194

Aflatoxinas: Anlise em Amendoim por Cromatografia em Camada Delgada

Captulo 21

Aflatoxinas: Anlise em Amendoim por Cromatografia em Camada Delgada

Miguel Machinski Junior

OCORRNCIA
As aflatoxinas so produtos do metabolismo secundrio de alguns fungos filamentosos (bolores). Essas micotoxinas podem ser produzidas por trs espcies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A. nomius, que proliferam em diversos substratos (sementes, cereais, alimentos e raes) e acarretam, quase sempre, graves danos sade do homem e dos animais.1 As aflatoxinas foram descobertas aps o acidente econmico ocorrido na Inglaterra em 1960 quando, em poucas semanas, cem mil filhotes de perus e outros milhares de filhotes de outros tipos de aves pereceram de hepatite aguda necrosante aps a ingesto de rao base de amendoim. Posteriormente, as aflatoxinas (B1, B2, G1 e G2) foram identificadas por apresentar uma intensa fluorescncia quando expostas luz ultravioleta (366 nm), devido ao anel furocumarnico (Fig. 21.1) e pela anlise de espectroscopia de massas.2 Muitos produtos agrcolas em geral, e o amendoim em particular, so viveis de sofrer infestao por fungos toxignicos e, conseqentemente, estar contaminados com aflatoxinas. A razo por que a ocorrncia de aflatoxinas alta em amendoim em relao a outros produtos agrcolas no foi completamente estabelecida. Entretanto, ela pode ser atribuda ao fato de que Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus dominam na micoflora em solos de plantio do amendoim.3 Nesse contexto, a aflatoxicose tornou-se um problema mundial. A prevalncia de afla-

Fig. 21.1 Estrutura qumica das principais aflatoxinas.

toxinas em alimentos e raes relativamente alta nas regies tropical e subtropical; por isso, a Organizao Mundial da Sade recomenda um controle sistemtico dos nveis de aflatoxinas na dieta dessas populaes.4

DISPOSIO NO ORGANISMO
As aflatoxinas so facilmente absorvidas aps ingesto, por serem molculas de relativo baixo peso molecular e lipoflicas. O local de absoro o intestino delgado, principalmente no duodeno, por difuso passiva.5 Na mucosa do trato gastrintestinal, as aflatoxinas esto sujeitas a processos de biotransformao; os principais produtos que interagem com as protenas da mucosa gastrintestinal so o 8,9-epxido, o diidrodiol e a aflatoxina

Aflatoxinas: Anlise em Amendoim por Cromatografia em Camada Delgada

195

B2. As aflatoxinas seguem para o fgado por meio do suplemento sangneo do sistema portal heptico. No fgado, so concentradas devido alta permeabilidade da membrana do hepatcito a essas toxinas e ao processo de biotransformao pelas enzimas presentes na frao citosol e microssmica da clula heptica.6 Os principais produtos de biotransformao da aflatoxina B1 so o 8,9-epxido, os produtos hidroxilados como a aflatoxina M1 e a aflatoxina Q1, a desmetilao para aflatoxina P1 e a reduo para aflatoxicol. O produto reativo, 8,9-epxido, pode se ligar tanto ao DNA como albumina srica, formando adutos de aflatoxina-N7guanina e aflatoxina-N7-lisina, respectivamente. As ligaes covalentes dos adutos no DNA so consideradas um passo crtico na hepatocarcinognese das aflatoxinas. Posteriormente, os produtos de biotransformao so conjugados com o glutation, cido glicurnico e sulfatos. A remoo das aflatoxinas e seus produtos do organismo ocorre primeiramente pela secreo biliar (~58%), seguida pela urina (~35%). Em lactentes e animais em lactao, uma frao considervel eliminada pelo leite na forma de aflatoxina M1.5

teco e a quantificao das aflatoxinas so realizadas por anlise visual sob luz ultravioleta (366 nm).

