerob. Bakteri jenis ini mempunyai alat gerak bermacammacam dapat dengan satu atau banyak flagel dan dapat berkembang biak pada berbagai macam substrat organik. Pseudomonas hidup secara saprofit di tanah maupun air dan memiliki peranan penting dalam biodegradasi. (Pradhika, 2011)

10

Pseudomonas sp. merupakan bakteri hidrokarbonoklastik yang mampu mendegradasi berbagai jenis hidrokarbon. Keberhasilan penggunaan bakteri Pseudomonas sp. dalam upaya bioremediasi lingkungan pemahaman akibat tentang pencemaran mekanisme hidrokarbon interaksi membutuhkan antara bakteri

Pseudomonas sp. dengan senyawa hidrokarbon. Kemampuan bakteri Pseudomonas sp. IA7D dalam

mendegradasi hidrokarbon dan dalam menghasilkan biosurfaktan menunjukkan bahwa isolat bakteri Pseudomonas sp. IA7D berpotensi untuk digunakan dalam upaya bioremediasi lingkungan akibat pencemaran hidrokarbon. (Wikipedia, 2011)

Gambar I.9. Pseudomonas putida (http://www.mokkka.hu) I.2.7.2. Bacillus thuringiensis

Gambar I.10. Bacillus thuringiensis (http://www.dmu.dk) Bacillus thuringiensis (Bt) adalah bakteri gram positif yang berbentuk batang, aerobik dan membentuk spora. Bakteri ini termasuk patogen fakultatif dan dapat hidup di daun tanaman konifer maupun pada tanah. Banyak strain dari bakteri ini yang

11

menghasilkan

protein

yang

beracun

bagi

serangga.

Sejak

diketahuinya potensi dari protein Kristal Bt sebagai agen pengendali serangga, berbagai isolat Bt dengan berbagai jenis protein kristal yang dikandungnya telah teridentifikasi. Sampai saat ini telah diidentifikasi protein kristal yang beracun terhadap larva dari berbagai ordo serangga yang menjadi hama pada tanaman pangan dan hortikultura. Kebanyakan dari protein kristal tersebut lebih ramah lingkungan karena mempunyai target yang spesifik sehingga tidak mematikan serangga bukan sasaran dan mudah terurai sehingga tidak menumpuk dan mencemari lingkungan. Bacillus thuringiensis dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, termasuk sayuran, kapas, tembakau, dan tanaman hutan. (Wikipedia, 2011) I.2.7.3. Acetobacter aceti Acetobacter aceti merupakan bakteri gram negatif dan juga termasuk dalam bakteri aerob. Bakteri ini dapat tumbuh dengan baik pada suhu 30 0C, ia bergerak dengan menggunakan flagella. Bakteri ini biasanya di gunakan dalam proses fermentasi industry, selain itu ia tidak pathogen terhadap manusia.

Gambar I.11. Acetobacter aceti (http://www.sciencephoto.com) I.2.7.4. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram Positif, tidak bergerak, tidak berspora dan mampu membentuk kapsul, berbentuk kokus dan tersusun seperti buah anggur. Ukuran Staphylococcus aureus berbeda-beda tergantung pada media pertumbuhannya.

12

Apabila ditumbuhkan pada media agar, Staphylococcus aureus memiliki diameter 0,5-1,0 mm dengan koloni berwarna kuning. Staphylococcus aureus adalah bakteri aerob dan anaerob, fakultatif yang mampu menfermentasikan manitol dan menghasilkan enzim koagulase, hyalurodinase, fosfatase, protease dan lipase. Staphylococcus aureus mengandung lysostaphin yang dapat

menyebabkan lisisnya sel darah merah. Toksin yang dibentuk oleh Staphylococcus aureus adalah haemolysin alfa, beta, gamma delta dan apsilon. Toksin lain ialah leukosidin, enterotoksin dan eksfoliatin. Enterotosin dan eksoenzim dapat menyebabkan keracunan makanan terutama yang mempengaruhi saluran pencernaan. Leukosidin menyerang leukosit sehingga daya tahan tubuh akan menurun. Eksofoliatin merupakan toksin yang menyerang kulit dengan tandatanda kulit terkena luka bakar.