Amostragem
Os critrios necessrios tomada de amostra para determinao de aflatoxinas em amendoim devem seguir planos de amostragem oficiais. A Resoluo da Diretoria Colegiada da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria RDC No 274/028 recomenda os Planos de Amostragem para Anlise de Aflatoxinas em Milho e Amendoim da FAO Food and Agriculture Organization.9 A amostra de amendoim a ser encaminhada para o laboratrio de 5 kg e ser transformada em pasta homognea ou moda em malha;1 posteriormente, ser dividida em quatro partes, e uma subamostra tomada para anlise de rotina. As subamostras sero armazenadas em embalagem de papel, algodo ou outro material apropriado em umidade relativa mxima de 60% temperatura mxima de 25C. O Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA) apresentou um projeto de Instruo Normativa para o Regulamento Tcnico referente ao Mtodo de Amostragem e Anlise para Determinao de Aflatoxinas em Amendoim, Portaria No 65/04.10 No entanto, at que as normas especficas sobre amostragem para anlise de micotoxinas sejam estabelecidas pelo MAPA, os critrios e procedimentos para amostragem dos produtos devero atender ao Manual de Procedimentos Operacionais da Vigilncia Agropecuria Internacional, aprovado pela Instruo Normativa No 26/0111 e Norma Interna No 1/03.12 Do volume total amostrado, aps sua homogeneizao, ser retirada uma nica amostra de, no mnimo, 3 kg, a qual dever ser encaminhada para anlise. Aps moagem e homogeneizao, a amostra dividida em quatro subamostras: anlise, contraprova, detentor do produto e destinada ao controle ou aferio interlaboratorial. O plano de amostragem proposto pela Portaria No 65/04 do MAPA tem como base o projeto de nvel de referncia e planos de amostragem para aflatoxinas presentes em amendoim do Codex Alimentarius elaborado em 1999, revisto em 2001.13 Encontra-se no Trmite 6.9. Nesse plano, o tamanho da amostra total de 27 e 20 kg para amendoim em casca e descascado, respectivamente, devendo ser coletada conforme a massa total do lote. A amostra de 27 ou 20 kg deve ser triturada integralmente, homogeneizada, quarteada at a obteno das subamostras de 7 e 5 kg de amendoim em casca e descascado, respectivamente. As subamostras devem ser conservadas a temperatura inferior a 15C.

FINALIDADE DA ANLISE
O conhecimento dos nveis de aflatoxinas em produtos naturalmente contaminados por essas micotoxinas s pode ser observado por meio de mtodos de anlise adequados. Tais mtodos so necessrios para a fiscalizao, o controle da qualidade, a monitorizao e a pesquisa nos seus vrios aspectos, seja anlise de sementes, gros, alimentos e raes, estudos epidemiolgicos, estudo da produo de micotoxinas e do metabolismo dos fungos toxignicos, verificao da estabilidade durante o processamento de alimentos, condies de armazenamento ou descontaminao.

MTODO DE ANLISE7 Fundamento do Mtodo

As aflatoxinas so extradas com metanol-cloreto de potssio da matriz usada para anlise. Posteriormente realizada a etapa de limpeza, com a precipitao de protenas com agentes clarificantes, sulfato de cobre ou sulfato de amnio e a remoo de gordura com n-hexano. As aflatoxinas so reextradas com clorofrmio por partio lquido-lquido e separadas dos componentes do extrato por cromatografia em camada delgada. A de-

198

Aflatoxinas: Anlise em Amendoim por Cromatografia em Camada Delgada

Quadro 21.2 Valores de Rf para aflatoxinas e derivados (cido trifluoroactico TFA) no sistema-solvente toluenoacetato de etila-clorofrmio-cido frmico (70:50:50:20)
Rf aps derivao com TFA 0,13 0,33 0,07 0,21

Clculos: Calcular a concentrao de cada aflatoxina encontrada na amostra analisada, conforme a frmula a seguir: g de aflatoxina/kg da matriz = (1.600 3 P 3 VP)/(m 3 VA)
em que: 1.600 = fator de diluio. P = concentrao da soluo de trabalho de aflatoxina em g/mL (5 g/mL para as aflatoxinas B1 e G1 e 1,5 g/mL para as aflatoxinas B2 e G2). VP = volume da soluo de trabalho de aflatoxina (L) cuja fluorescncia igual da amostra. m = peso em gramas da amostra analisada (50 g). VA = volume da amostra (L) que corresponde intensidade de fluorescncia igual do padro.

Aflatoxinas B1 B2 G1 G2

Rf 0,43 0,36 0,30 0,24

Fluorescncia Azul Azul Verde Verde

Parmetros de Validao
Os requerimentos mnimos para avaliar o desempenho de mtodos analticos para aflatoxinas dependem dos nveis de contaminao.18 A equao de Horwitz usada para predizer a eficincia dos mtodos em funo do limite de quantificao:
RSD 5 2(1 0,5 log C)

Fig. 21.2 Cromatograma esquemtico para a identificao e aps confirmao com cido trifluoroactico, fase mvel: tolueno-acetato de etilaclorofrmio-cido frmico (70:50:50:20).

A repetibilidade (RSDr) aceitvel deve ser igual ou menor que metade (RSDr 0,5 RSD) do valor encontrado na equao de Horwitz, enquanto a reprodutibilidade (RSDR) deve ser igual ao valor de Horwitz.19 Na maioria dos casos, os mtodos devem apresentar recuperao entre 70 e 110%, coeficiente de variao intralaboratorial inferior a 20% (RSDr 20%) e coeficiente de variao interlaboratorial inferior a 30% (RSDR 30%), bem como limite de quantificao inferior ao limite mximo tolervel (LMT).18

Adicionar 1 gota de cido trifluoroactico com o auxlio de capilar. Secar a placa em capela de exausto de gases durante 5 minutos. Eluir a placa em tolueno-acetato de etila-clorofrmio-cido frmico (70:50:50:20). Aps eluio, secar a placa em capela de exausto de gases temperatura ambiente. Realizar a anlise visual por observao da placa sob luz ultravioleta a 366 nm, detectando manchas nas amostras com Rf prximo s manchas das aflatoxinas no padro (Quadro 21.2, Fig. 21.2).

Interpretao dos Resultados

O Limite Mximo Tolervel (LMT) para aflatoxinas no Brasil segundo: Resoluo RDC No 274/02 Anvisa, Ministrio da Sade (Resol. Mercosul No 56/94 modificada Mercosul/GMC No 25/02) e Portaria MAARA No 183/964 de 20 g/kg para a somatria das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (amendoim, milho e seus produtos) e para aflatoxina M1 de 0,5 g/L (leite) e de 5 g/L (leite em p).16 Resoluo 34/79, do Ministrio da Sade,17 estabelece o limite de 30 g/kg para a somatria das

Aflatoxinas: Anlise em Amendoim por Cromatografia em Camada Delgada

199

aflatoxinas B1 e G1 para todos os alimentos, exceto amendoim, milho e seus produtos.

OuTROS MTODOS20
A necessidade de decises rpidas tem levado ao desenvolvimento de novos mtodos de triagem; por exemplo, ensaio imunoenzimtico (ELISA), colunas de imunoafinidade e fluorimetria. Mtodos de quantificao e confirmao foram desenvolvidos para cromatografia lquida de alta eficincia acopladas a detectores ou espectrmetros de massas. ELISA existem atualmente no comrcio vrios tipos de testes (kits comerciais) baseados em mtodos imunoqumicos, tanto para deteco qualitativa como para determinao quantitativa. Essa tcnica pode ser competitiva direta ou indireta. As principais vantagens so a rapidez, a facilidade de manuseio e o baixo uso de solventes orgnicos. No entanto, apresenta como desvantagens: alta incidncia de resultados falso-positivos e baixa reprodutibilidade. Colunas de imunoafinidade so usadas para detectar e/ou quantificar aflatoxinas. Para o ensaio qualitativo necessrio lmpada de ultravioleta e para a quantificao, o fluormetro. Apresentam como vantagem a alta sensibilidade e o baixo uso de solventes orgnicos; no entanto, tm demonstrado resultados falso-positivos e custo elevado. Cromatografia lquida de alta eficincia o uso de sistema de deteco por fluorescncia, bem como a formao de derivados de aflatoxinas por derivaes pr e ps-coluna, tem melhorado a sensibilidade dessa tcnica. As principais desvantagens so o custo do equipamento e o uso de solventes orgnicos, mas apresenta sensibilidade, especificidade, repetibilidade e reprodutibilidade altas. Espectrometria de massas essa tcnica acoplada ao cromatgrafo lquido de alta eficincia um procedimento de confirmao altamente especfico na anlise de aflatoxinas, mas requer equipamentos de alto custo.