Gambar I.12. Staphylococcus aureus (Wikipedia, 2010) I.2.8. Pewarnaan Gram Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, yaitu ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884. Pewarnaan gram ini merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini,

13

bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompik besar, yaitu (George, 1997): 1. Organisme yang dapat menahan komplek pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut gram positif. 2. Organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudiaan terwarnai oleh pewarna tandingan, yaitu safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut gram negatif. Karena kemampuannya untuk membedakan pewarnaan gram disebut juga pewarnaan diferensial. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pewarnaan Gram Terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil akhir pewarnaan Gram bakteri, di antaranya adalah: Metode atau Teknik yang Digunakan Pemanasan yang berlebihan selama fiksasi, dekolorisasi yang berlebihan dengan alkohol, dan bahkan pembilasan dengan air yang terlalu banyak pada tiap langkah dapat menyebabkan bakteri gram positif kehilangan kompleks kristal violet-iodine. Umur Biakan Biasanya, biakan dengan umur lebih dari 24 jam akan kehilangan kemampuan untuk menahan kompleks kristal violet-iodine. Jenis Organisme Beberapa bakteri gram positif lebih dapat menahan kompleks kristal violet-iodine dibandingkan dengan lainnya. Perubahan Keasaman (pH) Bila pH turun kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah menjadi gram negatif. Sebaliknya bila pH naik ada kemungkinan bakteri-bakteri gram dapat berubah menjadi gram positif.

14

Faktor Medium Misalnya bakteri-bakteri gram positif yang lemah bila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram negatif. Kerapatan Sel pada Olesan Bila kerapatan sel pada olesan rendah, maka pada saat pembilasan dengan alkohol warna ungu akan mudah luntur. (http:// www. uphs. upenn.edu) Terdapat beberapa jenis pewarna Gram yang digunakan dalam percobaan pewarnaan Gram secara diferensial, yaitu (George, 1997): a. Ungu Kristal (Crystal Violet) Ungu Kristal (Crystal Violet) merupakan pewarna ungu yang paling kontras dari semua pewarna ungu metil, dan sangat memuaskan untuk segala macam penggunaan, seperti

metakromatik (metachromatic) dan peragaan amiloid (Amyloid Demonstration). Warna ungu dari pewarna ungu kristal yang lebih pekat dibandingkan pewarna ungu lainnya membuat pewarna ungu kristal digunakan dalam pewarnaan Gram untuk klasifikasi utama bakteri. Meskipun ungu kristal sudah sering digunakan sejak dahulu sebagai agen bakteriostatik untuk aplikasi kulit tropis, ternyata ungu kristal telah diduga merupakan salah satu agen penyebab kanker. Ungu kristal memiliki kelarutan dalam air sebesar 1.68 %, sedangkan kelarutan dalam etanol sebesar 13.87%. Rumus molekul dari ungu kristal adalah C22H30N3Cl dan memiliki berat molekul 408 gr/mol. b. Safranin Safranin yang digunakan dalam pewarnaan Gram diferensial sebagai pewarna tandingan sebenarnya memiliki nama Safranin O. Safranin O merupakan pewarna tandingan dengan warna

15

merah muda yang sering digunakan. Dalam dunia medis, Safranin O juga dapat digunakan dalam metode metakromatis untuk pemeriksaan tulang rawan. Safranin O memiliki kelarutan dalam air sebesar 5.45% dan dalam etanol sebesar 3.41%. c. Iodin Selain zat pewarna Gram ungu kristal dan safranin, Iodin juga sangat penting dalam percobaan pengecatan Gram secara diferensial. Iodin dalam pewarnaan Gram sering disebut juga zat mordan. Zat mordan merupakan zat kimia yang dapat menyebabkan sel-sel bakteri dapat dicat lebih intensif dan menyebabkan cat terikat lebih kuat pada jaringan sel. I.2.9. Mikroskop Binokuler Dalam pengamatan bakteri, digunakan mikroskop binokuler yaitu mikroskop yang memiliki 2 lensa okuler yang memiliki pembesaran 10 kali dan lensa obyektif yang memiliki pembesaran 4,10,40, dan 100 kali. Berikut adalah contoh gambar mikroskop binokuler (Anonim, 2009):

Gambar I.13. Mikroskop Binokuler (www.nanpunya.files.wordpress.com)

16

I.2.10. Penggunaan Minyak Imersi Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa untuk memisahkan dua titik yang berdekatan pada preparat sehingga struktur benda terlihat lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang () pendek. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks bias pada perbesaran 10 x 100 pada penggunaan mikroskop binokuler.

Gambar I.14. Cara Penggunaan Minyak Imersi (Ekmon, 2008)