REFERNCIAS
1. GOLDBLATT, L.A. Mycotoxins past, present and future... J. Am. Oil Chem. Soc., Chicago, v. 54, pp. 302A-310A, 1977. 2. NRIAGU, J.O.; SIMMONS, M.S. Food contamination from environmental sources. Academic Press, New York, 1990. 643p. 3. DIENER, U.L.; PETTIT, R.E.; COLE, R.J. Aflatoxins, and other mycotoxins in peanuts. In: PATTEE, H.E.; YOUNG, C.T., eds. Peanut science and technology. American Peanut Research and Education Society, Yoakum, pp. 486-519, 1982.

4. WHO World Health Organization. Environmental Health Criteria 11. Mycotoxins. WHO, Geneva, 1979, 127 p. 5. HSIEH, D.P.H.; WONG, J.J. Pharmacokinetics and excretion of aflatoxins. In: EATON, D.L; GROOPMAN, J.D., eds. The toxicology of aflatoxins. Academic Press, New York, pp. 73-88, 1994. 6. WILSON, R.; ZIPRIN, R.; RAGSDALE, S.; BUSBEE, D. Uptake and vascular transport of ingested aflatoxin. Toxicol. Lett., Amsterdam, v. 29, pp. 169-176, 1985. 7. SOARES, L.M.V.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. Survey of aflatoxins, ochratoxin A, zearalenone, and sterigmatocystin in some Brazilian foods by using multi-toxin thin-layer chromatographic method. J. Assoc. Off. Anal. Chem., Arlington, v. 72, n. 1, pp. 22-26, 1989. 8. BRASIL, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, RDC No 274, 15 de outubro de 2002. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 16 de outubro de 2002. 9. FAO Food and Agriculture Organization. Sampling plans for aflatoxin analysis in peanuts and corn. FAO Food and Nutrition Paper 55. FAO, Rome, 1993. 10. BRASIL, Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Portaria No 65, 10 de setembro de 2004. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 24 de setembro de 2004. 11. BRASIL, Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Instruo Normativa No 26, 12 de junho de 2001. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 2 de julho de 2001. 12. BRASIL, Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Norma Interna No 1, 24 de fevereiro de 2003. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 27 de fevereiro de 2003. 13. CODEX ALIMENTARIUS. Nivel mximo y planes de muestreo para el contenido total de aflatoxinas en el man (cacahuete) destinado a ulterior elaboracin. Codex stan 209, Codex Alimentarius, 1999, Rev. 1, 2001, 1-6p. 14. AOAC INTERNATIONAL. Official methods of analysis of AOAC International. 16. ed. 4th ver. AOAC, Arlington, 1998 (Software Adobe and E-DOC/CJS). 15. PRZYBYLSKI, W. Formation of aflatoxin derivatives on thin layer chromatographic plates. J. Assoc. Off. Anal. Chem., Arlington, v. 58, n. 1, pp. 163-164, 1975. 16. BRASIL, Ministrio da Agricultura, Abastecimento e Reforma Agrria. Portaria No 183, 21 de maro de 1996. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 25 de maro de 1996. 17. BRASIL, Ministrio da Sade, Comisso Nacional de Normas e Padres para Alimentos CNNPA, Resoluo No 34/1976. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 19 de janeiro de 1977. 18. GILBERT, J.; ANKLAM, E. Validation of analytical methods for determining mycotoxins in foodstuffs. Trends Analyt. Chem., Amsterdam, v. 21, n. 6-7, pp. 468-486, 2002. 19. EUROPEAN COMMISSION. Decision 2002/657/EC 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal, L221 (August), 8-36, 2002. 20. AMARAL, K.A.S.; MACHINSKI JR, M. Mtodos analticos para a determinao de aflatoxinas em milho e seus derivados: uma reviso. Rev. Analytica, So Paulo, v. agosto/ setembro, n. 24, pp. 56-58, 2006.